Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3 oxim isatin hướng ức chế histon deacetylase

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AML Acute myeloid leukemia bệnh bạch cầu cấp dòng tủy AML-ETO Protein gây tăng sinh APL Acute promyelocytic leukemia ung thư bạch cầu APAF1 Apoptoic

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-

HISTON DEACETYLASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI-2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-

LỜI CẢM ƠN

Những dòng đầu tiên của khóa luận, tôi xin được dành để gửi lời cảm ơn tới thầy cô

và các bạn, những người đã đồng hành và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành

kh óa luận

Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành tới những người thầy,

người cô đáng kính của tôi tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại Học Dược Hà Nội: PGS TS Nguyễn Hải Nam, TS Phan Thị Phương Dung và DS Nguyễn Thị Mơ Các thầy cô đã

luô n ở bên cạnh chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, giúp tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Bên cạnh đó, tôi cũng mong được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo cũng như các anh chị kỹ thuật viên tại bộ môn Hóa Dược, trường đại học Dược Hà Nội Mọi người thật

sự đã giúp đỡ rất nhiều, tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi cùng nhóm thực nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài tốt nghiệp tại bộ môn

Ngoài ra không thể không kể tới sự đồng hành của các anh chị và các bạn trong nhóm thực nghiệm Sự chia sẻ và động viên của mọi người là nguồn động lực rất lớn của tôi trong suốt thời gian thực nghiệm khoa học

Và cuối cùng tôi muốn gửi sự biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và người thân của tôi, những người đã luôn ở bên giúp đỡ tôi trong mọi hoàn cảnh

Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2013

Sinh viên

Trần Thị Lan Phương

Trang

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.1.1 Định nghĩa và vai trò của HDAC trong cơ thể 2

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 10 1.2.3 Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC 12

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

17

2.4.2 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 20

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.2.1.2 Tổng hợp các acid hydroxamic 2a-d 27

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AML Acute myeloid leukemia (bệnh bạch cầu cấp dòng tủy)

AML-ETO Protein gây tăng sinh

APL Acute promyelocytic leukemia (ung thư bạch cầu)

APAF1 Apoptoic protease activating factor (yếu tố hoạt hóa protease)

CHAP Cyclic hydroxamic- containing peptid (các dẫn xuất của acid tetrapeptid

hydroxamic vòng)

CD Receptor gây chết nội tại

CBHA m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamid

DMF Dimethyl formamid

DMSO Dimethyl sulfoxid

DMSO-d6 Dimethyl sulfoxid đã được deuteri hóa

FBS Fetal bovine serum (huyết thanh bào thai bò)

HDAC Enzym histon deacetylase

HDACi Histon deacetylase inhibitor (Chất ức chế enzyme histon

deacetylase) HAT Enzym histon acetyltransferase

IC 50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào

IHCM1 Intercellular adhesion molecule 1(phân tử kết dính gian bào)

NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PLRF The Promyelocytic leukemia zinc finger (bệnh lơ-xê-mi cấp tiền tủy

bào)

RA Retinoic acid

RAR Retin oic acid receptor alpha (receptor của acid retinoic)

ROS Reactive oxygen species (gốc oxy tự do hoạt động)

SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic

TLC Phương pháp sắc ký lớp mỏng

TSA Trichostatin

VEGF Vascular endothelial growth factor (yếu tố gây phát triển màng

trong mao mạch)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

3.1 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các acid hydxamic 28 3.2 Số liệu phân tích phổ khối của các acid hydroxamic 29 3.3 Số liệu phân tích phổ IR của các acid hydroxamic 30 3.4 Số liệu phân tích phổ 1

H- NMR của các acid hydroxamic 31 3.5 Số liệu phân tích phổ 13

C- NMR của các acid hydroxamic 32

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1.2 Vai trò cân bằng của HDAC và HAT với sự phiên mã 3

1.4 Vai trò của sinh học của HDAC trong sinh lý tế bào ung thư 6 1.5 Công thức cấu tạo của Trichostatin (TSA) 7 1.6

Công thức cấu tạo của suberoylanilid hydroxamic acid (SAHA) 7

1.8 Công thức cấu tạo của depsipeptid FK228 9

1.10 Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố 13 1.11 Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất

-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-38

3.3 Công thức tổng quát chất dãy chất acid hydroxamic mang khung

benzothiazol

38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thời kỳ đầu thế kỷ XX trở về trước, việc nghiên cứu, phát triển thuốc mới hầu hết dựa trên kinh nghiệm Gần đây những thành tựu trong lĩnh vực di truyền học phân tử đã mở ra triển vọng cho việc tìm kiếm, phát hiện mục tiêu phân tử thuốc Nghiên cứu chi tiết các bản đồ gen cho phép xác định được nhiều enzym, protein, thụ thể khác nhau có khả năng sử dụng như các mục tiêu phân tử cho phát triển thuốc mới trong tương lai

