Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase
Trang 1
BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE
TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI
DBO THI ANH TUYET
TONG HOP MOT SO ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 5-PHENYL-1,3,4-
THIADIAZOL-2-YL
HUONG UC CHE ENZYM HISTON DEACETYLASE
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2012
Trang 2
BO GIAO DUC VA DAO TAO BOY TE
TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI
DBO THI ANH TUYET
TONG HOP MOT SO ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 5-PHENYL-1,3,4-
THIADIAZOL-2-YL
HUONG UC CHE ENZYM HISTON DEACETYLASE
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VA BAO CHE
MA SO : 607301
Người hướng dẫn khoa học: PGS TS.Nguyễn Hải Nam
HÀ NỘI 2012
Trang 3Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn người thầy đáng kính của tơi,
trưởng bộ mơn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội PGS.TS Nguyễn Ha
Nam: Thầy đã không chỉ tạo những điều kiện tốt nhất giúp tơi hồn thành luận
văn mà ln có những hướng dẫn chính xác và kịp thời những lúc tôi gặp khó khăn, ln ở bên động viên tôi, cho tôi niềm động lực tinh thần, niềm tin lớn
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên của bộ mơn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội trong suốt thời gian qua đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại bộ môn, đến những cô
chú anh chị cán bộ giúp đỡ tôi trong quá trình kiểm tra, đo đạc các loại phô tại
viện Hóa Học Việt Nam, viện Hóa Học các hợp chất tự nhiên và bộ mơn Hóa vật liệu trường Đại học Khoa học tự nhiên
Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các bạn và các em trong nhóm thực nghiệm tại bộ mơn Hóa Dược, những người đã chia sẻ vui buồn, đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua
Hà Nội ngày tháng nam 2012 Người việt
Trang 4MUC LUC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIET TAT DANH MUC CAC BANG
DANH MUC CAC HINH VE DANH MUC CAC SO DO
DAT VAN DE cece ccccccecccccuececsuecesuesceuescecueceseuscsaescseuesesneess 1
PHAN I - TONG QUAN ccccccccceessnetceeeeeeereeeetneeeeeeeneeetnaeee 2
1.1 Histon deacetyÌÏas - G Ăn ng ng 2 1.1.1 Câu trúc nhiễm sắc thê -‹ n2 1S yên 2
1.1.2 Histon deacetyÌase ch kg 3 1.1.3 Cơ chế hoạt động của histon deacetylase -‹cs<< <5 4
1.1.4 Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư -.‹‹<cc< << 5
1.2 Các chất ức chế HDAC -c S222 111k re 7
1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC c-«- 7
1.2.2 Phân loại chất ức chế HDAC SE S23 nh vn 10
1.2.3 Tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC - 5c se 15 1.2.4 Liên quan cấu trúc-tác dụng của các chất ức chế HDAC 16
1.3 Phản ứng hóa học cv 21
CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIEN 00090000 25
2.1 Nguyên liỆU Ăn KH no nh 25
2.1.1 Hóa chất chính + - ¿5< Set x1 5111111111151 1311 xtxee 26 2.1.1 Dung mơi và hóa chất khác -¿- - - + sE+k‡k£E£EZEx£xgkcvErvcxcee 26
Trang 52.4 Phương pháp nghiÊn CỨU - G0 G0 111939339 99 90 1 1111 1n g9 98 89955 27 2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết - - 2-5 s55: 27
2.4.2 Xác định cấu tTÚC 5< SxE*vEterkeEerkrrrrrrkrrerrrrerkerree 27 2.4.3 Thử tác dụng ức chế enzym HDAC ¿- 52c ccczceeesrrerrerree 27 2.4.4 Thử độc tính tế bào inVitrO . . -¿-5<©sc©csvcxsrxevrxerrerreerrrrrxee 27
2.4.5 Nghiên cứu docking của các chất .- ‹‹- cv cà 28
CHUONG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ . 5-55 55-55 sa 29
3.1 Tơng hợp hóa hỌc - + - 5c St 2212 121215 231122111115 1111511111121 EE g1 cee 31 3.1.1 Téng hop ”N’-hydroxy-N®-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid” CE 32 3.1.2 Tổng hợp ”NỶ-hydroxy-NŸ-(5-(2clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- y])octandiamid”” (S) - .- - <5 s3 3H TH ng 33 3.1.3 Tổng hợp “NỶ-hydroxy-NŸ-(5-(3clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- yÏ)octandiamid(ŠC) (c9 0 HH ng g9 4 35 3.1.4 Tổng hợp “NỶ-hydroxy-NŸ-(5-(4clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- y])octandiamid(5d]) - - - c1 0H TH ng 37 3.1.5 Tổng hop “N1-hydroxy-N8-(5-(methoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- yl)octandiamid(Se) 0.0.0 cescsssceessseeceessnecessseeeeeseeeeesseeeeeesseesesaeeseesaeeseeses 39
3.1.6 Kiém tra d6 tinh Khiét oc cccccsescssessesceseseesessessesesseseseesestesceseateseeess 40
3.2 Xdc dimh Av tric ccccccsccececssecececccescecssscscececeecceesecesacacacececseeesevatavaceeees 42
3.2.1 Ph6 hong ngoai (IR) cccececsessscssssssscsssscsssssscsssesscssssssssscecsssssscssceseesees 42 3.2.2 PhO khéi long (MS) cccsceccsssssssessssessesssssssesesssssesesssssseesssessessssseneees 45
Trang 6XS: c6 08 49
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN . -© 5+ ©5222 xExekerrrrerkerkrrereerree 51
“ăn: cố Ồ Ả.ẢẢ 51 4.2 Hoạt tính sinh hỌC - S130 109011 11 1011 vn se 53
KET LUAN VA KIEN NGHI uu cocccccccccccssccscesscssescssessssssssscsssssesseseesees 60 TAI LIEU THAM KHAO
Trang 7ALL AML APL CD CLL CTCL MDS DMF DMSO EtOH HDAC HDACi ICs IR MeOH MS NMR SAHA TLC TSA
: Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính :_ Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính :_ Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính : Receptor gay chét ndi tai
: Bénh ung thu bach cầu mãn tính
‘ U lympho té bao T duéi da
Hội chứng loạn sản tuy : Dimethyl formamid
: Dimethyl sulfoxid
: Ethanol
Histon acetyltranferase
: Enzym histon deacetylase
Chat irc ché enzym histon deacetylase
: Nong độ ức chế hoạt độ tế bào xuống một nửa :_ Phương pháp phô tử ngoại
: Methanol
:_ Phố khối lượng
:_ Phương pháp phô cộng hưởng từ hạt nhân : Acid retonic
