Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 5 aryl 1,3,4 thiadiazol hướng ức chế histon deacetylase

Nhóm chất này có hoạt tính ức chế mạnh, cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, trong đó acid suberoylanilid hydroxamic SAHA là chất đầu tiên đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH LAN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA

MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 5-ARYL-1,3,4-THIADIAZOL HƯỚNG

ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH LAN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 5-ARYL-1,3,4-THIADIAZOL HƯỚNG ỨC

CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình

và nhiều giúp đỡ quý báu của các thày cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Từ tận đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu

sắc tới TS Đào Thị Kim Oanh và PGS.TS Nguyễn Hải Nam, những người thày

đã chỉ dẫn tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em làm việc và thực hiện đề tài tại

bộ môn Hóa dược, đặc biệt các em Đỗ Thị Mai Dung và Lương Xuân Huy, đã

ủng hộ và giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi cũng nhận được sự phối hợp và giúp đỡ từ các cán bộ làm việc tại Khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Viện hóa học Việt Nam, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, cùng toàn thể các thày cô trong các phòng, ban, thư viện Tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bè bạn – những người luôn sát cánh, động viên và khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập

Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2014

Học viên

Trần Thị Bích Lan

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2

1.1.1 Khái niệm, phân loại 2

1.1.2 Cấu trúc của HDAC 3

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HDAC 3

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 4

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC (HDIs) 4

1.2.2 Cơ chế tác dụng 6

1.2.3 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 6

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC 7

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƯỚC VỀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 15

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 19

2.1.2 Hóa chất chính 19

2.1.2 Các hóa chất và dung môi khác 19

2.2 THIẾT BỊ 19

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 20

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26

3.1 NGHIÊN CỨU DOCKING 26

3.2 TỔNG HỢP HÓA HỌC 27

3.2.1 Tổng hợp chất N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Va) 27

3.2.2 Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8 -hydroxyoctandiamid (Vb) 31

3.2.3 Tổng hợp chất N 1 -hydroxy-N8 -[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vc) 33

3.2.4 Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vd) 34

3.2.5 Tổng hợp chất N1 -[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Ve) 36

3.2.6 Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vf) 37

3.2.7 Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vg) 39

3.2.8 Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vh) 40

3.2.9 Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8 -[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vi) 42

3.2 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 43

3.3 KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 44

3.3.1 Phổ hồng ngoại (IR) 44

3.3.2 Phổ khối lượng (MS) 46

3.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 H-NMR, 13C-NMR) 46

3.5 HOẠT TÍNH SINH HỌC 50

3.5.1 Tác dụng ức chế HDAC 50

3.5.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 51

Chương 4 BÀN LUẬN 52

4.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 52

4.2 KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 53

4.2.1 Phổ hồng ngoại (IR) 53

4.2.2 Phổ khối (MS) 54

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) 55

4.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AsPC-1: Tế bào ung thư tụy người

13

C - NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

1H - NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H

dd: Dung dịch

HAT: histon acetyltranferase

HDAC: Histon deacetylase

H460: Tế bào ung thư phổi người

HDI, HDIs: Histon deacetylase Inhibitor(s)

IR: Phổ hồng ngoại

MCF-7: Tế bào ung thư vú người

MS: Phổ khối lượng

MTT: (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) NCI-H460: Tế bào ung thư phổi người

3 Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC các tuýp và tác dụng

kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn chất

amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA

4 Bảng 1.4: Các acid hydroxamic mang khung

5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl và độc tính trên một số dòng tế bào

5 Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất Va-i với HDAC8

6 Bảng 3.2: Giá trị Rf và T0nc của các chất Va-i

7 Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ IR của Va-i

8 Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ khối lƣợng của các chất

13 Bảng 4.2: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của Va-d,

Vf-h với một số dẫn chất acid hydroxamic mang

khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ HÌNH VẼ

3 Hình 1.3: Công thức cổ điển của HDI

4 Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic

5 Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự

của khung SAHA

12 Hình 1.12: Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol,

cầu nối 6 carbon

13 Hình 2.1: Các dẫn chất hydroxamic mang khung

STT Tên sơ đồ

1 Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic

2 Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4)

