Tổng hợp một số acid hydroxamic mang hợp phần 1 (triazol 4 YL) methylindolin 2 on hướng tác dụng kháng ung thư

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  - NGUYỄN MINH TUẤN MSV: 1201669 TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG HỢP PHẦN 1(TRIAZOL-4-YL)METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  - NGUYỄN MINH TUẤN MSV: 1201669 TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG HỢP PHẦN 1(TRIAZOL-4-YL)METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS Đỗ Thị Mai Dung PGS.TS Phan Thị Phương Dung Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khố luận này, tơi nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô, bạn bè số tổ chức suốt thực đề tài Cho đến khố luận hồn thiện, tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành đến họ Đầu tiên từ tận đáy lịng mình, tơi xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung NCS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình dạy dỗ, hướng dẫn dìu dắt tơi suốt chặng đường khó khăn thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc, phòng nghiên cứu cấu trúc - Đại học Quốc gia Seoul - Hàn Quốc giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn anh chị, bạn em nghiên cứu mơn Hố Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, cảm ơn tập thể lớp M1K67 giúp đỡ nhiều thời gian thực đề tài Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến anh Lê Văn Cường, em Nguyễn Văn Huân, em Mai Quang Hưng bạn Nguyễn Gia Anh Tuấn người bạn bên lúc vui buồn giúp đỡ nhiều suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân bạn bè quan tâm, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất tình cảm giúp đỡ mà người thân bạn bè dành tặng cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Minh Tuấn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Các hợp chất ức chế HDAC 1.1.1 Giới thiệu sơ lược enzym HDAC 1.1.2 Phân loại chất ức chế HDAC 1.1.3 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.1.4 Liên quan cấu trúc tác dụng 1.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư khung triazol 1.2.1 Các hợp chất kháng tế bào ung thư mang khung triazol công bố 10 1.2.2 Vai trò vòng triazol thiết kế công thức chất ức chế HDAC 13 1.3 Các phương pháp tổng hợp khung 1,2,3-triazol phản ứng Click 14 1.3.1 Tổng hợp vịng 1,2,3-triazol theo quy trình Kolarovič 14 1.3.2 Tổng hợp vịng 1,2,3-triazol theo quy trình Steven Lal 15 1.3.3 Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình Yan 16 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18 18 2.1.1 Hoá chất 18 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Tổng hợp hóa học 19 2.2.2 Thử tác dụng sinh học chất vừa tổng hợp 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Nghiên cứu docking 20 2.3.2 Tổng hợp hoá học 20 2.3.3 Xác định cấu trúc dẫn chất tổng hợp 20 2.3.4 Thử tác dụng sinh học 21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu docking 23 3.2 Hoá học 24 3.2.1 Tổng hợp hoá học 24 3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết 33 3.2.3 Khẳng định cấu trúc 34 3.3 Thử hoạt tính sinh học 41 3.3.1 Thử tác dụng ức chế HDAC 41 3.3.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 42 3.4 Bàn luận 43 3.4.1 Nghiên cứu docking 43 3.4.2 Tổng hợp hóa học 44 3.4.3 Khẳng định cấu trúc 47 3.4.4 Thử hoạt tính sinh học 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 1.1 Về tổng hợp khẳng định cấu trúc 55 1.2 Về hoạt tính sinh học 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance) AsPC-1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon Nuclear Magnetic Resonance) Dòng tế bào ung thư tuyến tuỵ CTCL U lympho T da DCM Dicloromethan DMF N,N-dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid FBS Huyết bào thai bò (Fetal Bovine Serum) FDA Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) H Hiệu suất phản ứng HAT Histon acetyltransferase HDACi Histon deacetylase inhibitors HDAC Histon deacetylase HRMS Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrometry) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MeCN Acetonitril MeOH Methanol PC-3 Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt SAHA Acid sulberoylanillid hydroxamic SW620 Dòng tế bào ung thư đại tràng TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TCTH Tiêu chuẩn tổng hợp t-BuOH tert-Butanol THF Tetrahydrofuran 13 C-NMR DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 So sánh IC50 chất có vịng 1,2,3-triazol so với SAHA Bảng 1.2 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol từ azid alkyl phản ứng Click, xúc tác [CuBr(PPh3)3] với 13 15 số dung môi thông dụng Bảng 1.3 Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol từ azid alkyl phản ứng Click, xúc tác muối đồng với số 16 dung môi thông dụng Bảng 2.1 Bảng liệt kê danh sách hoá chất sử dụng đề tài 18 Bảng 2.2 Quá trình thử độc tính tế bào 22 Bảng 3.1 Kết docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 23 Bảng 3.2 Khảo sát thời gian phản ứng tạo II1 26 Bảng 3.3 Chỉ số lý hóa hiệu suất tổng hợp acid hydroxamic 33 Bảng 3.4 Giá trị Rf nhiệt độ nóng 34 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ IR dẫn chất VIa-f 35 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ MS dẫn chất VIa-f 36 chảy (tonc) chất VIa-f Bảng 3.7 Kết phân tích phổ H-NMR dẫn chất VIa-f 37 Bảng 3.8 Kết phân tích phổ 13C-NMR dẫn chất VIa-f 39 Bảng 3.9 Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất VIa-f 41 Bảng 3.10 