: Receptor cua acid retonic
: Acid suberoylanilid hydroxamic
Trang 8Stt Bang 1.1 Bang 1.2 Bang 3.1 Bang 3.2 Bang 3.3 Bang 3.4 Bang 3.5 Bang 3.6 Bang 3.7 Bang 3.8 Bang 4.1 Bang 4.2 Bang 4.3 Bang 4.4 Tén bang
Một số chất ức chế HDAC đang được thử lâm sàng Tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC
Gia tri Ry va Tox của các chất 5a-e Số liệu phân tích phơ IR của các chất 3a-d Số liệu phân tích phổ IR của các chất 4a-d Số liệu phân tích phô IR của các chất 5a-e
Số liệu phân tích phơ khối lượng của các chất
Số liệu phân tích phổ 'H-NMR của các chất 5a-e Số liệu phân tích phơ '?C-NMR của các chất 5a-e Kết quả thử hoạt tính của chất 5a-e và SAHA
Kêt quả thử độc tính tê bào in vitro của một sô dân chat phenyltriazolylhydroxamat
Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất
benzothiazol trong luận văn thạc sỹ của Trần Văn
Nam
Kết quả thử độc tính tế bào in vitro của một số dẫn chất
phenythiazolyllhydroxamat
Tương đồng cấu tạo của các chất đích và SAHA
Trang 9STT Hinh 1.1 Hinh 1.2 Hinh 1.3 Hinh 1.4 Hinh 1.5 Hinh 1.6 Hinh 1.7 Tén hinh Trang
Cấu trúc histon trong nucleosom 2
Cấu trúc 3D của một HDAC gắn với một chất ức chế HDAC 5 Tác động của các HDAC với tế bào ung thư 6
Cơ chế hoạt động của các chất ức chế HDAC 7
Trang 10STT Tên sơ đồ Trang
Sơ đồ 3.1 Quy trình tơng hợp chung 26
Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất 5a 27 Sơ đồ 3.3 Quy trình tơng hợp chất 5b 31 Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất 5c 33 Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất 5d 35
Trang 11Cho đến nay, ung thư vẫn được coi là căn bệnh khó chữa nhất Trong
khoảng năm thập ký trở lại đây, trong cuộc chiến chống lại căn bệnh ung thư, các
nhà khoa học đã nghiên cứu và phát triên nhiều loại thuốc mới để điều trị ung
thư Cho đến nay, có khoảng 200 thuốc đã được cấp phép sử dụng trong lâm sàng và hàng trăm thuốc vẫn đang được nghiên cứu Những thuốc này đã đạt
được một số thành tựu như cải thiện được tình trạng bệnh và kéo dài tuổi thọ
bệnh nhân tuy nhiên việc sử dụng chúng có nhiều hạn chế do độc tính cao, thiếu tính chọn lọc trên các khối u và hiệu lực điều trị thấp Ngày nay nhờ các tiến bộ về sinh học phân tử, di truyền học, người ta đã có những hiểu biết ngày càng sâu sắc về các tiễn trình sinh học trong ung thư: sự tăng trưởng tế bào, các gen diéu hòa chu trình tế bào, sự chết tế bào theo chương trình, sự tạo mạch Điều này đã tạo điều kiện thuận lợi để các nhà khoa học phát triển một liệu pháp mới: liệu
pháp nhắm trúng đích (targeted therapy) nhờ vào các hiêu biết về ung thư ở mức độ phân tử
Một trong những mục tiêu phân tử đang được chú ý hiện nay là các enzym histon deacetylase (HDAC) [1] Nghiên cứu về các HDAC, người ta đã chứng
mỉnh được rằng hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư Trong những năm gần đây, các chất ức chế HDAC đang trở thành các
tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic
(Vorinostat, Zolinza”) là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong
điều trịu lympho tế bào T da [13] Vorinostat là một chất ức chế HDAC có chứa nhóm hydroxamic trong phân tử Đây là một trong những chất được nghiên cứu phát triển từ TSA - là một chất ức chế HDAC tự nhiên có chứa nhóm hydroxamic trong phân tử Điều này cho thấy các chất ức chế HDAC có chứa nhóm chức hydroxamic rất có triển vọng trong điều trị ung thư Vì vậy chúng tôi tiễn hành thực hiện đề tài:
“Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4- thiadiazol-2-yl hwéng we ché enzyme histon deacetylase” vi 2 muc tiéu chinh:
1, Tổng hợp wW -hydroxy-N°-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-
yÙoctandiamid” và một sô dẫn chat
Trang 121.1 Histon deacetylase 1.1.1, Cau triic nhiém sac thê
Tất cá bộ gen của người được gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức
hợp đại phân tử protein-ADN NST có cấu trúc động, được tổ chức cao, bao gồm ADN, các protein histon và protein không phái histon Đơn vị cấu trúc cơ bản
cua NST 1a nucleosom [1,15,25] Một nucleosom bao gồm 146 cặp base của ADN quấn quanh một lõi histon octamer Histon octamer bao gồm từng cặp của mỗi H2A, H2B, H3 và H4 (hình 1.1) Những protein này là những protein cơ bán và được bảo tồn cao qua quá trình tiến hóa Tất cả 4 lõi của histon đều có một đi tận cùng là nhóm amino [1,18] Việc kéo dài nucleosom là do những đuôi amino mang điện của các histon Đuôi của histon H4 dường như kéo dài đến sát
ngay nucleosom kế tiếp để kết hợp với phức hợp H2A-H2B, cho thấy phần đi
của các histon có thể quyết định cẫu trúc bậc cao hơn của sợi nhiễm sắc [1] Thực tế là, những đuôi histon đặc biệt là H3 và H4 là đích đến cho nhiều sự biến đổi khác nhau sau phiên mã bao gồm: sự acetyl hóa, sự methyl hóa và sự phosphoryl hóa Những thay đơi cộng hóa trị của những đuôi histon được tạo thành bởi những enzym như histon acetyltransferase (HATT), methyltransferase,
kinase và đặc biệt là những histon deacetylase (HDAC) đã được biết đến là quyết
định sự biểu hiện gen [1,15]
Hình 1.1: Cấu trúc histon trong nucleosom
Trang 13acetyl/decacetyl hóa boi cdc histon acetyltransferase (HAT) va histon deacetylase (HDAC) Su acetyl héa làm trung hòa điện tích trên các lysin A,
acetyl; C, nhém carboxyl; E, acid glutamic; M, methyl; N, nhém amino; P,
Phosphat; S, serin; Ub, ubiquitin 1.1.2 Histon deacetylase
HDAC là enzym xúc tác cho sự di chuyển làm giảm bớt nhóm acetyl trên phần đuôi lysin của những protein histon H2A, H2B, H3 và H4 trong lõi nucleosom [26] Sự giảm acetyl hóa các histon có liên quan đến cấu trúc của
NST ở trạng thái đóng xoắn dẫn đến ức chế quá trình phiên mã gen, ngược lại
