Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Định danh và xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn Acinetobacter baumannii có trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Bình Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử

TEN DE TÀI: “Định danh va xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn Acinetobacterbaumannii có trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều tri tại Bệnh viện Dakhoa tỉnh Bình Dương bằng kỹ thuật si

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCMCán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYÊN TÚ ANHCán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS NGUYEN THUY HUONGCán bộ cham nhận xét 2: TS HOANG ANH HOÀNG

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG Tp.HCM ngày 15 thang 08 năm 2014

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:1 Chủ tịch: TS NGUYEN HỮU PHÚC

2 Phản biện 1: PGS.TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG3 Phản biện 2: TS HOÀNG ANH HOÀNG

4 Ủy viên: TS NGUYEN TÚ ANH5 Thư ký: TS PHAN NGỌC HÒAXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).CHỦ TỊCH HỘI DONG TRUONG KHOA KY THUẬT HOA HỌC

TS NGUYEN HUU PHUC

ĐẠI HOC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: Trương Thị Thu An MSHV: 12310721Ngày, tháng, năm sinh: 01/05/1988 Nơi sinh: Đồng ThápChuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 604280I TEN DE TÀI:

“Định danh va xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn Acinetobacterbaumannii có trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều tri tại Bệnh viện Dakhoa tỉnh Bình Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- _ Định danh vi khuẩn bang phương pháp giải trình tự 16S rDNA.- Phat hiện nhanh vi khuẩn Acinetobacter baumannii bang kỹ thuật multiplex

PCR.Il NGÀY GIAO NHIEM VU: 20/01/2014IH NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 20/06/2014IV CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: TS NGUYÊN TÚ ANH

Tp HCM, ngày 01 tháng 08 năm 2014CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS Nguyễn Tú Anh

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CÁM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Cô Nguyễn Tú Anh đã tận tìnhhướng dan, chỉ bao, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt khóaluận này.

Em xin cảm ơn các Thầy Cô và anh chị trong Bộ môn Vi sinh - Ký sinh,trường Đại học Y Dược Thành phố Hỗ Chí Minh đã nhiệt tình chi dẫn em trongsuốt thời gian thực hiện luận văn

Em xin chân thành cảm ơn Cô Nguyễn Thúy Hương đã cho em nhiều kiếnthức, đồng thời Cô luôn giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian găn bó vớitrường.

Em xin gửi lời cắm ơn đến các Thay Cô Bộ môn Cong nghệ sinh học, trườngĐại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền dat cho em nhiều kiến thứcquý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

ĐỊNH DANH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUAN

ACINETOBACTER BAUMANNII CÓ TRONG MẪU BỆNH PHẨM

CUA BỆNH NHÂN DIEU TRI TẠI BỆNH VIEN DA KHOA TINHBINH DUONG BANG KY THUAT SINH HOC PHAN TU

TOM TATĐặt van đề: Đối với các bệnh lý nhiễm khuẩn, việc định danh nhanh và chính xácvi khuẩn gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong chan đoán và điều trị bệnh

Mục tiêu: Định danh vi khuẩn bang phương pháp giải trình tự 16S rDNA và pháthiện nhanh cầu trực khuẩn Gram (-) Acinetobacter baumannii bằng kỹ thuậtmultiplex PCR.

Phương pháp: Nghiên cứu thực hiện trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều trịnội trú tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Bình Dương nhiễm cầu trực khuẩn Gram (-) A.baumannii Tiến hành tách chiết DNA nhiễm sắc thé vi khuẩn, khuếch đại trình tựgen 16S rDNA bang cặp mỗi 27F - 1492R, giải trình tự và phân tích đoạn gen này.Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn A baumannii bằng kỹ thuật multiplexPCR xác định gen bảo tồn recA (425 bp) đặc hiệu của chi Acinetobacter với cặpmỗi P-rAl - P-rA2 và vùng đặc hiệu ITS 16S-23S§ rDNA (208 bp) của loài 4.baumannii với cặp mỗi P-Ab-ITSF - P-Ab-ITSB

Kết quả:

5 mẫu vi khuân định danh bang kỹ thuật giải trình tự 16S rDNA, được xácđịnh có 4 mẫu thuộc loài Acinetobacter baumannii với độ tương đồng 97.4%-99.6% Có 01 mẫu chỉ xác định được thuộc chi Acinetobacter do có độ tương đồngtương đối thấp 93,2%

Quy trình multiplex PCR, xác định trong 14 mẫu bệnh phẩm nhiễm cầu trựckhuẩn Gram (-), 11/14 mẫu bị nhiễm A baumannii do phát hiện 02 băng DNA cókích thước 425 bp và 208 bp và 03/14 mẫu nhiễm vi khuẩn thuộc chi Acinetobacterdo chỉ phát hiện 01 bang DNA 425 bp.

IDENTIFICATION AND DETECTION OF ACINETOBACTERBAUMANNII IN SPECIMENS OF PATIENTS TREATED ATBINH-DUONG PROVINCE’S HOSPITAL BY MOLECULAR

BIOLOGY TECHNIQUES

SUMMARYIntroduction: For infectious diseases, a rapid and accurate identification ofpathogenic bacteria play an important role in diagnosis and treatment of diseases.Objective: Identification of bacteria by 16S rDNA sequencing method anddetecting fast Gram (-) Acinetobacter baumannii coccobacilli by multiplex PCRtechnique.

Methods: The study was carried out on samples of patients treated in Binh-Duongprovince’s hospital because of cocci-bacillus Gram (-) A baumannii infection.Extraction bacterial chromosomal DNA, amplification of 16S rDNA sequencesusing primers 27F - 492R, sequencing and analysing of this sequence Rapiddetection of A baumannii by multiplex PCR technique, which was used fordeterming conservation gene recA (425 bp) that specified for genus Acinetobacterwith primers P-rAl - P-rA2 and region specific ITS 16S-23S rDNA (208 bp) of A.baumannii with primers P-Ab-ITSF - P-Ab-ITSB.

Results:

There were 5 bacterial samples identified by 16S rDNA sequencing technique,consists of 4 samples belonging to Acinetobacter baumannii with similarity indexranging from 97.4%-99.6% and only one sample belongs to genus Acinetobacterdue to the low similarity index of 93.2%.

By using multiplex PCR technique, 14 samples were diagnosis of infection withcocci-bacilli Gram (-), 11/14 samples infected with A baumannii by detection oftwo DNA bands size 425 bp and 208 bp, and 3/14 contaminated samples caused bybacteria of the genus Acinetobacter detected only 1 425 bp DNA band.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là luận văn nghiên cứu của riêng tôi Các sô liệu và kêtquả trình bày trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bô trong bât kỳ côngtrình nào khác.

