CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quy trình tiến hành định danh va phát hiện nhanh vi khuẩn A. baumanii bang kỹ thuật sinh học phân tử được tiễn hành theo sơ đồ 2.1.
Vv
Phân lập vi khuẩn
Vv
Nuôi cấy vi khuẩn trên TSB )
Vv
Tach chiết DNA băng phương pháp hóa hoc va enzyme
Kiểm tra DNA nhiễm sắc thé bang phuong phap dién di
Ỷ
Khuếch đại đoạn gen Khuéch đại trình tự DNA đặc 16S rDNA hiệu bang multiplex PCR
Tinh sach sản phâm 16S rDNA
Vv
Giai trinh tu 16S rDNA
v
; Phat hién san pham PCR
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thi nghiệm
29
2.3.1. Định danh vi khuẩn bang phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA 2.3.1.1. Phân lập vi khuẩn
Phân lập nham tách riêng các loài vi khuẩn từ quan thé ban đầu va đưa về dạng thuần chủng. Tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trường MC và ủ ở nhiệt độ 37
°C để cho các vi khuẩn tạo khuẩn lạc riêng rẽ. Sau đó quan sát hình thái khóm vi
khuân về mau sac, hình dạng và kích thước.
* Quan sát hình dang vi khuẩn
Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi X100 về hình
dạng, cách săp xêp.
Có định vi khuẩn trên Quan sát kính hiển
lame với giọt nước vi 100X
Ho khô trên ngọn > Hơ khô lửa đèn con
id-“
-- -- Pd- .--“
---
30 giây, :-
Nhuôm rửa nước Nhuộm
: | — —— ơ. fucshin
tim gantian |.“ ơ
K ae V A * AV “
Co dinh lugol >| Tay bang con 95%
Hình 2.1. Quy trình nhuộm Gram vi khuẩn
2.3.1.2. Nuôi cấy vi khuẩn
Vi khuẩn được nuôi cấy bằng môi trường TSB với tốc độ lắc 200 vòng /phút ở 37 °C trong 18-24 giờ.
2.3.1.3. Tách chiết DNA vi khuẩn
Chọn ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm có số 5333, 4145, 5247, 5270, 5197 (bảng 2.1) tiễn hành phân lập vi khuẩn trên môi trường MC, nuôi cấy vi khuan trên môi trường TSB và tách chiết DNA nhiễm sắc thé với 5 quy trình (hình 2.2) bằng
phương pháp hóa học và enzyme.
30
Hút 1,5 ml dich vi khuẩn 4. baumannii. Ly tâm 13000 vòng/2 phút. Thu tế bào vi khuẩn Quy trình 1
3
Quy trình 5
Vv m m
1 ml đệm TE (50 ul đệm (Ề 567 wl đệm TE, b (400 ul đệm TE, 800 wl đệm TE, 30 pl sarcosyl
Tron đều | 17 80 °C/ TE, 50 ul 30 nl SDS 10%, 30 pl sarcosyl 20%, 4 wl proteinase K 20 mg/ml,
nhe nhàng | 5 phút SDS 10%, 3 wl proteinase K 20%, 5 ul 6 ul RNAase 4 mg/ml
25 ul 20 mg/ml proteinase K 20 :
Làm lạnh đến proteinase K Z mg/ml Tron đêu U 37°C/
nhiét 46 phong 20mg/mL | Trộônđều |U37°C `. yy nhẹ nhàng | 1 giờ
` yy yy nhẹ nhàng | /1 giờ Trộn đều U 37 °C/ Thém 700 ml cloroform 7 6 wl RNAase Tron U 55 "C/ 100 pl NaCl 5M, nhẹ nhàng | 1 giờ Tron đều Lv tâm Lặp lại
_ mm ou 50 phat | 80 pl CTAB/NaCl nhe nhang 13000 vòng/ | 3 lan
Tron đều U 37 °C nhang Tron déu | Ủ65°C 6 phut
nhe nhang | /30 phut ` , Ỳ
Vv nhẹ nhàng | (10 phút Ỷ [ Thu hồi dịch nổi |
Thêm 700 ml phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)
` Ỹ Vv Ỹ V
Tron đều nhẹ nhàng. Ly tâm 13000 vong/6 phút. Thu hỏi dịch nồi
` Ỹ Vv V Ỹ Vv
50 ul natri acetate 3 M
) Vv Vv Vv Vv V ‘
Tua DNA với 800 pl ethanol 100% lạnh. Ly tâm 13000 vong/5 phút
> Vv Ỹ V Vv Vv x
Rua DNA với 600 ul ethanol 70% lanh. Ly tâm 13000 vong/5 phút. Thu DNA. Làm khô ~ 50 °C.
Hòa tan với 25 wl nước cat vô trùng. Bảo quan DNA 4 °C hoặc -20 °C
` y
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA nhiễm sac thé vi khuẩn A. baumannii
31
s* Kiếm tra DNA nhiễm sắc thể bằng phương pháp điện di trên gel
Nguyên tắc của phương pháp điện di: phân tử DNA có điện tích âm vi vậy, khi phân tích DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose, DNA sẽ di chuyển vỀ cực dương. Đề quát sát được DNA, chúng được nhuộm băng SafeView TM Nucleic Acid Stain. Chat nay gan vào giữa các base nito của DNA va phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Cac phân tử DNA có kích thước va cầu dang khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau khi điện di, vì vậy có thé tách nhau. DNA có kích thước càng nhỏ cảng di chuyển nhanh và ngược lại.