những histon được acetyl hóa có liên hệ với một cấu trúc NST ở trạng thái giãn rộng hơn và sự hoạt hóa q trình phiên mã Ngồi ra, các HDAC cịn có chức năng quan trọng khác là kiểm soát trạng thái acetyl hóa và chức năng
của nhiều protein trong tế bào chất và những nhân tố phiên mã Hiện nay
người ta đã biết đến 18 HDAC, chia làm 4 nhóm [14,24]:
- Nhóm I gồm: HDACI, 2, 3 và 8, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào
-_ Nhóm II gồm: HDAC4, 5, 7, 9, 6 và 10 Các enzyme này biểu thị mô
đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân -_ Nhóm III gồm những sirtuin, có ở bào tương, ty thể và nhân -_ Nhóm IV gồm HDACII, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào
Nhóm I, II và IV gồm 11 thành viên và được coi là những HDAC “kinh
điển” Những HDAC “kinh điển” và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau Những HDAC “kinh điển” là những enzym phụ thuộc Zn””, vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn”” ở đáy của túi Những enzym này có thể bị
Trang 14chất này hiện nay đang được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng 1.1.3 Cơ chế hoạt động của các HDAC
Cơ chế hoạt động của các enzym HDAC liên quan đến sự loại bỏ nhóm acetyl từ các histon trong nucleosom Sự giảm acetyl hóa gây ra sự giảm
khoảng trống giữa nucleosom và ADN quấn quanh nó ADN quấn chặt hơn
làm các nhân tổ phiên mã khó tiếp cận hơn, dẫn đến ức chế quá trình phiên
mã Vùng xúc tác của HDAC được tạo thành bởi gần 390 aminoacid được bảo
tồn Vị trí hoạt động này có một túi hình ống hơi cong với phần đáy rộng hơn Sự di chuyển của một nhóm acetyl xảy ra thông qua một hệ thống rơ-le điện
(a charge-relay system) bao gồm hai đuôi histidin, hai đuôi aspartic (cách những histidin khoảng gần 30 aminoacid), và một đuôi tyrosin (ở cùng phía va cách những đuôi aspartic khoảng 123 aminoacid) ở gần kề nhau lon Zn””
là cần thiết cho hoạt động của hệ thống này Nguyên tử này được liên kết với
vị trí liên kết với kẽm ở đáy của túi Các chất ức chế HDAC thực hiện chức
năng bằng cách chiếm chỗ ion kẽm và do đó làm cho hệ thống rơ-le điện hoạt động bất thường [25] Trichosanthin A với nhóm hydroxamic của nó và dây
nối 5 nguyên tử Cacbon tới nhóm phenyl là cấu trúc tối ưu để lắp vừa vào vị
trí hoạt động Việc xác định cấu trúc của HDAC là rất cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kế công
thức cho các chất ức chế HDAC Bằng các kỹ thuật kết tỉnh tao tinh thé va
chụp tia X người ta đã xác định được cấu trúc 3D của nhiều HDAC khác nhau
(Hình 1.2), đồng thời nghiên cứu được các trung tâm xúc tác phản ứng
Trang 15HDLP:TSA 6)
HDACS: Compound | loop 332-345
Hình 1.2 Cấu trúc 3D của một HDAC gắn với một chất ức chế HDAC (A) Chỉ tiết các đặc điểm cẫu tạo tại trung tâm liên kết (B) và mô hình tối
giản trung tâm liên kết (C) 1.1.4 Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư
Mặc dù đã có sự ứng dụng rộng rãi các chất ức chế HDAC trong nuôi cây tế bào, các mơ hình động vật, hay các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn đầu, tuy nhiên chúng ta vẫn còn biết một cách mơ hồ về các mục tiêu của chúng trong các mô ung thư Điều này là do hiệu biết của chúng ta về các chức năng của các HDAC trong một mơ hình khối u nhất định còn chưa được đầy đủ
HDAC có thể liên quan tới việc trung gian điều hòa chức năng của các sản phẩm hoán vị gây ung thư trong một số loại bệnh bạch cầu và u lympho nhất định Mối liên quan giữa hoạt động của HDAC và sự hình thành khối u được thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính (APL) RARG, receptor của acid retonic (RA), là một chat diéu hoa phién ma
quan trong trong sy biét héa cua té bao tuy RARG và RXR (chất đồng trùng
hợp ngoại lai của RARG) liên kết với các yếu tố đáp ứng RA (RAREs) và
Trang 16bạch cầu dạng tủy cấp tính (AML) và ung thư nguyên bào lympho cấp tính (ALL) Các protein này có thể làm cho yếu tố phiên mã AMLI, từ chỗ là một chất hoạt hóa trở thành một chất ức chế, bằng cách thu nạp HDAC thông qua
ETO và TEL [31]
Tuy nhiên, những thay đổi trong biểu hiện gen được mô tả ở trên không
cho thấy một cách rõ ràng sự thay đôi các loại HDAC cu thé Do đó chưa thể có dữ liệu kết luận chung của sự thay đôi các HDAC biểu hiện trong các loại ung thư ở người Gần đây một số nghiên cứu về sự thay đổi của một số loại
HDAC trong các mơ hình khối u đã được cơng bố Ví dụ, có một sự gia tăng
của HDACI biểu hiện trong bệnh ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt [13], ung thư đại tràng [32], ung thư vú [33] hay ung thư da Một ví dụ khác, sự gia tăng quá mức của HDAC2 được tìm thấy trong ung thư cổ tử cung [15] và ung thư dạ dày [27] Một số nghiên cứu khác cũng đã có báo cáo về sự gia tăng không kiểm soát của HDAC3 và HDACG6 trong các mẫu xét nghiệm ở ung thư đại tràng và ung thư vú [36]
- ~-~ oh Dican => ¬ ca °ˆ” =, = \o> = >3 7 “Sa A : j lho©aec G A 4b — =Š
tort (0 Sy” > liệu pháp hóa học
=> N
\ ——)
- - HRAC Y SG
Hinh thanh mach bĐAc ó6 7 VN, HOAC 7 Té Dao ung thứ > WOAC | Nexis lgăn cản các s
: f Phan hea ~ “se | ss ⁄ đế” © ⁄ cœ› ( đỡ ö „7 “ Tự chết Sinh sản
Trang 17mã do HDAC là một cơ chế phân tử phổ biến của nhiều loại ung thư trong cả giai đoạn khởi phát và tiến triển Trong các ví dụ này, sự ức chế phiên mã dường như được điều hòa bởi sự thu nạp HDAC và cung cấp một cơ sở hợp lý cho phương pháp điều trị bệnh bạch cầu với các chất ức chế HDAC Su mat cân bằng trong quá trình acetyl hóa histone có thể dẫn tới những thay đổi trong cầu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào
điều khiển chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào 1.2 Các chất ức chế HDAC