Một trong những ví dụ điển hình là việc tìm ra vai trò của enzym histon deacetylase trong sinh lý bệnh ung thư Quá trình phiên mã hoặc biểu hiện bất thường do những gen mã hóa histon deacetylase hay những phần gắn chúng

bị đột biến là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến quá trình tấn công

và phát triển của ung thư Các chất ức chế histon deacetylase có thể phục hồi lại sự biểu hiện gen, ức chế sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư Một loạt các chất ức chế histon deacetylase đã được nghiên cứu phát triển Trong

đó acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là một ví dụ điển hình Với tên thương mại là Vorinostat (Zolinza®) loại thuốc này đã được Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược cũng đã tham gia nghiên cứu thiết kế và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế histon deacetylase và cho những kết quả bước đầu khả quan Tiếp tục hướng đi đó,

chúng tôi đã thực hiện đề tài “Tổng hợp một số acid hydroxamic mang

đây:

* Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid và một số dẫn chất

* Bước đầu thử tác dụng ức chế HDAC và đánh giá độc tính trên tế bào ung thư đại tràng SW620 của các dẫn chất tổng hợp được

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ENZYM HISTON DEACETYLASE

1.1.1 ĐỊNH NGHĨA VÀ VAI TRÒ CỦA HISTON DEACETYLASE TRONG CƠ THỂ

Mỗi loài sinh vật eukaryote đều có bộ nhiễm sắc thể đặc trưng về số lượng, hình thái và cấu trúc Đơn vị cấu trúc cơ bản của nhiễm sắc thể là các nucleosom Một nucleosom điển hình được hình thành do một chuỗi ADN khoảng 146 cặp nucleotid quấn quanh một lõi protein gồm 8 phân tử histon (2 H2A, 2 H2B, 2 H3 và 2 H4) [14](xem hình 1.1)

Hình 1.1 : Cấu trúc của histon trong nucleosom

Phân tử histon là một protein tích điện dương nên tương tác mạnh với phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom

và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể, quy định quá trình biểu thị gen Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu chịu ảnh hưởng của quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon Dưới tác dụng của enzym histon deacetylase (HDAC), gốc acetyl được tách khỏi ε-N-acetyl lysine amino acid ở phần đuôi protein histon và chuyển tới coenzym A, làm tăng

điện tích dương trên histon, ức chế phiên mã Trong khi đó enzym histon acetyltranferase (HAT) có tác dụng ngược lại [14] (xem hình 1.2)

1.1.2 PHÂN LOẠI HDAC

Hiện nay người ta đã biết 18 HDAC khác nhau, được chia làm 4 nhóm dựa trên chức năng và sự tương đồng với HDAC nấm men [13]

* Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 Các enzym này chỉ có trong nhân tế bào

* Nhóm IIa: HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9 Nhóm IIb: HDAC6, HDAC10

Các enzym này có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân, trừ HDAC6 chỉ có ở tế bào chất

* Nhóm III: các protein điều hòa chuỗi thông tin 2 (sir2 hay sirtuins) [14]

- Chất đồng đẳng của Sir2 trong Saccharomyces cerevisiae

- Sirtuins trong động vật có vú (sirt1, sirt2, sirt3, sirt4, sirt5, sirt6, sirt7)

* Nhóm IV: HDAC 11, có ở trong nhân của nhiều tế bào, tuy nhiên phức hợp HDAC11 với HDAC6 lại nằm trong bào tương, chủ yếu có ở tim,

cơ trơn, thận, não

Nhóm I, II và IV được coi như những HDAC “cổ điển” Các HDAC này và các sirtuins có cơ chế xúc tác khác nhau Các HDAC “cổ điển” là các enzym phụ thuộc Zn2+, chúng có chứa một túi xúc tác với một ion Zn2+ ở đáy túi và có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic, thiol Những hợp chất này không có tác dụng chống sirtuins vì sirtuins có cơ chế hoạt động phụ thuộc NAD+ như một cofactor thiết yếu [7] Thuật ngữ “các chất ức chế HDAC” thường được sử dụng cho những chất có mục tiêu phân tử là các HDAC “cổ điển”.

1.1.3 CẤU TẠO CỦA HDAC

Cho tới nay, bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X người ta xác định được cấu trúc 3D của hầu hết các HDAC và các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl của chúng [25] Theo đó, cấu trúc HDAC gồm các phần cơ bản sau:

- Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí Thông thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+

thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh

- Kênh enzym là nơi chứa đựng các cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất Kênh này có cấu trúc dạng túi Nó được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với

cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl

- Ngoài ra ở HDAC8 người ta còn tìm thấy có bốn ion K+

trong đó mỗi tiểu phân gồm 2 ion Các ion này đều tham gia 6 liên kết phối trí Ion thứ nhất cách ion Zn2+ khoảng 0,7nm và liên kết với 6 acid amin Ion thứ 2 nằm xa hơn

liên kết với 4 acid amin và 2 phân tử nước (xem hình 1.3)