Tác giả

Trương Thị Thu An

MỤC LỤC

0900922 iDANH MỤC TU VIET TAT ioccccccccecccccsccscscsscscssscscsssscsssssscsssscsssvsssscssssesessseeensvees ivDANH MỤC BANG uiececececcsccccccsssscscssscscsssscscsscscsvsscscscsscsessecssssscscsssecssssssesvsnsecasavees V

DANH MỤC SƠ DO wieeeeccccscccsscsesssscsscscscsscscssscscsvsscsvssescsssssscsvsssacsvsssscsvsscstsesseensvees viMO DAU wieecccccccecccscscssscsscscsesscscsssscscsvsscscsscacsvsscscsvsscscsvsscscsssesscsvsscscsssecstsvsscsvsnseeasevees |1 Dat Vai 0 |2 Phạm vi nghiên cứu dé tải - - - s99 5 SE ccư cv E1 1119151111 cxrkrkred 2

1.1 Vi khuẩn chỉ ACinetoDACter cecccccccccssscsssesscsessssesesessesssesescscsevscseseuscsesevscseseuseseaes 31.1.1 TỐng Quan -.- «s33 919191515111 111 1 1 111 1111111111111 1111k 3

1.1.3 Đặc điỂm - 5c tt S3 1211211111 1101111111511111151111 2151101111111 1111 tre 41.1.4 Phân Đố . -¿- + 2E E23 E5 521115152111151111511 111511111511 1115 1111151111 ce 4

1.1.6 Khả năng gây bệnh - - - - << << 100 11111111111111999331 11111111 ng ng giờ 51.2 Nhiễm khuẩn bệnh viện - ¿ - ¿22 EE+E+E£EE£E+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrkrrrred 5

1.2.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện ở Việt Nam 61.2.2 Nguồn lây truyền và phương thức lây truyền nhiễm khuẩn bệnh viện 7

1.2.4.1 Viêm phối mắc phải ở bệnh viện oe ccccseseesseeeescsesesecscecscncnens 9

1.2.4.3 Nhiễm khuân máu ¿22 S2 +E+E£EE£E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrkrkee 10

1.2.4.5 Nhiễm khuẩn mô mm se SE SE E8 E8 ESEE+EE+EESEESEEsEEzeeseeseeseed 10

1.2.4.6 Các biện pháp phòng ngừa nhiễm khuẩn bệnh viện 111.3 Gen 16S rRNA của tế bào vi KAUAN oes eeseeeseesseeeneecneeseeeseeeneeseeeneeseeneeeneee 121.4 Vùng ITS 16S-23S rRNA Q uo ecccccceeseeeesseecesneecseseeceeeeceneaeeeseaeeeeseeeesneees 13

1.8 Một số chương trình tin sinh học << << << 11111 Ssssssssssssssessa 19

CHUONG 2: VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 232.1 Đối tượng nghiên CỨU - - - E119 9E E11 111151 1xx 23

2.2.1 Dụng cụ và thiẾt bị - k1 E1 111111513 1 1x1 ryg 24

2.3.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA 28

2.3.1.3 Tach chiết DNA vi khuẩn -5-©c:+2+2ctvrxtsrttrrtsrrrrrrrrrrree 29

2.3.2 Phát hiện nhanh 4 baumannii bằng kỹ thuật multiplex PCR 33

2.3.2.1 Lua chon cap môi đặc hiệu o.eeccccescscsceseccscesesescesescseescsesesescsessestsesees 332.3.2.2 Khuéch đại trình tự DNA đặc hiệu bằng multiplex PCR 343.3.2.3 Phát hiện trình tự DNA đặc hiệu - <5 << << << cceess 35

3.1 Phân lập vi khuẩn - ¿E919 9E SE cvcT TT 1H 11111 xxx re cvrki 363.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA 38

3.3 Phát hiện nhanh 4 baumannii bang kỹ thuật multiplex PCR 48

4.1 KẾ luận - 5c - + SE 19 1 111515111115 11115 1111511111511 0115 11111511110 1111 tk 55z1 1n 56

DANH MỤC TU VIET TAT

ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

CAP Community-acquired pneumoniaCDC Center for Disease Control and PreventiondATP deoxyadenosine triphosphate

dCTP deoxycytidine triphosphatedGTP deoxyguanosine triphosphateDNA Deoxyribonucleic aciddNTP Deoxyribonucleotide triphosphatedTTP deoxythymidine triphosphateHAP Hospital-acquired pneumoniaICU Intensive care unit

ITS Intergenic spacer

NNIS United States National Nosocomial Infection Surveillance

PCR Polymerase Chain ReactionPFGE Pulsed field gel electrophoresisrDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid

RFLP Restriction Fragment Length PolymorphismRNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

TSA Tryptone Soya Agar

DANH MỤC BANG

Bảng 1.5 Một số thay đôi nhằm tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR 17

1502/2889) .1)00110077 = 24Bảng 2.3 Thiết bị - G1331 E1919151 1 11111 1 1 111111010111 11111 25Bảng 2.4 Một số hóa chất - - - k1 ST 1 1111111 811101515 11111111111 nen greg 27

Bang 2.6 Trinh tu môi đặc hiệu phát hiện nhanh A DaUMaNnil <- 34

Bảng 3.4 Thanh phan tối ưu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh vi khuẩn A.2/2111//140/1/1888890hrdtddddtỶẩdầểtdaa 50Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanhvi khuân A DQUMANNIEE coceccecccccccccccecccssessessessesscsssssssssssssssssssssssassssssssacssessssscsecsessecsees 51

DANH MỤC HINH

Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA nhiễm sắc thé vi khuẩn A bzwnammii 30Hình 2.3 Quy trình tinh sạch sản phẩm 16S rDNA << <5 5s+x+x+xeEeeseseee 33Hình 3.1 Mẫu 5333 - ¿E11 tt 1 1 1111111111111 11 01110121 111110101010101 111111 36Hình 3.2 Mẫu 4145 ¿ ¿E1 1 1 1215115151111 11 111111011111 1111111101 010101 11111 re 36Hình 3.3 Mẫu 5247 ¿ SE 1 1 1 1 12151111 11111111111 11011101 1711101010101 1101 111111 37

Hình 3.5 Mẫu 5 ]'97 ¿c2 1 1 1 1215115151111 11 111111011111 1111010101 011111 11111 re 37

Hình 3.11 Sản phẩm multiplex PCR từ DNA nhiễm sắc thé tại 49 °C 48Hình 3.12 Sản phẩm multiplex PCR tối ưu hóa Tag DNA polymerase 49Hình 3.13 Sản phẩm thu được từ quy trình multiplex PCR tối ưu - 50Hình 3.14 Kết qua sản phẩm multiplex PCR từ khuẩn lạc của 14 mẫu vi khuan 52

DANH MỤC SƠ DO

MỞ ĐẦU

1 DAT VAN DE

Hién nay, nhiém khuẩn bệnh viện đã trở thành một thách thức lớn đối vớinhiều bệnh viện trên thế giới do tỷ lệ nhiễm ngày càng gia tăng Nhiễm khuẩn bệnhviện có thé do vi khuẩn, vi rút hay nam Các vi sinh vật này hiện diện trên máy móctrang thiết bị y tế, dụng cụ y khoa và môi trường không khí trong bệnh viện Trongđó, vi khuẩn là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp nhất (> 90%) làmthời gian điều trị kéo dài thêm từ 7-14 ngày, chi phí điều trị tăng 2-4 lần và đặc biệtlà làm tăng tỷ lệ tử vong [4, 20] Trước năm 1970, nhiễm khuẩn bệnh viện chủ yếudo vi khuan Gram (+) Nhưng thời gian gần đây, các chuyên gia y tế cảnh báo cácbệnh viện cần phải theo dõi chặt chẽ các nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram (-) do tỷ lệnhiễm các vi khuẩn này đã tăng đến 78% và đặc biệt xuất hiện tình trạng đề khángvới kháng sinh thế hệ mới có phố rộng Theo điều tra của Hệ thống giám sát nhiễmkhuẩn bệnh viện quốc gia của Mỹ (NNIS) tiến hành năm 1988, vi khuẩn Gram (-)thuộc chi Acinetobacter đứng vi tri thứ mười trong các tác nhân gây ra nhiễm khuẩnbệnh viện; trong đó, chiếm 80% là A baumannii, chúng là một trong những nguyênnhân hang đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện vì chúng có khả năng sống rat lâu ở môitrường bên ngoài, chống lại chất tây ué và có thé đề kháng với nhiều loại kháng sinh[17] Cầu trực khuẩn Gram (-) 4 baumannii thường gây viêm phối bệnh viện tạikhoa chăm sóc đặc biệt (ICU), chủ yếu ở những bệnh nhân thở máy va làm tăng tylệ tử vong từ 19-64% [14, 54, 75] Ngoài ra, A baumannii còn gây ra các nhiễmkhuẩn khác như nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn mảng bụng, nhiễm khuân đườngtiết niệu, nhiễm khuẩn vết thương, da hoặc mất [29]

