Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3 methoxim isatin hướng ức chế histon deacetylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ I HC HÀ NI  LÊ TH THO TNG HP VÀ TH TÁC DNG SINH HC CA MT S ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-NG C CH HISTON DEACETYLASE LUC S C HC HÀ NI  2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ I HC HÀ NI  LÊ TH THO TNG HP VÀ TH TÁC DNG SINH HC CA MT S ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-NG C CH HISTON DEACETYLASE LUC S C HC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:  Kim Oanh 2. PGS.TS. Nguyn Hi Nam HÀ NI  2014 LI C Trong quá trình thực hiện đề tài “Tng hp và th tác dng sinh hc ca mt s acid hydroxamic mang khung 3-methoxim- ng c ch histon deacetylase”, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp. Trƣớc tiên, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Đào Thị Kim Oanh, PGS. TS. Nguyễn Hải Nam – những ngƣời thầy đã tận tâm hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài tại Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Huỳnh Kim Thoa – ngƣời Thầy đã tạo điều kiện cho tôi cơ hội đƣợc nâng cao kiến thức và có thời gian để thực hiện cơ hội đó. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa dƣợc - Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các anh chị Khoa hóa học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongji, Hàn Quốc) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này. Cuối cùng, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến chồng, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2014 Lê Thị Thảo MC LC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 3 1.1.1. Khái niệm HDAC 3 1.1.2. Phân loại HDAC 4 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự hoạt động bất thƣờng của HDAC 5 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs) 6 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 6 1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 9 1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 9 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY 10 1.3.1. Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới 10 i cu ni 11 i nhóm nhn din b mt 16 1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc 21 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC 24 1.4.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 24 1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic 25 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. NGUYÊN LIỆU 26 2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 26 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1. Nội dung nghiên cứu 27 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.2.1. Tng hp hóa hc 28  tinh khit 28 u trúc 28  hot tính sinh hc 29 2.3.2.5. Docking 31 2.3.2.6.  ging thuc ca các cht tng hc 31 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 33 3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC 33 3.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất (IIa-g) 33 3.1.1.1. Tng hp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIa) 34 3.1.1.2. Tng hp 5- fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIb) 34 3.1.1.3. Tng hp 5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIc) 34 3.1.1.4. Tng hp 5-bromoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IId) 34 3.1.1.5. Tng hp 3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin (IIe) 35 3.1.1.6. Tng hp 3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin (IIf) 35 3.1.1.7. Tng hp 7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIg) 35 3.1.2. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat và dẫn chất (IIIa – g) 35 3.1.2.1. Tng hp ethyl-7-(3-(methoxyimino)2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIa) 36 3.1.2.2. Tng hp ethyl-7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)heptanoat (IIIb) 36 3.1.2.3. Tng hp ethyl-7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIc) 36 3.1.2.4. Tng hp ethyl-7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)heptanoat (IIId) 37 3.1.2.5. Tng hp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIe) 37 3.1.2.6. Tng hp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1- yl)heptanoat (IIIf) 37 3.1.2.7. Tng hp ethyl-7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIg) 37 3.1.3. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và dẫn chất (IVa-g) 38 3.1.3.2. Tng hp N-hydroxy-7-(5-fluoro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (IVb) 39 3.1.3.3. Tng hp N-hydroxy-7-(5-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (IVc) 39 3.1.3.4. Tng hp N-hydroxy-7-(5-bromo-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (IVd) 39 3.1.3.5. Tng hp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (IVe) 39 3.1.3.6. Tng hp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (IVf) 40 3.1.3.7. Tng hp N-hydroxy-7-(7-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (IVg) 40 3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 41 3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 42 3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) 42 3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS) 43 3.