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 42 Bảng 3.11 So sánh tương quan lượng tương tác dự đoán với tác dụng ức chế HDAC2 43 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Vai trị HAT HDAC điều hồ biểu gen Hình 1.2 Một số acid hydroxamic ức chế HDAC Hình 1.3 Một số aminobenzamid ức chế HDAC Hình 1.4 Một số muối carboxylat ức chế HDAC Hình 1.5 Cấu trúc depsipeptid Hình 1.6 Một số epoxyceton ức chế HDAC Hình 1.7 Cấu trúc CHAP 31 Hình 1.8 Mơ hình mơ tả cấu trúc chung hợp chất ức chế HDAC tương ứng với cấu trúc SAHA Hình 1.9 Các dẫn chất amid ngược SAHA Hình 1.10 Mơ hình ZBG Vanommeslaeghe Hình 1.11 Một số chất ức chế sốc nhiệt protein mang khung triazol 10 Hình 1.12 Cấu trúc combretastatin A-4 chất 11 Hình 1.13 Cấu trúc số thuốc ức chế aromatase mang khung triazol 11 Hình 1.14 Cấu trúc chung chất 12 Hình 1.15 Cấu trúc chung chất 12 Hình 3.1 Hình ảnh docking dẫn chất VIc 24 Hình 3.2 Phổ IR chất VIa 48 Hình 3.3 Phổ MS chất VIc 48 Hình 3.4 Phổ 1H-NMR chất VIc 50 Hình 3.5 Phổ 13C-NMR chất VIa 51 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào dẫn chất 53 VIa-f dòng tế bào SW620, PC-3 AsPC-1 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1 Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol Kolarovič 14 Sơ đồ 1.2 Quy trình tổng hợp vịng 1,2,3-triazol Steven Lal 15 Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp vịng 1,2,3-triazol Yan 16 Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 24 Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II1 25 Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất IVa 26 Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất Va 28 Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất VIa 30 Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d 44 Sơ đồ 3.7 Cơ chế phản ứng Click tạo thành Va-f 45 Sơ đồ 3.8 Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-f 46 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong 20 năm trở lại đây, thuốc làm chết tế bào ung thư “nhắm tới phân tử đích” hướng điều trị mà nhiều nhà khoa học hướng tới Các mục tiêu phân tử điển hình nghiên cứu như: protein kinase (khóa thụ thể HER1, HER2, Bcr-Abl…), histon deaceylase (HDAC), telomerase… Trong enzym HDAC mục tiêu phân tử quan tâm Một số chất ức chế enzym HDAC hữu hiệu sử dụng việc điều trị ung thư như: SAHA (Zolinza®) (tác nhân ức chế HDAC FDA cấp phép điều trị u lympho tế bào T da) Không lâu sau romidepsin (Istodax®), belinostat (Beleodaq®) panobinostat (Farydax®) FDA cấp phép sử dụng điều trị ung thư Trên sở cấu trúc số chất ức chế HDAC công bố giới, nhóm nghiên cứu mơn Hố Dược – trường Đại Học Dược Hà Nội tiến hành thiết kế tổng hợp, công bố dãy chất với đích tác dụng HDAC Các dẫn chất thu cho thấy hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [2, 8, 28] Đặc biệt phải kể đến acid hydroxamic GS.TS Nguyễn Hải Nam nhóm nghiên cứu thiết kế tổng hợp mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol Chúng có tác dụng ức chế HDAC tốt gấp nhiều lần so với SAHA [28] Từ nghiên thấy hợp chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC mang nhóm nhận diện bề mặt dị vịng thơm, cho hoạt tính in vitro khả quan Tiếp tục hướng nghiên cứu tiếp tục thiết kế tổng hợp dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on tiến hành đề tài “Tổng hợp số acid hydroxamic mang hợp phần 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư” với mục tiêu: Tổng hợp N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanamid dẫn chất Thử tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào chất tổng hợp Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb (mở rộng) Phụ lục 21 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc Phụ lục 21 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc (mở rộng) Phụ lục 22 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId Phụ lục 22 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId (mở rộng) Phụ lục 23 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIe Phụ lục 23 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIe (mở rộng) Phụ lục 24 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIf Phụ lục 24 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIf (mở rộng) VIa (-7,5 kcal/mol) VIb (-7,8 kcal/mol) Phụ lục 25 Hình ảnh docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 VIc (-8,1 kcal/mol) VId (-7,9 kcal/mol) Phụ lục 25 Hình ảnh docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 (tiếp) VIe (-7,4 kcal/mol) VIf (-7,2 kcal/mol) Phụ lục 25 Hình ảnh docking dẫn chất VIa-f với HDAC2 (tiếp) Chú thích: VIa = 48A, VIb = 48C, VIc = 48F, VId = 48H Phụ lục 26 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ức chế HDAC2 Chú thích: VIe = 49F, VIf = 49H Phụ lục 26 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ức chế HDAC2 (tiếp) ... 16 73 15 52 17 17 16 34 16 64 16 08 29 08 3 517 VId νC-N 17 20 3 044 313 8 VIc νC=C (aren) 3 022 3 21 9 VIb νC=O 14 76 28 97 3378 14 41 1 713 VIe 5-CH3 3 317 318 8 30 61 28 79 16 22 14 60 16 08 14 69 16 80 VIf 7-Cl 3 42 2 316 5... (oC) (giờ) (%) 1: 2 25 59 ,4 1: 2 25 69 ,2 1: 2 25 12 85,3 1: 2 25 18 86 ,2 1: 2 25 24 86,7 3 .2 .1. 2 Tổng hợp chất IVa-d  Tổng hợp chất 1- (prop -2- yn -1- yl)indolin -2, 3-dion (IVa) Chất IVa tổng hợp từ isatin... ppm): δ 16 8,67 (C1), 16 3,63 (C2’’), 14 3 ,26 (C3’’), 14 2, 20 (C5’’), 13 8 ,45 (C4’), 13 3,77 (C7’’), VIf 7-Cl 12 5, 84 (C9’’), 12 4, 22 (C5’), 12 2 ,44 (C8’’), 11 8 ,29 (C4’’), 11 4, 80 (C6’’), 49 , 01 (C6’),