Hình1.3 : Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC8

1.1.4 HDAC VÀ UNG THƯ

Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thư [19, 22] Cụ thể, mối tương quan giữa hoạt động của HDAC và sự tạo thành khối u thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính (APL) Sự biến đổi trong cấu trúc chất nhiễm sắc có thể tác động lên quá trình biệt hóa các tế bào bình thường, kết quả dẫn tới sự hình thành khối u Ngoài

ra trong các tế bào ung thư người ta còn thấy sự hoạt động quá mức của HDAC như ung thư cổ tử cung (HDAC2) [16], ung thư dạ dày (HDAC1, 2) [10, 23,24]]; ung thư phổi (HDAC1, 3) [30, 34], ung thư đại tràng (HDAC1,

3, 6) [10, 30]

Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình, kể cả

sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch [9, 12, 19, 22] Vai trò của các

HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thư được tóm tắt như hình 1.4

Hình 1.4 : Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 PHÂN LOẠI CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

Từ những phát hiện đầu tiên về tác dụng ức chế HDAC của natri butyrat [9] đã có những đề tài rất đáng lưu ý trong việc nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế HDAC có tác dụng kháng tế bào ung thư Ngày nay có khoảng 15 chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị ung thư và được chia làm 4 nhóm dựa theo cấu trúc – tác dụng [12]

- Các hydroxamat: TSA, SAHA, CBHA

- Các peptid vòng: depsipeptid, CHAPs

- Các acid béo mạch ngắn: butyrat, phenylbutyrat, valproic acid

- Các benzamid: N-acetyldinalin, MS-275

Mỗi nhóm nêu trên đều có những hạn chế nhất định như:

- Các hydroxamat bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc lên các loại enzym HDAC

- Các benzamid và acid béo có hiệu lực kém

- Các peptid vòng khó tổng hợp vì cấu trúc phức tạp

Sau đây chúng tôi xin đề cập cụ thể hơn về các dẫn chất này:

1.2.1.1 Các hydroxamat

Trichostatin A (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên được phát hiện có tác dụng ức chế HDAC Do việc sản xuất TSA rất tốn kém và hiệu suất thấp (phải trải qua 20 giai đoạn với hiệu suất chỉ là 2) nên ngày nay TSA chỉ được dùng chủ yếu làm chất đối chiếu trong việc tìm kiếm các

HDACi mới [21] (xem hình 1.5).

Hình 1.5 : Công thức cấu tạo của trichostatin (TSA)

Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) có cấu trúc tương tự TSA và

là chất ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol Cả SAHA và TSA đều không ức chế HDAC nhóm III [20](xem hình 1.6)

M-carboxycinnamic acid bishydroxamid (CBHA) là chất ức chế HDAC mạnh khác Nó là cơ sở cấu trúc của nhiều dẫn chất khác bao gồm LAQ824 và một dẫn chất sulfonamid PXD-101, cả hai chất này đều ức chế HDAC nhóm I

và II ở nồng độ nanomol [19, 21, 27]

Các HDACi có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng tương tác với vị trí xúc tác của HDAC, ngăn không cho cơ chất tiếp xúc với

ion Zn2+ tại vị trí của nó Nhược điểm của các hydroxamat là bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [28]

1.2.1.2 Các acid béo mạch ngắn

Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat cùng các dẫn chất và

các acid valproic (xem hình 1.7) có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, ở khoảng nồng độ micromol Gần đây, một hợp chất có cấu trúc ghép giữa phenylbutyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận là có tác dụng ức chế ở nồng độ micromol thấp [30]

Hình 1.7 : Công thức cấu tạo của acid valproic

1.2.1.3 Các peptid vòng

Nhóm các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất trong số các HDACi, bao gồm: depsipeptid tự nhiên (FK228), apicidin và các phần tử khác thuộc nhóm các CHAPs (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng) Trong khi hầu hết các hợp chất này là sản phẩm của vi khuẩn hoặc nấm, thì apicidin và depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa acid hydroxamic và peptid vòng Tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC mạnh ở mức nồng độ

nanomol [9] (xem hình 1.8)

Các tetrepeptid vòng có chứa các nhóm chức năng trifluoroethyl và pentafluoroethyl ceton, liên kết với kẽm đã được tổng hợp và là những chất ức chế HDAC mạnh [11]

1.2.1.4 Các benzamid

Nhóm HDACi thứ tư bao gồm các tác nhân trong cấu trúc có chứa nhóm chức benzamid Nhóm này ức chế các HDAC bằng cách xâm nhập vào

vị trí xúc tác và liên kết với ion kẽm hoạt động Các chất thuộc nhóm này

gồm: MS-275 (có khả năng ức chế HDAC ở mức nồng độ micromol) (xem

hình 1.9) và CI-994 (N-acetyldinalin) có tác dụng ức chế HDAC theo cơ chế chưa được xác định, giá trị IC50 từ 2 đến 10 micromol Người ta chưa nhận

thấy tác dụng bất lợi nào của chất này [17]