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 43 3.3.3.1. Ph cng t ht nhân 1 H-NMR 44 3.3.3.2. Ph cng t ht nhân 13 C-NMR 45 3.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 47 3.4.1. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase 47 3.4.2. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 47 3.5. KẾT QUẢ DOCKING 47 3.6. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP 49 Chƣơng 4. BÀN LUẬN 50 4.1. VỀ HÓA HỌC 50 4.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (IIa-g) 50 4.1.2. Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian (IIIa-g) 50 4.1.3. Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic (IVa-g) 51 4.2. VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 52 4.2.1. Phổ hồng ngoại 52 4.2.2. Phổ khối lƣợng 54 4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 55 4.2.3.1. Ph 1 H  NMR 56 4.2.3.2. Ph 13 C  NMR 61 4.3. VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 64 4.3.1. Về tác dụng ức chế HDAC 64 4.3.2. Về tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72 1. KẾT LUẬN 72 1.1. Về tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc 72 1.2. Về hoạt tính sinh học 72 2. ĐỀ XUẤT 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỔ DANH MC CÁC CH VIT TT AsPC-1 Tế bào ung thƣ tụy 13 C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13 C DCM Dicloromethan DMF Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid FDA Cục quản lý dƣợc phẩm và thực phẩm Mỹ HAT Histon acetyl transferase HDAC Enzym histon deacetylase HDACIs Các chất ức chế HDAC 1 H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1 H IC 50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào IR Phƣơng pháp phổ tử ngoại LD 50 Liều gây chết cho 50% số cá thể nghiên cứu MCF-7 Tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol MS Phổ khối lƣợng NCI-H460 Tế bào ung thƣ phổi NMR Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân PC-3 Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic SW620 Tế bào ung thƣ ruột kết THF Tetrahydrofuran TLC Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng TSA Trichostatin A DANH MC HÌNH V Tên hình Trang Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo nucleosom 3 Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV 4 Hình 1.3: Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ 5 : HDACIs có cấu trúc hydroxamat 10 Hình 1.5: Các dẫn chất thế 2’ của SAHA 12 Hình 1.6: Các dẫn chất -alkoxy của SAHA 12 Hình 1.7: Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid 13 Hình 1.8: SAR của các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC 14 Hình 1.9: Các dẫn chất amid ngƣợc của SAHA 14 Hình 1.10: Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối của SAHA 16 Hình 1.11: Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA 16 Hình 1.12: Các aryl-hydroxamic tƣơng tự SAHA 17 Hình 1.13: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic 17 Hình 1.14: Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA 18 Hình 1.15: Một số acid phenylthiazol hydroxamic 19 Hình 1.16: Dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049 19 Hình 1.17: Dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic acid 19 Hình 1.18: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol hydroxamic 20 Hình 1.19: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol hydroxamic 20 Hình 1.20: Cấu trúc N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid 21 Hình 1.21: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động benzothiazol 22 Hình 1.22: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol 22 Hình 1.23: Cấu trúc của các dẫn chất 3-oxim-isatin 24 Hình 3.1: Kết quả phân tích Western blot của các chất IVa  g 47 Hình 3.2: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC8 48 Hình 3.3: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC2 48 Hình 4.1: Hiện tƣợng hỗ biến của nhóm chức hydroxamic 53 Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của chất IVa 54 Hình 4.3: Phổ khối lƣợng của chất IVa 55 Hình 4.4: Phổ 1 H – NMR dãn rộng của IVa 57 Hình 4.5: Phổ 1 H – NMR dãn rộng của IVg 58 Hình 4.6: Phổ cộng hƣởng từ 1 H – NMR của 19e 59 Hình 4.7: Phổ cộng hƣởng từ 1 H – NMR của IVe 59 Hình 4.8: a, Phổ 13 C – NMR của chất IVf. b, Phổ 13 C – NMR dãn rộng của chất IVf 63 Hình 4.9: Kết quả phân tích Western blot của 2 dãy chất 19a-g và IVa-g 64 Hình 4.10: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn chất IVa-g 67 [...]