1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
Khi HDAC bị ức chế bởi các chất ức chế HDAC (butyrat, TSA, depsipeptid, oxamflatin, MS-275 và SAHA), những histon sẽ bị acetyl hóa, ADN đang quấn quanh histon đó sẽ giãn ra Một vị trí đặc biệt trong vùng hoạt hóa của một nhóm nhỏ gen (ví dụ các vị trí SP1) được cho là gan phức hợp yếu tố phiên mã (TEC) với HDAC và sự tích tụ những histon bị acetyl
hóa trong nucleosom dẫn đến sự phiên mã của nhóm nhỏ gen này tăng lên (ví
dụ, CDKNIA (còn gọi là p2l), gen này mã hóa chất ức chế phụ thuộc cyclin
(CDK) là WAFI), và dẫn đến tác dụng hiệp đồng là gây ra sự ngừng phat
triển, sự biệt hóa và/hoặc sự chết tế bào theo chương trình, kết quả là ức chế
sự phát triển khối u [18]
Trang 18
yếu [15]:
* Sự biệt hóa gây ra bởi các chất ức ché HDAC: Các chất ức chế
HDAC tác động lên các tế bào ung thư gây ra sự ngừng tế bào ở pha G1, kết quả là gây ra sự biệt hóa tế bào ung thư
* Các chất ức chế HDAC gián tiếp gây ra sự chết té bào theo chương trình: Các chất ức chế HDAC tác động lên những tế bào bình thường và tế
bào ung thư với cùng mức độ gây ra G2 checkpoint (vị trí mà tại đó chu trình
tế bào tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện trở nên phù hợp thì chu
trình lại tiếp tục) Những tế bào bình thường trải qua G2 checkpoint và tiếp tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thư tái tạo ADN tạo thành dạng 4nADN và chuyền sang giai đoạn gây chết tế bào theo chương trình
* Các chất ức chế HDAC cịn có những tác dụng gián tiếp đến sự phát triển khối u Bằng cách làm tăng các phản ứng miễn dịch chủ thể và ức chế sự tạo mạch của khối u để có thể ngăn cản rõ rệt sự phát triển khối u ban đầu và sự đi căn
1.2.1.1 Các chất HDAC¡ gây ra sự biệt hóa
Khi là 1 tác nhân riêng lẻ, các HDAC¡ có thể khiến cho nhiều loại tế bào ung thư bạch cầu và u rắn khác nhau phải thể hiện đặc tính biệt hóa và
ngừng tăng sinh Sự ức chế chu trình tế bào là cần thiết cho sự biệt hóa của tế bào, và tác dụng kìm tế bào của HDAC¡ là rất quan trọng cho hoạt động chống ung thư của chúng Phân tích các số liệu về chu trình tế bào của các tế
bào ung thư đã được điều trị với HDAC¡ cho thấy các tế bào thường đừng ở
pha G1, nhưng đơi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình
Sự biệt hóa của tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của RARœ và protein gây ung thư PLZF-RARơ làm ngắt quãng chương trình biệt
hóa bình thường HDAC¡ có thể kết hợp với RA để tạo ra sự biệt hóa tế bào
Trang 19protein AMLI-ETO và TEL-AMLI bị kìm hãm bởi các HDAC], và sự nhạy cảm của tế bào ác tính với RA vẫn được báo toàn Trong hai trường hợp này, mục tiêu phân tử của HDACI đã được xác định rõ, và chu trình dẫn đến sự
biệt hoá cũng đã được nghiên cứu tỉ mỉ Tuy nhién HDACi có thể gây ra sự
biệt hóa ở rất nhiều loại tế bào khác, và các hiện tượng phân tử có liên quan tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn chưa được sáng tỏ [7]
1.2.1.2 Các chất HDAC¡ điều hòa sự gây chết tế bào theo chương trình Quá trình điều trị các tế bào ung thư với HDAC¡ có thể dẫn đến sự gây chết tế bào theo chương trình Sự gây chết tế bào theo chương trình là một
chương trình gây chết tế bào sinh lý với mục đích là kiểm sốt số lượng tế bào
bình thường trong quá trình phát triển hoặc trong các loại bệnh Người ta đã xác định hai con đường chết nội bào với chức năng riêng biệt nhưng có mối liên hệ phân tử với nhau Cá hai con đường này đều đời hỏi sự có mặt của
Caspases- một họ cystein protease Con đường thứ nhất được hoạt hóa bởi các yếu tố nội là “death-receptor” như CD95, TNF, TRAIL Các yếu tố này sau khi liên kết với phối tử của chúng sẽ hoạt hóa các capase cạnh màng tế bào như caspase-8 và -10 Các caspase này sau đó sẽ tiếp tục hoạt hóa các capases kích thích như caspase-3 và -7 Con đường thứ hai lại cần thiết phải có sự rách màng ty thể nhằm điều hòa sự giải phóng cla cytochrome c và các protein hỗ trợ sự chết tế bào theo chu trình (như SMAC, AIF) và sự hoạt hóa của capaes-9 thơng qua yếu tố APAFI Sự toàn vẹn của màng tế bào ty thê được quyết định bởi các protein trong họ protein BCL2 (bao gồm các protein pro-apoptic (BAX, BAK) va cac protein anti-apoptic (BCL2, BCL-X;) HDAC¡ đã được ghi nhận là hoạt hóa cá chu trình gây chết receptor và chết tế
Trang 20butyrat sẽ làm cho các tế bào nhạy cảm với sự gây chết tế bào được điều hịa
bởi CD95 mà khơng cần sự mã hóa của phối tử hay receptor Su biểu hiện quá mức của BCL2 có thể ngăn chặn chu trình chết tế bào nội sinh nhưng không ảnh hưởng tới con đường gây chết receptor, ức chế gây chết tế bào theo chu trinh do HDACi, chi ra tam quan trọng của chu trình nội sinh đối với chức năng của các HDAC¡ Các đữ liệu này được củng cố bởi các phát hiện rằng sự
gây chết tế bào theo chu trình do HDAC¡ trùng hợp với sự tăng cường điều
chỉnh các protein BCL2 pro-apoptic và sự giảm điều chỉnh các BCL2 anti- apoptic [18]
1.2.1.3 Các tác dụng khác lên ung thư của các chat HDACi
Ngoài việc trực tiếp tác động lên sự tồn tại và phát triển của khối u, HDACi cịn có thể có các hoạt động khác gián tiếp ảnh hưởng lên sự phát
triển của khối u HDAC¡ có thể hoạt hóa phiên mã các protein MHC (major
histo-compatibility complex) nhém I va IL, cdc phân tử đồng kích thích CD40, CD80, va CD86, phan tir kết dính gian bao ICAM1 va interferon loai I va II,
nhằm làm tăng mạnh sự nhận biết và hoạt hóa các tế bào miễn dịch Thêm vào
đó, sự tồn tại và phát triển của các khối u rắn phát triển rộng và nhanh cần cung cấp oxy va chat dinh dưỡng một cách liên tục dé duy tri hé mach cua
khối u TSA có thê ức chế sự gây giám oxy huyết của yếu tố gây phát triển