Từ tháng 08/2011 đến tháng 03/2012, có 53 mẫu vi khuân Gram (-) đượcphân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị tại các khoa lâm sảng của bệnh việnĐa khoa tỉnh Bình Dương, các mẫu này được chuyển về Bộ môn Vi sinh - Ký sinh,Khoa Dược, Dai học Y Dược Thanh phố Hồ Chí Minh Định danh bang phuongpháp sinh hóa, kết qua cho thay vi khuẩn A baumannii chiém tỷ lệ cao nhất 30,8%

Tuy nhiên, phương pháp nảy tốn nhiều thời gian, công sức và kết quả một vài phảnứng sinh hóa đôi khi không rõ, gây khó khăn cho việc biện giải kết quả Vì vậy, vớimục đích rút ngăn thời gian phát hiện vi khuẩn A baumannii đồng thời đối chiếuvới kết quả định danh bang phương pháp sinh hóa, chúng tôi tiến hành dé tài nghiêncứu “Định danh và xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn Acinetobacterbaumannii có trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều tri tại Bệnh viện Dakhoa tỉnh Bình Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử”.

2 PHAM VI NGHIÊN CỨU DE TÀI

Đối tượng nghiên cứu: vi khuẩn 4 baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩmcủa bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Da khoa tỉnh Bình Dương

Nội dung nghiên cứu: định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự16S rDNA và phát hiện nhanh vi khuẩn A baumannii bang kỹ thuật multiplex PCR

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 VI KHUAN CHI ACINETOBACTER1.1.1 Tong quan

Vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter được Beierinck - nha vi sinh học ngườiHà Lan mô tả đầu tiên vào năm 1911 với tên Micrococcus calcoaceticus [64] Sauđó, các vi khuẩn có đặc điểm tương tự được phát hiện như Diplococcus mucosus,Alcaligenes haemolysans, Mma polymorpha, Moraxella lwoffi, Herelleavaginicola, Bacterium anitratum, Moraxella lwoffi var glucidolytica, Neisseriawinograskyi, Achromobacter anitratus, Achromobacter mucosus [T74] Nam 1968,nghiên cứu của Baumann va cộng su đã xếp các vi khuẩn này thuộc chiAcinetobacter.

1.1.2 Phan loai

Giới Bacteria |Ngành Proteobacteria

1.1.3 Đặc điểm

Acinetobacter phát triển nhanh trên môi trường có 5% mau cừu, môi trườngMacConkey hay TSA Acinetobacter tạo khóm khuẩn lạc trơn nhẫn, màu trang,đường kính 02-03 mm và một số có khả năng huyết giải B Ngoài ra, môi trườngkhoáng có tính acid thấp (chứa acetate và nitrat) hoặc môi trường chọn lọc Leedscũng được sử dụng dé phân lập các loài Acinetobacter

Acinetobacter là cầu trực khuẩn Gram (-), hiếu khí, có nang, kích thướckhoảng 1,0-1,5 um x 1,5-2,5 um và phát triển tốt ở 44 °C Có thé chia các vi khuẩntrong chi này thành 02 nhóm dựa trên kha năng sử dụng glucose: phân giải đườngvà không phân giải đường Các chủng sử dụng đường glucose và không huyết giảiđược xác định là A baumannii và các chủng không sử đường glucose và khônghuyết giải là 4 /woffii Cac chủng huyết giải B được xác định là A haemolyticus[23].

1.1.4 Phân bố

Acinetobacter được tim thay Ở người, đất, nước, thiết bị y té, dung cu y khoanhu day may tho, day hut dom nhot, dung cu lam âm, kim luồn tĩnh mach, dụng cụđo áp lực tĩnh mạch trung tâm, ống thông tiéu, Trong đó, 4 baumannii thườnghiện diện nhiều trong máu, đờm, da, dịch màng phối và nước tiểu của bệnh nhân Ovùng khí hậu nhiệt đới, tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện còn có thé thay đối theomùa Tai Hong Kông, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do Acinetobacter vào mùa hèchiếm 53% và mùa đông giảm xuống 32% [83] Ngoài ra, 4 baumannii còn là tácnhân gây bệnh ở động vật Đặc biệt, 22% A baumannii được tim thay trén con ranđược lay từ người vô gia cu [22] Tại Anh, Berlau và cộng sự phat hiện 4.baumannii và Acinetobacter genospecies 11 ở rau chiếm 27% [44]

1.1.5 DNA nhiễm sắc thé của Acinetobacter baumannii

Nhiễm sac thé A baumannii dạng vòng có kích thước 3.976.747 cặp base,trong đó 3.454 nucleotide chịu trách nhiệm mã hóa protein [84] 4 baumannii có 25

gen kháng khang sinh như: tetracycline, aminoglycoside, cotrimoxazole vachloramphenicol Yếu tố di chuyền động transposon tìm thay trên khung doc ORF22 [67].

1.1.6 Kha năng gay bệnh

Khả năng gây bệnh của A pittii và A nosocomialis tương đôi thấp, các loàiA bereziniae, A guillouiae, A haemolyticus, A johnsonii, A junii, A lwoffii, A.parvus, A radioresistens, A schindleri, A soli, A ursingiiare hiém khi gay nhiémkhuẩn bệnh viện [39, 68] Trong khi đó, A baumannii lại được xem như mộtnguyên nhân chủ yếu gây nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt đối với bệnh nhân thởmáy tại khoa ICU.

1.2 NHIEM KHUAN BỆNH VIEN

Theo Tổ chức Y tế thé giới, nhiễm khuẩn bệnh viện là “những nhiễm khuẩnmặc phải trong thời gian bệnh nhân điều trị tại bệnh viện ma thời điểm nhập việnkhông thấy có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nao Nhiễm khuẩn bệnh viện thườngxuất hiện sau 48 giờ kế từ khi người bệnh nhập viện” [33]

1.2.1 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện1.2.1.1 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện trên thé giới

Tại Mỹ, từ những năm 1980, hầu như tat cả các bệnh viện đều thành lập đơnvị kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát vàphòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC), nhiễm khuẩn bệnh viện thường xảy ra trên5% bệnh nhân nhập viện, tuy nhiên đối với những bệnh nhân phẫu thuật thì ty lệnày tăng lên 10-15%, do vậy làm tăng thời gian năm viện, chỉ phí điều trị tốnkhoảng 1.000-8.000 USD và là nguyên nhân làm 19.000 người tử vong mỗi năm[60].

Năm 2002, tô chức Y tế thé giới tiến hành điều tra nhiễm khuẩn bệnh viện tai55 bệnh viện của 14 nước đại diện cho bốn khu vực (Đông Nam Á, Châu Âu, ĐịaTrung Hải và Tây Thái Bình Dương) có tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện trung bình là

6,7%, trong đó khu vực Dia Trung Hải 11,8%, Đông Nam Á 10%, Tây Thái BìnhDương 9% và khu vực có tỷ lệ thấp nhất là Châu Âu 7% Cũng theo ước tính của tổchức Y tế thế giới ở bất cứ thời điểm nao đều có hơn 1,4 triệu người bệnh trên thếgiới mắc nhiễm khuẩn bệnh viện [32] Tại Trung Quốc, từ năm 2006-2008 phân lậpđược 149 chủng 4 baumannii tại khoa ICU (chiếm ty lệ 72,5%) [71] Một nghiêncứu khác thực hiện từ năm 2008-2011 tại bệnh viện nhi Diyarbakir (Thổ Nhĩ Ky),phát hiện 580 trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện, trong đó A baumannii chiễm48% tại khoa ICU [72|.

1.2.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện ở Việt Nam

Tại Việt Nam, kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện đã từng bước được thiết lập,tuy nhiên do tình trạng quá tải và nguồn lực còn hạn chế của các bệnh viện nên ty lệnhiễm khuẩn bệnh viện vẫn còn khá cao Năm 1998, Bộ Y tế điều tra trên 901 bệnhnhân tại 12 bệnh viện cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện là 11,5%, trong đónhiễm khuẩn vết m6 chiém 51% Năm 2001, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện là 6,8%tại 11 bệnh viện và viêm phối bệnh viện chiếm 41.8% Năm 2005 tỷ lệ nhiễm khuẩnbệnh viện ở 19 bệnh viện là 5,7% và viêm phổi bệnh viện cũng chiếm tỷ lệ cao là55,4% [10] Năm 2009-2010, tại Trung tâm chống độc - Bệnh viện Bach Mai (HàNội), tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện là 5,66%, trong đó viêm phối bệnh viện chiếm69.9%; nhiễm khuẩn máu 28,8%: nhiễm khuẩn tiết niệu 23,1%; nhiễm khuẩn liênquan đến ống thông tinh mạch trung tâm 11,5% Nguyên nhân do 4 baumanniichiếm ty lỆ cao nhất 31,7% so với các vi khuan Pseudomonas aeruginosa 18,7%,Klebsiella pneumoniae 14,2% va Escherichia coli 6,19% [13] Năm 2010, tại khoaHỏi Sức tích cực - chống độc của bệnh viện Cấp Cứu Trung Vuong (Tp Hồ ChíMinh), phát hiện A baumannii chiễm 32.3% va là nguyên nhân hang đầu gây nhiễmkhuẩn đường hô hấp với tý lệ 39,3% [12] Như vậy tý lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tạiViệt Nam dao động trong khoảng 5 đến 11,5%, tương tự với kết quả khảo sát của tổchức Y tế thế giới tại các khu vực khác trên thế giới

1.2.2 Nguồn lây truyền và phương thức lây truyền nhiễm khuẩn bệnh viện

Nhiễm khuẩn bệnh viện thường lây truyền từ người sang người hay từ môitrường (bảng 1.1) [9].

Bảng 1.1 Nguồn lây truyền nhiễm khuẩn bệnh việnNguồn lây Tác động

- _ Nhân viên y tế mang mam bệnh lây cho bệnh nhânCon -

người - - Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân: gây nhiêm khuân chéo

cho nhau- _ Không khí: mức độ ô nhiễm vi sinh vật thay đối theo địa điểm,

mật độ bệnh nhân và số lượng nhân viên y té- _ Nước sinh hoạt: là nguồn chứa va là yếu tố trung gian lan

truyền các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện

Bảng 1.2 Phương thức lây truyền nhiễm khuẩn bệnh việnĐường lây truyền Phương thức lây truyền

' Tiêp xúc trực tiêp hoặc gián tiêp qua nhân viên y tê, đặc

Đường tiêp xúc , ;

biệt là tay nhân viên y té trước và sau khi chăm sóc

Đường lây truyền Phương thức lây truyềnĐường tiếp xúc

bệnh nhân; được xem là nguyên nhân quan trọng nhattrong việc phát tán vi khuẩn gây bệnh

Tiếp xúc qua dụng cụ y té, qua thức ăn, nước uống hoặccác chất thải y tế như bông băng có dịch rỉ vết thương

hoặc khi thực hiện một số thủ thuật chăm sóc đường thở

Đường không khí

Mâm bệnh được thải ra không khí qua ho, hắt hơi, khạcnhố Với những hạt có kích thước nhỏ sẽ bay lơ lửngtrong không khí và xâm nhập vào người qua đường mũi,miệng

1.2.3 Các yếu tố nguy cơ dẫn đến nhiễm khuẩn bệnh viện

Nguy cơ nhiễm khuẩn bệnh viện thường liên quan đến các yếu tố như tìnhtrạng sức khỏe, các bệnh cấp tính, thủ thuật xâm lấn hay cách thức điều trị bệnh(bảng 1.3) [49].

Bang 1.3 Các yếu tố nguy cơ dẫn đến nhiễm khuẩn bệnh viện

Đặt ông qua đường hô hap Ông thông mũi dạ dàyCatheter tinh mạch trung tam Khí quản

Ông dẫn lưu Ông thông đường tiểu

Yếu tố nguy cơ Tình trạng

Truyền máu Vị trí năm nghiêngĐiều trị Điều trị kháng sinh Dinh dưỡng

Điều trị ức chế miễn dịch Thời gian nằm viện1.2.4 Một số bệnh do nhiễm khuẩn bệnh viện

1.2.4.1 Viêm phối mắc phải ở bệnh viện

Bệnh viêm phôi mắc phải ở bệnh viện (HAP) thường xảy ra tại các cơ sở y tếtrên toàn thế giới, đứng hàng thứ hai sau nhiễm khuẩn đường tiểu Bệnh lý viêmphối xuất hiện sau nhập viện ít nhất 48-72 gid, thường gây viêm phối ở bệnh nhânthở máy và một số trường hợp liên quan đến chăm sóc y tế ngoại trú như truyềndịch, tiêm tinh mạch, chạy thận nhân tạo

Theo điều tra của NNIS trên 181.993 bệnh nhân điều trị tại khoa ICU từ năm1992 đến 1997, có 6% trường hợp viêm phối liên quan đến thở máy Một khảo sátkhác từ năm 2001-2006 ở các nước khí hậu nhiệt đới tỷ lệ viêm phối chiếm 43% tạikhoa ICU, trong đó 4 baumannii là nguyên nhân thường gặp nhất [37, 63] Dacbiệt, ty lệ tử vong liên quan đến viêm phổi mac phải ở bệnh viện do Acinetobacterchiếm từ 40-70% [48] Năm 2008, tại bệnh viện Cho Ray (Tp Hồ Chí Minh) bệnhviêm phối chiếm 81,8% và tỷ lệ tử vong là 45,5% [5]

1.2.4.2 Viêm phối mắc phải ở cộng đồng

Viêm phối mac phải ở cộng đồng (CAP) là hiện tượng viêm phổi xảy ra ởngoài bệnh viện Tại bệnh viện Bạch Mai (Hà Nội) từ năm 1996-2000 có 345(9,57%) bệnh nhân bi CAP trong số 3.606 bệnh nhân điều trị viêm phối, đứng hangthứ 4 trong số các bệnh lý nhiễm khuẩn Viêm phổi mac phải ở cộng đồng doAcinetobacter làm tăng tỷ lệ tử vong từ 40-60% và thường liên quan đến tình trạngcủa bệnh nhân như lạm dụng rượu, bệnh tắc nghẽn phối mạn tính, chấn thương sọnão, hôn mê, hút thuốc lá, tiểu đường và một số trường hợp gặp ở người khỏe mạnh[50].

Một nghiên cứu về các biêu hiện lâm sang của nhiễm khuân bệnh viện do A.baumannii, có 19 trường hợp viêm phôi mặc phải ở cộng đông và 74 trường hợpviêm phôi mac phải ở bệnh viện, hon 80% các trường hợp có biêu hiện sot, ho, códom [81].

1.2.4.3 Nhiễm khuẩn máu

Trên thế giới, tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn máu chiếm từ 20-70% [18, 19,

28, 79] Chỉ riêng tại Mỹ mỗi năm có khoảng 750.000 người bị bệnh và 215.000

trường hợp tử vong [18, 79] Tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn máu tương đương vớitử vong do nhéi máu cơ tim cấp và cao hơn nhiều so với AIDS và ung thư vú A.baumannii là nguyên nhân pho bién gây nhiễm khuẩn máu, chiếm 20% tại khoaICU của bệnh viện Singapore vào năm 2001-2006 và chiếm 40.8% tại bệnh viện ARap Saudi vào năm 2006-2010 [37, 65] Tại bệnh viện Nhiệt Doi (Tp Hồ Chí Minh)nhiễm khuẩn máu do Acinetobacter chỉ chiém 4%, tuy nhiên tại bệnh viện cấp cứuTrưng Vương (Tp Hỗ Chi Minh) tỷ lệ này là 15% vào năm 2010 [12] Nhiễm khuẩnmáu do A baumannii gây tu vong từ 28-43% [36, 39].

1.2.4.4 Nhiễm khuẩn do bỏng

Da bị ton thương do bỏng là môi trường thuận lợi dé vi khuẩn xâm nhập, gâyức chế miễn dịch, làm vết thương lâu lành Nhiễm khuẩn vết bỏng do 4 baumanniichiếm tỷ lệ 22% trong các vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện [31] Tuy nhiên,nhiễm khuẩn bong do A baumannii làm tăng tỷ lệ tử vong lên 31% so với các bệnhnhân không bị nhiễm khuẩn là 14% [38]

1.2.4.5 Nhiễm khuẩn mô mém

Nhiễm khuẩn mô mém do vi khuẩn xâm nhập vào vùng da bị tôn thươnghoặc da bình thường Nhiễm khuẩn có thể gây ra hiện tượng đỏ da, sưng, nóng, đau

hoặc tăng nhạy cảm, chảy dịch hoặc mủ, sốt Trong đó, nhiễm khuẩn mô mềm do A

baumannii được quan tâm nhiều ở bệnh nhân bị chân thương [26, 69]

1.2.4.6 Các biện pháp phòng ngừa nhiễm khuẩn bệnh viện

Đề giảm thiểu tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện cần phải thực hiện các biệnpháp như phòng ngừa lây truyền và loại bỏ các nguy co gây nhiễm khuẩn bệnh viện,đồng thời tăng cường sức dé kháng cho bệnh nhân (bảng 1.4) [9, 33]

Bảng 1.4 Các biện pháp phòng ngừa nhiễm khuẩn bệnh việnBiện pháp Thực hiện

Giam sát môi trường bệnh viện và kiêm soát chất lượngLoại bỏ nguy co nhiễm nguồn nước

khuẩn bệnh viện Khử khuẩn bề mặt môi trường phòng bệnh, phòng khám,

phòng cận lâm sang, đồ dùng y tế, Vệ sinh tay theo đúng hướng dan của tô chức Y tê thé giới Xử lý dụng cu và đồ vải bị nhiễm

Phòng ngừa lây truyền

+ , Kỹ thuật làm giảm vi sinh vật trên da người bệnh trướctác nhân nhiễm khuân -

phâu thuậtbệnh viện ‹ ;

Giảm nguy cơ lan truyền vi sinh vật từ nhân viên y tê hoặctừ môi trường tới người bệnh

Kiểm soát ô nhiễm không khíTăng cường sức dé Sử dụng kháng sinh dự phòng tại chỗ hoặc toàn thân đôi

kháng của cơ thể với những bệnh nhân phẫu thuậtĐề hạn chế các hậu quả do nhiễm khuẩn gây ra, một trong những việc cầnthực hiện là định danh nhanh và chính xác vi khuẩn gây bệnh Điều này sẽ giúp cácbác sĩ có chỉ định sử dụng kháng sinh hiệu qua, hợp lý và an toàn, góp phan làmgiảm tỷ lệ tử vong cũng như hiện tượng đề kháng kháng sinh Hiện nay, để địnhdanh vi khuẩn, 02 phương pháp thường được sử dụng đó là phương pháp thực hiệnphản ứng sinh hóa và phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA Phương phápđịnh danh dựa trên phản ứng sinh hóa là phương pháp thường qui, được áp dụngrộng rãi tại các phòng xét nghiệm lâm sàng Trong khi đó phương pháp định danhdựa trên trình tự gen 16S rDNA lại được sử dung trong nghiên cứu co bản hay đối

với trường hợp gặp khó khăn khi làm phản ứng sinh hóa như đã đề cập, ví dụ vikhuẩn khó nuôi cấy, vi khuẩn có thời gian thế hệ dải hay một số kết quả phản ứngsinh hóa không rõ giữa các loài thuộc cùng một chi.

1.3 GEN 16S rRNA CUA TE BAO VI KHUAN

Ribosome của vi khuẩn có hệ số lang 708 gồm 02 tiểu đơn vị, tiểu đơn vịnhỏ 30S và tiểu đơn vị lớn 50S Tiểu đơn vị nhỏ được cấu tạo bởi phân tử 16StRNA ~ 1540 nucleotide liên kết với 21 protein, tiểu đơn vị lớn cau tạo bởi 5SrRNA ~ 120 nucleotide và 23S rRNA ~ 2900 nucleotide liên kết với 31 protein[24] rRNA chiếm 80% tổng số RNA của tế bào rRNA đóng vai trò quan trọng chosự sống còn của tất cả các tế bào, chúng có nhiều bản sao và có tính bảo tồn vìchúng đòi hỏi sự tương tác phức tap dé duy trì bộ máy tong hợp protein Tuy nhiên

rRNA vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt và đặc trưng cho từng vi

sinh vật [40] Do đó, rRNA được xem là công cụ hữu ich để phân loại, định danh vàxác định cây tiến hóa của vi sinh vật Gen 16S rRNA gồm 10 vùng DNA có trình tựnucleotide có thé thay đổi tùy theo loài (V1-V10) (hình 1.1) [40] Vùng bảo tồn vàvùng thay đổi xếp xen ké liên tục nhau, nhờ vậy một số cặp môi phổ quát có trình tựgiống vùng bảo tồn đã được thiết kế, cho phép khuếch đại gen 16S rRNA Môi phổquát thường có trình tự tương đồng với vùng bảo tổn ở phan dau trình tự gen, vùngbảo ton giữa V3-V4 hoặc ở phan kết thúc của trình tự gen (hình 1.1)

nhưng không thé nuôi cay Phương pháp nay có thé rút ngăn thời gian, giảm côngsức và cho kết quả chính xác so với phương pháp nuôi cấy