3 Sơ đồ 2.1: Tổng hợp các dẫn chất hydroxamic mang khung

ĐẶT VẤN ĐỀ

Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm enzym có ảnh hưởng lên quá trình sao chép và biểu hiện gen Các nghiên cứu cho thấy sự hoạt động bất thường của HDAC là căn nguyên của nhiều bệnh ung thư [7,11,15,24] Vì thế, việc tìm ra các thuốc có hoạt tính ức chế HDAC để điều trị ung thư đang là một hướng nghiên cứu được rất nhiều nhà khoa học quan tâm

Một trong các nhóm chất ức chế HDAC được tập trung nghiên cứu hiện nay

là các dẫn chất acid hydroxamic Nhóm chất này có hoạt tính ức chế mạnh, cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, trong đó acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là chất đầu tiên đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T [31] Tiếp tục thành công này, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới tối ưu hơn dựa trên phiên mẫu của SAHA và các chất đã tìm được

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu thiết kế, tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC đã và đang được thực hiện tại bộ môn Hóa Dược – trường Đại học Dược Hà Nội Các nghiên cứu này tập trung vào hai hướng: thay đổi cầu nối hoặc nhóm khóa hoạt động dựa trên khung của SAHA Trong luận án tiến sĩ của tác giả Đào Thị Kim Oanh, dẫn chất mang khung benzothiazol với vai trò là nhóm khóa hoạt động thay cho nhân phenyl của SAHA và cầu nối 6 carbon cho hoạt tính rất đáng lưu ý [3] Ngoài ra, trong một công bố gần đây của tác giả Nguyễn Hải Nam và cộng sự, các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl với cầu nối 6 carbon cũng cho hoạt tính rất tốt [21]

Vì vậy, tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp

và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung thiadiazol hướng ức chế histon deacetylase” với hai mục tiêu:

- Tổng hợp được một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol

5-aryl-1,3,4 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng một số dòng tế

bào ung thư in vitro của các chất tổng hợp được

- Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.1.1 Khái niệm, phân loại

Histon là các protein cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể, trong đó bốn cặp histon (H2A, H2B, H3 và H4) tạo nên lõi protein của nucleosom Các cặp histon lõi

có 2 phần quan trọng: đuôi C nằm bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom Đầu amin này mang nhiều điện tích dương nên tương tác mạnh với phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể

Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dương lớn, tương tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế sự biểu hiện gen Ngược lại, khi bị acetyl hóa, điện tích dương bị trung hòa, nhiễm sắc thể được tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra và đặc tính của gen được biểu hiện Trong tế bào, quá trình acetyl hóa này được điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltranferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [1, 13, 27, 29]

Histon deacetylase (HDAC) là nhóm gồm 18 enzym xúc tác cho sự di chuyển làm giảm bớt nhóm acetyl trên phần đuôi lysin của các protein histon H2A, H2B, H3 và H4 trong lõi nucleosom Hiện nay, 18 HDAC khác nhau ở người đã được xác định, chia làm 4 nhóm [1, 5, 6, 27, 29]

- Nhóm I: HDAC 1, HDAC 2, HDAC 3, HDAC 8 : Nằm ở nhân tế bào, có protein đích là các histon

- Nhóm IIa: HDAC 4, HDAC 5, HDAC 7, HDAC 9: Nằm ở nhân hoặc tế bào chất, có protein đích là các protein histon và không phải histon

- Nhóm IIb: HDAC 6, HDAC 10 : Nằm ở tế bào chất, có đích là các protein không phải histon

- Nhóm III: Các protein điều hoà chuỗi thông tin 2 (SIRT): SIRT 1 – 7, chúng

có ở bào tương, ty thể và nhân

- Nhóm IV: HDAC 11 : Nằm ở nhân tế bào, có đích là các histon

Các HDAC nhóm I, II, IV được gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc vào

Zn2+ và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic, thiol Trong khi đó các HDAC nhóm III lại phụ thuộc vào NAD+ [6] Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thường được dùng cho những chất có mục tiêu phân tử là các HDAC kinh điển và hiện đang được nghiên cứu trên lâm sàng [1, 6]

1.1.2 Cấu trúc của HDAC

Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X người ta đã xác định được cấu trúc 3D của một số HDAC và các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl của chúng Về cơ bản các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau:

+ Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí Thông thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+

thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [12, 19, 28]

+ Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ

chất Kênh này có cấu trúc dạng túi hình ống hẹp, được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl Trên miệng túi có một vành nhỏ được tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC) Đối với các hợp chất acid hydroxamic chiều dài của kênh này là tối ưu với khoảng 5-6 liên kết carbon [12, 28, 29]