màng trong mao mạch (VEGFE) và triệt tiêu sự hình thành mạch cả in vivo va in vitro Do đó, sự kích thích đáp ứng miễn dịch chính và sự ức chế hình thành mạch khối u có thể ngăn chặn sự phát triển của các khối u lớn và ngăn cản sự di căn [11]
1.2.2 Phân loại chất ức chế HDAC:
Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng để sử dụng
trong điều trị ung thư có thể được chia làm 4 nhóm dựa trên cấu trúc [18]:
> Các acid hydroxamic: SAHA, pyroxamid, TSA, oxamflatin va
Trang 21> Các acid béo chuỗi ngắn: 4-phenylbutyrat, acid valproic
> Cac tetrapeptid vòng: trapoxin, apicidin và depsipeptid (cũng
được gọi là FK-228 hay FR901228) > Các benzamid: MS-275, CI-994
1.2.2.1 Cac hydroxamat
Trichostatin A (TSA) 1a dan chat hydroxamat tự nhiên đầu tiên được
phát hiện có tác dụng ức chế HDAC TSA là một sản phẩm lên men của
Streptomyces Ban dau, TSA dugc str dung 1am chat chéng nắm, nhưng sau đó người ta đã phát hiện ra khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh các tế bào ung thư của nó TSA có tác dụng ở: viro ngay ở mức nồng độ nanomol Do việc
sản xuất TSA rất tốn kém và hiệu suất thấp (20 giai đoạn, với hiệu suất chỉ là 2%) nên việc tìm kiếm một HDAC¡ thay thế nó đang được tiến hành và rất
quan trọng Ngày nay, TSA được dùng chủ yếu làm chất đối chiếu trong việc tìm kiếm các các HDAC¡ mới Rất nhiều hợp chất tương tự TSA thuộc nhóm
hydroxamat đã được tìm ra, nhưng trong đó chỉ có oxamflatin là có tác dụng
in vitro trong ty TSA [22]
Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) cé cau tric tuong tu TSA va
la chat uc ché HDAC nhém I va II & néng d6 nanomol Ca SAHA va TSA
đều không ức chế HDAC nhoém III M-carboxycinnamic acid bishydroxamid
(CBHA) là một chất ức chế HDAC mạnh khác, nó là cơ sở câu trúc của nhiều
dẫn chất khác bao gồm LAQS824 và 1 dẫn chất sulfonamid PXD-101, ca hai
chất này đều ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol
Các HDACI có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng tương tác với vị trí xúc tác của HDAC, do đó chúng ngăn khơng cho cơ chất
tiếp xúc với ion Zn” tại vị trí của nó Nhược điểm của các hydroxamat là bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [30]
Trang 22Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat và các dẫn chất và
acid valproic có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, có tác dụng ở khoảng nồng độ micromol và ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen với các chức
năng tế bào khác nhau Những tác nhân này đã được đánh giá trong lâm sàng,
nhưng có chu kỳ bán hủy ngắn trong huyết tương và cần phải có nồng độ
tương đối cao (cỡ milimol) cho các hoạt động của chúng Gần đây, một hợp
chất có cầu trúc ghép giữa phenyl butyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận là có tác dụng ức chế ở nồng độ micromol thấp Cả valproic acid và
phenylbutyrat đều đã được sử dụng làm thuốc trên thị trường từ lâu, không phải với tác dụng chống ung thư Cho đến gần đây chúng mới được phát hiện
là có khả năng ức chế HDAC [32] 1.2.2.3 Các pepfid vịng
Nhóm các peptid vịng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất trong số các HDACI, bao gồm: depsipeptid tự nhiên (FK228), apicidin và các phần tử khác thuộc nhóm các CHAP (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng) Trong khi hầu hết các hợp chất này là sản phẩm của vi khuẩn hoặc nắm, thì apicidin va depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa acid hydroxamic và peptid
vòng Tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC mạnh ở mức nồng
độ nanomol [22]
Apicidin là chất được chiết xuất từ các thử nghiệm với ký sinh trùng,
chất này gây ra sự acetyl hóa quá mức histon trong ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum va tc ché histon deacetylase cua nhiều loại ký sinh
tring nhu Eimeria tenella (ICs9 = 0,7 nM) đồng thời cũng có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư bạch cầu Trong khi đó, các chất dẫn xuất như 9-hydroxy- hoặc 9-acyloxyapicidin đã được cấp bằng sáng chế nhưng chưa có báo cáo về hoạt tính sinh học nào
Trang 23ung thư phổi và ung thư tuyến vú, những kiểu ghép dị chủng u melanin, ngồi ra có tác dụng với ung thư bach cau cing loại ở chuột và u melanin Depsipeptide được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng vì hoạt tính chống ung
thư của nó có khởi đầu ấn tượng khi nó được phát hiện là một tác nhân ức chế HDAC ở mức nMol Kết quả đầu tiên cho thấy tác dụng điều trị trong bệnh
giảm tiểu cầu đột ngột có hồi phục như một tác dụng phụ ở mức liều tới hạn Các tetrapeptid vịng có chứa các nhóm chức năng trifuoroethyl và pentafluoroethyl ceton, liên kết với kẽm đã được tông hợp và là những chất
ức chế HDAC mạnh [12]
1.2.2.4 Cac benzamid
Nhém HDACi thir tu bao gém tập hợp các tác nhân trong cấu trúc có
chứa nhóm chức benzamid Nhóm này ức chế các HDAC bằng cách xâm
nhập vào vị trí xúc tác và liên kết với ion kẽm hoạt động Các chất thuộc
nhóm này gồm: MS-275 (có khả năng ức chế HDAC ở mức nồng độ micromol) và CI-994 (N-acetyldinalin) có tác dụng ức chế HDAC theo cơ chế chưa được xác định
Một nhóm các benzamid được phát hiện có hoạt tính ức chế HDAC ở
mức micromol thấp Một chức 2'- hydroxy hoặc amino được chỉ ra là cần
thiết cho hoạt tính của chúng và giá trị ICzo của những chất này là từ 2 đến 10 uM Hợp chất 2'-amino MS-275 (thường được gọi là MS-27-275 trong những báo cáo đầu tiên) là tác nhân ức chế HDAC đầu tiên được chứng minh có hoạt tính chống ung thư ở miệng trong các loại động vật Thêm vào đó, người ta chưa nhận thấy tác dụng bất lợi nào của chất này
Bảng 1.1 Một số chất ức chế HDAC đang được thử lâm sàng
