Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3 hydroxyimino 2 oxoindolin hướng ức chế histon deacetylase

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  LÊ XUÂN THIỆN MÃ SINH VIÊN: 1101488 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-HYDROXYIMINO-2-OXOINDOLIN HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  LÊ XUÂN THIỆN MÃ SINH VIÊN: 1101488 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-HYDROXYIMINO-2-OXOINDOLIN HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: GS.TS Nguyễn Hải Nam TS Phan Thị Phương Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận lúc xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến người dạy dỗ, hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Trước hết với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến GS.TS Nguyễn Hải Nam, TS Phan Thị Phương Dung DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo, đưa hướng dẫn xác kịp thời gặp khó khăn, tạo điều kiện tốt giúp hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ tình cảm thân thương đến anh chị, bạn em nhóm tổng hợp môn Hoá Dược, người chia sẻ buồn vui, đồng hành suốt thời gian nghiên cứu Cuối xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân bạn bè quan tâm, động viên khích lệ suốt trình học tập nghiên cứu Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu mà người dành cho Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Lê Xuân Thiện MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm histon deacetylase (HDAC) 1.1.2 Phân loại HDAC 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.2 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.2.3 Tác dụng chất ức chế HDAC (HDACi) 1.2.4 Liên quan cấu trúc – tác dụng HDACi 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 11 1.3.1 Thay đổi nhóm khóa hoạt động 11 1.3.2 Thay đổi cầu nối 12 1.3.3 Các thay đổi khác 12 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 15 15 2.1.1 Hóa chất 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Tổng hợp hóa học 16 2.2.2 Thử tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Tổng hợp hóa học 16 2.3.2 Thử tác dụng sinh học 17 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 HÓA HỌC 19 3.1.1 Tổng hợp hóa học 19 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 28 3.1.3 Xác định cấu trúc 29 3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 35 3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC 35 3.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 35 3.3 BÀN LUẬN 36 3.3.1 Tổng hợp hóa học 36 3.3.2 Khẳng định cấu trúc 39 3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon-13 nuclear magnetic resonance) H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) 2D-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy) AcOH : Acid acetic ADN : Acid desoxyribonucleic AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người CDK : Tác nhân ức chế kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinase) CU : Nhóm liên kết (Connecting unit) d : Vạch đôi phổ 1H-NMR (Doublet) DCM : Dichloromethan dd : Vạch chẻ đôi lần phổ 1H-NMR (Doublet of doublet) DHFR : Dihydrofolat reductase DMF : Dimethylformamid DMSO : Dimethylsulfoxid DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deutri hóa DSB : Gãy kép ADN (DNA double-strand breaks) ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization) FBS : Huyết bào thai bò (Fetal bovine serum) FDA : Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (U.S Food and Drug Administration) h : Giờ H (%) : Hiệu suất HAT : Histon acetyltransferase HDAC : Histon deacetylase HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors) HDLP : Protein giống HDAC (Histone deacetylase-like protein) HMBC : Phổ tương tác đa liên kết dị hạt nhân (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) HSQC : Phổ tương dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single Quantum Coherence) 13 IC50 IR J KRIBB m MeCN MeOH MS NAD+ NST PC-3 Rf ROS RPMI s SAHA SRG SW620 t tºnc TLC TMS Trx TSA UV ZBG δ (ppm) ν : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration) : Hồng ngoại (Infrared) : Hằng số ghép cặp phổ 1H-NMR : Viện nghiên cứu Sinh học Công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) : Đa vạch phổ 1H-NMR (Multiplet) : Acetonitril : Methanol : Phổ khối lượng (Mass spectrometry) : Nicotinamid adenin dinucleotid : Nhiễm sắc thể : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người : Hệ số lưu giữ TLC : Gốc tự oxy hóa (Reactive oxygen species) : Môi trường nuôi cấy tế bào : Vạch đơn phổ 1H-NMR (Singlet) : Acid suberoylanilid hydroxamic : Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group) : Dòng tế bào ung thư đại tràng người : Vạch ba phổ 1H-NMR (Triplet) : Nhiệt độ nóng chảy : Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) : Tetramethylsilan : Thioredoxin : Trichostatin A : Tử ngoại (Ultraviolet) : Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) phổ NMR : Dao động hóa trị phổ IR DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa hiệu suất tổng hợp acid hydroxamic từ ester 28 Bảng 3.2 Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (tonc) dẫn chất VIa-d 29 Bảng 3.3 Kết phân tích phổ IR dẫn chất VIa-d 30 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ MS dẫn chất VIa-d 31 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều dẫn chất VIa 31 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ 1H-NMR dẫn chất VIa-d 32 Bảng 3.7 Kết phân tích phổ 13C-NMR dẫn chất VIa-d 34 Bảng 3.8 Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất IVa-d 35 Bảng 3.9 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn chất VIa-d 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Ảnh hưởng HAT HDAC lên cấu trúc histon Hình 1.2 Bảng phân loại HDAC “kinh điển” Hình 1.3 Một số ví dụ phân loại chất ức chế HDAC Hình 1.4 Cấu trúc SAHA gắn với protein giống HDAC (HDLP) Hình 1.5 Cấu trúc phân tử SAHA tương ứng với vùng cấu trúc chung HDACi Hình 1.6 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Bouchain Hình 1.7 Khung cấu trúc vùng ZBG HDACi 10 Hình 1.8 Cấu trúc chung chất nghiên cứu NCS Đào Thị Kim Oanh 11 Hình 1.9 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Chen 11 Hình 1.10 