Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3 methoxim isatin hướng ức chế histon deacetylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -  LÊ THỊ THẢO TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -  LÊ THỊ THẢO TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đào Thị Kim Oanh PGS.TS Nguyễn Hải Nam HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài “Tổng hợp thử tác dụng sinh học số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase”, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp Trƣớc tiên, xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Đào Thị Kim Oanh, PGS TS Nguyễn Hải Nam – ngƣời thầy tận tâm hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu, thực đề tài Bộ mơn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Với lòng kính trọng biết ơn, tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Huỳnh Kim Thoa – ngƣời Thầy tạo điều kiện cho hội đƣợc nâng cao kiến thức có thời gian để thực hội Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên, bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa dƣợc - Bộ mơn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, anh chị Khoa hóa học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongji, Hàn Quốc) nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến chồng, gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, hỗ trợ nhiều trình học tập, làm việc hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2014 Lê Thị Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm HDAC 1.1.2 Phân loại HDAC 1.1.3 Mối liên quan ung thƣ hoạt động bất thƣờng HDAC 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs) 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.2 Cơ chế tác dụng chất ức chế HDAC 1.2.3 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC 10 HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY 1.3.1 Các nghiên cứu tổng hợp acid hydroxamic giới 10 1.3.1.1 Thay đổi cầu nối 11 1.3.1.2 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt 16 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc 21 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC 24 1.4.1 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 24 1.4.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic 25 Chƣơng NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 26 2.2 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 26 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 27 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.2.1 Tổng hợp hóa học 28 2.3.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 28 2.3.2.3 Phương pháp phân tích cấu trúc 28 2.3.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 29 2.3.2.5 Docking 31 2.3.2.6 Đánh giá mức độ giống thuốc chất tổng hợp 31 Chƣơng THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 33 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 33 3.1.1 Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin dẫn chất (IIa-g) 33 3.1.1.1 Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIa) 34 3.1.1.2 Tổng hợp 5- fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIb) 34 3.1.1.3 Tổng hợp 5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIc) 34 3.1.1.4 Tổng hợp 5-bromoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IId) 34 3.1.1.5 Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin (IIe) 35 3.1.1.6 Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin (IIf) 35 3.1.1.7 Tổng hợp 7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIg) 35 3.1.2 Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat dẫn 35 chất (IIIa – g) 3.1.2.1 Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)–2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIa) 36 3.1.2.2 ethyl-7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 36 3.1.2.3 Tổng hợp ethyl-7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat 36 Tổng hợp yl)heptanoat (IIIb) (IIIc) 3.1.2.4 Tổng hợp ethyl-7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 37 3.1.2.5 Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat 37 yl)heptanoat (IIId) (IIIe) 3.1.2.6 Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1- 37 3.1.2.7 Tổng hợp ethyl-7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat 37 yl)heptanoat (IIIf) (IIIg) 3.1.3 Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid 38 dẫn chất (IVa-g) 3.1.3.2 Tổng hợp N-hydroxy-7-(5-fluoro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 39 N-hydroxy-7-(5-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 39 N-hydroxy-7-(5-bromo-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 39 N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1- 39 3.1.3.6 Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1- 40 yl)heptanamid (IVb) 3.1.3.3 Tổng hợp yl)heptanamid (IVc) 3.1.3.4 Tổng hợp yl)heptanamid (IVd) 3.1.3.5 Tổng hợp yl)heptanamid (IVe) yl)heptanamid (IVf) 3.1.3.7 Tổng hợp N-hydroxy-7-(7-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 40 yl)heptanamid (IVg) 3.2 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 41 3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 42 3.3.1 Phổ hồng ngoại (IR) 42 3.3.2 Phổ khối lƣợng (MS) 43 3.3.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 43 3.3.3.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 44 3.