Nhóm chất Hợp chất Pha Loại ung thư
Phenyl butyrat |I AML/MDS
Acid carboxylic acid valproic I, I AML, MDS, u trung biêu mô
Acid SAHA I, Il CTCL
Trang 24
hydroxamic LAQ824 I ung thu mau
PXD101 II ung thư máu LBH589 II, WI ung thư máu CRA 024781 I u lympho Hodgkin
SB-939 I MDS
u lympho, AML, u hic sac tơ
Các benzamd | số ác tính di căn tiền triển
MGCD0103 II ung thu bach cau, MDS peptid vòng Depsipeptid LH AML, CTCL, u đa tuỷ xương oO H N Ah Y1 SAHA oO H N Nt SS A oe: Pyroxamid BAe ON H Re % LT ey LVB-LAQ-824 xà LBB 589 HOHN Ss Dẫn chất của tetrapeptid vòng L/ (CHAP) _—"> NHOH Trichostatin (TSA) 9 9 H N SN O wo CBHA ° Oxamflatin Oo N we 57 À NHOH Oo PXD-101 O -_ C3 H ITF-2357 NEt,
Trang 251.2.3 Tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC
Người ta đã đưa ra các bằng chứng răng một chất ức chế HDAC nhất định có thể có tác dụng ức chế chọn lọc trên các HDAC khác nhau Một số ví dụ, TSA là tác nhân ức chế mạnh HDACI, 3 và 8, trong khi đó MS-275 ức
chế chọn lọc hơn trên HDACI với IC50 là 0,3 uM so với HDAC3 là 8 uM và không có tác dụng ức chế với HDAC8 Hai hợp chất mới được tông hợp và đã
được xác định là HDACi 1a: SK 7041 va SK 7046 có tác dụng chọn lọc hơn trên HDACTI và 2 [33]
Nghiên cứu về tính chọn lọc của các chất ức chế enzym histon deacetylase (HDAC¡) đối với từng loại HDAC là bước rất quan trọng giúp lựa
chọn chính xác các phác đồ điều trị bằng liệu pháp dùng HDAC¡ (cả đơn trị liệu và kết hợp) trong mỗi loại bệnh cụ thể có liên quan đến HDAC Vi vay di
đôi với các công trình nghiên cứu ra thuốc mới, thì việc nghiên cứu về đích tác dụng của thuốc trong mỗi loại ung thư cụ thê cũng rất được chú trọng Ở đây chúng tôi tông kết một số nghiên cứu về một số loại thuốc ức chế HDAC đang được dùng phô biến hiện nay (bang 1.2)
Bảng 1.2: Tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC
Loại enzym HDAC và nhóm tương ứng `
Trang 26<— 1 4 1 4 {1 3 <_ <_ <_ <_ <_ _ x _ _ x <— <— x x x x Lib did x x x LoL od ý } 4} ) )‡ ý 4 4 3 } } mm mm mm mm +— ý 3 4 ý X } ‡ x xẻ Chú thích: |: ức chế, x: không có tác dụng
1.2.4 Liên quan cấu trúc-tác dụng của các chất ức ché HDAC Phần mang dược tính của các chất ức chế HDAC thông thường bao
gồm [8,9,16, 17]:
- Nhóm gan với kẽm (ZBG): tương tác với Zn” ở vị trí hoạt động của
cac enzym HDAC: acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton Với
các chất ức chế HDAC có nhóm hydroxamic, in Zn** tao 2 lién két phối trí với 2 nguyên tử oxy của nhóm hydroxamIc
- _ Vùng cầu nối sơ nước: là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hay vịng, có thê no hoặc không no, nằm trong lòng mạch enzyme
Trang 27miệng túi trong cầu tạo của kênh enzyme HDAC được tạo nên từ vài vòng xoan protein
cầu nối
nhóm nhận diện bê mặt nhóm gắn với kẽm
Hình 1.6 Phần mang dược tính của các chất ức chế HDAC
Khi phân tích cấu trúc tia X của một đồng đẳng của HDAC, protein
giống HDAC (HDLP), kết hợp được với SAHA hay TSA, và gần đây khi
nghiên cứu HDAC8 ở người, người ta đã xác định được ZBG tương tác với
một ion Zn”" của vị trí hoạt động có dạng túi (Zn”" ở đáy của túi) [9] Dây nối
sơ nước đưa ZBG đến vị trí hoạt động một cách có hiệu quả bằng cách lap kin túi Trong khi đó, nhóm khóa hoạt động ở phía bên kia của dây nối liên kết với những đuôi amino acid ở mép túi Cầu trúc ZBG thông thường của những chất ức chế HDAC là một nửa hydroxamat Sự thay đổi cấu trúc của ZBG
hydroxamat đạt được một số thành công; sinh ra những đẳng vị như
benzamid, những œ-ketoester, những keton ái điện tử, mercaptoamid và những phosphonat [9]
Trong một chất ức chế HDAC nguyên mẫu, nhóm khóa hoạt động có thé được nối với dây nối sơ nước thông qua những nhóm cho hay những nhóm nhận liên kết hydro khác như những nhóm keto- và amid- Sự thiếu hụt những nhóm cho hay những nhóm nhận liên kết hydro trong một nửa dây nối
đưa đến một cơ hội liên kết với những nhóm khác mà dễ tổng hợp hơn và có được động học thuận lợi hơn từ đó có thể giúp đơn giản hóa việc thiết kế và
tổng hợp những chất ức chế HDAC mới Trong khi cá TSA và SAHA có cầu nối chứa các nhóm carbonyl (tương ứng với keto và amid), các nghiên cứu đã
Trang 28nhóm này thể hiện tác dụng ức chế trung bình trong các thử nghiệm với
enzym Từ đó ta có thể thấy rằng nguyên tử oxy xen giữa vòng thơm và dây nối alkyl là một yếu tố có thê phát triển và tạo ra nhiều chất ức chế HDAC
tiềm năng hơn so với các dẫn xuất thioete
Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl- acid hydroxamic
đã được biết đến nhiều, ví dụ như SAHA Cấu trúc của chúng bao giờ cũng
bao gồm 3 phần chính A-B-C [29]
- phần A liên quan đến hiệu lực và tính đặc hiệu ( thường là aryl)
- Phần B là cầu nối như amid-alkyl
- Phần C là nhóm gắn kết với Zn: acid hydroxamic
Cho đến nay phần lớn các nghiên cứu liên quan cấu trúc -tác dụng đều tập trung tìm hiểu vai trị của nhóm gắn kết Zn, cố gắng ngiên cứu thay thế acid hydroxamic và một vài cầu nối Sau đây là tổng kết liên quan cấu trúc- tác dụng của một dãy các dẫn chất của acid hydroxamic đã được nghiên cứu [29] aooe , ° ° “ ` ` wane ‘ 2®& Co ` có ‘ ‘ CC + N a os : EAB ` >, oO oN : / 2, vờ , ` “xz Q7 ` / oo , ` ' ; 2 Ss, “, cac CHỢ TT pt 8n nnnrnrerenrne a Art ó ‘ Nhan thom ' n" Nhóm '
tốt hơn Nếu ; 0 10 hydroxamic ! có cầu nối ‘ SAHA (n= 4) cầncho : : với amid, cầu 'O ; tacdung | ; nối không no tốthơn Ard “NYA ul ‘ NHOH mạnh
‘ ‘ n1 ' 1 a 1 CC 10 ÝNHm=m————mm=m=m=m=m=m===e :
Hình 1.7 Liên quan cấu trúc — tác dụng của các chất ức chế HDAC
Trang 29Các nghiên cứu thiết kế công thức cho các HDAC¡ mới đều dựa trên việc thay đôi cấu trúc của 3 phần: cầu nối, nhóm gan kẽm, nhóm nhận diện bề mặt.'