... mang khung 3- methoxim- isatin hướng ức chế histon deacetylase với mục tiêu: 1 Tổng hợp N-hydroxy-7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và một số dẫn chất 2 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro trên một số dòng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc 2 Chƣơ g 1 TỔNG QUAN 1.2 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.2.1 Khái niệm HDAC Histon – một phần của cấu... So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-g và 19a-g 69 Bảng 4.4: So sánh giá trị logP của các chất 19a-g và IVa-g 70 DANH MỤC SƠ ĐỒ Tê sơ đồ Trang Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của 24 Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid biaryl hydroxamic 25 Sơ đồ 1 .3: Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic 25 Sơ đồ 3. 1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung 3- methoximisatin Sơ đồ 3. 2: Sơ đồ... các chất ức chế HDAC 7 Bảng 1.2: Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV 8 Bảng 1 .3: Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ 13 in vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid Bảng 1.4: Tác dụng kháng các tế bào ung thƣ in vitro của N25 21 Bảng 1.5: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế 23 enzym HDAC của các... ức chế histon deacetylase đã cho thấy có hoạt tính tốt trên tế bào ung thƣ trong thử nghiệm in vitro, đặc biệt là một số dẫy chất mang khung benzothiazol [1, 40, 41], 3- oximisatin [4] Với mong muốn đem lại nhiều ứng viên lâm sàng để tìm ra thuốc điều trị ung thƣ mới, theo hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung. .. tính [33 ], vì thế hiện nay chất ức chế HDAC trở thành mục tiêu hấp dẫn và mang đầy tính khả quan trong công cuộc nghiên cứu tìm ra chất chống ung thƣ của các công ty dƣợc phẩm và các tổ chức chính phủ 1 Tại Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thiết kế công thức và tổng hợp các chất ức chế HDAC Trong các chất đã tổng hợp, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic. .. chất 18a-d Bảng 3. 1: Kết quả tổng hợp 3- (methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất 35 Bảng 3. 2: Kết 7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1- 38 Bảng 3. 3: Kết quả tổng hợp N-hydroxy-7- (3- methoxyimino-2-oxoindolin-1- 40 quả tổng hợp ethyl yl)heptanoatvà dẫn chất yl)heptanamidvà dẫn chất Bảng 3. 4: Giá trị Rf và Tnc của các chất IVa-g 41 Bảng 3. 5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-g 42 Bảng 3. 6: Kết quả... cổ điển này 1 .3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY 1 .3. 1 Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới Năm 1986, TSA đã đƣợc Morioka và cộng sự chứng minh tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend và ức chế chu trình tế bào bình thƣờng ở cả pha G1 và G2 [ 53] Bên cạnh đó, TSA có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu... Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol -hydroxamic WR3018049 (hình 1.16) Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50 thấp đến 0,002 nM [31 ] Hình 1.16 Dẫn chất acid phenylisoxazol -hydroxamic WR3018049  Các dẫn chất 1 ,3, 4-thiadiazol hydroxamic acid Nhóm nghiên cứu của Peng Guan (Trung Quốc) đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic. .. khung 3- methoximisatin Sơ đồ 3. 2: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIa - g 33 Sơ đồ 3. 3: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIIa - g 36 Sơ đồ 3. 4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IVa-g 38 Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIIa-g 50 Sơ đồ 4.2: Phản ứng thế ái nhân acyl 51 Sơ đồ 4 .3: Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-g từ ester 51 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ là bệnh khó có thể điều trị... N của histon, sự chuyển đổi này xảy ra nhiều hơn trên histon H3 và H4 Sự acetyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dƣơng của phần đầu N của histon, do vậy làm giảm ái 3 lực của histon với phần điện tích âm trên ADN [45] Ngƣợc lại, histon deacetylase (HDAC) xúc tác việc loại bỏ nhóm acetyl của lysin ở phần đầu N của histon, dẫn đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức chế . hành thực hiện đề tài: Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase với mục tiêu: 1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid. Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thiết kế công thức và tổng hợp các chất ức chế HDAC. Trong các chất đã tổng hợp, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic. N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và một số dẫn chất. 2. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro trên một số dòng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc.