Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3 hydroxyimino 2 oxoindolin hướng ức chế histon deacetylase

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng HDAC không chỉ liên quan đến cấu trúc của chromatin và sự biểu hiện của gen mà còn tác động đến chu trình phát triển của tế bào và tiến trình ung thư bao

HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 GS.TS Nguyễn Hải Nam

2 TS Phan Thị Phương Dung

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua Trước hết với lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành

đến GS.TS Nguyễn Hải Nam, TS Phan Thị Phương Dung và DS Đỗ Thị Mai

Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực

tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, đưa ra những hướng dẫn chính xác và kịp thời khi

tôi gặp khó khăn, tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của

Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên

- Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các bạn và các

em trong nhóm tổng hợp tại bộ môn Hoá Dược, những người đã chia sẻ buồn vui, đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân và bạn bè

đã quan tâm, động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu mà mọi người đã dành cho tôi

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Lê Xuân Thiện

1.2.3 Tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi) 6 1.2.4 Liên quan cấu trúc – tác dụng của các HDACi 8 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC

2.2.1 Tổng hợp hóa học 16 2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được 16

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton nuclear magnetic resonance)

2D-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều

(Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy) AcOH : Acid acetic

ADN : Acid desoxyribonucleic

AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người

CDK : Tác nhân ức chế kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinase)

CU : Nhóm liên kết (Connecting unit)

d : Vạch đôi trong phổ 1H-NMR (Doublet)

DMSO-d 6 : Dimethylsulfoxid deutri hóa

DSB : Gãy kép ADN (DNA double-strand breaks)

ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FBS : Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA : Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ

(U.S Food and Drug Administration)

H (%) : Hiệu suất

HAT : Histon acetyltransferase

HDAC : Histon deacetylase

HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors) HDLP : Protein giống HDAC (Histone deacetylase-like protein)

HMBC : Phổ tương tác đa liên kết dị hạt nhân

(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

HSQC : Phổ tương dị hạt nhân qua một liên kết

(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

IR : Hồng ngoại (Infrared)

J : Hằng số ghép cặp trong phổ 1H-NMR

KRIBB : Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc

(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)

m : Đa vạch trong phổ 1H-NMR (Multiplet)

MeCN : Acetonitril

MeOH : Methanol

MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NAD+ : Nicotinamid adenin dinucleotid

NST : Nhiễm sắc thể

PC-3 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người

Rf : Hệ số lưu giữ trong TLC

ROS : Gốc tự do oxy hóa (Reactive oxygen species)

RPMI : Môi trường nuôi cấy tế bào

s : Vạch đơn trong phổ 1H-NMR (Singlet)

SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG : Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)

SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng người

ZBG : Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)

δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

ν : Dao động hóa trị trong phổ IR

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester 28

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to

nc) của các dẫn chất VIa-d 29

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d 30

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d 31

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều của dẫn chất VIa 31

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-d 32

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-d 34

Bảng 3.8 Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-d 35

Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d 36

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Ảnh hưởng của HAT và HDAC lên cấu trúc của histon 2

Hình 1.2 Bảng phân loại các HDAC “kinh điển” 3

Hình 1.3 Một số ví dụ về phân loại các chất ức chế HDAC 4

Hình 1.4 Cấu trúc của SAHA gắn với protein giống HDAC (HDLP) 5

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử SAHA tương ứng với các vùng cấu trúc chung

Hình 1.6 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Bouchain 9

Hình 1.7 Khung cấu trúc vùng ZBG của các HDACi 10

Hình 1.8 Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của NCS Đào Thị Kim Oanh 11 Hình 1.9 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Chen 11

Hình 1.10 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Rossi 12

Hình 1.11 Cấu trúc của các dẫn chất hydroxamic vừa được FDA cấp phép gần đây 12 Hình 1.12 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Methot 13

Hình 1.13 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Carrasco 13

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất VIa-d trên các

dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1 43

Hình 3.2 Cấu trúc chung của dãy dẫn chất 3a-g 44

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 19

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II 19

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất IVa 20

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất Va 21

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa 22

Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác Cu(I) 37

Sơ đồ 3.7 Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một trong những bệnh hiểm nghèo và có tỉ lệ tử vong cao, làm hao tổn chi phí cũng như sức lực của bệnh nhân và xã hội Hiện nay, sự phát triển của y học hiện đại đã làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh và quá trình phát triển của nhiều loại ung thư Bên cạnh đó, với sự nỗ lực không ngừng của các nhà khoa học, rất nhiều sản phẩm điều trị ung thư đã được tìm ra Có khoảng trên 200 thuốc đã được cấp phép sử dụng trên lâm sàng và hàng trăm chất vẫn đang được nghiên cứu phát triển Một hướng nghiên cứu mới

là dựa trên mục tiêu phân tử Đây là phương pháp nghiên cứu mang lại tiềm năng rất hấp dẫn hứa hẹn tìm ra những thuốc mới có chất lượng cao hơn và một trong những mục tiêu phân tử đó là enzym histon deacetylase Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng HDAC không chỉ liên quan đến cấu trúc của chromatin và sự biểu hiện của gen mà còn tác động đến chu trình phát triển của tế bào và tiến trình ung thư bao gồm sự hình thành của các khối

u ác tính [42] Khởi đầu với SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006, và sau đó lần lượt romidepsin (Istodax®), belinostat (Beleodaq®) và panobinostat (Farydax®) cũng đã được cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư

Nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư có triển vọng GS.TS Nguyễn Hải Nam cùng các cộng sự [28] đã tổng hợp các acid hydroxamic có cấu trúc tương tự SAHA sử dụng khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol làm nhóm khoá hoạt động cho tác dụng ức chế HDAC tốt hơn nhiều lần SAHA Kết quả tương tự cũng nhận được từ nghiên cứu của tác giả Đào Thị Kim Oanh

và Trương Thanh Tùng [29] khi thay khung phenyl ở SAHA thành khung benzothiazol Nhằm tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, chúng tôi tiến hành tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin với cầu nối là dẫn chất của propenamid và tiến hành đề tài

“Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung hydroxyimino-2-oxoindolin hướng ức chế histon deacetylase” với 2 mục tiêu:

3-1 Tổng hợp (2E)-N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)

methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid và 3 dẫn chất

2 Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)

Cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) là yếu tố quan trọng để xác định xem một gen cụ thể có được biểu hiện hay không Tất cả hệ gen của người đều được “gói” trong các NST, là những phức hợp đại phân tử cấu tạo từ 3 thành phần chính là: ADN, histon và protein không histon Nucleosom là đơn vị cấu trúc cơ bản của NST bao gồm một đoạn ADN (146 cặp nucleotid) quấn xung quanh một protein octomer được cấu tạo từ 4 hợp phần histon gồm 1 tetrame H3-H4 và 2 dime H2A-H2B [16, 26] Phần đuôi histon, đặc biệt ở H3 và H4, là đích của nhiều loại biến đổi sau dịch mã như acetyl hóa, alkyl hóa

và phosphoryl hóa Sự tác động đồng thời của các biến đổi lên phần đuôi histon chính bằng histon acetyltransferase (HAT), histon deacetylase (HDAC), methyltransferase

và các kinase đã dẫn đến cơ chế điều hòa biểu hiện của gen [16]

Hình 1.1 Ảnh hưởng của HAT và HDAC lên cấu trúc của histon [21]

Histon acetyltransferase là nhóm các enzym có chức năng acetyl hóa nhóm

ε-NH2 của lysin ở đầu N tận histon tương ứng với hoạt động sửa chữa và phiên mã của nucleosom [16] Hầu hết các HAT đã được tìm thấy ở người đều gắn vào NST thông qua tương tác với một đoạn liên tục, đặc hiệu của các protein gắn với ADN và hoạt động như là đồng tác nhân kích thích quá trình phiên mã [16]

Histon deacetylase là các enzym có chức năng đối lập với HAT, chúng loại bỏ nhóm acetyl từ lysin đã được acetyl hóa nằm ở đầu N của histon, qua đó nhiễm sắc thể đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã

1.1.2 Phân loại các HDAC

Cho đến nay đã xác định được 18 loại HDAC có ở người và được chia thành 4 nhóm [7, 10, 27]:

- Nhóm I: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-8

- Nhóm II: HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-9, HDAC-10

- Nhóm III: Sirtuin 1-7

- Nhóm IV: HDAC-11

Trong đó, nhóm I, II và IV được gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc Zn2+; nhóm còn lại (nhóm III) là HDAC phụ thuộc NAD+

Hình 1.2 Bảng phân loại các HDAC “kinh điển”

Ghi chú: Vùng màu xanh là vùng hoạt động của HDAC, các số ở cuối các vùng hoạt động chỉ ra

số lượng amino acid của mỗi HDAC [10, 13]

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

Người ta nhận thấy rằng có mối tương quan rõ rệt giữa sự biểu hiện quá mức hoạt động của HDAC, sự deacetyl hóa ở đuôi histon và cấu trúc nhiễm sắc thể dẫn đến sự phiên mã gen bất thường, đây là một trong những sự kiện cơ bản dẫn đến xuất hiện và tiến triển ung thư Từ đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chọn hướng

nghiên cứu dựa trên mục tiêu phân tử là HDAC để tìm ra phương pháp kiểm soát căn bệnh này, trong đó không thể thiếu sự góp mặt của các chất ức chế HDAC

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Năm 1990, Yosida và cộng sự [7] lần đầu tiên đã phát hiện ra tác dụng ức chế HDAC của trichostatin A (TSA) - một dẫn chất nhóm acid hydroxamic Hiện tại, TSA vẫn là một trong số rất ít các chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh nhất đã từng được phát hiện cho đến nay Tuy nhiên, do chi phí sản xuất TSA quá cao và hiệu suất tổng hợp thấp nên đã thôi thúc các nhà khoa học tìm kiếm các chất ức chế HDAC thay thế khác có nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc tổng hợp Cho đến nay, FDA đã chính thức cấp phép lưu hành trên thị trường cho 4 thuốc có tác dụng ức chế HDAC sử dụng trong điều trị ung thư gồm: SAHA (2006), romidepsin (2009), belinostat (2014) và panobinostat (2015)