Chuẩn bị gel và tiến hành điện di
- Cân 0,8 g agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X.
- Dun sôi, sau đó dé nguội đến 40-50 °C. Thêm 5 pl SafeView'TM Nucleic Acid
Stain.
- Đồ gel vào khuôn điện di.
- Chuẩn bị mẫu DNA nhiễm sắc thé: lay 9 pl DNA trộn với 1 wl đệm tải, nạp mẫu vào gel agarose.
- Chạy điện di ở điện thế 120V/45 phút.
- Quan sat DNA dưới UV.
2.3.1.4. Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA bằng PCR
Đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn kích thước ~ 1.500 bp được khuếch đại với cặp mỗi 27F 5’°-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’, Tm° 53,2 °C và 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3°, Tm® 54,6 °C (Y là T hoặc C, M là A hoặc C).
Bảng 2.5. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR
Thành phan Nong độ Thể tích (ul)
Dung dịch đệm PCR 10x 2.5 dNTPs 10 mM 1,5
32
Thành phan Nong độ Thể tích (ul)
MgSO, 25 mM 1,5
Mỗi xuôi 27F 10 uM 2,0 Mỗi ngược 1492R 10 uM 2,0
Tag DNA polymerase 5 Ul/pl 0,25
DNA nhiém sac thé 1,0
dH;O vừa du 25 ul 14,25
Đề thu được san pham DNA đặc hiệu, chúng tôi tiễn hành tối ưu hóa các thông số như nụng độ dNTPs, nụng độ MgSO/, nụng độ mụi, nụng độ 7ứứ DNA
polymerase và nhiệt độ găn môi.
và 56 °C.
- Tối ưu hóa nông độ MgSO,: ở nhiệt độ gan môi 52 °C, MgSO, được khảo sat VỚI 5 nông độ khác nhau 1,0 mM, 2,0 mM, 3,0 mM, 4.0 mM và 5,0 mM.
- Tối ưu hóa nông độ Tag DNA polymerase: ở nhiệt độ gắn mỗi 52 °C, Tag DNA polymerase được khảo sat với 5 nông độ khác nhau 0,2 UI, 0,6 UI, 1,0
UL 1,4 UI va 1,8 UL.
- Tdi ưu hóa nông độ dNTPs: ở nhiệt độ gan môi 52 °C, dNTPs được khảo sát với 5 nồng độ khác nhau 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,7 mM.
- TOi uu hóa nông độ môi: ở nhiệt độ gan mỗi 52 °C, môi được khảo sat với 5
Khảo sát nhiệt độ gắn môi: với thành phần phản ứng PCR cơ bản (bảng 2.5), tiễn hành khảo sát 5 nhiệt độ gắn môi khác nhau 48 °C, 50 °C, 52 °C, 54 °C
nông độ khác nhau 0,1 uM, 0,4 uM, 1,0 pM, 1,2 uM và 1,6 uM.
2.3.1.5. Tỉnh sạch sản phẩm PCR
Mẫu DNA sử dụng để giải trình tự đòi hỏi phải có độ tỉnh sạch cao. Vì vậy, DNA thu được sau PCR cần được làm sạch để loại bỏ các thành phan phan ứng PCR còn du cũng như các san phẩm PCR không đặc hiệu khác nếu có. Quá trình
33
này thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up
System” (hình 2.3).
Điện di và cat = Chuyển vào
băng DNA đặc 10 ml dung dịch gan cét SV tube hiệu trên gel màng/10 mg gel thu nhân
G >7 > >
Sản phẩm Gel chứa U 30-65 C/10 phut
PCR 16S DNA hoặc tới khi gel tan Ly tâm
rDNA 14000 rpm/
1 phút
Vv
Chuyén cột SV sang
tube mới Bỏ dich nỗi
Thêm nước Thêm dung dịch rửa màng Ly tâm 14000 vòng/ Ly tâm 14000 vong/1 phút
DNA tinh sach 1 phút Lap lại 2 lân
Hinh 2.3. Quy trinh tinh sach san pham 16S rDNA
Mau DNA sau khi tiến hành tinh sạch được gửi giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự 16S rDNA được xử lý bang phần mềm
DNA Star, so sánh với ngân hang dữ liệu HOMD 16S rRNA RefSeq Version 13.2 [85].
2.3.2. Phát hiện nhanh A. baumannii bang kỹ thuật multiplex PCR 2.3.2.1. Lựa chọn cặp môi đặc hiệu
Dé tài sử dụng 02 cặp mỗi đặc hiệu (bang 2.6) theo nghiên cứu của Chen T.L và cộng sự dé phát hiện nhanh vi khuẩn 4. baumannii bang kỹ thuật multiplex PCR.
Hai sản pham PCR gồm đoạn DNA thuộc vùng gen đặc hiệu ITS 16S-23S rRNA có
kích thước 208 bp và gen recA có kích thước 425 bp [77].
34
Bang 2.6. Trình tự mỗi đặc hiệu phát hiện nhanh A. baumannii
` Tm Kích Môi Trinh tự (8’ - 3’) Muc dich
(°C) thước
P-Ab-ITSF CATTATCACGGTAATTAGTG 52,1 Phat hién
208 bp -