1.2.2 CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi)

Tác dụng chống ung thư của các HDACi bắt nguồn từ khả năng tác động lên nhiều giai đoạn chu trình tế bào đã bị biến đổi ở các tế bào ung thư

Hơn thế nữa các HDACi tác dụng chọn lọc trên tế bào ác tính có thể do HDACi làm tăng sinh yếu tố ROS (reactive oxygen species) – gốc tự do oxy hóa [12, 13]

Các HDACi tác động tới tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu dưới đây [12, 13, 18]:

- HDACi ức chế chu trình tế bào, hoạt hóa các chương trình biệt hóa

- HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình (sau khi phát hiện được các sai lệch về gen trong khi kiểm tra giai đoạn G2, tế bào ung thư được đưa vào chu trình gây chết tế bào aptosis)

- HDACi ức chế sự tạo mạch

1.2.2.1 Các chất HDACi gây ra sự biệt hóa

Khi là tác nhân riêng lẻ, các HDACi có thể ức chế chu trình tế bào khiến cho nhiều loại tế bào ung thư bạch cầu và u rắn khác nhau phải thể hiện đặc tính biệt hóa và ngừng tăng sinh Phân tích các số liệu về chu trình tế bào của các tế bào ung thư đã được điều trị với HDACi cho thấy các tế bào thường dừng ở pha G1 nhưng đôi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình

Sự biệt hóa của tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của RARα và protein gây ung thư PLZF-RARα làm ngắt quãng chương trình biệt hóa bình thường HDACi có thể kết hợp với RA để tạo ra sự biệt hóa tế bào

APL kháng hóa trị liệu PLZF-RARα cả in vivo và in vitro [16] Tuy nhiên

HDACi cũng có thể gây ra sự biệt hóa ở rất nhiều loại tế bào khác, và các hiện tượng phân tử có liên quan tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn chưa được sáng tỏ [9]

1.2.2.2 Các chất HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình

Quá trình điều trị các tế bào ung thư với HDACi có thể dẫn đến sự gây chết tế bào theo chương trình với mục đích kiểm soát số lượng tế bào bất thường trong quá trình phát triển [9] Người ta đã xác định hai con đường chết nội bào với chức năng riêng biệt nhưng có mối liên hệ phân tử với nhau HDACi đã được ghi nhận là hoạt hóa cả chu trình gây chết receptor và gây chết tế bào nội sinh Ví dụ apicidin và CBHA có thể kích thích sự biểu hiện của CD95 và phối tử CD95 (CD95L) và việc ức chế sự phát tín hiệu của CD95 sẽ kháng lại sự gây chết tế bào do apicidin gây ra [19]

1 2.2.3 HDACi ức chế sự tạo mạch

Ngoài việc trực tiếp tác động lên sự tồn tại và phát triển của khối u,

HDACi còn có thể có các hoạt động khác gián tiếp ảnh hưởng lên sự phát triển của khối u HDACi có thể hoạt hóa phiên mã các protein MHC (major histo-compatibility complex) nhóm I và II, các phân tử đồng kích thích CD40, CD80 và CD86, phân tử kết dính gian bào ICAM1 và interferon loại I và II, nhằm làm tăng mạnh sự nhận biết và hoạt hóa các tế bào miễn dịch Thêm vào

đó, sự tồn tại và phát triển của các khối u rắn phát triển rộng và nhanh cần cung cấp oxy và chất dinh dưỡng một cách liên tục để duy trì hệ mạch của khối u TSA có thể ức chế sự gây giảm oxy huyết của yếu tố gây phát triển

màng trong mao mạch (VEGF) và triệt tiêu sự hình thành mạch cả in vivo và

in vitro Sự kích thích đáp ứng miễn dịch chính và sự ức chế hình thành mạch khối

u có thể ngăn chặn sự phát triển của các khối u lớn và ngăn cản sự di căn [11]

1.2.3 LIÊN QUAN GIỮA CẤU TRÚC VÀ TÁC DỤNG CỦA CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC MANG CẤU TRÚC ACID HYDROXAMIC

1 2.3.1 Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC mang cấu trúc acid hydroxamic

Dựa trên nghiên cứu cấu trúc enzym đích HDAC, nhóm nghiên cứu tại

bộ môn Hóa Dược trường Đại Học Dược Hà Nội đã thiết kế và phát triển

hàng loạt các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC [2, 3, 6] (xem

hình 1.10) Các nghiên cứu và thử nghiệm cho thấy kết quả khả quan về khả

năng ức chế HDAC cũng như độc tính in vitro trên một số dòng tế bào ung thư

Các kết quả này đã tạo nền tảng cho tác giả phát triển theo hướng nghiên cứu trên trong việc thiết kế công thức, tổng hợp và thu được những kết quả nhất định trong khóa luận này