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HDAC

Như đã trình bày trong phần khái niệm, hoạt động của HDAC ảnh hưởng tới

sự tích điện trên phần đầu amin của histon, từ đó gây tác động lên quá trình phiên

mã Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn tới sự hình thành khối u [1] Chẳng hạn, mối tương quan giữa hoạt động của HDAC và sự

tạo thành khối u được thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp

tính (APL) Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã

không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thư

(oncoprotein) Ngoài ra trong các tế bào ung thư người ta còn thấy sự hoạt động

quá mức của HDAC như ung thư buồng trứng (HDAC1-3), ung thư dạ dày (HDAC2); ung thư phổi (HDAC1, 3) [11, 24]

Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình, kể cả sự di chuyển,

sự xâm lấn và sự tạo mạch Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thư được tóm tắt ở hình 1.1 [7, 11, 15, 24]

Hình 1.1: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC (HDIs)

HDIs được chia thành 5 nhóm chính dựa trên cấu trúc hóa học: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton [9]

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng

N

O

Oxamflatin

O NHOH H

S O

O

LAQ-824

O

H3C

CH3

O NH O

CH 3

CH3O

HN O

S S

Các dẫn chất ceton

Trifluoromethyl

ceton

cetoamid Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic là những chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế, trong khi các peptid vòng có cấu trúc quá phức tạp và gây

Alpha-ra sự chảy máu khó chữa và FK-228 trong cấu trúc có một phần liên kết với kim loại có chứa lưu huỳnh không mong muốn [4, 14]

1.2.2 Cơ chế tác dụng

Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư do tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thư của HDIs là thúc đẩy

sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào

Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế tạo mạch cũng là vai trò rất

quan trọng của HDIs, gián tiếp ức chế sự phát triển in vivo của khối u (hình 1.2) [2,

13]

Hình 1.2: Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC

1.2.3 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

- Nhóm gắn với ion Zn2+ (Zinc binding group - ZBG) (A): tương tác với ion Zn2+tại trung tâm hoạt động của các HDAC như acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton , quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của HDIs

- Vùng cầu nối sơ nước (B): thường là những hydrocacbon thân dầu có thể tạo các liên kết Van der Waals với kênh enzym

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (surface recognition group) (C): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt enzym

Hình 1.3: Công thức cổ điển của HDI

Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC liên kết với một số chất ức chế HDAC cho thấy phần A, B và một phần của C nằm trong túi enzym, làm lấp đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động C tương tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Nhóm nhận diện bề mặt C

có thể liên kết với phần cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dược động học cho các chất ức chế HDAC Việc nghiên cứu thiết kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC

Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC được nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol

Trichostatin A ( (R)-TSA) là chất đầu tiên được phân lập từ Streptomyces

hygroscopicus đã được chứng minh có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu với HDAC

(Ki =3,4nM), có tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh

bạch cầu Friend, và đóng vai trò như chất ngăn cản sự di căn trong ung thư đại tràng Tuy nhiên việc sản xuất ra TSA rất tốn kém với hiệu suất thấp (trải qua 20

bước với hiệu suất 2%) nên việc nghiên cứu ra các chất ức chế HDAC thay thế TSA đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Hiện nay, TSA chủ yếu được dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra HDIs mới [23]

Một chất ức chế HDAC đã được nghiên cứu tổng hợp thành công là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) Chất này đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T SAHA làm tăng sự acetyl hóa của các histon H2B, H3 và H4, đồng thời thay đổi sự biểu hiện của một số gen dẫn đến sự chết tế bào theo chương trình [31]

Bên cạnh đó, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC đang được nghiên cứu rộng rãi và được chia thành nhiều phân nhóm nhỏ (hình 1.4)

Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic

Đặc điểm chung của các chất này là nhóm hydroxamic dễ tạo phức với Zn2+

của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh [20, 30]

Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu TSA, SAHA và các chất đã tìm được Dựa trên

nghiên cứu có thể tiến hành thay đổi một trong 2 phần cấu trúc: nhóm khóa hoạt động (C), cầu nối (B)

Sau đây là tổng kết một số nghiên cứu trên thế giới về thay đổi nhóm khóa hoạt động của các acid hydroxamic

Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu quân đội Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần

phenylthiazol thay thế vào vị trí của phenyl trong SAHA (1, hình 1.5) [10] Một

dẫn chất oxazol là WR301849 cũng được tổng hợp [17]

Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA

Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy dẫn chất WR301801 (1a)

với nhóm khóa hoạt động là 3-aminophenyl-5-thiazolyl có tác dụng ức chế mạnh nhất với IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm Đồng phân vị

trí của WR301801 là WR301826 (1b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác

dụng mạnh tương đương SAHA [30]

Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đường mới, nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếp tục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm amino của vòng phenyl (hình 1.6) [16] Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl được acyl hóa bằng những nhóm cồng kềnh, tác dụng ức chế nhiều týp

HDAC tăng Tác dụng mạnh nhất thu được với dẫn chất 1a-5 (hình 10) IC50 của dẫn chất này với HDAC2, HDAC3 thấp dưới mức 0,2 nM Kết quả thử độc tính

trên 5 dòng tế bào ung thư tụy công bố với 1a, 1b, 1a-2 cho thấy các dẫn chất này

đều có IC50 nhỏ hơn 3 M [16]

Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski cũng đồng thời tiến hành thiết kế và tổng hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA (hình 1.7) [16] Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3, 8, 10, 6) Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenyl thứ 2 hoạt tính giảm song khi nhóm -NH2 này được acyl hóa bằng những nhóm aminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại được tăng cường Điều này chứng tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhận nhiều nhóm có kích thước lớn Kết quả này cũng gợi ý các tương tác được tạo lập thêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đã làm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất Một số acid biphenyl-hydroxamic cũng cho độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư tụy thử nghiệm nhưng tác dụng không tốt bằng các acid phenylthiazol hydroxamic

Hình 1.7: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR301849 (hình 1.8) [17] Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50thấp đến 0,002 nM Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazol được đưa vào vị trí ngay sát cạnh nhóm acid hydroxamic đã được thiết kế

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic

* Tác nhân và điều kiện: (a) acid 7-heptynoic, POCl 3 , pyridin, -13 o Crt, 30 phút; (b) ethyl clorooxamidoacetat, triethylamin, THF, rt, 16 h; (c) NH 2 OH.HCl, KOH, MeOH, rt, 15 phút

Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy một số dẫn chất trong các acid isoxazol-hydroxamic tổng hợp ức chế cả 5 tuýp HDAC1, 2, 3, 6 và 10 với IC50trung bình khoảng 150 nM [25] Tác dụng này kém hơn nhiều so với các acid

phenylthiazol-hydroxamic (1) và acid biphenyl-hydroxamic (2) Có thể nhận xét,

khi có mặt vòng isoxazol cạnh nhóm hydroxamic, nhóm khóa hoạt động là quinolin hoặc biphenyl không tối ưu cho hoạt tính, trong khi hai dẫn chất với vòng 5-

phenylthiazol (3a, 3b) có tác dụng ức chế HDAC khá mạnh, gần tương đương

SAHA (hình 1.8) Đây cũng là hai dẫn chất thể hiện độc tính tế bào mạnh nhất với

IC50 thấp đến 1 µM Điều ngạc nhiên là mặc dù 3b ức chế HDAC mạnh hơn 3a song 3a lại có độc tính tế bào mạnh hơn 3b [25] Có thể sự có mặt của nhóm 3- amino ở 3b đã làm giảm tính thấm qua màng tế bào của chất này, dẫn đến độc tính

tế bào thấp hơn so với 3a Có thể các dẫn chất acyl hóa của 3b sẽ cải thiện cả tác

dụng trên HDAC và tế bào, tương tự như với các dẫn chất acid

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4) Tác nhân và điều kiện: (a) CuI,

Hunig base, THF, rt; (b) dd NH 2 OH, KCN, THF/MeOH (1/1), rt

Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC cho thấy cầu nối giữa phần hydroxamic và triazol 5, 6C là tối ưu Tuy nhiên, không thấy có quy luật rõ ràng khi so sánh hai dẫn chất có cùng nhóm khóa hoạt động Ar và khác nhau về độ dài cầu nối Với nhóm Ar cồng kềnh, dẫn chất 5C thường có tác dụng ức chế HDAC mạnh hơn trong khi những chất có Ar nhỏ, dẫn chất 6C thường biểu thị hoạt tính trên HDAC mạnh hơn Khi so sánh với SAHA, rất nhiều dẫn chất triazol chứng tỏ

có ái lực mạnh hơn với HDAC In vitro, 4 dẫn chất 4t, 4v, 4y, 4w gây độc đối với

dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến của người DU145 với IC50 thấp nhất đến 2,25

