Chƣơ g 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.4.Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Thử tác dụng ức chế histon deacetylase
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng
29
SW620. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.
a. Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:
Các tế bào ung thƣ đại tràng SW620 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovine serum)), gọi là môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả tế bào đƣợc ủ ở 37°C với
5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí. Trƣớc khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm
dạng bột đƣợc hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/ml. Các dung dịch gốc sau đó đƣợc pha loãng bằng môi trƣờng nuôi cấy
hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 1 M.
b. Phân lập histon và Western Blot
Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) đƣợc ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song
làm mẫu trắng (mẫu tế bào không ủ với mẫu thử). Sau đó, các tế bào đƣợc xử lý và rửa bằng dung dịch nƣớc muối sinh lý có đệm phosphat. Tế bào đƣợc dung giải trong dung dịch dung giải đệm [20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150 mM NaCl; 1 mM
Na2EDTA; 1 mM EGTA; 1% triton; 2,5 mM Na pyrophosphat; 1 mM -
glycerophosphat; 1 mM Na3VO4; 1 g/ml leupeptin], ủ trong đá 15 phút. Hỗn dịch
đƣợc ly tâm và phần dịch đƣợc thu hồi để tiến hành điện di trên gel. Histon đƣợc điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Các màng đƣợc ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (Milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ. Các dải có phản ứng dƣơng tính đƣợc phát hiện nhờ sự phát quang đã đƣợc tăng cƣờng. Các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa
Dƣợc, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phƣơng
pháp MTT [12, 15] và giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism.
D ng tế bào thử nghiệm:
- SW620: tế bào ung thƣ đại tràng
30
- AsPC-1: tế bào ung thƣ tụy
- PC-3: tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến
- NCI-H460: tế bào ung thƣ phổi
Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium với dòng tế bào MCF-7) hoặc RPMI (với dòng 4 tế bào còn lại) bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò).
Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau:
Bước 1: Chuẩn bị
Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng DMEM hoặc RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96
giếng, mỗi giếng 200l. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2. Sau
24 giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20l môi trƣờng DMEM/RPMI bổ sung (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/ml trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2
l mẫu thử vàocác giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là 0,1%.
Bước 2: Tiến hành thử
Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) nồng độ 5 mg/ml trong PBS. Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi
giếng đƣợc cho 100 l dung dịch MTT trong DMSO, để 5 phút cho thuốc nhuộm
MTT đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510nm.
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với
31
cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%.
2.3.2.5. Docking
Để kiểm tra sơ bộ tính tƣơng tác của các chất tổng hợp đƣợc với HDAC, chất
IVa đã đƣợc tiến hành docking. Quá trình docking đƣợc thực hiện tại phòng nghiên
cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seul, Hàn Quốc, sử dụng mạng lƣới cấu trúc của HDAC8, HDAC2 tƣơng tác với SAHA.
Chúng tôi lựa chọn HDAC2 và HDAC8 là hai enzym thuộc HDAC nhóm I – phân nhóm HDAC mà các dẫn chất acid hydroxamic có tác dụng ức chế mạnh nhất
(bảng 1.2) để tiến hành docking nhằm dự đoán khả năng ức chế của IVa đối với các
enzym này căn cứ vào sự phù hợp về hình dạng, kích thƣớc và năng lƣợng tƣơng
tác giữa IVa và các enzym. Docking đƣợc thực hiện bằng chƣơng trình AutoDock
Vina, sau đó dự đoán năng lƣợng của tƣơng tác liên kết từ sự gắn kết trên khi SAHA rời khỏi hệ tƣơng tác. Kết quả sẽ đƣợc minh họa bằng hình ảnh mô hình và số liệu dự đoán năng lƣợng liên kết (mục 3.5).