1.4 VUNG ITS 16S-23S rRNA

Cac gen rRNA 16S, 23S va 5S thuong duoc su dung dé dinh danh vi sinh vatvà nghiên cứu quá trình tiễn hóa Trong đó, phân tích trình tự 16S rRNA được sửdụng cho mục đích định danh và phân loại vi khuẩn Tuy nhiên, khó khăn gặp phảikhi phân tích trình tự 16S rRNA là sự thay đôi xảy ra chậm, khác biệt về trình tựnucleotide giữa các loài thấp, vi vậy việc phân loại vi khuẩn khó chính xác Phântích vùng ITS 16S-23S rRNA có thé khắc phục được vấn dé nay vi sự thay đôi trìnhtự nucleotide xảy ra nhanh hơn 10 lần so với gen rRNA [78] Vùng ITS có sự thayđối giữa các loài ở mức độ cao, cả về chiều dài cũng như trình tự nucleotide nênchúng cũng là công cụ hữu ich để định danh, phân loại và nghiên cứu quá trình tiếnhóa của vi sinh vật [59, 80] Vung ITS là một trình tự nucleotide không có chứcnăng thuộc rRNA Ở vi khuẩn, gen rRNA phiên mã thành tiền rRNA gồm các thànhphan (theo chiều 5°-3') 16S rRNA, spacer, 23S rRNA, spacer và 5S rRNA (hình1.2) [43] Các vùng bảo tồn 1-10 được dùng dé thiết kế cặp môi đặc hiệu khuếch đạivùng ITS 16S-23S rRNA có chiều dài trung bình 150-1.500 bp [42, 53]

Hình 1.2 Cấu trúc tiền rRNA

1-4: trình tự nucleotid phiên mã 16S rRNA5-10: trình tự nucleotid phiên mã 23S rRNA

1.5 GEN recA

Ở tế bao vi sinh vật, khi DNA bị hu hỏng như do chiếu tia UV, tia X hoặc dotac dung của hóa chất gây đột biến, hệ thống sửa sai SOS của tế bao nhanh chóngđược khởi động Hai protein thuộc hệ thống nay được mã hóa bởi gen /exA va recA

Protein lexA kìm hãm hoạt động của hệ thông SOS, tuy nhiên trong trường hợpDNA có nhiều sai hỏng cần can thiệp, recA sẽ phiên mã, protein recA được tonghợp giúp quá trình sao chép DNA hư hỏng tiếp tục được diễn ra, không bị giánđoạn Đặc biệt, recA có tính bảo tồn cao giữa các loài sinh vật (hình 1.3) [70] Tuynhiên, chúng cũng có những vùng gen khác nhau giữa các loài nên cũng thườngđược sử dụng để định danh và phân loại vi khuẩn [73] Protein recA gồm 8 vùngbảo tổn cao BI, B2, Cl, C2, D, El, E2, F và có sự tương đồng giữa các proteinrecA của vi sinh vật Chỉ số bảo tôn tại mỗi vung cua eubacteria, eukaryote vaarchaea khác nhau, trong đó vùng E1 bảo tồn cao nhất Nếu chỉ số bảo tôn là 1,00thì vùng đó không thay đổi trong tất cả các protein recA tương đồng Ngoài ra, mỗivùng của protein recA có các vùng chức năng như liên kết với DNA, liên kết vớiATP, Monomer-Monomer (MM) và tương tác chuỗi Cơ chế hoạt động của recAđược biết rõ ở È coi và một sô vi khuân khác.

N-terminus C-terminusVùng trung tâm”"Ầ——ẹœ “te ®

c2 D E1 E2 t

Hình 1.3 Chức nang của protein recA

Vùng bảo tồnB1 B2Amino acid

Monomer-Monomer

Tương tác chuỗi

1.6 PHƯƠNG PHÁP PCR1.6.1 Nguyên tắc

PCR là kỹ thuật tong hop DNA in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minhnăm 1985 Kỹ thuật này cho phép khuếch đại các đoạn DNA thành hang triệu bansao nhờ vào sự tham gia của các thành phần: DNA khuôn mẫu chứa đoạn DNA cầnkhuếch đại DNA polymerase có vai trò xúc tac tổng hop DNA, 4 loạideoxynucleotide (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), mỗi xuôi va mỗi ngược cótrình tự bố sung với hai đầu của chuỗi DNA cần khuếch đại, ngoài ra còn có sựtham gia của ion Mg” và dung dịch dịch đệm phản ứng PCR [1, 11]

Phản ứng PCR gồm khoảng 30-40 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước (hình1.4) Bước 1: DNA khuôn mẫu được biến tính ở 94-95 °C trong thời gian từ 30giây đến 1 phút, sợi đôi DNA tách nhau hoàn toàn, tạo thành các sợi don dùnglàm khuôn cho tong hop DNA Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp còn khoảng 40-70°C (thấp hơn Tm của các mỗi) Giai đoạn này 2 cặp mỗi xuôi và mỗi ngược sẽbắt cặp với DNA khuôn mẫu trong khoảng 30 giây đến 1 phút Bước 3: nhiệt độtăng lên 72 °C, đây là nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme DNA polymerase.Giai đoạn này sợi đơn DNA được tổng hợp theo chiều 5’-3’ trong khoảng thờigian 30 giây đến vài phút Sau một chu kỳ, một DNA đích đã được nhân lênthành hai ban sao và như vậy sau n chu kỳ sẽ tao được 2” bản sao.

30 - 40 chu kỳ, gồm 3 bước

Sợi đơn DNA 94-95 °C/30 giây-1 phút

ngugc

72 °C/30 giây-vài phút

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng PCR1.6.2 Ưu nhược điểm của phương pháp PCR

1.6.2.1 Uu điểm- _ Thời gian thực hiện nhanh, chỉ mat khoảng 3 giờ dé khuếch đại một trình tự

DNA đích.- _ Độ nhạy của phản ứng cao, chi cần 0,1-1,0 pg DNA khuôn mẫu cũng có thé

thu được sản phẩm [1].1.6.2.2 Nhược điểm

- — Ngoại nhiễm là một trong những nhược điểm của kỹ thuật PCR Ngoạinhiễm có thể gây khuếch đại các sản phẩm PCR không đặc hiệu Nguyênnhân ngoại nhiễm thường do nhiễm chéo DNA giữa các lần thao tác Ngoạinhiễm có thé khắc phục băng cách sử dung dUTP thay dTTP b6 sung thànhphan uracil DNA glycosylase (UNG), UNG sẽ phân hủy tất cả DNA ngoạinhiễm có dUTP UNG sé bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần bién tính đầu tiên[1 15].

- Can trang bị máy luân nhiệt PCR, hóa chất chuyên biệt và kỹ thuật viênphải có trình độ chuyên môn.

1.7 MULTIPLEX PCR1.7.1 Nguyén tac

Multiplex PCR ra doi năm 1988, là một kỹ thuật được cai tién từ phuongpháp PCR don giản [45] Phuong pháp này sử dung nhiều cặp môi trong một phảnứng PCR cho phép khuếch đại cùng lúc nhiều đoạn DNA đích có kích thước khácnhau Hiện nay, multiplex PCR được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chan đoán cácbệnh nhiễm khuẩn [21, 45]

1.7.2 Một số thay đối nhằm tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR

Đề thu được toàn bộ sản phẩm PCR đích mong muốn, điều kiện thực hiệnmultiplex PCR can được tối ưu hóa Khi xảy ra sự cô như các sản phẩm khuếch đạikhông rõ hay không có sản phẩm thì có những giải pháp như thay đổi nhiệt độ gắnmôi, thay đổi thành phần phản ứng PCR (bảng 1.5) [2, 66]

Bang 1.5 Một số thay đôi nhằm tối ưu hóa phan ứng multiplex PCRVấn đề Giải pháp

- Tăng thời giai đoạn kéo dài

- Giảm nhiệt độ giai đoạn kéo dài (62-68 °C)

- Giảm nhiệt độ bắt cặp môi (2 °C) hoặc giảm đến mức thấp

Sản phẩm khuếch đại nhất có thể

không rõ - Tăng nông độ môi

- Tăng nông độ DNA khuôn mẫu- Thay đôi nông độ Tag polymerase- Tăng nồng độ MgCl ~ 3,0-4,5 mM

Sản phẩm cókích - lãng nông độ dung dịch đệm từ 1,0X lên 1,4-2,0X

thước ngăn không rõ - Giảm nhiệt độ bắt cặp môi hoặc nhiệt độ giai đoạn kéo dài

Sản phẩm có kíchthước ngăn không rõ

- Tang nông độ môi của san phâm không rõ

Sản phẩm có kíchthước lớn không rõ

- Tang thời gian ở giai đoạn kéo dai

- Tăng nhiệt độ bắt cặp môi hoặc giai đoạn kéo dài

- Giảm nông độ dung dịch đệm 0,7-0,8X, giữ nguyên nồngđộ MgCl, 1,5-2,0 mM

Không có san phẩmDNA đích

- Nếu sản phẩm có kích thước lớn: tăng nồng độ dung dịchđệm 1,4-2,0X

- Nêu sản phâm có kích thước ngăn: giảm nông độ dungdịch đệm 0,7-0,9X

- Tăng dần nhiệt độ bắt cặp mỗi- Giảm nông độ DNA khuôn mẫu và enzyme Tagpolymerase

- Tăng nông độ MgCl, 2,0-12 mM

Không có băng DNA

- Bồ sung BSA 0,1-0,8 pg/ul- Bồ sung DMSO 5% hoặc glycerol- Kiểm tra các cặp môi

- Thay đổi tất cả các thành phan phan ứng PCR mới1.7.3 Ưu điểm và nhược điểm của multiplex PCR

So với phương pháp PCR đơn giản, kỹ thuật multiplex PCR có một số ưuđiểm và nhược diém sau:

s* Uu điểm

- Phat hiện cùng mot lúc nhiêu vùng của bộ gen hoặc nhiêu sinh vật trong

- Dé thao tác, tự động hóa.- Giam giá thành so với PCR.- Tiét kiệm hóa chất và thời gian thực hiện.s* Nhược điểm

- Kho khăn khi thiết kế và lựa chọn các mỗi phù hợp trong một phản ứng.Bên cạnh hai phương pháp PCR va multiplex PCR, phương pháp colony-PCR cũngđược sử dụng khá phổ biến Khác với hai phương pháp PCR trên, colony-PCR thựchiện trực tiếp trên các khuẩn lạc - nguồn cung cấp DNA khuôn mẫu cho phản ứng.Vì vậy, colony-PCR rất tiện lợi, nhanh chóng và tiết kiệm thời gian do không cần visinh vật thuần chủng, không cần tách chiết DNA nhiễm sắc thể

1.8 MỘT SO CHUONG TRINH TIN SINH HOC* Hệ thong NCBI

NCBI (National Center for Biotechnology Information) là trung tâm quốc giavé thông tin công nghệ sinh học, được thành lập vào năm 1988 tại Mỹ, là một trongnhững cơ sở dữ liệu ngân hàng gen lớn nhất thế giới Như cơ sở dữ liệu phân tử:Nucleotide Database, Protein Database, Structure Database, PopSet Database Co sởdữ liệu bộ gen của sinh vat Genomes, Clusters of Orthologous Groups (COG)Database, Homologene, LocusLink.

* Hệ thong HOMD 16S rRNA Gene SequenceHOMD (Human Oral Microbiome Database) là ngân hang dữ liệu cung cấpthông tin về trình tự 16S rRNA của khoảng 700 loài va các trình tự 16S rRNA khác

“+ Phần mềm DNA StarEditSeq: công cụ xử lý nhanh chóng và chính xác các dữ liệu về trình tựDNA hoặc protein DNA Star EditSeq có thé doc được đữ liệu từ các địnhdạng: GenBank, FASTA, ABI, MacVector, Text va GCG.

SeqMan: công cụ sắp xếp các trình tự nucleotide theo trật tự.1.9 CAC NGHIÊN CUU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.9.1 Nghiên cứu trong nước

Tran Thị Thanh Nga nghiên cứu tình hình “Nhiễm khuẩn va dé kháng khángsinh tại bệnh viện Chợ Rẫy năm 2008-2009” Kết quả cho thấy 5 vi khuẩn gây bệnhthường gặp là E coli (18%), A baumannii (16%), Klebsiella spp (16%), S aureus(15%) và P aeruginosa (7%) Ty lệ đề kháng của 5 chủng này với Cephalosporinthế hệ 3 và 4, Quinolone > 70% Ngoài ra, xuất hiện chủng A.baumannii và P.Aeruginosa dé kháng với Carbapenem [6]

Cao Xuân Minh, Pham Hùng Vân và cộng sự (2010) nghiên cứu “Đặc điểmlâm sàng và mối quan hệ giữa kiểu gen và tính kháng thuốc của vi khuẩnAcinetobacter baumannii trong viêm phối bệnh viện tại bệnh viện Chợ Ray” 80%A baumannii kháng với các kháng sinh Cephalosorine thé hệ 3 và Ciproloxaeine; tỷ

lệ kháng cao (> 50%) và gia tăng mỗi năm [5]

Lý Ngọc Kính và Ngô Thị Bích Hà (2011) nghiên cứu “Tình hình khángthuốc kháng sinh trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số đơn vị điều trị tích cực ởmột số cơ sở khám, chữa bệnh” 1.100 bệnh án của bệnh nhân điều trị tại khoa hồi

sức tích cực, từ tháng 12/2009 đến 10/2010 tại 19 bệnh viện ở 3 thành pho: Hà Nội,

Hồ Chí Minh, Hải Phòng đã được điều tra Kết quả cho thấy vi khuẩn Gram (-)Acinetobacter, Pseudomonas, E coli va Klebsiella là những nguyên nhân chủ yếugây nhiễm khuẩn bệnh viện Trong đó, Acinetobacter và Pseudomonas gặp nhiềunhất ở viêm phối bệnh viện và kháng kháng sinh điều trị > 50% [4]

Nguyễn Phú Hương Lan và cộng sự (2012) “Khảo sát mức độ đề khángkháng sinh cua Acinetobacter và Pseudomonas phân lập tại bệnh viện bệnh NhiệtĐới năm 2010” Kết quả phân lập vi khuẩn chi Acinetobacter chiếm ty lệ 50,5% vàPseudomonas chiêm 31% Acinetobacter kháng Carbapenem với tỷ lệ 75% [3]

Ngô Thị Héng Phương, Nguyễn Quốc Hiệu và cộng su (2013) đã nghiên cứu“Tinh hình kháng khang sinh của Acinetobacter baumannii phát hiện được tại ViệnPasteur Thành phố Hồ Chí Minh” Tỷ lệ kháng các loại kháng sinh thường dùng >90%, nhạy với Colistin và 50% số chủng sản xuất được enzyme metallo-beta-lactamase [7].