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR 45 3.4 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 47 3.4.1 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase 47 3.4.2 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 47 3.5 KẾT QUẢ DOCKING 47 3.6 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP 49 Chƣơng BÀN LUẬN 50 4.1 VỀ HÓA HỌC 50 4.1.1 Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin dẫn chất (IIa-g) 50 4.1.2 Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian (IIIa-g) 50 4.1.3 Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic (IVa-g) 51 4.2 VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 52 4.2.1 Phổ hồng ngoại 52 4.2.2 Phổ khối lƣợng 54 4.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 55 4.2.3.1 Phổ 1H – NMR 56 4.2.3.2 Phổ 13C – NMR 61 4.3 VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 64 4.3.1 Về tác dụng ức chế HDAC 64 4.3.2 Về tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72 KẾT LUẬN 72 1.1 Về tổng hợp hóa học khẳng định cấu trúc 72 1.2 Về hoạt tính sinh học 72 ĐỀ XUẤT 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỔ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AsPC-1 Tế bào ung thƣ tụy 13 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C C-NMR DCM Dicloromethan DMF Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid FDA Cục quản lý dƣợc phẩm thực phẩm Mỹ HAT Histon acetyl transferase HDAC Enzym histon deacetylase HDACIs Các chất ức chế HDAC Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H H-NMR IC50 Nồng độ ức chế 50% phát triển tế bào IR Phƣơng pháp phổ tử ngoại LD50 Liều gây chết cho 50% số cá thể nghiên cứu MCF-7 Tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol MS Phổ khối lƣợng NCI-H460 Tế bào ung thƣ phổi NMR Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân PC-3 Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic SW620 Tế bào ung thƣ ruột kết THF Tetrahydrofuran TLC Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng TSA Trichostatin A DANH MỤC HÌNH VẼ Tên hình Trang Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo nucleosom Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động HDAC nhóm I, II, IV Hình 1.3: Vai trò HDAC sinh lý tế bào ung thƣ H h 1.4: HDACIs có cấu trúc hydroxamat 10 Hình 1.5: Các dẫn chất 2’ SAHA 12 Hình 1.6: Các dẫn chất -alkoxy SAHA 12 Hình 1.7: Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid 13 Hình 1.8: SAR dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC 14 Hình 1.9: Các dẫn chất amid ngƣợc SAHA 14 Hình 1.10: Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối SAHA 16 Hình 1.11: Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA 16 Hình 1.12: Các aryl-hydroxamic tƣơng tự SAHA 17 Hình 1.13: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic 17 Hình 1.14: Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA 18 Hình 1.15: Một số acid phenylthiazol hydroxamic 19 Hình 1.16: Dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049 19 Hình 1.17: Dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic acid 19 Hình 1.18: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol hydroxamic 20 Hình 1.19: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol hydroxamic 20 Hình 1.20: Cấu trúc N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid 21 Hình 1.21: Cấu trúc hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động 22 benzothiazol Hình 1.22: Cấu trúc hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động 22 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol Hình 1.23: Cấu trúc dẫn chất 3-oxim-isatin 24 Hình 3.1: Kết phân tích Western blot chất IVa – g 47 Hình 3.2: Kết docking chất IVa SAHA với HDAC8 48 Hình 3.3: Kết docking chất IVa SAHA với HDAC2 48 Hình 4.1: Hiện tƣợng hỗ biến nhóm chức hydroxamic 53 Hình 4.2: Phổ hồng ngoại chất IVa 54 Hình 4.3: Phổ khối lƣợng chất IVa 55 Hình 4.4: Phổ 1H – NMR dãn rộng IVa 57 Hình 4.5: Phổ 1H – NMR dãn rộng IVg 58 Hình 4.6: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR 19e 59 Hình 4.7: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR IVe 59 Hình 4.8: a, Phổ 13C – NMR chất IVf 63 b, Phổ 13C – NMR dãn rộng chất IVf Hình 4.9: Kết phân tích Western blot dãy chất 19a-g IVa-g 64 Hình 4.10: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro dẫn 67 chất IVa-g Phụ lục 4-2: Phổ MS chất IVd Phụ lục 4-3: Phổ 1H-NMR chất IVd Phụ lục 4-4: Phổ 13C-NMR chất IVd Phụ lục 5-1: Phổ IR chất IVe Phụ lục 5-2: Phổ MS chất IVe Phụ lục 5-3: Phổ 1H-NMR chất IVe Phụ lục 5-4: Phổ 13C-NMR chất IVe Phụ lục 6-1: Phổ IR chất IVf Phụ lục 6-2: Phổ MS chất IVf Phụ lục 6-3: Phổ 1H-NMR chất IVf Phụ lục 6-4: Phổ 13C-NMR chất IVf Phụ lục 7-1: Phổ IR chất IVg Phụ lục 7-2: Phổ MS chất IVg Phụ lục 7-3: Phổ 1H-NMR chất IVg Phụ lục 7-4: Phổ 13C-NMR chất IVc ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -  LÊ THỊ THẢO TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3- METHOXIM- ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE. .. tiến hành thực đề tài: Tổng hợp thử tác dụng sinh học số acid hydroxamic mang khung 3- methoxim- isatin hướng ức chế histon deacetylase với mục tiêu: Tổng hợp N-hydroxy-7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid... Phương pháp thử hoạt tính sinh học 29 2 .3. 2.5 Docking 31 2 .3. 2.6 Đánh giá mức độ giống thuốc chất tổng hợp 31 Chƣơng THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 33 3. 1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 33 3. 1.1 Tổng hợp 3- (methoxyimino)-2-oxoindolin