VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong thực nghiệm được trình bày ở bảng dưới đây:
Nguyên liệu Tên nguyên liệu Xuất xứ
Hóa chất chính
Isatin Merck
5-cloro isatin Merck
5-bromo isatin Merck
5-nitro isatin Merck
Hydroxylamin Sigma-aldrich
Ethyl 7-bromoheptanoat Merck
Dung môi và hóa chất khác
Dimethyl formamid Merck
Kali carbonat Việt Nam
Methanol Merck
Natri hydroxid Merck
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, bình chiết, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, máy siêu âm, máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital),
- Tủ lạnh, tủ sấy.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật.
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer tại phòng thí nghiệm bộ môn Hóa vật liệu – khoa Hóa – trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.
- Phổ khối (MS) được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap MS và máy khối phổ HP 5989B – MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1
H-NMR) và carbon (13C-NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
* Tổng hợp 4 chất:
- N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid (2a) - N-hydroxy-7-(5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin) heptanamid (2b) - N-hydroxy-7-(5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin) heptanamid (2c) - N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin) heptanamid (2d) * Bước đầu định tính khả năng ức chế HDAC và thử độc tính trên tế bào ung thư đại tràng SW620 của các dẫn chất tổng hợp được.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. NGHIÊN CỨU DOCKING CỦA CÁC CHẤT
Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác một số chất với HDAC (docking) được thực hiện tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seul, Hàn Quốc. Tại đây sử dụng mạng lưới cấu trúc của HDAC 8 tương tác với SAHA. Cấu trúc này có sự tương đồng cao với HDAC 4 với điểm DALI Z (Z-score, điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và r.m.s.d (root-mean-square deviation, độ lệch) = 2,1Ǻ, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên được nghiên cứu kỹ nhất. Chúng tôi kiểm soát thử
nghiệm lắp ghép các chất vào HDAC 8 bằng chương trình AutoDock Vina, tiếp theo dự đoán năng lượng của tương tác liên kết từ sự lắp ghép trên.
Kết quả sẽ được minh họa bằng hình ảnh mô hình và số liệu dự đoán năng lượng liên kết.
2.4.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC VÀ KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT - Tổng hợp 4 dẫn chất 2a-dbằng phương pháp hóa học. - Tổng hợp 4 dẫn chất 2a-dbằng phương pháp hóa học.
- Dùng SKLM để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng và độ tinh khiết của các dẫn chất.
- Đo nhiệt độ nóng chảy để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất. 2.4.3. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC
Các chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các loại phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1
H – NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13
C – NMR)
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-600 cm-1 tại phòng thí nghiệm bộ môn hóa vật liệu – Khoa Hóa – Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1
H-NMR) và carbon (13C-NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500, dùng DMSO-d6 làm dung môi. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million – ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.4.4. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620. Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.