2.3.1. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát và tổng hợp 9 chất với công thức nhƣ sau:
Hình 2.1: Các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol dự kiến tổng hợp
STT Chất R Tên 1 Va N 1 -[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8- hydroxyoctandiamid. 2 Vb N 1 -[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2- yl]-N8-hydroxyoctandiamid.
3 Vc N 1 -hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid. 4 Vd N 1 -hydroxy-N8-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid. 5 Ve N 1 -[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol- 2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid. 6 Vf N 1 -hydroxy-N8-[5-(5-methylthiophen-2-yl)- 1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. 7 Vg N 1 -hydroxy-N8-[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid. 8 Vh N 1 -hydroxy-N8-[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid. 9 Vi N 1 -hydroxy-N8-[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4- thiadiazol-2-yl]octandiamid. - Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc
- Thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thƣ (in vitro) của các chất tổng hợp đƣợc
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Nghiên cứu Docking
Sau khi thiết kế dãy dẫn chất, để nghiên cứu sơ bộ tƣơng tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp đƣợc với HDAC8 [12]. Cấu trúc HDAC8 đƣợc lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank (PDB)) (PDB ID: 1T69). Cấu trúc của HDAC8 có điểm tƣơng đồng cao với HDAC4 với điểm DALI Z (Z-score điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và điểm r.m.s.d (root-meansquare deviation, độ lệch) = 2,1Å, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên có cấu trúc không gian đƣợc nghiên cứu kỹ nhất. Chúng tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng chƣơng trình AutoDock Vina [22]. Tiếp theo chúng tôi dự đoán năng lƣợng
của sự tƣơng tác liên kết của các chất tổng hợp đƣợc với HDAC8 từ sự lắp ghép trên.
Nghiên cứu docking đƣợc thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.
Kết quả đƣợc minh họa bằng hình ảnh docking và số liệu dự đoán tƣơng tác.
2.3.2.2. Tổng hợp hóa học
Tổng hợp 9 chất mục tiêu theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2.1: Tổng hợp các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol a) Thiosemicarbazid, ethanol, đun hồi lưu; (b) FeCl3.12H2O; c) Acid suberic monomethyl
ester, CDI, DMF; d) NH2OH.HCl, MeOH, NaOH.
Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng.
2.3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết
Nhiệt độ nóng chảy: Đo bằng máy đo điểm chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế.
Sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất. Mẫu thử đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp. Chấm khoảng 2l.
2.3.2.4. Xác định cấu trúc Sử dụng các phƣơng pháp phổ IR, MS, NMR (1 H và 13C) để xác định cấu trúc của các chất tổng hợp. 2.3.2.5. Thử hoạt tính sinh học * Thử hoạt tính ức chế HDAC:
Phân tích dựa trên Western blot, đƣợc tiến hành tại khoa Dƣợc, ĐH Chungbuk, Hàn Quốc. Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong các tế bào ung thƣ. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.
Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:
Các tế bào ung thƣ đại tràng SW620 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovine serum)), gọi là môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả tế bào đƣợc ủ ở 37 C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí. Trƣớc khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột đƣợc hòa tan trong dimethylsulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/ml. Các dung dịch gốc sau đó đƣợc pha loãng bằng môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 1 g/ml và 10 g/ml.
Phân lập histon và Western Blot
Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) đƣợc ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (tế bào không ủ với mẫu thử). Sau đó, các tế bào đƣợc xử lý và rửa bằng dung dịch muối có bổ sung đệm phosphat. Tế bào đƣợc ly giải trong dung dịch đệm [20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150 mM NaCl; 1 mM Na2EDTA; 1 mM EGTA; 1% triton; 2,5 mM Na pyrophosphat; 1 mM -glycerophosphat; 1 mM Na3VO4; 1 g/ml leupeptin], ủ trong đá 15 phút. Hỗn dịch đƣợc ly tâm và phần dịch đƣợc thu hồi để tiến hành điện di trên gel. Histon đƣợc điện di qua gel SDS- PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Các màng đƣợc ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (Milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ. Các dải
có phản ứng dƣơng tính đƣợc phát hiện nhờ sự phát quang đã đƣợc tăng cƣờng. Các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.
* Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro:
Thử độc tính tế bào in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chungbuk, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT và giá trị IC50 đƣợc tính theo phƣơng pháp GraphPad Prism.
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời), MCF-7 (tế bào ung thƣ vú ngƣời), AsPC-1 (tế bào ung thƣ tụy ngƣời), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời).
Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau:
- Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104
đến 3,5. 104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 µl. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20 µl môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µl mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%.
- Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µl thuốc nhuộm MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS. Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng đƣợc cho 100µl dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510 nm.
quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism.
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. NGHIÊN CỨU DOCKING
Để tìm hiểu sơ bộ về khả năng tƣơng tác của các chất với mục tiêu phân tử là các HDAC, chúng tôi nghiên cứu và dự đoán năng lƣợng liên kết các chất trong thiết kế với trung tâm hoạt động của HDAC8. Kết quả năng lƣợng liên kết dự đoán đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất Va-i với HDAC8
STT Chất R Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) 1 Va -6.9 2 Vb -7.1 3 Vc -6.9 4 Vd -6.8 5 Ve -6.6 6 Vf -6.8 7 Vg -6.9 8 Vh -6.4 9 Vi -6.4 SAHA -4.4
hƣớng thiết kế tìm kiếm các chất có tác dụng ức chế HDAC nên chúng tôi tiếp tục tiến hành tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dãy chất.
Dƣới đây là hình ảnh minh họa bằng mô hình tƣơng tác của các chất với HDAC8 của chất Va, Vg (hình 3.1).
Hình 3.1: Mô hình tương tác của Va, Vg và SAHA với HDAC8
Chú thích: SAHA (màu vàng); Va (màu xanh dương), Vg(màu vàng nâu); Ion Zn2+ (màu xám) 3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC 3.2.1. Tổng hợp chất N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8- hydroxyoctandiamid (Va) Chất Va đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.1. Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Va 3.2.1.1. Tổng hợp chất IIa
Tổng hợp 2-(furan-2-ylmethyliden)hydrazincarbothioamid (IIa) từ furan-2- carbaldehyd (Ia) đƣợc thực hiện bằng phản ứng ngƣng tụ với xúc tác là acid hữu cơ, tiến hành theo sơ đồ 3.2.
Sơ đồ 3.2: Tổng hợp chất IIa Tiến hành phản ứng:
Cho 0,18ml (2mmol) furan-2-carbaldehyd (Ia) và 0,2180g (2,4mmol) thiosemicarbazid vào bình cầu 50 mL. Thêm 20 ml dung môi EtOH tuyệt đối và 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác. Đun hồi lƣu và khuấy 300 vòng/phút trong 4h.
Thu sản phẩm:
Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C sau đó thêm 15 mL nƣớc cất để tủa sản phẩm. Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL nƣớc cất. Sấy khô tủa ở 600C (trong khoảng 24h).
Kết quả:
Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng .
Hiệu suất: 90,5% (0,3059g).
T0nc: 165-1670C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,66.
Toàn bộ sản phẩm IIa đƣợc dùng để thực hiện bƣớc tiếp theo của quá trình tổng hợp chất Va.
3.2.1.2. Tổng hợp chất IIIa
Thực hiện việc tổng hợp chất 5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIa) từ IIa bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử. Quá trình tổng hợp đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.3 [33].
Sơ đồ 3.3: Tổng hợp chất IIIa Tiến hành phản ứng:
mmol) chất IIa, hòa tan bằng 20 mL dung môi EtOH tuyệt đối trong cốc có mỏ, đun nóng khoảng 70ºC.
Đổ dung dịch chất IIa từ cốc có mỏ vào bình phản ứng, tiếp tục đun hồi lƣu và khuấy 300 vòng/phút. Kết thúc phản ứng sau 3 giờ.
Thu sản phẩm:
Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ khoảng 400C trong 2 phút sau đó pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng nƣớc cất. Kiềm hóa hỗn hợp bằng khoảng 10 mL dung dịch NaOH 30% (kiểm tra bằng giấy quỳ).
Chiết 3 lần bằng cloroform (mỗi lần 5-10 mL), thu lớp dƣới. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết lại với nƣớc muối bão hòa. Cất thu hồi dung môi của dịch chiết bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C đến khi hết dung môi, thu sản phẩm IIIa. Sấy sản phẩm ở 600C trong 4h.
Kết quả:
Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.
Hiệu suất: 72,1% (0,1204g).
T0nc: 196-1970C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,54.
3.2.1.3. Tổng hợp chất IVa
Chất methyl 8-{[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}-8-oxooctanoat
(IVa) đƣợc tổng hợp từ chất IIIa bằng phản ứng acyl hóa của chất IIIa với acid suberic monomethyl ester. Quy trình tổng hợp đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Sơ đồ 3.4: Tổng hợp chất IVa
Tiến hành phản ứng:
Cho 0,1620g (1 mmol) 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) và 1mL (1 mmol) acid suberic monomethyl ester vào bình cầu 50mL. Thêm 3mL dung môi DMF. Hoạt hóa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi hỗn hợp trong bình phản ứng đã
hoạt hóa đủ thời gian, cho 0,1670g (1 mmol) chất IIIa vào bình phản ứng, gia nhiệt lên 600C, khuấy 300 vòng/phút trong vòng 24h.
Thu sản phẩm:
Làm lạnh bình phản ứng bằng nƣớc đá. Đổ từ từ 15 mL dung dịch HCl loãng, lạnh vào bình phản ứng, vừa đổ vừa lắc. Để yên 15 phút.
Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch acid HCl loãng, lạnh. Sấy tủa ở 600C trong 24h.
Kết quả:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hơi hồng.
Hiệu suất: 57,0% (0,1921g).
T0nc: 228-2300C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,72.
3.2.1.4. Tổng hợp chất Va
Chất N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Va) đƣợc tổng hợp bằng phản ứng giữa chất IVa với hydroxylamin hydroclorid. Tổng hợp chất Va đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Sơ đồ 3.5: Tổng hợp chất Va
Tiến hành phản ứng:
Cho 0,1690g (0,5 mmol) chất IVa và 0,33g (5 mmol) hydroxylamin hydroclorid vào bình cầu 50 mL, thêm 20 mL dung môi MeOH, dùng siêu âm để tạo hỗn dịch đồng nhất. Đặt bình phản ứng trong hỗn hợp nƣớc đá và muối ăn, duy trì nhiệt độ dƣới 00C, khuấy 300 vòng/phút.
Hòa tan 0,40g (10mmol) NaOH trong 5 ml nƣớc cất trong ống nghiệm và làm lạnh xuống dƣới 00C trong hỗn hợp nƣớc đá muối. Đổ dung dịch NaOH vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ dƣới 00C, phản ứng kết thúc sau 1giờ. Theo dõi tiến
trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 và TLC, cụ thể làm nhƣ sau:
- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic đƣợc tạo ra.
- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng, kiểm tra TLC với pha động DCM : MeOH (9:1). Kết thúc phản ứng khi ester ban đầu đã hết.
Thu sản phẩm:
Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng, lạnh điều chỉnh pH về khoảng 4-5 (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng). Để qua đêm sau đó lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch HCl loãng. Sấy tủa ở 600C trong 24h.
Kết quả:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất: 51,2% (0,0865g).
Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3). T0nc: 198-2010C. 3.2.2. Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8- hydroxyoctandiamid (Vb) Chất Vb đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.6. Sơ đồ 3.6: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vb
3.2.2.1. Tổng hợp chất IIb
Tổng hợp chất IIb từ 0,3500g (2 mmol) chất 5-bromofuran-2-carbaldehyd
(Ib) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau:
Cảm quan: Sản phẩm thu đƣợc là bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất: 85,0% (0,4216g).
T0nc: 171-1740C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.
3.2.2.2. Tổng hợp chất IIIb
Tổng hợp chất 5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIb) từ 0,2480g (1 mmol) chất IIb đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.
Hiệu suất: 70,3% (0,1729g).
T0nc: 192-1940C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,53.
3.2.2.3. Tổng hợp chất IVb
Tổng hợp chất methyl 8-{[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2- yl]amino}-8-oxooctanoat (IVb) từ 0,2460g (1 mmol) chất IIIb đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng ngà.
Hiệu suất: 62,9% (0,2617g).
T0nc: 210-2120C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,77.
3.2.2.4. Tổng hợp chất Vb
Tổng hợp chất đích N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8- hydroxyoctandiamid (Vb) từ 0,2080g (0,5 mmol) chất IVb đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả của quá trình nhƣ sau:
Hiệu suất phản ứng: 52,0% (0,1084g).
T0nc: 200-2030C.
Kiểm tra bằng TLC và xác định công thức (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3). 3.2.3. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol- 2-yl]octandiamid (Vc) Chất Vc đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.7. Sơ đồ 3.7: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vc 3.2.3.1. Tổng hợp chất IIc
Tổng hợp chất IIc từ 0,2220g (2 mmol) chất 5-methylfuran-2-carbaldehyd
(Ic) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau:
Cảm quan: Sản phẩm thu đƣợc là bột kết tinh màu trắng.
Hiệu suất: 86,6% (0,3170g).
T0nc: 169-1710C.
Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.
3.2.3.2. Tổng hợp chất IIIc
Tổng hợp chất 5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIc) từ 0,1830g (1 mmol) chất IIc đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau:
Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.
Hiệu suất: 71,0% (0,1285g).
T0nc: 186-1890C.