Để tìm hiểu sơ bộ tƣơng tác liên kết của các chất với HDAC, chúng tôi nghiên cứu đánh giá tính tƣơng tác của HDAC8 và HDAC2 với chất 2a. Docking đƣợc tiến hành tại phòng nghiên cứu cấu trúc của đại học quốc gia Seul, Hàn quốc theo phƣơng pháp đã đƣợc trình bày sơ bộ ở phần phƣơng pháp nghiên cứu.
Hình 3.1: Kết quả docking của chất 2a và SAHA với HDAC8
Kết quả docking cho thấy chất 2a gắn với HDAC8 tại trung tâm hoạt động của enzym tƣơng tự SAHA. Phần acid hydroxamic cũng tạo tƣơng tác với ion kẽm (hình 3.1). Ái lực của 2a với HDAC8 lớn hơn SAHA thể hiện ở năng lƣợng liên kết của 2a với HDAC8 (-5,3kcal mol) nhỏ hơn năng lƣợng liên kết của SAHA với HDAC8 (-4,4 kcal/mol).
Tƣơng tự, khi tiến hành docking với HDAC2, kết quả cho thấy ái lực của 2a với HDAC8 cũng khá mạnh, thể hiện ở năng lƣợng liên kết của 2a với HDAC2 là -6,7 kcal/mol. Tuy nhiên ái lực của nó vẫn thấp hơn N-(2-aminophenyl)benzamid (một chất ức chế HDAC dùng làm phối tử đối chiếu). Năng lƣợng liên kết của N-(2- aminophenyl)benzamid với HDAC2 là -7,5 kcal/mol (hình 3.2).
Hình 3.2: Kết quả docking của chất 2a và N-(2-aminophenyl)benzamid với HDAC2
3.5. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC
Tất cả các chất 2a-g đều thỏa mãn đƣợc 5 yêu cầu của quy tắc Lipinsky về độ giống thuốc. Cùng với kết quả thử hoạt tính sinh học in vitro khá tốt, các chất có nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu tác dụng in vivo.
Bảng 3 6: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 2a-g theo quy t c Lipinsky
R OH OH O NH O N N 2a-g Chất R LogP KLPT Số NH, OH Số N, O Số liên kết linh động 2a H 2,69 305,0 3 7 3 2b 5-Cl 3,34 339,5 3 7 3 2c 5-Br 3,58 384,0 3 7 3 2d 5-NO2 2.91 350,0 3 8 3 2e 5-F 2,90 323,0 3 7 3 2f 5-CH3 3,24 318,0 3 7 3 HDAC2 N-(2-aminophenyl)benzamid (-7,5kcal/mol) Chất 2a (-6,7 kcal/mol)
2g 7-Cl 3,34 339,5 3 7 3
CHƢƠNG 4 - BÀN LUẬN
4.1. VỀ HÓA HỌC
4.1.1. Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian 1a-g
Phản ứng xảy ra khá dễ dàng, hiệu suất tƣơng đối cao (từ 77% tới 86%). Kiểm tra bằng SKLM cho thấy sản phẩm ester thu đƣợc tƣơng đối tinh khiết, có thể sử dụng cho giai đoạn tổng hợp tiếp theo.
- Phản ứng có cơ chế là thế ái nhân alkyl, phản ứng này xảy ra trong dung môi phân cực. Vì vậy, dung môi đƣợc sử dụng là hỗn hợp DMF-MeOH để làm tăng độ tan của các chất tham gia phản ứng giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn ngoài ra tránh nguy cơ thủy phân nhóm chức amid và ester.
- K2CO3 đƣợc sử dụng để hoạt hóa isatin tạo tác nhân ái nhân
- KI dùng làm tăng tốc độ phản ứng do các RI có khả năng tham gia phản ứng thế ái nhân acyl nhanh hơn RBr.
- Cần kiểm soát thời gian phản ứng và theo dõi kết quả phản ứng bằng SKLM để tránh tạo sản phẩm phụ.
- Các dung môi và dụng cụ thực hiện phản ứng này phải đảm bảo yêu cầu khan nƣớc để tránh thủy phân chức ester tạo ra.
4.1.2. Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic 2a-g
Giai đoạn này xảy ra hai loại phản ứng: N – acyl hóa tạo acid hydroxamic với tác nhân ái nhân là hydroxylamin và phản ứng oxim hóa.
Các chất 2a-g tổng hợp nhìn chung là các chất có cấu tạo phức tạp, có mạch carbon dài, có các nhóm chức nhạy cảm với các yếu tố của môi trƣờng phản ứng. Vì vậy khi thực hiện phản ứng cần đảm bảo nghiêm ngặt về điều kiện phản ứng. Cụ thể:
- Phản ứng tổng hợp các acid hydmic từ ester và hydroxylamin ở môi trƣờng trung tính không xả ra, nó chỉ đƣợc thực hiện ở pH lớn hơn 10. Phƣơng pháp tổng hợp chủ yếu là dùng xúc tác base và ester trong alcol [51]. Vì vậy, lƣợng NaOH sử dụng cần dƣ để đảm bảo điều kiện của phản ứng và chuyển NH2OH. HCl thành dạng NH2OH và alcol sử dụng là MeOH.
- Cần duy trì ở nhiệt độ thấp (-5oC) và làm lạnh các ester trung gian, NaOH trƣớc khi cho vào bình phản ứng để tránh thủy phân nguyên liệu ester 1a-g thành acid carboxylic do sự có mặt của NaOH.
- Thời gian phản ứng cần khống chế từ 15-20 phút để tránh làm phân hủy nhóm chức amid (lƣu ý theo dõi bằng SKLM và thử phản ứng màu với FeCl3/HCl);
- Dung dịch NaOH phải đƣợc cho từ từ vào vào bình cầu để tránh quá nhiệt khi pha loãng dung môi MeOH bằng H2O.
- Khi acid hóa bằng acid HCl phải hết sức cẩn thận vì khi pH vƣợt quá pH tủa thì các acid hydroxamic tạo thành sẽ chuyển sang dạng dầu và rất khó tủa lại.
4.2. VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC
7 chất trong luận văn sau khi tổng hợp xong đều đƣợc nhận dạng cấu trúc bằng các phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR). Dữ liệu các loại phổ đƣợc trình bày trong mục 3.2 và phổ đồ trong phần phụ lục.
4.2.1. Phổ hồng ngoại
- 7 chất đều là các dẫn chất của acid hydroxamic nên đều có vân hấp thụ của dao động hóa trị O-H acid mạnh từ vùng 3455-3216 cm-1. Vân này có thể che lấp các vân của
- Trong cấu trúc các chất đều có -NH-CO- và C=O nên trong phổ đồ của 7 chất đều xuất hiện một hoặc hai vân hấp thụ của dao động hóa trị C=O và 5 chất 2a-c, 2f , 2g còn xuất hiện một vân hấp thụ của dao động hóa trị N-H amid. Dải hấp thụ trong khoảng 1747-1629 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm C=O và dải hấp thụ ở khoảng 3109-3050 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm -NH amid.
- Phần cầu nối alkyl và liên kết C=C (benzen) của các chất tổng hợp đƣợc cũng cho thấy sự có mặt trên phổ đồ với dao động hóa trị từ 2865-2856 cm-1 và 1661-1558 cm-1.
- Ngoài ra còn có dải hấp thụ đặc trƣng cho dao động hóa trị của các nhóm thế trên khung 3-oxim-isatin nhƣ : ở khoảng 773-618 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C-Cl, dao động hóa trị của liên kết C-Br, C-NO2 và C-F lần lƣợt là 620 cm-1, 1558 cm-1 và 731- 631 cm-1.
Nhƣ vậy, qua việc xác định sự có mặt của các nhóm thế đặc trƣng, sơ bộ có thể nhận thấy phản ứng tổng hợp đã xảy ra. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn cấu trúc của cá chất thì các dữ liệu của phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân mới thực sự có ý nghĩa quyết định.
Hình 4.1: Phổ hồng ngoại của chất 2g
4.2.2. Phổ khối lƣợng
Phổ khối lƣợng đóng vai trò quan trọng trong khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp và thƣờng là loại phổ đƣợc lựa chọn đo đầu tiên để kiểm chứng xem sản phẩm phản ứng đƣợc tạo thành có là chất dự kiến hay không.
Trên phổ đồ của 7 chất đều xuất hiện pic ion có số khối bằng [M-H]- (chế độ ESI (- ). Pic ion phân tử của các hợp chất hữu cơ nói chung không phải là vạch riêng lẻ mà là một cụm pic vì các nguyên tố chứa trong hợp chất đều tồn tại các đồng vị nhƣ 13C là đồng vị của 12
C, 2H là đồng vị của 1
H, 33S, 34S là đồng vị của 32
S, 15N là đồng vị của 14
N, 18O là đồng vị của 16O... Bởi vậy, bên cạnh vạch chính ứng với pic ion phân tử M- còn có các vạch [M-1]-
Sự có mặt của các pic đồng vị giúp tính toán công thức cộng của hợp chất và kiểm tra sự phù hợp giữa CTPT dự kiến với CTPT trên phổ đồ [37].
Hình 4.2: Phổ khối lượng của chất 2c
Trên đây là ví dụ phân tích cụm pic ion phân tử để xác định sự phù hợp giữa CTPT dự kiến và CTPT của chất 2c tổng hợp đƣợc. Chất 2c có CTPT dự kiến là C15H18O4 N3Cl tƣơng ứng với số khối 339,5. Trên phổ đồ xuất hiện pic [M-1]-
cƣờng độ lớn nhất có số khối 338,5 (hình4.2). Nhƣ vậy, sơ bộ cho thấy chất 2c có số khối đúng nhƣ số khối dự kiến. Phổ đồ hình 4.2 cho thấy cụm pic ion phân tử gồm các ion đồng vị có số khối là M- 1, M, M+1 và pic M-1 có cƣờng độ 100%.
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Dung_p2a_120815131950 8/21/2012 8:34:52 AM Dung_p2a Dung_p2a_120815131950 #517 RT:3.10 AV:1 NL:1.80E5
T:ITMS - c ESI Full ms [150.00-2000.00]
160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la tive Ab u n d a n ce 338.4789 320.8299 298.6741 178.6200 165.6120 192.7157 308.8544 239.6476 277.7562 293.7209 206.6943 221.7540 256.0020 359.2917 Pic M- 1 Pic M Pic M+1
Để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất 2a-g chất tổng hợp đƣợc, cả 7 chất không chỉ đƣợc đo phổ hồng ngoại, phổ khối mà còn đƣợc đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của các chất đƣợc trình bày trong mục 3.2 và phổ đồ trong phần phụ lục. Sau đây là một số bàn luận dựa trên số liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân.
Kết quả phổ đồ của 7 chất 2a-g đều thể hiện sự có mặt của khung 3-oxim-isatin và cầu nối alkyl với đầy đủ tín hiệu proton và carbon.
4.2.3.1 Phổ 1H-NMR
Các chất 2a-g có công thức cấu tạo chung nhƣ sau:
2 3 1 4 5 6 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' R OH OH O NH O N N 2a-g
- Khung 3-oxim-isatin có các proton ở vị trí 4’, 5’, 6’, và 7’ đƣợc xác định rõ ràng trên phổ đồ (hình 4.3).
- Proton vị trí 4’ (H4’) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,42-8,67 ppm và vân phổ có dạng doublet (d) hoặc multiplet (m) do tƣơng tác với H6’và H5’, hằng số tƣơng tác
Jmeta =1,0-2,5 Hz, Jortho =7,5-8,5 Hz.
- Proton vị trí 5’ (H5’) ở các chất 2a và 2g không có nhóm thế tại vị trí 5’có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,08-7,42 ppm, vân phổ có dạng triplet (t) do tƣơng tác với H4’ và H6’, hằng số tƣơng tác Jortho =7,5-8,5 Hz
-Proton vị trí 6’ (H6’) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,22-8,34 ppm và vân phổ có dạng doublet (d) hoặc triplet (t) do tƣơng tác với H5’ và H7’, hằng số tƣơng tác Jmeta =1,0-2,5 Hz, J ortho=7,5-9,0 Hz.
Hình 4.3: Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất 2f
- Proton vị trí 7’ (H7’) ở các chất 2b-f có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 6,88-7,35 ppm và vân phổ có dạng doublet (d) do tƣơng tác với H6’, hằng số tƣơng tác J
ortho=7,5-9,0 Hz (hình 4.4).
- Trong cấu trúc của dãy chất trên còn có một nhóm các proton quan trọng khác là các proton mạch nhánh. Các chất đều có đủ số proton của mạch nhánh với độ dịch chuyển hóa học của nhóm -CH2- trong khoảng 1,25-3,97 ppm (hình 4.4). Ngoài ra còn có proton trong nhóm thế -CH3 của chất 2f với độ dịch chuyển hóa học là 2,28 ppm.
OH, oxim
NH OH
H4’
H6’ H7’
Hình 4.4: Phổ dãn rộng 1H-NMR của chất 2e
-Trên phổ 1H NMR của 2a-g, pic tƣơng ứng với H4’ xuất hiện ở vùng trƣờng thấp hơn (δ 8,67-7,42 ppm) so với H4’ của các hợp chất 3’-oxo (δ 7,80-7,63 ppm). Hiện tƣợng dịch chuyển xa hơn về vùng trƣờng thấp của H4’ phù hợp với các hợp chất 3- oxim-isatin [42]. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của 2a-g đo trongDMSO-d6 xuất hiện 3 pic singlet tại δ ~ 8,60; 10,30; và 13,20-14,32 ppm, tƣơng ứng với -OH, -NH (của acid hydroxamic), và - OH (của nhóm 3’-oxim).
4.2.3.2. Phổ 13C-NMR
Các chất 2a-g có công thức cấu tạo chung nhƣ sau:
2H-7
2H-2
2H-4, 2H-5 2H-2 2H-3
2 3 1 4 5 6 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' R OH OH O NH O N N 2a-g
Sau đây là phổ đồ minh họa của chất 2f.
Hình 4.5: Phổ dãn rộng 13C-NMR của chất 2f
- Ƣu điểm hơn phổ 1H-NMR, toàn bộ carbon có trong phân tử các chất đều cho tín hiệu rõ ràng.
- Carbon trong nhóm carbonyl (C O) có độ dịch chuyển hóa học từ 169,01-169,56 ppm C1 C2’ C3’ C8’ C5’ C4’ C9’ C6’ C7’
- 8 carbon của khung 3-oxim-isatin có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 108,86-169,95 ppm. Trong đó C2’; C3’ và C8’ do gắn với dị tố N, O nên cộng hƣởng ở trƣờng thấp hơn (δ cao hơn) so với carbon C4’, C5’, C6’, C7’, C9’. Tuy nhiên tùy thuộc vào bản chất của nhóm thế 5’-R và 6’-R mà độ dịch chuyển hóa học của 8 carbon khung 3- oxim-isatin có thể thay đổi tăng hoặc giảm so với các chất không gắn nhóm thế.
- Phần cầu nối alkyl cho tín hiệu cộng hƣởng của các proton của carbon trong khoảng 24,91-39,49 ppm.
- Trên phổ 13C-NMR của 2a-g không thấy xuất hiện pic ở vùng trƣờng thấp δ 184,00-188,00 ppm tƣơng ứng với pic của carbon trong nhóm 3’-ceton [43], chứng tỏ nhóm ceton ở vị trí 3’ đã bị dẫn chất hóa thành nhóm oxim.
4.3. VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.3.1. Về tác dụng ức chế HDAC
Hình 4.6: Kết quả phân tích western blot của các chất 2a-g
Chú thích:VH: m u tr ng; GAPDH: enzym chuyển h a glucosid; SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic 17 KDa 37 KDa 11 KDa 37KDa 2a 2b 2c 2d 2e 2f 2g Acetyl-Histon-H3 GAPDH Acetyl-Histon-H4 GAPDH
Kết quả cho thấy các chất 2a-d và 2f, 2g đều có tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 1µM. Từ hình ảnh kết quả điện di trên gel (hình 4.6), vết đậm của 2a-d và 2f, 2g biểu thị sự có mặt của acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4 chứng tỏ các chất này đã ức chế đƣợc HDAC nên các acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4 không bị deacetyl hóa.
Với chất 2e, kết quả cho thấy histon H3 và H4 đã bị deacetyl hóa nên không còn vết của protein trên hình ảnh điện di. Nhƣ vậy ở nồng độ 1 µM, chất 2e không thể hiện rõ tác dụng ức chế HDAC.
4.3.2. Về tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro
Với các acid hydroxamic thiết kế, tác dụng ức chế HDAC là một yếu tố quan trọng quyết định tác dụng kháng tế bào ung thƣ. Tuy nhiên để gây ra độc tính với tế bào các chất phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào tiếp cận với HDAC. Do đó các chất 2a-g tiếp tục đƣợc tiến hành thử độc tính tế bào in vitro nhằm tìm ra những chất thực sự có tác dụng sinh học tốt.
Thử nghiệm tiến hành trên 5 dòng tế bào ung thƣ: SW620: tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời, MCF-7: tế bào ung thƣ vú ngƣời, PC-3: tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời, AsPC- 1: dòng tế bào ung thƣ tụy ngƣời, NCI-H460: tế bào ung thƣ phổi ngƣời. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các chất 2a-g
R OH OH O NH O N N 2a-g Chất R KLPT Độc tính tế bào (IC50)1, M) SW620 MCF-7 PC-3 AsPC-1 NCI-H460 2a -H 305.33 0.64 0.79 0.98 1.10 0.89 2b 5-F 323.32 0.11 1.55 2.73 1.72 1.50 2c 5-Cl 339.77 0.65 0.68 0.85 1.86 0.85 2d 5-Br 384.23 0.29 1.77 2.21 0.08 0.97 2e 5-NO2 350.33 3.39 1.34 19.69 4.68 7.71
2f 5-CH3 319.36 0.99 1.19 0.62 2.44 2.09