1.2.4.1 Thay đổi nhóm tạo chelat với kẽm
Khả năng tạo phức với ion Zn”” tại trung tâm hoạt động của HDAC quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của các HDACI Hiện nay, 1 số nhóm có thể có liên kết với Zn”*' bao gồm hydroxamic acid, sulfanamid, nhóm chức aminoamilin, thiol, acid carboxylic Nhóm acid hydroxamic tạo chelat bền vũng với Zn” nhất và vẫn là một nhóm chức quan trọng trong nghiên cứu
HDACi Hau hét cdc dan chat acid hydroxamic đều ức chế HDAC ở nồng độ
nM Mặt khác, việc thay đôi nhóm A cũng làm thay đổi tính chọn lọc của
HDAC¡: các hợp chất benzamid (BZG là o-aminoanilin) chủ yếu ức chế chọn
lọc HDAC nhóm I, còn sulfamid lại chủ yếu ức chế HDAC6 [21]
1.2.4.2 Thay đổi phần cầu nối
TSA và SAHA là 2 điển hình cho phần cầu nối có 5-6 carbon, chúng
thể hiện tác dụng ức chế HDAC mạnh Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng khoảng cách tốt nhất giữa nhóm hydroxamic aicd và phần (C) là 5, 6, 7
nguyên tử carbon, với khả năng ức chế theo thứ tự số nguyên tử carbon là
6>5~7>>4, 3 Trong phần cầu nối, liên kết amid có vai trò khá quan trọng Phân cầu nối chứa vòng thơm, có thể ánh hưởng đến tác dụng ức chế chọn lọc HDAC, cũng như đến hiệu lực của HDACi Nếu cầu nối là mạch carbon béo
mà thiếu nhóm nhận diện bề mặt như các acid béo mạch ngắn thì hầu như khó tương tác với túi enzym của HDAC nhóm IIb Việc đảo chiều liên kết amid
cũng làm thay đổi tác dụng HDACI
1.2.4.3 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt:
Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt nhằm khai thác sự khác biệt ở phần miệng kênh enzym giữa các HDAC, từ đó có thê thiết kế công thức làm tăng
Trang 30yếu là các vịng, có thể là vòng thơm hoặc peptid vòng Các nghiên cứu cho thấy nhóm nhận diện bề mặt là vịng thơm thì tác dụng tốt hơn vòng no Mặt khác vòng lớn thường tốt hơn vịng nhỏ Ví dụ khi thay thế nhóm phenyl của SAHA bang vong indol thì ICzo của dẫn chất indol nhỏ hơn SAHA nhiều lần
Việc thay đơi phần (C) cịn ảnh hưởng đến khả nang tc ché chon loc của các HDACi, nhóm nhận diện bề mặt nhỏ thường tạo ra các HDAC¡I không chọn lọc, còn các vòng lớn như peptid vịng thì làm tăng khả năng ức chế chọn lọc: SAHA và các acid hydroxamic có phần (C) nhỏ ức chế không chọn loc HDAC I va II, trong khi CHAP (các hydroxamic tổng hợp chứa peptid vòng) chi tc chế chọn lọc một s6 HDAC nhémI Diéu này có thể do HDAC nhóm II có phần vành trên bề mặt miệng túi enzym được tạo thành từ 2 vòng xoắn có thể ngăn cản liên kết với phần peptid vòng của HDACi¡ Cấu trúc càng công kểnh thì càng khó tương thích với các HDAC khác nhau mặc dù chúng vẫn thể hiện tác dụng ức mạnh HDAC Tuy nhiên nhóm nhận diện bề mặt quá lớn cũng làm giảm tác dụng do làm cho HDAC khó thâm nhập vào vị trí xúc tác của HDAC Nếu là vòng thơm nhỏ, muốn thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc thì phải tăng số lượng vòng thơm trong nhóm nhận diện bề mặt, tạo liên kết amid giữa các vòng thơm với nhau sẽ tăng tác dụng ức chế chọn lọc Khi vòng thơm có thêm nhóm halogen cũng có thể làm tăng hoạt tính [21,
28]
Khi phân tích cấu tạo trung tấm hoat động của dạng túi của HDAC, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm Sigma-Tau (Ý) đặc biệt chú trọng phần miệng túi với các vịng aminoacid có thể tham gia tương tác quan trọng với các nhóm nhận diện bề mặt hoặc các nhóm lân cận Phần nhận diện bề mặt tại trung tâm hoạt động của HDAC chấp nhận một hệ vòng khá đa dạng, từ indol,
bemzofuran, quinolin, benzodioxol Nhóm Nitơ trong cấu trúc của phần
Trang 31đó tăng hoạt tính của các chất ức chế HDAC Vì vậy, các nghiên cứu khảo sát
dẫn chất ức chế HDAC bằng cách thay đổi nhóm khố hoạt tính (thay thé vi
tri phenyl bang các nhân thơm như benzothiazol, phenylthiazol, isoxazol )
trong SAHA có tính khả quan cao
1.3 Phản ứng hóa học
1.3.1 Phản ứn ngưng tụ loại nước: phản ứng giữa aldehyd, ceton với amin tao base Shif
Đây là phản ứng đặc trưng của nhóm carbonyl, phản ứng xảy ra như sau
%=o + HNR —=m CC oe =N
NHR
1.3.2 Phản ứng tông hợp amid
Amid là dẫn chất của acid dẫn chất của acid carboxylic trong đó nhóm hydroxyd của carboxyl được thay bằng nhóm amin.[5]
Nhóm amid có cơng thức: &
~NH»
Có hai loại amid thế là Amid 1 lần thế (1) và amid 2 lần thế (2)
O
oP —œ£ Ry
X NF
NHR Nw
(1) (2) Ro
Để điều chế amid từ amin bậc 1, thường sử dụng các tác nhân acyl hóa
sau đây:
- Phương pháp 1: tác nhân acyl hóa là halogenid, thường dùng là các
Trang 32H
R,; py Hạ
bị H 6 NHR
- Phương pháp 2: tác nhân acyl hóa là anhydrid acid, , xúc tác pyridine hoac triethylamin TEA, dung môi dicloromethan hoặc dimethylformamid DME
Rà ⁄ O H R 1
CE b H 6 NHR
RZ“ À
- Phương pháp 3: tác nhân acyl hóa là acid carboxylic
R; ⁄ O H R 1
Xứ + = — CL
\ OH H ⁄ O Z `NHR
Acid carboxylic là tác nhân oxy hóa yếu, để acyl hóa cần có xúc tác
Trang 33Đề hạn chế phản ứng phụ, thường chọn dung mơi có hằng số điện môi thấp như chloroform, đicloromethan Các carbodiimid hay dùng là N,N- dicyclohexylcarbodiimid (DDC), N,N-diisopropylcarbodiimid (DIC), 1-ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)
¿N ¿N of yo” yo” x^W
DIC
DCC
1.3.3 Phản ứng tông hợp hydroxamic acid
Có nhiều cách để tổng hợp acid hydroxamic từ ester, hay dùng nhất với xúc tác KCN hoặc NaOH Các phản ứng được tiến hành như sau:
KCN
Trang 34NaOH
RCOOMe +NHOH —P RCONHOH H;O/MeOH
Tùy trường hợp cụ thê, đối với các chất khác nhau, điều kiện tiến hành
Trang 35CHUONG 2 NGUYEN LIEU, THIET BI, NOI DUNG VA
PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.1.Nguyên liệu
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich và được sử dụng trực tiếp khơng có tinh chế gì thêm
2.1.1 Hóa chất chính
v Thiosemicarbazid ¥ Cac benzaldehyd: Y= FeCl3.12H,O e Benzaldehyd
¥ Acid monomethyl suberic e 2-Cloro-benzaldehyd ¥ Carbonyl diimidazol e 3-Cloro-benzaldehyd
Ơ Hydroxylamin.HCl e 4-Cloro-benzaldehyd đ 4-Methoxy-benzaldehyd 2.1.2 Dung môi và các hóa chất khác