Các chất ức chế HDAC có thể được chia thành 6 nhóm dựa trên cấu trúc hóa học gồm: các acid hydroxamic, các acid carboxylic mạch ngắn, các aminobenzamid, các peptid vòng, các epoxyceton và các phân tử lai [32, 41]

Hình 1.3 Một số ví dụ về phân loại các chất ức chế HDAC

Mỗi nhóm chất đều có những ưu, nhược điểm riêng, ví dụ như nhóm các acid hydroxamic nhanh bị thải trừ và tác dụng ức chế HDAC không chọn lọc, tuy nhiên lại có hoạt tính cao hơn (cỡ nmol) và cấu trúc đơn giản hơn [7, 17]

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC “kinh điển” thường gồm 3 phần chính [9]:

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (ZBG): nhóm này tương tác với ion Zn2+ ở trung tâm hoạt động của HDAC, có thể là acid hydroxamic hoặc các nhóm không phải dẫn chất của acid hydroxamic như benzamid, thiol, các ceton…

- Vùng cầu nối (linker): có chức năng liên kết nhóm kết thúc gắn Zn2+ với nhóm nhận diện bề mặt; vùng này thường là các nhóm sơ nước như các mạch hydrocarbon thẳng hay vòng, có thể no hoặc không no, có khả năng tương tác với các thành phần nằm trên kênh enzym thông qua tương tác Van der Waals

- Nhóm nhận diện bề mặt (nhóm khóa hoạt động) (SRG): thường là vòng aryl hoặc một số vòng khác, có chức năng tham gia nhận diện bề mặt amino acid của enzym Theo một số tác giả, các chất ức chế HDAC thuộc nhóm acid hydroxamic còn có thể có thêm nhóm liên kết (connecting unit) có nhiệm vụ kết nối nhóm khóa hoạt động với vùng cầu nối sơ nước như nhóm amid ở SAHA [10]

Hình 1.4 Cấu trúc của SAHA gắn với protein giống HDAC (HDLP)[23]

1.2.3 Tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi)

1.2.3.1 HDACi tác động lên cơ chế gây đột biến và sửa chữa ADN

HDACi làm giảm hoạt động của HDAC, qua đó tăng cường sự acetyl hóa histon, dẫn đến thay đổi cấu trúc NST, ADN trở nên dễ phơi nhiễm với các yếu tố nguy cơ như tia UV, các loại bức xạ, thuốc độc tế bào và các gốc tự do oxy hóa (ROS) dẫn đến

sự gãy kép ADN (DSB) HDACi tham gia điều hòa xuống sự biểu hiện của các gen mã hóa protein sửa chữa ADN Tích lũy DSB gây nên thay đổi biểu hiện gen, dẫn đến sự chết tế bào theo chương trình [24]

1.2.3.2 HDACi làm thay đổi biểu hiện gen

Ở tế bào ARP-1, SAHA làm giảm đáng kể hoạt động của HDAC-1, Myc và sự tích lũy ARN polymerase II trong phức hợp protein có liên quan đến vùng khởi động của gen p21 (một tác nhân ức chế kinase phụ thuộc cyclin - CDK) HDACi có thể ức chế biểu hiện gen một cách gián tiếp thông qua STAT5, làm giảm hoạt động của androgen receptor trong quá trình phiên mã Các HDACi như SAHA làm thay đổi phiên mã miARN ở tế bào bất thường, những miARN này có hướng đích liên quan đến sự hình thành mạch, sự chết tế bào theo chương trình, biến đổi NST của tế bào

Số lượng gen thay đổi biểu hiện tăng lên cùng với thời gian cũng như nồng độ HDACi được sử dụng [24]

1.2.3.3 HDACi làm ngừng sự phát triển tế bào

SAHA làm ngừng chu trình tế bào tại pha G1 ngay ở nồng độ thấp và tại cả G1

và G2/M khi sử dụng với nồng độ cao Trên tế bào phơi nhiễm với HDACi, sự gia tăng mức độ hoạt động của các tác nhân ức chế CDK và giảm số lượng cyclin gây nên sự dephosphoryl hóa của Rb, khóa hoạt động của E2F trong quá trình phiên mã

ở pha G1 và tại điểm chuyển giao G1/S HDACi có thể tiêu diệt cả tế bào bất thường tăng sinh và không tăng sinh, điều này trái ngược với các thuốc hóa trị liệu khác chỉ

có tác dụng lên tế bào bất thường tăng sinh [24]

1.2.3.4 HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình

HDACi thúc đẩy chương trình chết trên tế bào bất thường theo cả con đường nội sinh và ngoại sinh Con đường ngoại sinh bắt đầu bằng cách gắn các receptor gây

chết như Fas, TNFR-1, TRAIL, DR-3, DR-4, DR-5, DR-6 với các phối tử của chúng dẫn đến hoạt hóa capase-8 và 10 HDACi có thể điều hòa lên hoạt động của receptor gây chết và phối tử ở tế bào bất thường HDACi ức chế con đường phụ thuộc ubiquitin gây ra sự chết theo chương trình có liên quan đến TNF

Con đường nội sinh được thực hiện gián tiếp qua sự phá vỡ màng ty thể, giải phóng cytochrom c, AIF và Smac dẫn đến hoạt hóa capase HDACi thúc đẩy sự phân tách tiền quá trình chết (pro-apotic) của Bid, làm vỡ màng ty thể ở tế bào bất thường HDACi điều hòa lên hoạt động các protein tiền chết như Bim, Bmf, Bax, Bik đồng thời làm giảm hoạt động của các protein chống lại sự chết tế bào như Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 và các gen “sống còn” như XIAP; HDACi cũng làm giảm hoạt động của survivin Các HDACi như SAHA hay butyrat đẩy nhanh sự tự thực tế bào bởi các không bào tiêu hóa trong tế bào chất của tế bào bất thường [24]

1.2.3.5 HDACi cản trở quá trình phân bào

Ở tế bào bất thường phơi nhiễm TSA, histon của sợi nhiễm sắc ở trạng thái acetyl hóa làm sai lệch cấu trúc và chức năng của tâm động và làm mất khả năng gắn với protein liên kết của vùng gần tâm động Sự acetyl hóa histon đồng thời cũng ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa, làm mất chức năng của protein kiểm tra việc bám vào thoi vô sắc của NST như BubR1, hBUB1, CENP-F và CENNP-E gây nên sự ngừng tạm thời tại kì giữa và bất thường trong phân bào gây ra sự chết tế bào [24]

1.2.3.6 HDACi liên quan đến ROS và con đường oxy hóa-khử thay thế

Dạng khử của thioredoxin (Trx) đóng vai trò dọn dẹp chống lại tác nhân oxy hóa ROS SAHA điều hòa lên sự biểu hiện của TBP-2 (tác nhân ức chế hoạt động của dạng khử Trx) chỉ ở tế bào bất thường Ức chế Trx còn làm hoạt hóa ASK1- hoạt hóa chương trình chết bằng cách tác động vào sự dẫn truyền tín hiệu của SET1-JNK và MKK3/MKK6-p38 và tăng cường sự biểu hiện của protein tiền chết Bim [24]

1.2.3.7 HDACi ức chế hình thành mạch máu nuôi khối u

Các khối u rắn tồn tại phụ thuộc vào sự hình thành mạch Trên động vật thí nghiệm, HDACi ức chế sự hình thành mạch thông qua kìm hãm hoạt động của HIF-1α và VEGF Ở điều kiện thiếu oxy, HDAC-1, 2, 3 được tăng cường biểu hiện ở tế

bào bất thường làm giảm hoạt động của pVHL, dẫn đến tăng biểu hiện của tác nhân kích hoạt quá trình sinh mạch HIF-1α HDACi thúc đẩy sự phân hủy HIF-1α bằng một

cơ chế phụ thuộc VHL [24]

1.2.3.8 HDACi chống di căn

HDACi điều hòa lên hoạt động của gen kìm hãm sự di căn như Kangai (KAII), RhoB (1 gen nhóm Ras), RECK và TIMP-1 Các gen hoạt hóa cho sự di căn như NMP, integrin-α5 và protein collagen được điều hòa xuống bởi HDACi Những khám phá này cho thấy HDACi có thể có hiệu quả trong việc giảm khả năng di căn từ khối u ban đầu [24]

1.2.3.9 HDACi làm giảm chuyển hóa glucose

HDACi có hướng tác dụng lên hoạt tính enzym của yếu tố trung gian vận chuyển glucose GLUT1 và hexokinase I, ức chế chọn lọc khả năng sử dụng glucose ở các tế bào bất thường, góp phần dẫn đến ngừng chu trình tế bào và chết theo chương trình [24]

1.2.4 Liên quan cấu trúc – tác dụng của các HDACi

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử SAHA tương ứng với các vùng cấu trúc chung

của các HDACi

1.2.4.1 Ảnh hưởng của nhóm khóa hoạt động

- Những phân tử không có nhóm khóa hoạt động kị nước cho hoạt tính yếu [36]

- Theo nhóm nghiên cứu của Juvale [18], nhóm phenyl ở vùng khóa hoạt động

có lợi cho hoạt tính, khi thêm 1 nhóm thế trên cầu nối ở vị trí sát với nhóm phenyl cũng làm tăng hoạt tính nhưng nếu gắn thêm bất kì nhóm thế nào vào sát nhóm acid hydroxamic sẽ không có lợi cho hoạt tính Các nhóm chức và cấu trúc có mật độ electron cao như nhóm phenyl ở vùng khóa hoạt động làm tăng hoạt tính Từ sơ đồ

phân bố sự thân nước - thân dầu cho thấy có một nhóm thân nước ở gần vòng thơm, như vậy tính thân nước của nhóm khóa hoạt động là quan trọng đối với hoạt tính

- Năm 2005, Guo và các cộng sự [11] đã khảo sát hoạt tính ức chế HDAC-1 của một dãy các dẫn chất indol amid, nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm indol amid nằm ở vùng miệng túi, liên kết với protein bề mặt qua liên kết hydro giữa –COO- của Asp99

và nhóm -NH- amid của phối tử và của nhân indol Nhóm thế cho liên kết hydro ở vị trí gần vòng indol, như nhóm –NH- amid, làm tăng hoạt tính ức chế HDAC Khi đưa nhóm thế cồng kềnh vào vị trí số 4 trên vòng indol, chẳng hạn như nhóm -OCH3 cho hoạt tính tốt hơn so với khi không có nhóm thế, có thể do đã xảy ra một tương tác kị nước nào đó của vị trí này với enzym Điện tích âm ở vị trí số 4 và 5 có lợi cho sự gắn của phối tử, như vậy gắn nhóm thế hút electron vào các vị trí này sẽ làm tăng hoạt tính

1.2.4.2 Ảnh hưởng của vùng cầu nối

- Vùng hoạt động của HDAC có dạng ống kị nước, hẹp, độ dài 4-6 C, ở đáy ống

là ion Zn2+, vì vậy các HDACi trong phân tử nếu có vùng cầu nối có độ dài 4-6 C sẽ cho hoạt tính ức chế HDAC tốt hơn [12]

- Tương tác kị nước và tương tác π-π với vùng cấu trúc chứa Phe-141/Phe-198

và Tyr-91/Glu-92 đóng vai trò quan trọng trọng việc gắn phối tử vào enzym để tối ưu hóa khả năng gắn của nhóm hydroxamat với Zn2+ Nhóm thế isopropyl có thể làm

thuận lợi cho tương tác với vùng kị nước này [22]

- Theo Bouchain, vòng thơm làm tăng hoạt tính bởi vì có lẽ đã xảy ra tương tác

với một vài vị trí của receptor [15]

Hình 1.6 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Bouchain

- Cấu trúc túi vùng hoạt động của các HDAC trong nhóm HDAC I có sự khác biệt quá nhỏ để có thể thu được tác dụng ức chế chọn lọc Tuy nhiên, có thể tạo ra tác dụng chọn lọc giữa HDAC-1, HDAC-3 và HDAC-8 bằng cách khai thác một số khác biệt về hình dạng và cấu trúc quanh miệng túi, nhưng cách này không hiệu quả trong trường hợp giữa hai HDAC-1 và -2 [40]

1.2.4.3 Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn kẽm

Hình 1.7 Khung cấu trúc vùng ZBG của các HDACi

Ghi chú:

A: mang đôi electron không liên kết, để liên kết với ion Zn 2+ hoặc để

nhận liên kết hydro từ nhóm OH của Tyr297 (HDLP)

B: liên kết ZBG với cầu nối, vì vậy phải tạo ít nhất 3 liên kết

C: cho liên kết hydro với His132 (HDLP)

D: nhóm cho proton để proton hóa His131 (HDLP), hình thành liên kết

tĩnh điện với His 131 và liên kết chặt với ion Zn 2+

L: cầu nối

- Dạng proton hóa của acid hydroxamic ức chế các HDAC I tốt hơn so với dạng không proton hóa của hydroxamat vì tạo được nhiều liên kết hydro hơn [19]

1.2.4.4 Một số yếu tố khác ảnh hưởng tới hoạt tính của các HDACi

- Năng lượng solvat hóa của phân tử tăng, hoạt tính ức chế HDAC giảm [43]

- Phân tử thân dầu có lợi cho hoạt tính nhưng nếu kích thước phân tử quá lớn sẽ làm giảm đi hoạt tính [38] Những phân tử quá thân dầu hay những phân tử chứa nhiều vòng 6 cạnh thì hoạt tính sẽ không quá cao, do ảnh hưởng của hiệu ứng không gian [4] Khả năng thân nước-thân dầu ở mức cân bằng có lợi cho hoạt tính ức chế HDAC-6 [20]

- Khi phân tử có xu hướng cầu hóa sẽ làm thu nhỏ vùng cho dung môi thâm nhập

do các nhóm thân nước bị che khuất Cấu trúc phân tử càng có xu hướng “mở”, hoạt tính ức chế HDAC sẽ tăng [39]

- Phân tử có dạng gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho hoạt tính ức chế chọn lọc HD1-A (tương đồng HDAC II); khung phân tử có dạng thẳng sẽ cho ức chế chọn lọc trên HD1-B (tương đồng HDAC I) [30]

1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1 Thay đổi nhóm khóa hoạt động

Năm 2011, NCS Đào Thị Kim Oanh cùng các cộng sự [1] đã nghiên cứu dãy dẫn chất mang nhóm khóa hoạt động là benzothiazol với chiều dài cầu nối là từ 2-6

C mạch thẳng Kết quả nghiên cứu cho thấy việc thay nhân phenyl của SAHA bằng khung benzothiazol cho nhiều chất có tác dụng tốt, thậm chí còn mạnh hơn SAHA, đặc biệt là khi cầu nối là 6C

Hình 1.8 Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của

NCS Đào Thị Kim Oanh

Trên thế giới, nhóm nghiên cứu của Chen, năm 2008, [6] đã đưa thêm vòng 1,2,3-triazol vào nhóm nhận diện bề mặt, các chất này đều cho tác dụng tốt và chọn

lọc hơn SAHA, ví dụ như chất 3 dưới đây cho hoạt tính mạnh gấp 4 lần SAHA

Hình 1.9 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Chen

Năm 2011, Rossi và các cộng sự [33] đã tổng hợp các dẫn chất thế ở vị trí N của 4-alkylpiperazin và 4-alkylpiperidin, kết quả thu được nhiều dẫn chất có tác dụng

ức chế HDAC với IC50 xấp xỉ 0,1 µM (xem hình 1.10)

Hình 1.10 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Rossi

1.3.2 Thay đổi cầu nối

Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều thay đổi trên độ dài cầu nối, thay đổi nhóm thế, hay thay mạch hydrocarbon bão hòa bằng các mạch chứa nối đôi hoặc vòng thơm nhằm đạt được chất ức chế hiệu quả và chọn lọc hơn

Trong nước, với việc nghiên cứu sử dụng nhóm khóa hoạt động benzothiazol của mình, tác giả Đào Thị Kim Oanh đã thay đổi độ dài của cầu nối (từ 2 đến 6C) để tìm ra khoảng cách tối ưu Kết quả nghiên cứu cho thấy cầu nối 6C có tác dụng tốt hơn hẳn trên HDAC-3,4 và ức chế 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trung bình

là 0,81 µg/ml [1, 29]

Thời gian gần đây, FDA đã cấp phép lưu hành cho belinostat (2014) và panobinostat (2015) với chỉ định điều trị ung thư, hai thuốc này sử dụng cầu nối cinnamoyl trong cấu trúc của mình

Hình 1.11 Cấu trúc của các dẫn chất hydroxamic vừa được FDA cấp phép gần đây

(A) Belinostat; (B) Panobinostat

Hình 1.12 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Methot

Năm 2011, Carrasco và các cộng sự [5] đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất hydroxamat của acid folic với hy vọng sẽ cho hoạt tính ức chế đồng thời lên HDAC

và DHFR, đây là hai enzym liên quan đến sự phát triển của khối u Qua thử hoạt tính sinh học Carrasco nhận thấy cấu trúc này cho hoạt tính ức chế đồng thời HDAC và DHFR như dự kiến

Hình 1.13 Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Carrasco

Từ những kết quả nghiên cứu rất hấp dẫn và phong phú trên thế giới cũng như trong nước đã tạo cơ sở cho khóa luận phát triển theo hướng nghiên cứu: giữ nguyên cấu trúc cầu nối cinnamoyl như ở hai thuốc mới được FDA phê duyệt lưu hành (belinostat và panobinostat) nhưng thay đổi nhóm khóa hoạt động Chúng tôi đã lựa chọn cấu trúc nhóm khóa hoạt động là khung 3-oximisatin gắn với vòng 1,2,3-triazol với các lý do như sau:

- Isatin và các dẫn chất mang khung isatin đã được công bố trong nhiều công trình nghiên cứu trước đây, là những chất có nhiều tác dụng sinh học, trong đó có hoạt tính chống ung thư [34, 37]

- Vòng 1,2,3-triazol có thể coi như là một nhóm liên kết (CU) được đưa vào cấu trúc nhằm tăng khả năng tương tác giữa nhóm khóa hoạt động với các aminoacid bề mặt gần lối vào túi thân dầu của HDAC, đồng thời cải thiện dược động học và tăng tính chọn lọc với đích cụ thể, hạn chế độc tính của thuốc hơn so với khi sử dụng nhóm amid hay ceton [6]

Kết quả nghiên cứu cụ thể được trình bày trong các chương tiếp theo của khóa luận

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Các dung môi, hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thực nghiệm là loại dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma-Aldrich hoặc Merck Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

Và các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF),

acetonitril (MeCN), dichloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH), aceton, ethyl acetat, K2CO3, KI, NaCl, Na2SO4, NaOH, HCl, CuI, FeCl3…

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC), sinh hàn hồi lưu

- Bản mỏng silicagel Merck 70 – 230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng

- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm

- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

- Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM để ghi phổ MS, đặt tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC

và HSQC, đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

(2E)-N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1-yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-(2E)-N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VId)

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Xác định cấu trúc của các chất vừa tổng hợp được

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

và xác định nhiệt độ nóng chảy

2.3.1.3 Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR);

chất VIa có thêm các phổ 2D-NMR như HMBC và HSQC

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Cary 660 FTIR với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1

- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(-)-MS, dung môi methanol

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz

Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K

- Các phổ 2D-NMR như HMBC và HSQC sử dụng các kĩ thuật xử lý tín hiệu kết hợp phổ 1H-NMR và 13C-NMR thu được trước đó để tái khẳng định cấu trúc của dẫn chất bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

Định lượng nồng độ HDAC-2 bị ức chế bằng phương pháp huỳnh quang Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được được thử tại Khoa Dược - Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Sử dụng bộ KIT định lượng HDAC có phát huỳnh quang (Fluoregenic HDAC Assay Kit - BPS Bioscience) Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT thử nghiệm

Kết quả độ hấp thụ được đọc trên máy đo hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) tại bước sóng kích thích 360 nm, bước sóng phát quang 450 nm

2.3.2.2 Thử độc tính tế bào:

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được tiến

hành tại Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Dòng tế bào thử nghiệm: PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt), SW620 (tế bào ung thư đại tràng) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ) Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Thử độc tính tế bào của các theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) [35]

* Tính kết quả: Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp 4 chất VIa-d trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ quy

trình chung như sau:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

Tác nhân và điều kiện: i) NaN 3 , MeOH, 6 h; ii) Propagyl bromid, K 2 CO 3 , KI, DMF, 50ºC, 3-4 h;

iii) CuI, MeCN, 8 h; iv) NH 2 OH.HCl, NaOH, MeOH/H 2 O, 0-5ºC, 30 phút

3.1.1.1 Tổng hợp chất methyl (E)-3-(4-(azidomethyl)phenyl)acrylat (II)

Hợp chất II được tổng hợp từ methyl (E)-3-(4-(bromomethyl)phenyl)acrylat (I)

bằng phản ứng thế nucleophin với tác nhân NaN3 theo sơ đồ 3.2:

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II

 Tiến hành phản ứng:

- Hòa tan 1,53 g (6,0 mmol) chất I và 0,59 g (9,0 mmol) NaN3 vào 20,0 ml MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml

- Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 6 h

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM

 Xử lý phản ứng:

- Cất quay chân không ở 60ºC loại dung môi

- Phân tán cắn thu được vào 30 ml nước cất

- Chiết thu sản phẩm bằng dung môi DCM (4 lần, mỗi lần 30 ml), gộp chung dịch của các lần chiết

- Rửa dịch chiết bằng NaCl bão hòa và làm khan bằng Na2SO4 khan

- Cất quay loại dung môi

- Bảo quản sản phẩm trong ngăn mát tủ lạnh ở 0-5ºC, đậy nút kín

(2E)-N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-2-a Tổng hợp chất IVa:

Tổng hợp chất 1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVa) từ nguyên liệu isatin (IIIa) qua phản ứng alkyl hóa với propagyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI theo sơ đồ 3.3 sau:

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất IVa

 Tiến hành phản ứng:

- Hòa tan 0,29 g (2,0 mmol) chất IIIa vào 1,5 ml DMF khan trong bình cầu

sạch đáy tròn dung tích 50 ml; thêm 0,28 g (2,0 mmol) K2CO3

- Khuấy hỗn hợp trong bình ở 50ºC trong 1 h đến khi toàn bộ khối phản ứng đổi màu sẫm hoàn toàn

- Thêm 0,33 g (2,0 mmol) KI và 0,29 g (2,4 mmol) propagyl bromid vào bình phản ứng

- Tiếp tục tiến hành phản ứng trong 3 h vẫn ở 50ºC

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 100:1

 Xử lý phản ứng:

- Làm lạnh bình phản ứng

- Trung tính hóa hỗn hợp phản ứng bằng HCl 5% lạnh

- Thêm vào 40 ml nước cất lạnh để tạo tủa

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC

Điều chế chất methyl

(E)-3-(4-((4-((2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (Va) từ chất IVa thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI Phản ứng theo sơ đồ 3.4 sau:

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất Va

 Tiến hành phản ứng:

- Hòa tan 0,19 g (1,0 mmol) chất IVa, 0,22 g (1,0 mmol) chất II và 0,19 g

(1,0 mmol) CuI vào 4,0 ml MeCN trong bình cầu sạch dung tích 50 ml

- Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 8 h

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 10:1

 Xử lý phản ứng:

- Cất quay chân không ở 60ºC loại dung môi MeCN

- Phân tán cắn vào 30 ml DCM, gia nhiệt đến 60ºC để hòa tan hết chất Va và

còn CuI không tan lắng ở đáy bình

- Lọc loại bỏ CuI

- Cất quay loại dung môi thu hỗn hợp 2 chất Va và II (có thể còn dư)

- Hòa tan cắn vào 1 lượng MeCN tối thiểu, thêm từ từ nước cất vào đến khi thấy tủa không tăng nữa thì dừng Để lạnh để ổn định tủa

- Gạn, lọc lấy tủa, rửa tủa với nhiều lần nước cất để loại chất II

- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC

methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VIa) được tổng hợp qua

phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Va và hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ phản

- Khuấy phân tán hỗn hợp trong bình phản ứng

- Chuẩn bị dung dịch NaOH bão hòa trong nước, đã được làm lạnh Chuyển

từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng đến pH = 12

- Tiếp tục cho phản ứng thêm 30 phút ở -5ºC

- Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và TLC, tiến trình thực hiện như sau:

+ Lấy 0,05 ml dịch từ bình phản ứng lên khay sứ, acid hóa bằng dung dịch HCl 5% Nhỏ 1 giọt thuốc thử FeCl3 5% vào hỗn hợp trên, nếu thấy xuất hiện màu

đỏ vang chứng tỏ đã có sản phẩm acid hydroxamic

+ Acid hóa 0,05 ml dịch lấy từ bình phản ứng bằng dung dịch HCl loãng 5% trong vial, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm Đưa pha dung môi hữu cơ lên bản mỏng Tiến hành TLC với pha động DCM:MeOH = 5:2 Phản ứng kết thúc khi

thấy vết ester Va đã mất đi hoàn toàn

 Xử lý phản ứng:

- Trung tính hóa hỗn hợp trong bình phản ứng bằng HCl lạnh 5%

- Thêm vào 20 ml nước cất lạnh

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Tinh chế sản phẩm:

+ Kết tinh lại bằng hệ MeOH - H2O: Hòa tan sản phẩm thu được trong lượng MeOH tối thiểu Nhỏ từ từ nước cất vào cho đến khi bắt đầu xuất hiện tủa mịn và ổn định Để lạnh ở 0-5ºC trong 48 h

+ Lọc tủa; sấy ở 60ºC

 Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng

- Hiệu suất: 52,6% (0,11 g)

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất 1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyacrylamide (VIb)

(2E)-3-(4-((4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-Dẫn chất VIb được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ đồ 3.1

a Tổng hợp chất IVb:

Tổng hợp chất 5-fluoro-1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVb) từ nguyên liệu 5-fluoroisatin (IIIb) bằng phản ứng alkyl hóa với propagyl bromid có mặt xúc tác là

K2CO3 và KI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa, sử dụng 0,33 g (2,0 mmol) chất IIIb

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất IVa

Điều chế chất methyl

(E)-3-(4-((4-((5-fluoro-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (Vb) từ chất IVb thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,20 g (1,0 mmol) chất IVb

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va

(2E)-3-(4-((4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyacrylamid (VIb) được tổng hợp qua

phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Vb và hydroxylamin hydroclorid

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,21 g (0,5 mmol) chất Vb

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ

dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O

 Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng

- Hiệu suất: 55,0% (0,12 g)

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VIc)

N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-5-methyl-2-Dẫn chất VIc được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ

Điều chế chất methyl

(E)-3-(4-((4-((5-methyl-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (Vc) từ chất IVc thông qua phản ứng

Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,20 g (1,0 mmol) chất IVc

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va

 Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn, màu da cam

(2E)-N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VIc) được tổng hợp

qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Vc và hydroxylamin hydroclorid

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,21 g (0,5 mmol) chất Vc

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ

dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O

 Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng

- Hiệu suất: 51,0% (0,11 g)

- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VId)

N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-Dẫn chất VId được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ đồ

Điều chế chất methyl

(E)-3-(4-((4-((5-methoxy-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (Vd) từ chất IVd thông qua phản ứng

Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va, sử dụng 0,22 g (1,0 mmol) chất IVd

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất Va

-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VId) được tổng hợp

qua phản ứng tạo hydroxamic giữa chất Vd và hydroxylamin hydroclorid

 Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,22 g (0,5 mmol) chất Vd

 Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ

dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

 Hiệu suất tổng hợp và chỉ số lý hóa của các dẫn chất VIa-d được trình bày

VIb 5-F C21H17FN6O4 436,1 MeOH - H2O Vàng 55,0

VIc 5-CH 3 C22H20N6O4 432,2 MeOH - H2O Vàng 51,0

VId 5-OCH 3 C22H20N6O5 448,4 MeOH - H2O Nâu 53,6

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các sản phẩm sau khi được tổng hợp, xử lý và tinh chế bao gồm các dẫn chất

VIa-d và các sản phẩm trung gian II, IVa-d, Va-d đều được kiểm tra độ tinh khiết

bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy Các kết quả về Rf và tonc của

các dẫn chất VIa-d được trình bày cụ thể ở bảng 3.2

 Sắc ký lớp mỏng:

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck

70-230 mesh, với 4 hệ dung môi khác nhau là DCM, DCM:MeOH (100:1 và 10:1), DCM:MeOH:AcOH (100:40:1), tiến hành quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng

254 nm Kết quả TLC cho thấy các sản phẩm đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ

 Đo nhiệt độ nóng chảy:

Các dẫn chất VIa-d sau khi được kết tinh lại đều ở thể rắn, có thể tiến hành xác

định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Kết quả được

trình bày trong bảng 3.2, nhận thấy các dẫn chất VIa-d đều có nhiệt độ nóng chảy

xác định (khoảng dao động nhiệt độ hẹp, từ 1-2oC)

Bảng 3.2 Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy (t o

định được các dẫn chất VIa-d là tinh khiết và có thể sử dụng để thực hiện các bước

xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR

3.1.3 Xác định cấu trúc

Các phương pháp ghi phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ cacbon (13C-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HMBC và HSQC được sử dụng để khẳng định cấu trúc

của các dẫn chất VIa-d đã tổng hợp được Kết quả ghi phổ cụ thể của các chất được

trình bày trong phần phân tích phổ và phụ lục

3.1.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR):

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các dẫn chất VIa-d được trình bày trong

bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d

Ghi chú: ν là dao động hóa trị

Nhận xét: Dựa trên phổ đồ (phụ lục 1, 2, 3 và 4) và một số tài liệu tham khảo

[2, 3], có thể sơ bộ nhận ra sự hiện diện của các nhóm chức thông qua vị trí, cường

độ, hình dạng pic, ví dụ như O-H, N-H và C=O của acid hydroxamic; C=O của nhóm carbonyl; N-O và O-H của oxim

Tuy nhiên các phổ IR này chưa thể cung cấp đầy đủ dữ liệu để khẳng định cấu

trúc của các dẫn chất VIa-d

3.1.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS):

Kết quả phân tích phổ khối lượng của các dẫn chất VIa-d được trình bày trong

bảng 3.4 (trang sau)