Dưới đây là cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố:

O

OH

O

NH S

N

NH

R1

n ( )

N

NH

R2

6 ( )

N

S

NH ( )

6

Nói chung cấu trúc của các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần chính [23]:

- Phần A (nhóm nhận diện bề mặt hay nhóm khóa hoạt động – capping group): thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt enzym; phần này liên quan tới hiệu lực và tính đặc hiệu của HDACi (thường

là aryl hoặc phenyl)

- Phần B (cầu nối): thường là các hydrocacbon thân dầu, nằm trong lòng mạch enzym (như amid-alkyl)

- Phần C (nhóm kết thúc): có thể gắn với Zn2+ trên vị trí tác dụng của các enzym HDAC (zinc-binding group-ZBG), có thể là acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercapoceton

Mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC

mang cấu trúc acid hydroxamic có thể xem ở hình 1.11 Nghiên cứu thiết kế

công thức cho các HDACi mới đều dựa trên việc thay đổi cấu trúc của 3 phần này

dẫn chất acid hydroxamic

1 2.3.2 Thiết kế công thức cho các HDACi mới

Khả năng tạo phức với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của HDAC quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của các HDACi Hiện nay đã biết một số

nhóm có thể liên kết với Zn2+ bao gồm: acid hydroxamic, sulfanamid, nhóm chức aminoanilin, thiol, acid carboxylic Trong đó, nhóm acid hydroxamic tạo chelat bền vững với Zn2+ nhất và hầu hết các dẫn chất của acid hydroxamic đều ức chế HDAC ở nồng độ nM Các hợp chất còn lại đã phần

ức chế HDAC với IC50ở mức μmol Do đó acid hydroxamic vẫn là một nhóm chức quan trọng trong nghiên cứu HDACi

b Thay đổi phần cầu nối

TSA và SAHA là hai điển hình cho phần cầu nối 5-6 carbon Chúng thể hiện tác dụng ức chế mạnh HDAC [20] Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng khoảng cách tốt nhất giữa nhóm acid hydroxamic và phần (A) là 5, 6, 7 nguyên tử carbon, với khả năng ức chế của dẫn chất theo mang cầu nối 6C lớn hơn so với cầu nối 5C hay 7C và tác dụng tốt hơn rất nhiều so với cầu nối 3

hoặc 4C [2, 3, 6]

Trong HDACi nguyên mẫu,nhóm khóa hoạt động có thể liên kết với phần cầu nối thông qua các nhóm cho hoặc nhận liên kết hydro như amid, ceton Đối với các HDACi có liên kết amid ở cầu nối, liên kết này có vai trò quan trọng Việc đảo chiều liên kết amid cũng làm thay đổi tác dụng của HDACi, IC50 giảm rõ rệt khi đổi chiều liên kết amid ở SAHA [8] Tuy nhiên việc thiếu hụt nhóm cho hoặc nhận liên kết hydro trong nửa liên kết tạo ra cơ hội liên kết chặt chẽ hơn với các nhóm khác, dễ tổng hợp và thỏa mãn hơn về dược động học [11]

Ngoài ra phần cầu nối chứa vòng thơm có thể ảnh hưởng tới tác dụng

ức chế chọn lọc HDAC, cũng như đến hiệu lực của HDAC Nếu cầu nối là mạch carbon béo mà thiếu nhóm nhận diện bề mặt như các acid béo mạch ngắn thì hầu như không tương thích với túi enzym của HDAC nhóm IIb [8]

c Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt

Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt nhằm khai thác sự khác biệt ở phần miệng kênh enzym giữa các HDAC, từ đó có thể thiết kế công thức làm tăng hoạt tính hoặc tăng khả năng ức chế chọn lọc Nhóm nhận diện bề mặt chủ yếu là các vòng, có thể là vòng thơm hoặc peptid vòng Các nghiên cứu cho thấy nhóm nhận diện bề mặt là vòng thơm thì tác dụng tốt hơn vòng no Mặt khác vòng lớn thường tốt hơn vòng nhỏ Ví dụ khi thay nhóm phenyl của SAHA bằng vòng indol thì IC50của dẫn chất indol nhỏ hơn SAHA nhiều lần [25]

Việc thay đổi phần A còn ảnh hưởng tới khả năng ức chế chọn lọc của các HDACi, nhóm nhận diện bề mặt nhỏ thường tạo ra các HDACi không chọn lọc, còn các vòng lớn như peptid vòng làm tăng khả năng ức chế chọn lọc: SAHA và các acid hydroxamic có phần A nhỏ ức chế không chọn lọc HDAC I và II, trong khi CHAP (các acid hydroxamic tổng hợp chứa peptid vòng) chỉ ức chế chọn lọc một số HDAC nhóm I Điều này có thể do HDAC nhóm II có phần vành trên bề mặt miệng túi enzym được tạo thành từ hai vòng xoắn có thể ngăn cản liên kết với phần peptid vòng của HDACi Cấu trúc càng cồng kềnh thì càng khó tương thích với các HDAC khác nhau mặc

dù chúng vẫn thể hiện tác dụng ức chế mạnh HDAC (CHAP có IC50 tương ứng với HDAC I và VI là 0,38 – 13nM) [8]

Tuy nhiên nhóm nhận diện bề mặt quá lớn cũng làm giảm tác dụng do làm cho các HDACi khó thâm nhập vào vị trí xúc tác của HDAC Nếu là vòng thơm nhỏ, muốn thể hiện tác dụng ức chế không chọn lọc thì phải tăng

số lượng vòng thơm trong nhóm nhận diện bề mặt, tạo liên kết amid giữa các vòng thơm với nhau sẽ làm tăng khả năng ức chế chọn lọc Khi vòng thơm có mặt các halogen cũng có thể làm tăng hoạt tính [9]

Tổng kết liên quan cấu trúc – tác dụng của một dãy các dẫn chất của acid hydroxamic đã được nghiên cứu thể hiện trong hình 1.12:

Hình 1.12: Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất

ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic

Chương 2 NGUY ÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ethyl 7-bromoheptanoat Merck

Dung môi và

hóa chất khác

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer tại phòng thí nghiệm bộ môn Hóa vật liệu – khoa Hóa – trường đại học Khoa học tự nhiên

Hà Nội

- Phổ khối (MS) được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap

MS và máy khối phổ HP 5989B – MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H-NMR) và carbon (13C-NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và công nghệ

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 NGHIÊN CỨU DOCKING CỦA CÁC CHẤT

Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác một số chất với HDAC (docking) được thực hiện tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seul, Hàn Quốc Tại đây sử dụng mạng lưới cấu trúc của HDAC 8 tương tác với SAHA Cấu trúc này có sự tương đồng cao với HDAC 4 với điểm DALI Z (Z-score, điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và r.m.s.d (root-mean-square deviation, độ lệch) = 2,1Ǻ, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên được nghiên cứu kỹ nhất Chúng tôi kiểm soát thử

nghiệm lắp ghép các chất vào HDAC 8 bằng chương trình AutoDock Vina, tiếp theo dự đoán năng lượng của tương tác liên kết từ sự lắp ghép trên

Kết quả sẽ được minh họa bằng hình ảnh mô hình và số liệu dự đoán năng lượng liên kết

- Tổng hợp 4 dẫn chất 2a-d bằng phương pháp hóa học

- Dùng SKLM để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng và độ tinh khiết của các dẫn chất

- Đo nhiệt độ nóng chảy để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất 2.4.3 KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC

Các chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các loại phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1

H – NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13

C – NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-600 cm-1 tại phòng thí nghiệm bộ môn hóa vật liệu – Khoa Hóa – Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H-NMR) và carbon (13C-NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500, dùng DMSO-d6 làm dung môi Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million – ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.4.4 THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC

2.4.3.1 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián

tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620 Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định được tác

dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng

a Nguyên li ệu và nuôi cấy tế bào:

Các tế bào ung thư đại tràng SW620 được nuôi cấy trong môi trường RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò FBS (fetal bovine serum)), gọi là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium) Tất cả các tế bào được ủ ở 37o

C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí

Trước khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong DMSO để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/mL Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 1μg/mL và 10μg/mL

b Phân l ập histon và Western Blot

Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) được ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (mẫu tế bào không ủ với mẫu thử) Sau đó, các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý có đệm phosphate

Tiếp theo, tế bào được dung giải trong dung dịch dung giải đệm (20

mM Tris-HCl (pH 7,5); 150mM NaCl; 1mM Na2EDTA; 1mM EGTA; 1% triton; 2,5% Na pyrophosphate; 1 mM β-glycerophosphat; 1mM Na3VO4; 1 μg/mL leupeptin), ủ trong đá 15 phút Hỗn dịch được ly tâm và phần dịch được thu hồi để tiến hành điện di trên gel

Histon được điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF Các màng được ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng

thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ Các dải có phản ứng

dương tính được phát hiện nhờ sự phát quang đã được tăng cường Các thí nghiệm được làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập

2.4.3.2 Thử độc tính trên tế bào ung thư

a Nguyên tắc thử

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại khoa Dược, trường đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism

Dòng tế bào thử nghiệm SW620: tế bào ung thư đại tràng

Tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:

b Chuẩn bị

Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán và o hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng

độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104

tế bào, sau đó chia đ ều vào các gi ếng của đĩa

96 giếng, mỗi giếng 200 µl Các đĩa sau đó được ủ ở 370

Ctrong điều kiện 5%

CO2 Sau 24 giờ ủ, các m ẫu thử được chuẩn bị trong 20 µL môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong DMSO

rồi thêm 2 µL mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đư ợc ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ

cuối cùng của DMSO không quá 0,1%

c Ti ến hành thử

Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µl thuốc nhuộm MTT (nồng

độ MTT 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS) Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 370

C trong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 µl

dung dịch DMSO , để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

d Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50%

so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết

quả cuối cùng là giá tr ị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá tr ị IC50 được tính d ựa trên phần mềm

GraphPad Prism Trong phương pháp th ử này, IC50 ≤ 20 µg/mL được coi là

có hoạt tính

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ DOCKING

Để tìm hiểu sơ bộ tương tác liên kết của các chất với HDAC, chúng tôi nghiên cứu đánh giá tính tương tác của HDAC 8 với chất 2d Docking được tiến hành tại phòng nghiên cứu cấu trúc của đại học quốc gia Seul, Hàn quốc theo phương pháp đã được trình bày sơ bộ ở phần phương pháp nghiên cứu Kết quả nghiên cứu Docking và dự đoán năng lượng liên kết được trình bày ở hình dưới đây

Hình 3.1 : Kết quả docking và dự đoán năng lượng liên kết của chất 2d và

HDAC 8

Kết quả docking cho thấy ở chất 2d phần cấu trúc gắn với coenzym

Zn2+ ở đáy túi HDAC không phải là nhóm chức acid hydroxamic như các

hydroxamat đã tổng hợp trước đây mà là nhóm 3-oxim với ái lực của chất 2d

với HDAC 8 lớn hơn SAHA thể hiện ở năng lượng liên kết của 2d với HDAC

8 (-5,3kcal/mol) nhỏ hơn năng lượng liên kết của SAHA với HDAC 8 (-4,4

kcal/mol) Đây là một điểm mới cần tiến hành nghiên cứu thêm

3.2 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ

chung dưới đây:

N H

Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung

Tác nhân và điều kiện:

i) ethyl 7-bromoheptanoat, DMF, K 2 CO 3 , CH 3 OH, KI, 80 o C, 2h; ii) CH 3 OH, NH 2 OH.HCl, NaOH, -5 o C, 15-20’

Quy trình tổng hợp gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1 là phản ứng thế ái nhân, tổng hợp ethyl

7-(2,3-dioxoindolin-1-yl) heptanoat từ isatin và ethyl 7-bromoheptanoat trong dung

môi là DMF

- Giai đoạn 2, tiếp tục tổng hợp

N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và hydroxylamin.HCl, trong giai đoạn này có sử

dụng xúc tác là NaOH và dung môi là CH3OH

3.2.1 TỔNG HỢP CÁC CHẤT ESTER TRUNG GIAN

Quy trình tổng hợp các ester trung gian 1a-d được thực hiện theo sơ đồ

dưới đây (xem sơ đồ 3.2):

N H

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất trung gian ester 1a-d

Tác nhân và điều kiện:

i) ethyl 7-bromoheptanoat, DMF, K 2 CO 3 , CH 3 OH, KI, 80 o C, 2h;

3.2.1.1 Tổng hợp chất ethyl 7-(2,3-dioxoindolin-1-yl) heptanoat (1a)

- Cho 0,147 g isatin (≈ 1mmol) và 1ml DMF vào bình cầu dung tích 50ml Thêm 0,207g K2CO3 khan (≈ 1,5mmol) Khuấy từ trong khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp đồng nhất Thêm 0,5ml CH3OH, khuấy 15 phút nữa Cho 0,08g KI (≈ 0,5 mmol) vào bình phản ứng, trộn đều

- Chuẩn bị 0,237g ethyl 7-bromoheptanoat (≈ 1mmol) hòa trong 1ml DMF sau đó nhỏ từ từ vào hỗn hợp phản ứng

- Nâng nhiệt độ lên 80o

C, tiến hành phản ứng trong 2h có kèm khuấy

từ Kiểm tra phản ứng bằng SKLM với pha động DCM:CH3OH (90:10)

Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh bình phản ứng rồi đổ hỗn hợp phản ứng vào dung dịch HCl 5% lạnh Chiết sản phẩm bằng DCM, mỗi lần 5ml x 3 lần, thu lớp DCM Rửa lớp DCM 3 lần bằng H2O, mỗi lần 5ml Làm khan bằng

Na2SO4 khan Cất quay loại DCM dưới áp suất giảm, thu được dẫn chất 1a

c Kết quả

- Khối lượng dẫn chất 1a: 0,248g

- Cảm quan: màu đỏ nâu

- Hiệu suất: 82%

Sản phẩm 1a của phản ứng chúng tôi dùng để thực hiện bước tiếp theo

của quá trình tổng hợp tạo dẫn chất 2a

3.2.1.2 Tổng hợp ethyl 7-(5-cloro-2,3-dioxoindolin-1-yl) heptanoat (1b)

Quá trình tổng hợp chất 1b từ 0,181g 5-cloroisatin (≈1mmol) và 0,237g

ethyl 7-bromoheptanoat (≈ 1mmol) được thực hiện tương tự như tổng hợp

chất 1a

Kết quả thu được như sau:

* Khối lượng của dẫn chất 1b: 0,263g

* Cảm quan: màu đỏ nâu

* Hiệu suất: 78%

3.2.1.3 Tổng hợp ethyl 7-(5-bromo-2,3-dioxoindolin-1-yl) heptanoat (1c)

Quá trình tổng hợp chất 1c từ 0,226g 5-bromoisatin (≈1mmol) và

0,237g ethyl 7-bromoheptanoat (≈ 1mmol) được thực hiện tương tự như quy

trình tổng hợp chất 1a

Kết quả thu được như sau:

* Khối lượng của dẫn chất 1c: 0,317g

* Cảm quan: màu đỏ nâu

Kết quả thu được như sau:

* Khối lượng của dẫn chất 1d: 0,299g

* Cảm quan: màu đỏ nâu

* Hiệu suất: 86%

3.2.2 TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC

Phản ứng tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic 2a-d được thực hiện

theo sơ đồ sau (xem sơ đồ 3.3):

NHOH

NOH

O O

i

X= -H -Cl -Br -NO2

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp các acid hydroxamic 2a-d

Tác nhân và điều kiện:

i) CH 3 OH, NH 2 OH.HCl, NaOH, -5 o C, 15-20’

3.2.2.1 Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid (2a)

C Sau khoảng thời gian trên, kiểm tra phản ứng bằng SKLM với pha động DCM:CH3OH (90:10) tới khi hết nguyên liệu ester thì dừng phản ứng

b Xử lý hỗn hợp phản ứng

Sau khi acid hóa hỗn hợp thu được bằng HCl 5% lạnh, điều chỉnh về

pH 4-5, tạo tủa Lọc và rửa tủa bằng nước cất đến khi dịch lọc trung tính Sấy khô tủa ở 60o

N-hydroxy-7-(5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-Quy trình tổng hợp chất 2b từ ester 1b và 0,69g NH2OH.HCl

(≈10mmmol) được tiến hành tương tự như quy trình tổng hợp chất 2a

Tinh chế: tiến hành kết tinh lại trong acetone/n-hexan

Kết quả thu được như sau:

* Khối lượng của dẫn chất 2b: 0,19g

N-hydroxy-7-(5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-Phản ứng tổng hợp chất 2c từ ester 1c và 0,695g NH2OH.HCl

(≈10mmol) được thực hiện tương tự như quá trình tổng hợp chất 2a

Tinh chế: tiến hành kết tinh lại trong aceton/n-hexan

Kết quả thu được như sau:

* Khối lượng của dẫn chất 2c: 0,203g

* Cảm quan: chất rắn màu vàng đậm

* Hiệu suất: 53%

* Nhiệt độ nóng chảy: 183-184o

C

3.2.2.4 Tổng hợp yl) heptanamid (2d)

N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-Phản ứng tổng hợp chất 2d từ ester 1d và 0,69g NH2OH.HCl

(≈10mmol) được thực hiện tương tự như quá trình tổng hợp chất 2a

Tinh chế: tiến hành kết tinh lại trong acetone/n-hexan

Kết quả thu được như sau:

* Khối lượng của dẫn chất 2d: 0,22g

* Cảm quan: chất rắn màu vàng

* Hiệu suất: 63%

* Nhiệt độ nóng chảy: 189-191o

C

3.3 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT

Sau khi tổng hợp các dẫn chất 2a-d chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết

các chất bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy (Tnc) của chúng

* Sắc ký lớp mỏng (SKLM)

SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70 –

230 Các chất 2a-d được hòa tan trong dung môi DMF Chúng tôi đã tiến

hành chạy SKLM với các hệ dung môi DCM : MeOH (9:1) và DCM : MeOH (90:1) Sau khi chạy sắc ký, đem soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm thì thấy các chất đem thử đều cho 1 vết gọn Giá trị Rf của các

chất 2a-d khi triển khai với hai hệ dung môi được tóm tắt trong bảng 3.1

* Đo nhiệt độ nóng chảy:

Bên cạnh việc kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM, chúng tôi đã tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của bốn chất tổng hợp được Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy: các chất đều có điểm chảy rõ ràng, khoảng chênh lệch

hẹp Kết quả cụ thể được tóm tắt trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy T o

nc của các acid hydroxamic 2a-d

Hệ DCM : MeOH (90:1)

Nhận xét: Thông qua sắc ký đồ khi chạy SKLM và nhiệt độ nóng chảy

của các chất chúng tôi có thể khẳng định các chất này là tinh khiết, đủ điều kiện để đo phổ và thử tác dụng sinh học

C-NMR) của dãy các chất acid

hydroxamic 2a-d Kết quả phổ của các chất được trình bày cụ thể ở phần phân tích phổ và phụ lục

3.4.1 PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)

Sử dụng phương pháp đo phổ khối lượng ở chế độ CI-MS và EI-MS chúng tôi thu được kết quả như sau (xem trang sau):