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Rossi 12 Hình 1.11 Cấu trúc dẫn chất hydroxamic vừa FDA cấp phép gần 12 Hình 1.12 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Methot 13 Hình 1.13 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Carrasco 13 Hình 3.1 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào dẫn chất VIa-d dòng tế bào SW620, PC-3 AsPC-1 43 Hình 3.2 Cấu trúc chung dãy dẫn chất 3a-g 44 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 19 Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II 19 Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất IVa 20 Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất Va 21 Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa 22 Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác Cu(I) 37 Sơ đồ 3.7 Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d 38 Phụ lục 12 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR VId (dãn rộng) Chú thích: 46A = VIa Phụ lục 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIa Phụ lục 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIa (dãn rộng) Chú thích: 46B = VIb Phụ lục 14 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb Phụ lục 14 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb (dãn rộng) Chú thích: 46F = VIc Phụ lục 15 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc Phụ lục 15 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc (dãn rộng) Chú thích: 46G = VId Phụ lục 16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId Phụ lục 16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId (dãn rộng) Phụ lục 17 Phổ HSQC VIa Phụ lục 17 Phổ HSQC VIa (dãn rộng) Phụ lục 18 Phổ HMBC VIa Phụ lục 18 Phổ HMBC VIa (dãn rộng) Phụ lục 18 Phổ HMBC VIa (dãn rộng) Phụ lục 18 Phổ HMBC VIa (dãn rộng) [...]... hydroxamic mang khung 3hydroxyimino- 2- oxoindolin hướng ức chế histon deacetylase với 2 mục tiêu: 1 Tổng hợp (2E)-N-hydroxy -3- (4-((4-( (3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl) methyl)-1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid và 3 dẫn chất 2 Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được 2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase. .. (2E)-N-hydroxy -3- (4-((4-( (3- (hydroxyimino) -5-methyl -2- oxoindolin- 1yl)methyl)-1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VIc) + (2E)-N-hydroxy -3- (4-((4-( (3- (hydroxyimino) -5-methoxy -2- oxoindolin1 -yl) methyl)-1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VId) - Kiểm tra độ tinh khiết - Xác định cấu trúc của các chất vừa tổng hợp được 2. 2 .2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được - Thử tác dụng ức chế. .. cứu của tác giả Đào Thị Kim Oanh và Trương Thanh Tùng [29 ] khi thay khung phenyl ở SAHA thành khung benzothiazol Nhằm tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, chúng tôi tiến hành tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 3hydroxyimino- 2- oxoindolin với cầu nối là dẫn chất của propenamid và tiến hành đề tài Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic. .. tín hiệu kết hợp phổ 1H-NMR và 13C-NMR thu được trước đó để tái khẳng định cấu trúc của dẫn chất bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 .3. 2 Thử tác dụng sinh học 2 .3. 2. 1 Thử tác dụng ức chế HDAC Định lượng nồng độ HDAC -2 bị ức chế bằng phương pháp huỳnh quang Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được được thử tại Khoa Dược - Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Sử dụng bộ KIT... 13C-NMR, HMBC và HSQC, đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2. 2.1 Tổng hợp hóa học - Tổng hợp 4 chất: + (2E)-N-hydroxy -3- (4-((4-( (3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl) -1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VIa) + (2E) -3- (4-((4-((5-fluoro -3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl)1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyacrylamid (VIb) + (2E)-N-hydroxy -3- (4-((4-( (3- (hydroxyimino) -5-methyl -2- oxoindolin- 1yl)methyl)-1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid... (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3. 2 - Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3. 3, 3. 4, 3. 5 và 3. 6 3. 1.1 .3 Tổng hợp dẫn chất (2E) -3- (4-((4-((5-fluoro -3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin1 -yl)methyl)-1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyacrylamide (VIb) Dẫn chất VIb được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ đồ 3. 1 a Tổng hợp. .. chế HDAC - Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW 620 ), ung thư tuyến tụy (AsPC-1), ung thư biểu mô tuyền tiền liệt (PC -3) 2 .3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 .3. 1 Tổng hợp hóa học 2 .3. 1.1 Tổng hợp - Dựa trên các nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành tổng hợp các chất theo thiết kế - Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) 17 2 .3. 1 .2 Kiểm tra... thuốc có tác dụng ức chế HDAC sử dụng trong điều trị ung thư gồm: SAHA (20 06), romidepsin (20 09), belinostat (20 14) và panobinostat (20 15) Các chất ức chế HDAC có thể được chia thành 6 nhóm dựa trên cấu trúc hóa học gồm: các acid hydroxamic, các acid carboxylic mạch ngắn, các aminobenzamid, các peptid vòng, các epoxyceton và các phân tử lai [ 32 , 41] Hình 1 .3 Một số ví dụ về phân loại các chất ức chế HDAC... đóng vai trò dọn dẹp chống lại tác nhân oxy hóa ROS SAHA điều hòa lên sự biểu hiện của TBP -2 (tác nhân ức chế hoạt động của dạng khử Trx) chỉ ở tế bào bất thường Ức chế Trx còn làm hoạt hóa ASK1- hoạt hóa chương trình chết bằng cách tác động vào sự dẫn truyền tín hiệu của SET1-JNK và MKK3/MKK6-p38 và tăng cường sự biểu hiện của protein tiền chết Bim [24 ] 1 .2 .3. 7 HDACi ức chế hình thành mạch máu nuôi... quả được trình bày cụ thể trong bảng 3. 3, 3. 4, 3. 5 và 3. 6 3. 1.1.4 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy -3- (4-((4-( (3- (hydroxyimino) -5-methyl- 2oxoindolin- 1-yl)methyl)-1H-1 ,2 ,3- triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (VIc) Dẫn chất VIc được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ đồ 3. 1 a Tổng hợp chất IVc: Tổng hợp chất 5-methyl-1-(prop -2- yn-1-yl)indolin -2 ,3- dion (IVc) từ nguyên liệu 5-methylisatin