Trần Thị Thúy Phượng và Kiều Chí Thành (2013) “Nghiên cứu khả năng khángthuốc kháng sinh của một số chủng thuộc loài Acinetobacter baumannii phân lập tại bệnhviện Trung ương Huế” Mức độ kháng kháng sinh họ Aminoglycosid từ 70,53% -74,74%:;Cephalosphorin từ 83,37% - 91,58%; Floroquinolon từ 81,05% - 91,58% [8].

Nguyễn Thị Vân và cộng sự (2014) “Nghiên cứu tình hình nhiễm Acinetobacterbaumannii và Pseudomonas aeruginosa trong nhiễm khuẩn tại khoa hồi sức tích cực bệnhviện Hữu Nghị Việt Đức” cho thay A baumannii và P aeruginosa là hai nguyên nhân gâynhiễm khuẩn hàng đầu tại Khoa Hồi sức tích cực tại bệnh viện Việt Đức [14]

1.9.2 Nghiên cứu ngoài nước

M.Vaneechoutte và cộng sự (1995) định danh được các loài A haemolyticus,A johnsonii, A junii, A calcoaceticus, A baumannii, A pittii và A nosocomialisbăng kỹ thuật khuếch đại các đoạn cắt giới han rDNA (ARDRA) của gen 16SrDNA [57].

German Bou va céng su (2000) khao sat tinh hinh nhiém khuan do vi khuanAcinetobacter baumannii khang Carbapenem bang kỹ thuật điện di trong trườngxung điện (PFGE) tại bệnh viện Ramon y Cajal, Madrid, Tây Ban Nha Kết qua chothay A baumannii kháng với Imipenem và Meropenem [34]

Chang và cộng su (2005) định danh va phát hiện được 2 loài Acinetobactercalcoaceticus va Acinetobacter baumannii trong mẫu bệnh phâm nhiễm 2 loài naybằng kỹ thuật phân tích trình tự vùng ITS16S-23S rRNA [35]

Chen T.L và cộng sự (2007) định danh vi khuẩn 4 baumannii băng kỹ thuậtmultiplex PCR tại trình tự ITS 16S-23S rRNA và kỹ thuật ribotyping Kết quả cho

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

14 mẫu bệnh phẩm (bảng 2.1) của bệnh nhân điều trị tại các khoa lâm sàngbệnh viện Da khoa tỉnh Bình Dương nhiễm cầu trực khuẩn Gram (-) A.baumannii Các A baumannii đã được định danh bang phương pháp sinh hóatại Bộ môn VI sinh - Ký sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố HồChí Minh Vi khuân được bảo quản trong môi trường chứa 10% glycerol, ở -20 °C

Bacillus subtilis su dung làm chứng âm trong phan tng multiplex PCR do Bộmôn Vi sinh - Ky sinh, Khoa Dược, Dai học Y Dược Thanh phố Hồ ChíMinh cung cấp

Bang 2.1 Mẫu bệnh phẩm A baumanniiSTT Mã số Mẫu bệnh phẩm Khoa/phòng

| 5333(*) Dich phé quan Nội 12 4145(*) Phan Hồi sức tích cực - chống độc3 5247(5) Dịch phế quản Hồi sức tích cực - chống độc4 5270(*) Dich phé quan Hồi sức tích cực - chống độc5 5197(*) Dich phé quan Hồi sức tích cực - chống độc6 4246 Mu Nội 1

7 5378 Dich ối San8 5308 Dich phé quan Nội 19 5370 Dich phé quan Hồi sức tích cực - chống độc

STT Mã số Mẫu bệnh phẩm Khoa/phòng10 5251 Dịch phế quản Hồi sức tích cực - chống độc11 5249 Dich phé quan Hồi sức tích cực - chống độc12 5377 Dịch phế quản Hồi sức tích cực - chống độc13 4154 Dịch phế quản Hồi sức tích cực - chống độc14 5199 Dịch phế quản Hồi sức tích cực - chống độc(*): mẫu bệnh phẩm được tách chiết DNA nhiễm sac thé và giải trình tự 16S rDNA

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU2.2.1 Dụng eụ và thiết bị

Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.2, bảng2.3.

Bảng 2.2 Dụng cụSTT Dung cu STT Dung cu

| Micropipette các loại: 0,5 - 1000 ul 7 Binh tam giác2 Đầu tip tương ứng 0,5 - 1000 ul 8 Dia Petri3 Eppendorf : 0,2 ml; 1,5 ml; 2 ml 9 _ Đèn cồn4 Ong nghiém 10 Que cấy5 Ong dong 11 Giddéng nghiệm6 Kính bao hộ phòng thi nghiệm 12 Các dụng cụ khác

Bảng 2.3 Thiết bịSTT Thiết bị Xuất xứ

| Bộ đọc gel (UV) Mỹ2 Bếp cách thủy Memmert WB14, Đức3 Bo gia nhiét Wealtee HB-2, My4 Can ky thuat dién tu TE412, Duc

5 Kinh hién vi Labomed, Indonesia6 May anh kỹ thuật số Sony, Nhật Bản7 Máy điện di năm ngang My

8 May do pH Meter pH-200L, Han Quốc9 May lac Shaker-300, Han Quốc10 May ly tam HERMLE Z233 M-2, ĐứcII Máy PCR TC - 3000G, Mỹ

12 May vortex ZX3, Y13 Lo hap tiét tring Hirayama HV-110, Nhat Ban14 Tu am Binder-115, Mỹ

15 Tủ hốt Indonesial6 Buông thôi khí vô trùng ESCO-AVC-4AI1, Indonesia17 Tủ lạnh sâu -40 °C Sanyo MDF-41, Nhật Ban

2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường MacConkey (MC)

Peptone từ gelatinPeptone từ caseinPeptone từ thịt

NaCl

Lactose

Hỗn hop muối mậtĐỏ trung tínhTím tinh thểThạch

pH

Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB)

Pepton từ caseinPepton tu đậu nành

NaCl

D (+) — glucoseK,HPO,

pH

0,03 g0,001 g13,5 g71+02

7,3 = 0,2

2.2.3 Hóa chất

Bảng 2.4 Một số hóa chấtThành phần Hãng san xuất Bao quảnTím Gentian Merck Nhiệt độ phòngDung dịch Lugol Merck Nhiệt độ phòngDung dịch Fuchsin Merck Nhiệt độ phòng

TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA) Merck Nhiệt độ phòngSarcosyl 20% Merck Nhiệt độ phòngSodium dodecyl sulfate (SDS) 10% Merck Nhiệt độ phòngNatri acetate 3 M Merck Nhiệt độ phòngCetyltrimethyl Ammonium Bromide /NaCl Merck Nhiệt độ phòng

Chloroform Merck Nhiệt độ phòngAgarose tinh khiết Merck Nhiệt độ phòngTris base Merck Nhiệt độ phòng

Acid acetic Merck Nhiệt độ phòng

Na;EDTA Merck Nhiệt độ phòngCôn 100% và cồn 70% VN-chemsol Nhiệt độ phòngKit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up

System” Promega Nhiệt độ phòng

RNAase 4 mg/ml Promega 25°C

Dung dịch đệm PCR 10X abm -20 °CdNTPs 10 mM abm -20 °CMgSO, 25 mM abm -20 °CEnzyme Tag DNA polymerase 5 UI/pl abm -20 °C

Proteinase K 20 mg/ml abm -20 °C