DME Aceton MeOH Acid acetic bang n-Hexan HCl EtOH NaOH Dicloromethan Nước cất
2.2 Thiết bị, dụng cụ
- Bình cầu đáy trịn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt,
sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, pipet, bình chiết, phếu thủy tỉnh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)
- TLC tién hanh trén ban mong silicagel Merck 70-230 mesh
- Nhiệt d6 néng chay (T°,,) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng
cháy nhiét dién (Electrothermal digital)
- Phé hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer, st dung ky
thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-600 cm” tại phịng thí nghiệm bộ mơn
Trang 36- Phố khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phố Agilent 6310 lon Trap MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam
- Phố cộng hưởng từ hạt nhân proton 'H-NMR, '“C-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500, dùng DMSO làm dung môi Độ chuyên dịch hóa hoc (8) duoc biéu thi bang don vi phan triéu (parts per million - ppm), lay mốc là pic của chất chuẩn ndi tetramethylsilan (TMS) [3]
2.3 Nội dung nghiên cứu Tổng hợp 5 chất: NÌ-hydroxy-NƯ-(5-phenyl- 1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid N' -hydroxy-N*-[5-(2-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid N' -hydroxy-N*-[5-(3-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid N' -hydroxy-N*-[5-(4-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid N' -hydroxy-N*-[5-(4-methoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid Thử tác dụng ức chế enzyme histon deacetylase của các dẫn chất tổng hợp được
Thử độc tính tế bào ung thu (in vitro) cua các dẫn chất ức chế HDAC tổng hợp được
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Tông hợp hóa học và kiểm tra độ tỉnh khiết
v Nghiên cứu tổng hợp 5 chất trong mục tiêu bằng phương pháp hóa học
- Phản tmg amid hoa ding dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hoac 1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (CDI)
- Một số phản ứng khác
Các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol (với
mạch chứa nhóm acid hydroxamic găn vào vị trí số 2) dự kiến được tông hợp
Trang 37thiosemicarbazid —> XuuN ANH H E 5 N-N Ar H ethanol, acetic Ar~ SN T ethanol, reflux Ar A, Hạ
monomethy! suber suberat / NH;OH.HCI OH.HC]I
“CDLDMF es VY hết MeOH, NaOH
N-N O
Ar S NH ‘OH
O
Trong d6 Ar = Phenyl Ar = 4-Cl-Phenyl Ar = 2-Cl-Phenyl Ar = 4-methoxy-Phenyl Ar = 3-Cl-Ph
Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng
⁄ Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy 2.4.2 Xác định cấu trúc: Sử dụng các phương pháp phố bao gồm:
- Phô hồng ngoại (IR) - Phổ khối (MS)
- Phê cộng hưởng từ hạt nhân (H NMR và '“C NMR)
2.4.3 Thử tác dụng ức ché enzym histon deacetylase:
Tác dụng ức chế hoạt tính HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3 trong rVSMCs
Phân tích dựa trên Western blot có thê khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3 khi so sánh với mẫu trắng
Trang 382.4.4 Thử độc tính tế bào in vitro:
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tinh té bao) in vitro duoc thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị ICzo được tính trén phan mém GraphPad Prism Dòng tế bào thử nghiệm:
e SW620: tế bào ung thư đại tràng e© MCE-7: tế bào ung thư vú e AsPC-1: tế bào ung thư tụy
e PC-3: tế bào ung thư tiền liệt tuyến
e© NCI-H460: tế bào ung thư phổi
Giá trị ICszo là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm dung môi pha chất thử):
kết quá cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp
thụ khác nhau không quá 5% Giá trị ICszo được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism Trong phương pháp thử này, ICs) < 20 ug/ml duge coi là có hoạt tính
2.4.5 Nghiên cứu docking của các chất:
Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác của 1 số chất với HDAC
(docking) được thực hiện tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc Để tìm hiểu sơ bộ tương tác liên kết của các chất với
HDAC, chúng tôi đánh giá tương tác với HDACS8 cho các chất tổng hợp
Trang 39CHUONG 3 THUC NGHIEM, KET QUA 3.1 Tổng hợp hóa học
Q trình tơng hợp 5 chất trong luận văn này được tiến hành theo sơ
đồ
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung nN | Snes, s vas JI ZZ la-e a-e + Ny Aen oe = AO
Tác nhân va diéu kién: i) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic bang, héi
luu, 4h; ti) F eCl3.1 2H20, ethanol, 1 00°C, I/4h; iii) acid monomethyl suberic, CDI, DMF, hdi luu, 24h; iv) hydroxylamine.HCl, NaOH, DMF, methanol,
0°C, 1-2h
3.1.1 Tổng hợp ?NÍ-hydroxy-NŠ-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2- yl)octandiamid” (5a)
Trang 40NÀ H | À Tu, CHO SUN N NH, 5 " i Y4 ii iii C CY | la ra Ja O O Ụ O
i | À— H 5 OCH; 1 \ Ark | À—¬ H s_ TNHUH
§ iv S
4a Sa
So đồ 3.2 Quy trình tơng hợp chất 5a
Tác nhân và điều kién i) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic bang, hôi luu, 4h; ti) FeCl3;.12H20, ethanol, | 00°C, I/Ah; iii) acid monomethyl suberic,
CDI, DMF, hoi luu, 24h; iv) hydroxylamine.HCl, NaOH, DMF, methanol,
0°C, 1-2h
a Tổng hợp chất 2a
Đề tông hợp chất 5a cần tông hợp 2-phenylidenhydrazincarbothioamid (2a) Tổng hợp chất 2a từ benzaldehyd (1a) được chúng tôi thực hiện bằng phán ứng ngưng tụ với xúc tác là acid hữu cơ, tiên hành phản ứng như sau:
v Tiến hành phản ứng:
Thêm 20ml dung môi EtOH tuyệt đối và 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác vào bình cầu 50ml chứa hỗn hợp gôm (0,2 ml; 2mmol) benzaldehyd (la) va (0,218g; 2,4mmol) thiosemicarbazid, khuấy 300 vòng/phút và hồi lưu trong 4h
v Thu sản phẩm:
Hỗn hợp sau phản ứng được đưa về nhiệt độ phòng Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40°C trong 2 phút Thêm 15ml nước cất để tủa sản phẩm Lọc và rửa tủa 3 lần băng 15ml nước cất Sây khô tủa ở 60°C (trong khoảng 48h)
v Kết quả: