2.4.1. Phƣơng pháp tổng hợp hóa học
- Tổng hợp 7 dẫn chất 2a-g có công thức cấu tạo dƣới đây bằng phƣơng pháp hóa học. Sơ đồ tổng hợp đƣợc trình bày trong phần 3.1
R OH OH O NH O N N 2a-g a, R = H b, R = 5-F c, R = 5-Cl d, R = 5-Br e, R = 5-NO2 f , R = 5-CH3 g, R = 7-Cl
4 1 Kiểm tra độ tinh khiết
- Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất.
- Đo nhiệt độ nóng chảy để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất.
2.4.2.2. Khẳng định cấu trúc
Các chất tổng hợp đƣợc xác định cấu trúc bằng các loại phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ proton (1
H-NMR), phổ cộng hƣởng từ carbon (13C- NMR)
- Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-600 cm-1
tại phòng thí nghiệm bộ môn hóa vật liệu – Khoa Hóa – Trƣờng đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội. Các mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dƣới dạng film mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lƣợng (MS) đƣợc ghi bằng: máy HP 5989B-MS, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, máy Agilent 6310 Ion Trap LC/MS, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy LTQ Orbitrap XL , Khoa Hóa học – Trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội .
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon (13C-NMR) đƣợc ghi bằng máy Bruker AV-500, dùng DMSO-d6 làm dung môi. Độ dịch chuyển hóa học (δ) đƣợc biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million – ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.4.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
2.4.3 1 Phương pháp thử tác dụng ức chế histon deacetylase
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng SW620. Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng [13,56].
a. Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào
Các tế bào ung thƣ đại tràng SW620 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI đƣợc bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò FBS (fetal bovine serum); gọi là môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả các tế bào đƣợc ủ ở 37o
C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí.
Trƣớc khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột đƣợc hòa tan trong DMSO để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mM. Các dung dịch gốc sau đó đƣợc pha loãng bằng môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc. Nồng độ thử cuối cùng với các mẫu là 1 μM.
b. Phân lập histon và Western Blot
Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) đƣợc ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (mẫu tế bào không ủ với mẫu thử). Sau đó, các tế bào đƣợc xử lý và rửa bằng dung dịch nƣớc muối sinh lý có đệm phosphate.
Tiếp theo, tế bào đƣợc dung giải trong dung dịch dung giải đệm (20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150mM NaCl; 1mM Na2EDTA; 1mM EGTA; 1% triton; 2,5% Na pyrophosphate; 1 mM β-glycerophosphat; 1mM Na3VO4; 1 μg mL leupeptin), ủ trong đá 15 phút. Hỗn dịch đƣợc ly tâm và phần dịch đƣợc thu hồi để tiến hành điện di trên gel.
Histon đƣợc điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Các màng đƣợc ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ. Các dải có phản ứng dƣơng tính đƣợc phát hiện nhờ sự phát quang đã đƣợc tăng cƣờng. Các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.
2.4.3.2. Phương pháp thử độc tính trên tế bào ung thư
a. Nguyên t c thử
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ (thử độc tính tế bào) in vitro đƣợc thực hiện tại khoa Dƣợc, trƣờng đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT và giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism.
Dòng tế bào thử nghiệm:
- SW620: tế bào ung thƣ đại tràng - MCF-7: tế bào ung thƣ vú - AsPC-1: tế bào ung thƣ tụy
- PC-3: tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến - NCI-H460: tế bào ung thƣ phổi
Các tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò).
Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau:
b. Chuẩn bị
Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 l. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 370Ctrong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20 L môi trƣờng DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong DMSO rồi thêm 2 L mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%.
c. Tiến hành thử
Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5 mg mL trong muối đệm phosphat - PBS). Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 370Ctrong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng đƣợc cho 100 l dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510 nm.
d. tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trƣờng nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị
IC50 đƣợc tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism. Trong phƣơng pháp thử này, IC50
20 g mL đƣợc coi là có hoạt tính.
2.4.4. Kiểm chứng tác dụng ức chế HDAC thông qua phƣơng pháp docking chất đại diện
Để kiểm tra sơ bộ tính tƣơng tác của các chất tổng hợp đƣợc với HDAC (docking), chất 2a đã đƣợc tiến hành docking thử. Quá trình docking đƣợc thực hiện tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seul, Hàn Quốc. Tại đây sử dụng mạng lƣới cấu trúc của HDAC8 tƣơng tác với SAHA và HDAC2 tƣơng tác với N-(2- aminophenyl)benzamid. HDAC8 có sự tƣơng đồng cao với HDAC4 với điểm DALI Z (Z- score, điểm đánh giá độ giống) 40,4 và r.m.s.d (root-mean-square deviation, độ lệch) 2,1Ǻ, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên đƣợc nghiên cứu kỹ nhất. HDAC2 cũng có sự tƣơng đồng cao với HDAC3, thứ tự acid amin giống nhau (67%). Thử nghiệm lắp ghép các chất vào HDAC8 và HDAC2 đƣợc kiểm soát bằng chƣơng trình AutoDock Vina, tiếp theo dự đoán năng lƣợng của tƣơng tác liên kết từ sự lắp ghép trên.
Kết quả sẽ đƣợc minh họa bằng hình ảnh mô hình và số liệu dự đoán năng lƣợng liên kết.
2.4.5. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc
Tính giá trị logP của các chất tổng hợp bằng phần mền EPTsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency's Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đƣa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [32]: + Khối lƣợng phân tử của chất không lớn hơn 500 g mol.
+ Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10. + Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5.
+ Giá trị logP của chất không lớn hơn 5. + Số liên kết linh động không lớn hơn 15.
CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC
Từ đặc điểm chung của các chất ức chế HDAC và cấu trúc của SAHA, luận văn đã thiết kế công cấu trúc của dãy chất với cấu trúc tƣơng tự SAHA nhƣ sau: duy trì phần cầu nối carbon và nhóm chức acid hydroxamic, thay khung phenyl của SAHA bằng khung 3- oxim-isatin.
7 chất trong luận văn đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học theo sơ đồ chung dƣới đây: O O N H R i R ii R C2H5 O O O O N a, R = H b, R = 5-F c, R = 5-Cl d, R = 5-Br e, R = 5-NO2 f , R = 5-CH3 g, R = 7-Cl OH OH O NH O N N 2a-g 1a-g
Sơ đồ 3 1: Quy trình tổng hợp chung
Tác nhân và điều kiện:
i) Ethyl 7-bromoheptanoat, DMF, K2CO3, CH3OH, KI, 80oC, 2h; ii) CH3OH, NH2OH.HCl, NaOH, -5oC, 15-20’
Quy trình tổng hợp gồm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 thực hiện phản ứng alkyl hóa, tổng hợp ethyl 7-(2,3-dioxoindolin-1- yl)heptanoat từ isatin và các dẫn chất mang nhóm thế tại vị trí số 5 và số 7 với ethyl 7- bromoheptanoat trong dung môi là DMF.
- Giai đoạn 2 thực hiện phản ứng thế ái nhân acyl và tạo oxim, tổng hợp N- hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid từ sản phẩm trung gian đƣợc
tạo ra ở giai đoạn 1 và hydroxylamin.HCl. Trong giai đoạn này có sử dụng xúc tác là NaOH, dung môi là CH3OH, nhiệt độ tiến hành thấp (-50c).
3.1.1. Tổng hợp các ester trung gian 1a-g
Quy trình tổng hợp các ester trung gian 1a-g đƣợc thực hiện theo sơ đồ dƣới đây
(sơ đồ 3.2): O O N H R i R OC2H5 O O O N 1a-g a, R = H b, R = 5-F c, R = 5-Cl d, R = 5-Br e, R = 5-NO2 f , R = 5-CH3 g, R = 7-Cl
Sơ đồ 3 : Quytrình tổng hợp các ester trung gian 1a-g
Tác nhân và điều kiện:
i) ethyl 7-bromoheptanoat, DMF, K2CO3, CH3OH, KI, 80oC, 2h;
3.1 1 1 Tổng hợp chất ethyl 7-(2,3-dioxoindolin-1-yl)heptanoat (1a)
*Tiến hành phản ứng
- Cân 0,147 g isatin (≈ 1mmol) và 1ml DMF cho vào bình cầu dung tích 50ml. Thêm 0,207g K2CO3 khan (≈ 1,5mmol). Khuấy từ trong khoảng 45 phút ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Thêm 0,5ml CH3OH, khuấy 15 phút nữa. Cho 0,08g KI (≈ 0,5 mmol) vào bình phản ứng.
- Chuẩn bị 0,237g ethyl 7-bromoheptanoat (≈ 1mmol) hòa trong 1ml DMF sau đó nhỏ từ từ vào hỗn hợp phản ứng.
- Nâng nhiệt độ lên 80oC, tiến hành phản ứng trong 2h. Kiểm tra phản ứng bằng SKLM với pha động DCM:CH3OH (9:1).
Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh bình phản ứng rồi đổ hỗn hợp phản ứng vào dung dịch HCl 5% lạnh. Chiết sản phẩm bằng DCM, mỗi lần 5ml x 3 lần, thu lớp DCM. Rửa lớp DCM 3 lần bằng H2O, mỗi lần 5ml. Làm khan bằng Na2SO4 khan. Cất quay loại DCM dƣới áp suất giảm, thu đƣợc dẫn chất 1a.
* Kết quả
- Khối lƣợng dẫn chất 1a: 0,248g.
- Cảm quan: sản phẩm thu đƣợc có màu đỏ nâu, dạng dầu - Hiệu suất: 82%.
Sản phẩm trung gian 1a của phản ứng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp tạo dẫn chất 2a.
3.1.1.2. Tổng hợp ethyl 7-(5-fluoro-2,3-dioxoindolin-1-yl)heptanoat (1b)
Chất 1b đƣợc tổng hợp từ 0,165g 5-flouroisatin (≈ 1mmol) và 0,237g ethyl 7- bromoheptanoat (≈ 1mmol) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 1a.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Khối lƣợng của dẫn chất 1b: 0,257g
- Cảm quan: sản phẩm thu đƣợc có màu đỏ nâu, dạng dầu - Hiệu suất: 80%
3.1.1.3 Tổng hợp ethyl 7-(5-cloro-2,3-dioxoindolin-1-yl)heptanoat (1c)
Quá trình tổng hợp chất 1c từ 0,181g 5-cloroisatin (≈ 1mmol) và 0,237g ethyl 7- bromoheptanoat (≈ 1mmol) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 1a.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Khối lƣợng của dẫn chất 1c: 0,263g
- Cảm quan: sản phẩm thu đƣợc có màu đỏ nâu, dạng dầu - Hiệu suất: 78%
3.1.1.4. Tổng hợp ethyl 7-(5-bromo-2,3-dioxoindolin-1-yl)heptanoat (1d)
Quá trình tổng hợp chất 1d từ 0,226g 5-bromoisatin (≈ 1mmol) và 0,237g ethyl 7- bromoheptanoat (≈ 1mmol) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp chất 1a.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Khối lƣợng của dẫn chất 1d: 0,317g
- Cảm quan: sản phẩm thu đƣợc có màu đỏ nâu, dạng dầu - Hiệu suất: 83%
3.1.1.5. Tổng hợp ethyl 7-(2,3-dioxoindolin-5-nitro-1-yl)heptanoat (1e)
Phản ứng tổng hợp chất 1e từ 0,192g 5-nitroisatin (≈ 1mmol) và 0,237g ethyl 7- bromoheptanoat (≈ 1mmol) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 1a.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Khối lƣợng của dẫn chất 1e: 0,299g