µM, tương đương với SAHA (hình 1.9) [8]

Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic

Đã có nhiều nghiên cứu về các dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC (các dẫn chất N-hydroxybenzamid, 1,3,4-thiadiazol và tetrahydroisoquinolin), gần đây, nhóm các nhà khoa học của Trung Quốc và Mỹ tiếp tục công bố kết quả tổng hợp

và thử tác dụng sinh học của một dãy các dẫn chất saccarin dihydrobenzo[d]isothiazol-3-1-1,1-dioxid) của acid hydroxamic mới (hình 1.10) [18]

(1,2-Hình 1.10: Một số dẫn chất saccarin của acid hydroxamic mới

Việc khảo sát độ dài cầu nối n=1-5 cũng cho thấy các dẫn chất có cầu nối 5C

cho hoạt tính ức chế HDAC mạnh nhất Đặc biệt các chất 5e, 5m, 5p ức chế HDAC

tương tự hoặc tốt hơn SAHA (với IC50 lần lượt là 0,152; 0,113; 0,096µM so với

SAHA là 0,135µM) Các đánh giá sinh học sâu hơn cho thấy 5m có hoạt tính kháng

các tế bào ung thư MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú); PC-3 (tế bào ung thư tiền liệt tuyến) và KG1 (tế bào ung thư bạch cầu nguyên bào tủy) mạnh nhất với IC50 = 4,34; 9,28 và 1,66 µM, tương đương SAHA [18] Kết quả này gợi ý rằng các dẫn chất hydroxamat mang khung saccarin có thể là các chất dẫn đường để phát triển các hoạt chất kháng ung thư mới

Một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc khác cũng vừa đăng ký bằng sáng chế (số CN 103159646) cho một dẫn chất mới của SAHA là N1-(2,5-

dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid (N25) [32] Hoạt tính kháng ung thư

của N25 mạnh hơn SAHA trên các dòng tế bào ung thư phổi H460, A549, H1299

và ung thư thần kinh đệm U251 (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Tác dụng kháng các tế bào ung thư in vitro của N25 (IC 50 ±SD [µM])

Một hướng thay đổi nhóm khóa hoạt động của SAHA được thực hiện bởi các nhà khoa học Italia (Maurizio Taddei và cộng sự, cuối năm 2013) bằng cách gắn các lactam-carboxyamid vào vị trí số 7 của khungsuberoylanilid đã thu được kết quả rất đáng lưu ý Việc gắn lactam vào nhóm khóa hoạt động này đã tăng

cường đáng kể tác dụng in vitro Nhiều dẫn chất được tạo ra có khả năng ức chế

HDAC các tuýp với IC50 ở mức nanomol, thấp hơn SAHA hàng trăm lần, điển hình

là 3 chất 6, 7, 8 (hình 1.11, bảng 1.3) [26]

Hình 1.11: Công thức một số dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA

Nghiên cứu tác dụng kháng tế bào ung thư (H460) cũng cho thấy các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA cho hoạt tính rất mạnh Các dẫn chất thế ở vị trí meta-, para- và γ-lactam anilid ở vị trí 7 đều có độc tính cao với IC

dưới micromol, đặc biệt các chất 6, 7 và 8 có IC50 = 0.5 µM, thấp hơn SAHA hơn

60 lần (bảng 1.3) [26]

Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC các tuýp và tác dụng kháng tế bào ung thư in

vitro của các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA

Nhìn chung, các dẫn chất SAHA chứa (S)-7-amino carboxylactam ức chế các tuýp HDAC với giá trị IC50 ở mức nano, cho thấy sự có mặt của vòng amid trên vùng khóa hoạt động có ảnh hưởng đặc biệt lên ái lực với enzym Sự biến đổi trên nhóm khóa hoạt động của SAHA này đã mang lại các chất có hoạt tính cực mạnh trên các HDAC nhóm I và II, được chứng thực thêm bằng khả năng kháng ung thư

đầy hứa hẹn trên dòng tế bào thử nghiệm Chất 6 có thể coi là một chất dẫn đường

hấp dẫn, với các biến đổi đơn giản nhưng tạo được được một chất kháng ung thư mới hướng ức chế HDAC đầy triển vọng [26]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƯỚC VỀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

Tại Việt Nam, lần đầu tiên các nghiên cứu thiết kế, tổng hợp các chất ức chế HDAC và thử hoạt tính để sàng lọc tìm ra chất có hướng tác dụng kháng tế bào ung thư đã và đang được nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược

Hà Nội thực hiện

Luận án tiến sĩ của tác giả Đào Thị Kim Oanh đã tiến hành thay thế nhân phenyl của SAHA bằng khung benzothiazol với vai trò là nhóm khóa hoạt động (hình 1.12) Kết quả khảo sát độ dài cầu nối từ 2 – 6 carbon cho thấy với cầu nối 6C cho hoạt tính tối ưu [3]

Hình 1.12: Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol, cầu nối 6 carbon

Kết quả thử độc tính tế bào in vitro cho thấy chất 9b, 9g có hoạt tính mạnh

tương đương SAHA Thậm chí trên 3 dòng tế bào SW620, AsPC-1 và NCI-H460,

chất 9g có tác dụng mạnh gần gấp đôi so với SAHA, thể hiện ở giá trị IC50 = 0,32; 0,34; 0,39 µg/ml (tương ứng với từng dòng tế bào) so với của SAHA là IC50 = 0,50; 0,69; 0,68 µg/ml Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư tiền liệt tuyến PC-3

in vivo với mô hình ghép dị chủng ở chuột trụi lông cho thấy chất 9g ức chế

49,00% sự phát triển của khối u tương đương SAHA (48,30%) (liều 30 mg/kg) Giữ nguyên cầu nối 6 carbon đã được khảo sát trong luận án trên, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội tiếp tục hướng nghiên cứu thay đổi nhóm khóa hoạt động Dãy dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl đã được thiết kế, tổng hợp và kết quả cũng cho hoạt tính rất đáng chú ý (bảng 1.4) [21]

Bảng 1.4: Các acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl và độc

SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic

Nghiên cứu này đã tổng hợp được nhiều dẫn chất chất mang khung

5-phenyl-1,3,4 thiadiazol có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh Các chất 10a-c có IC50thấp hơn SAHA 3-20 lần trên các dòng tế bào thử nghiệm, còn 10d-f, 10m-o cũng

cho hoạt tính thấp hơn hoặc tương đương SAHA

Các nghiên cứu trên cho thấy, việc giữ cầu nối 6C và thay nhân phenyl của SAHA bằng các dẫn chất vòng benzothiazol, 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol đều tạo ra được các chất có tác dụng kháng ung thư hiệu quả với hoạt lực mạnh hơn Vì vậy,

đề tài này sẽ tiếp tục hướng nghiên cứu trên, thay khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol bằng khung 5-aryl-1,3,4-thidiazol và vẫn giữ nguyên cầu nối 6 carbon

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ,

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Bao gồm:

2.1.2 Hóa chất chính

Các aldehyd:

Furan-2-carbaldehyd Pyridin-2-carbaldehyd Pyridin-3-carbaldehyd Pyridin-4-carbaldehyd Thiophen-2-carbaldehyd 5-Bromothiophen-2-carbaldehyd 5-Bromofuran-2-carbaldehyd

2.1.2 Các hóa chất và dung môi khác

2.2 THIẾT BỊ

- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy

lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (SKLM), chị thị màu vạn năng

- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn

- Nhiệt độ nóng chảy (tonc) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital)

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer – USA tại bộ môn Hóa vật liệu – Khoa hóa – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia

Hà Nội

- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ LC-MSD-Trap-SL (của Viện hóa học Việt Nam) và Agilent 6310 Ion Trap (của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR) và carbon (13C - NMR) được ghi bằng

máy Bruker AV-500 tại Trung tâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát và tổng hợp 9 chất với công thức như sau:

Hình 2.1: Các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol dự kiến tổng hợp

1

-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8hydroxyoctandiamid

1

-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid

-hydroxy-N8thiadiazol-2-yl]octandiamid

1

-hydroxy-N8thiadiazol-2-yl]octandiamid

-[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4 Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được

- Thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư

(in vitro) của các chất tổng hợp được

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Nghiên cứu Docking

Sau khi thiết kế dãy dẫn chất, để nghiên cứu sơ bộ tương tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp được với HDAC8 [12] Cấu trúc HDAC8 được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank (PDB)) (PDB ID: 1T69) Cấu trúc của HDAC8 có điểm tương đồng cao với HDAC4 với điểm DALI Z (Z-score điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và điểm r.m.s.d (root-meansquare deviation, độ lệch) = 2,1Å, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và

là HDAC của động vật có vú đầu tiên có cấu trúc không gian được nghiên cứu kỹ nhất Chúng tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng chương trình AutoDock Vina [22] Tiếp theo chúng tôi dự đoán năng lượng

của sự tương tác liên kết của các chất tổng hợp được với HDAC8 từ sự lắp ghép trên

Nghiên cứu docking được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc

Kết quả được minh họa bằng hình ảnh docking và số liệu dự đoán tương tác

2.3.2.2 Tổng hợp hóa học

 Tổng hợp 9 chất mục tiêu theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol

a) Thiosemicarbazid, ethanol, đun hồi lưu; (b) FeCl 3 12H 2 O ; c) Acid suberic monomethyl

 Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

2.3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết

Nhiệt độ nóng chảy: Đo bằng máy đo điểm chảy nhiệt điện (Electrothermal

digital)

Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm

kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế

 Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp Chấm khoảng

2l

 Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho

2.3.2.4 Xác định cấu trúc

Sử dụng các phương pháp phổ IR, MS, NMR (1

H và 13C) để xác định cấu trúc của các chất tổng hợp

2.3.2.5 Thử hoạt tính sinh học

* Thử hoạt tính ức chế HDAC:

Phân tích dựa trên Western blot, được tiến hành tại khoa Dược, ĐH Chungbuk, Hàn Quốc Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong các tế bào ung thư Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng

Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:

Các tế bào ung thư đại tràng SW620 được nuôi cấy trong môi trường RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovine serum)), gọi là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium) Tất cả tế bào được ủ ở 37 C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí Trước khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong dimethylsulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng

độ 10 mg/ml Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 1 g/ml và 10 g/ml

Phân lập histon và Western Blot

Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) được ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (tế bào không ủ với mẫu thử) Sau đó, các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch muối có bổ sung đệm phosphat Tế bào được ly giải trong dung dịch đệm [20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150 mM NaCl; 1 mM Na2EDTA; 1 mM EGTA; 1% triton; 2,5 mM Na pyrophosphat; 1 mM -glycerophosphat; 1 mM

Na3VO4; 1 g/ml leupeptin], ủ trong đá 15 phút Hỗn dịch được ly tâm và phần dịch được thu hồi để tiến hành điện di trên gel Histon được điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF Các màng được ủ qua đêm cùng kháng thể

1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (Milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ Các dải

có phản ứng dương tính được phát hiện nhờ sự phát quang đã được tăng cường Các thí nghiệm được làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập

* Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro:

Thử độc tính tế bào in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính theo phương

pháp GraphPad Prism

Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng người), MCF-7 (tế bào ung thư vú người), AsPC-1 (tế bào ung thư tụy người), PC-3 (tế bào ung thư tiền liệt tuyến người)

Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:

- Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn

tế bào trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104

đến 3,5 104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 µl Các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2 Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 µl môi trường RPMI bổ sung 10% FBS

từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µl mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%

- Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µl thuốc nhuộm MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100µl dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

- Tính kết quả: Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi

quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 NGHIÊN CỨU DOCKING

Để tìm hiểu sơ bộ về khả năng tương tác của các chất với mục tiêu phân tử

là các HDAC, chúng tôi nghiên cứu và dự đoán năng lượng liên kết các chất trong thiết kế với trung tâm hoạt động của HDAC8 Kết quả năng lượng liên kết dự đoán được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất Va-i với HDAC8

hướng thiết kế tìm kiếm các chất có tác dụng ức chế HDAC nên chúng tôi tiếp tục tiến hành tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dãy chất

Dưới đây là hình ảnh minh họa bằng mô hình tương tác của các chất với

HDAC8 của chất Va, Vg (hình 3.1)

Hình 3.1: Mô hình tương tác của Va, Vg và SAHA với HDAC8

Tổng hợp 2-(ylmethyliden)hydrazincarbothioamid (IIa) từ

furan-2-carbaldehyd (Ia) được thực hiện bằng phản ứng ngưng tụ với xúc tác là acid hữu

cơ, tiến hành theo sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2: Tổng hợp chất IIa Tiến hành phản ứng:

Cho 0,18ml (2mmol) furan-2-carbaldehyd (Ia) và 0,2180g (2,4mmol)

thiosemicarbazid vào bình cầu 50 mL Thêm 20 ml dung môi EtOH tuyệt đối và 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác Đun hồi lưu và khuấy 300 vòng/phút trong 4h

Thu sản phẩm:

Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C sau đó thêm 15

mL nước cất để tủa sản phẩm Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL nước cất Sấy khô tủa ở 600C (trong khoảng 24h)

Kết quả:

 Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng

 Hiệu suất: 90,5% (0,3059g)

 T0nc: 165-1670C

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,66

Toàn bộ sản phẩm IIa được dùng để thực hiện bước tiếp theo của quá trình tổng hợp chất Va

3.2.1.2 Tổng hợp chất IIIa

Thực hiện việc tổng hợp chất 5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIa)

từ IIa bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử Quá trình tổng hợp được thực hiện

theo sơ đồ 3.3 [33]

Sơ đồ 3.3: Tổng hợp chất IIIa Tiến hành phản ứng:

mmol) chất IIa, hòa tan bằng 20 mL dung môi EtOH tuyệt đối trong cốc có mỏ,

đun nóng khoảng 70ºC

Đổ dung dịch chất IIa từ cốc có mỏ vào bình phản ứng, tiếp tục đun hồi lưu

và khuấy 300 vòng/phút Kết thúc phản ứng sau 3 giờ

Thu sản phẩm:

Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ khoảng 400C trong 2 phút sau đó pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng nước cất Kiềm hóa hỗn hợp bằng khoảng 10 mL dung dịch NaOH 30% (kiểm tra bằng giấy quỳ)

Chiết 3 lần bằng cloroform (mỗi lần 5-10 mL), thu lớp dưới Gộp dịch chiết của 3 lần chiết lại với nước muối bão hòa Cất thu hồi dung môi của dịch chiết bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C đến khi hết dung môi, thu sản phẩm IIIa Sấy sản

(IVa) được tổng hợp từ chất IIIa bằng phản ứng acyl hóa của chất IIIa với acid

suberic monomethyl ester Quy trình tổng hợp được thực hiện như sau:

Sơ đồ 3.4: Tổng hợp chất IVa Tiến hành phản ứng:

Cho 0,1620g (1 mmol) 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) và 1mL (1 mmol) acid suberic monomethyl ester vào bình cầu 50mL Thêm 3mL dung môi DMF Hoạt hóa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi hỗn hợp trong bình phản ứng đã

hoạt hóa đủ thời gian, cho 0,1670g (1 mmol) chất IIIa vào bình phản ứng, gia nhiệt

lên 600C, khuấy 300 vòng/phút trong vòng 24h

Thu sản phẩm:

Làm lạnh bình phản ứng bằng nước đá Đổ từ từ 15 mL dung dịch HCl loãng, lạnh vào bình phản ứng, vừa đổ vừa lắc Để yên 15 phút

Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch acid HCl loãng, lạnh Sấy tủa ở

-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N 8 -hydroxyoctandiamid (Va)

được tổng hợp bằng phản ứng giữa chất IVa với hydroxylamin hydroclorid Tổng hợp chất Va được thực hiện như sau:

Sơ đồ 3.5: Tổng hợp chất Va Tiến hành phản ứng:

Cho 0,1690g (0,5 mmol) chất IVa và 0,33g (5 mmol) hydroxylamin

hydroclorid vào bình cầu 50 mL, thêm 20 mL dung môi MeOH, dùng siêu âm để tạo hỗn dịch đồng nhất Đặt bình phản ứng trong hỗn hợp nước đá và muối ăn, duy trì nhiệt độ dưới 00C, khuấy 300 vòng/phút

Hòa tan 0,40g (10mmol) NaOH trong 5 ml nước cất trong ống nghiệm và làm lạnh xuống dưới 00C trong hỗn hợp nước đá muối Đổ dung dịch NaOH vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ dưới 00C, phản ứng kết thúc sau 1giờ Theo dõi tiến