- Cảm quan: sản phẩm thu đƣợc có màu đỏ nâu, dạng dầu - Hiệu suất: 86%
3.1.1.6. Tổng hợp ethyl 7-(2,3-dioxoindolin-5-methyl-1-yl)heptanoat (1f)
Chất 1f đƣợc tổng hợp từ 0,163g 5- methylisatin (≈ 1mmol) và 0,237g ethyl 7- bromoheptanoat (≈ 1mmol) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 1a.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Khối lƣợng của dẫn chất 1f: 0,246g
- Cảm quan: sản phẩm thu đƣợc có màu đỏ nâu, dạng dầu - Hiệu suất: 77%
3.1.1.7 Tổng hợp ethyl 7-(7-cloro-2,3-dioxoindolin-1-yl)heptanoat (1g)
Quá trình tổng hợp chất 1g từ 0,181g 7-cloroisatin (≈ 1mmol) và 0,237g ethyl 7- bromoheptanoat (≈ 1mmol) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 1a.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Khối lƣợng của dẫn chất 1g: 0,273g
- Cảm quan: sản phẩm thu đƣợc có màu đỏ nâu, dạng dầu - Hiệu suất: 81%
Phản ứng tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic 2a-g đƣợc thực hiện theo sơ đồ sau (sơ đồ 3.3): R OC2H5 O O O N ii R OH OH O NH O N N 1a-g 2a-g a, R = H b, R = 5-F c, R = 5-Cl d, R = 5-Br e, R = 5-NO2 f , R = 5-CH3 g, R = 7-Cl
Sơ đồ 3 3: Quy trình tổng hợp các acid hydroxamic 2a-g
Tác nhân và điều kiện:
ii) CH3OH, NH2OH.HCl, NaOH, -5oC, 15-20’
3.1.2.1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid (2a)
* Tiến hành:
Cho ester 1a (≈ 1mmol) hòa với 3ml CH3OH trong bình cầu dung tích 50ml. Đặt bình cầu trong nƣớc ở nhiệt độ -5oC (sử dụng đá làm bằng nƣớc muối bão hòa). Thêm 0,695g NH2OH. HCl (≈ 10mmol) vào bình cầu. Chuẩn bị dung dịch NaOH bằng cách hòa tan 3,2g NaOH (≈ 80mmol) trong 2ml H2O, làm lạnh. Rót từ từ dung dịch NaOH lạnh vào bình phản ứng. Tiến hành phản ứng trong thời gian 15-20 phút. Chú ý luôn duy trì nhiệt độ phản ứng dƣới -5oC. Sau khoảng thời gian trên, kiểm tra phản ứng bằng SKLM với pha động DCM:CH3OH (9:1) tới khi hết nguyên liệu ester thì dừng phản ứng.
* Xử lý hỗn hợp phản ứng
Sau khi acid hóa hỗn hợp thu đƣợc bằng HCl 5% lạnh, điều chỉnh từ từ về pH 4-5, tạo tủa. Lọc và rửa tủa bằng nƣớc cất đến khi dịch lọc trung tính. Tủa thu đƣợc đem sấy khô ở 60oC.
Tinh chế: tiến hành kết tinh lại trong aceton/n-hexan
- Khối lƣợng của dẫn chất 2a: 0,20g. - Cảm quan: chất rắn màu vàng - Hiệu suất: 65% - Nhiệt độ nóng chảy: 192-194oC. 3.1.2.2 Tổng hợp N-hydroxy-7-(5-fluoro3-(hydroxyimino-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (2b)
Chất 2b đƣợc tổng hợp từ ester 1b (≈ 1mmol) và 0,69g NH2OH.HCl (≈ 10mmol) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ quá trình tổng hợp chất 2a.
Tinh chế: tiến hành kết tinh lại trong aceton n-hexan Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Khối lƣợng của dẫn chất 2b: 0,22g - Cảm quan: chất rắn màu vàng - Hiệu suất: 67,5% - Nhiệt độ nóng chảy: 188-190oC 3.1.2.3. Tổng hợp N-hydroxy-7-(5-cloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)heptanamid (2c)
Quy trình tổng hợp chất 2c từ ester 1c (≈ 1mmol) và 0,69g NH2OH.HCl (≈ 10mmol) đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp chất 2a.