CHUONG 3: KET QUA VA BAN LUAN
3.3. PHÁT HIỆN NHANH A. BAUMANNII BANG KY THUAT MULTIPLEX
PCR
Multiplex PCR được ứng dung dé phat hiện 02 gen đặc hiệu cua vi khuan A.
baumannii, sử dung 02 cặp môi: cặp môi P-Ab-ITSF va P-Ab-ITSB khuếch đại trình tự đặc hiệu vùng ITS 16S-23S rDNA của vi khuẩn A. baumannii có kích thước 208 bp; cặp môi P-rAI và P-rA2 khuếch đại trình tự bảo tổn của gen recA của vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter có kích thước 425 bp.
s* Toi ưu hóa nhiệt độ gan moi
Multiplex PCR với DNA khuôn mẫu là DNA nhiễm sắc thé vi khuẩn chiết tach được. Khảo sát nhiệt độ gan môi tại 47 °C, 49 °C, 51 °C, 53 °C và 56 °C. Kết quả cho thay điều kiện phản ứng PCR (bảng 2.7) chưa tối ưu để 02 môi cùng hoạt động. Khảo sát nhiệt độ ở 49 °C và 53 °C, cả 5 mẫu chúng tôi chỉ phát hiện được 01 băng DNA, mẫu 5333 có DNA ~ 425 bp, 4 mẫu còn lại 4145, 5247, 5270 và 5197 có DNA ~ 208 bp (hình 3.11). Mẫu chứng âm thực hiện với DNA nhiễm sac thé của vi khuẩn B. subtilis. Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn môi 51 °C, 4 mẫu 4145, 5247, 5270
và 5197 có 02 băng DNA ~ 425 bp (recA) và ~ 208 bp (ITS 16S-23S rDNA),
nhưng băng ~ 425 bp rất mờ. Mẫu 5333 có 01 băng DNA recA kích thước ~ 425 bp sáng rõ không kèm sản phẩm phụ.
Như vậy, với kết quả trên chúng tôi quyết định sử dụng 02 cặp môi đặc hiệu đã chon là P-Ab-ITSF - P-Ab-ITSB và P-rAl - P-rA2, nhiệt độ gắn môi 51 °C để tiễn hành tối ưu hóa các thành phan phan ứng PCR.
500 bp 250 bp
Hình 3.11. Sản phẩm multiplex PCR từ DNA nhiễm sắc thé tại 49°C
M- thang đo Ikb plus, B: Nhiễm sắc thê B. subtilis
49
* Tối ưu hóa nông độ Taq DNA polymerase
Khảo sát 4 nông độ Tag DNA polymerase 0,4 UI, 1,0 UI, 1,4 UI và 1,6 UI cho thay nồng độ 0,4 UI khuếch đại san phẩm không đặc hiệu ở cả 5 mau DNA nhiễm sac thể. Ở nông độ 1,0 UL, phát hiện một băng DNA recA ~ 425 bp của mau 5333, một băng DNA ITS 16S-23S rDNA ~ 208 bp ở 4 mẫu còn lại sáng rõ, tuy nhiên băng DNA ~ 425 bp khá mờ (hình 3.12). Tại 2 nồng độ 1,4 UI và 1,6 UI không phat
hiện được gen đích.
Vì vay, chúng tôi chọn nồng độ Tag DNA polymerase 1,0 UI cho các thử nghiệm tiếp theo.
500 bp
250 bp
Hình 3.12. San phẩm multiplex PCR tối ưu hóa Tag DNA polymerase
M- thang do Ikb plus, B: Nhiễm sắc thé B. subtilis
s* Tối ưu hóa nông độ MgSO,
Kết quả tối ưu nông độ MgSO, 2,5 mM, 3,0 mM, 4,0 mM và 5,0 mM tại nhiệt độ gắn môi 52 °C cho thấy, MgSO, 4,0 mM cho kết quả tốt nhất trong khi MgSO, 2,5 mM, 4,0 mM và 5,0 mM khuéch dai san pham khong dac hiéu.
Nhu vay, nông độ MgSO, 4,0 mM được chon để tiễn hành các bước tối ưu hóa điều kiện phản ứng tiếp theo.
s* Tối ưu hóa nồng độ dNTPs 4 nông độ dNTPs 0,25 mM, 0,4 mM, 0,6 mM và 1,0 mM được thử nghiệm.
Kết quả ở nông độ dNTPs 0,4 mM các sản phẩm của phan ứng multiplex PCR thu
50
được rõ nhất, mẫu 5333 khếch đại 01 băng ~ 425 bp, 4 mẫu 4145, 5247, 5270 và 5197 khuếch đại 02 băng DNA có kích thước ~ 208 bp và ~ 425 bp (hình 3.13), kết
quả này phù hop với nghiên cứu cua Chen T.L và cộng sự [76, 77].
Từ kết quả thu được, nông độ dNTPs 0,4 mM được chọn cho phản ứng
multiplex PCR phát hiện nhanh A. baumannii.
500 bp 250 bp
Hình 3.13. Sản phẩm thu được từ quy trình multiplex PCR tối wu
M- thang đo Ikb plus, B: Nhiễm sắc thé B. subtilis
Kết quả phương pháp phát hiện nhanh 4. baumannii bang multiplex PCR phù hợp với kết quả giải trình tự 16S rDNA. Chúng tôi có thé kết luận 4 mẫu 4145, 5247, 5270 và 5197 là A. baumannii còn mẫu 5333 thuộc chi Acinetobacter.
Thành phan phan ứng và chu trình luân nhiệt đã tối ưu được trình bay trong
bảng 3.4 và 3.5.
Bang 3.4. Thành phan tối wu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh vi
khuân A. baumannii
Thanh phan Nong độ Thể tích (ul)
Dung dịch đệm PCR 10x 2.5
dNTPs 10 mM 1,0
5
Thành phan Nong độ Thể tích (ul)
MgSO, 25 mM 4,0
Mỗi P-Ab-ITSF 10 uM 4,0 Mỗi P-Ab-ITSB 10 uM 4,0 Mỗi P-rA1 10 uM 4,0 Mỗi P-rA2 10 uM 4,0
Taq DNA polymerase 5 Ul/pl 0,2
DNA nhiễm sắc thé 1,0
dH;O vừa đủ 12,3
Bang 3.5. Chu trình luân nhiệt tối ưu của phan ứng multiplex PCR phat hiện
nhanh vi khuân A. baumannii
Bién Bién Gan Kéo dai cudi
Bước : Kéo đài
tính tính moi cung
Nhiệt độ (°C) 94 94 51 68 68
Thời gian Sphut 30giây 30giây 45 giây 5 phút
Số chu kỳ | 35 |
Từ kết quả tối ưu thành phan phản ứng và chu trình luân nhiệt của multiplex PCR 5 mẫu DNA nhiễm sắc thể, chúng tôi thử nghiệm phát hiện 14 mẫu A.baumarmii trực tiếp từ khuẩn lạc. Mẫu số 5333, 4246 và 5378 chỉ khuếch đại một đoạn gen recA ~ 425 bp. Như vậy 03 mẫu vi khuẩn này chỉ có thé kết luận thuộc chi Acinetobacter, chưa kết luận được chúng là A. baumannii. 11 mẫu còn lại số 4145,
52
5247, 5270, 5197, 5308, 5370, 5251, 5249, 5377, 4154 va 5199 déu khuéch dai 02
băng có kích thước ~ 425 bp (recA) va ~ 208 bp (ITS 16S-23S rDNA), day là những vi khuân A. baumannii.
500 bp
—= 250 bp
Hình 3.14. Kết quả san phẩm multiplex PCR từ khuẩn lac của 14 mẫu vi khuẩn
M - thang đo Ikb plus, B: Khuan lac Bacillus subtilis
Như vậy, từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi xây dựng được quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn 4. baumannii bang kỹ thuật multiplex PCR (hình 3.15).
53
Mẫu bệnh phẩm
Ỷ Phân lập vi khuẩn trên môi trường MC
Nhuộm Gram } Cau truc khuan, Gram (-)Ỷ
Vv Chọn khuẩn lạc đặc trưng, khuếch tán vào
20 wl môi trường TSB
Thực hiện phản ứng multiplex PCR với 2 cặp môi ]Ỷ
ITS (P-Ab-ITSF, P-Ab-ITSB) va recA (P-rA1, P-rA2)
Dién di trén gel agarose 1,5%, dién thé 120 V/30-45 phut
2 bang DNA có kích thước I băng DNA có kích thước 208 bp và 425 bp 425 bp
A. baumannii Acinetobacter spp.
Hinh 3.15. Quy trinh phat hién nhanh vi khuan A. baumannii
Tom lại, trong 14 mẫu thực nghiệm có 02/14 mẫu (số 5333 và 4246) từ khoa Nội 1 và 01/14 (số 5378) mẫu từ khoa San cho kết quả âm tính, không phải 4.
baumannii. 11/14 mẫu cho kết quả dương tính là 4. baumannii, trong đó 10/11 vi khuẩn A. baumannii có nguồn gốc từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị tại khoa Hồi sức tích cực - chống độc (9/10 mẫu từ dịch phế quản, 01/10 mẫu từ phân) và 01/11 mẫu (số 5308) từ dịch phế quản của bệnh nhân điều trị tại khoa Nội 1.
Điều này chứng tỏ, vi khuẩn A. baumannii gây tỷ lệ nhiễm khuẩn cao tại khoa Hồi sức tích cực - chống độc của bệnh Đa khoa tỉnh Bình Dương.
54
Định danh băng phương pháp sinh hóa được sử dụng nhiều trong phòng xét nghiệm vi sinh tại các bệnh viện do không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, tuy nhiên về nguyên tac phương pháp này dựa trên các đặc điểm hình thái va sinh hóa của vi khuẩn nên không tránh khỏi hạn chế vẻ đặc tính hình thái có thé không 6n định, đặc biệt các chủng phân lập từ mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này đòi hỏi vi khuẩn định danh phải thuần chủng, thời gian nuôi cấy không quá 24 giờ để kết quả phản ứng
sinh hóa không bị ảnh hưởng.
Như đã dé cập, kết quả định định danh vi khuẩn băng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA cho kết quả chính xác hơn phương pháp sinh hóa. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như kết quả giải trình tự tại đoạn đầu của gen 16S rDNA đôi khi không rõ, có những kết quả như nucleotide N (A
hoặc G), R (C hoặc T), Y (A hoặc T), W (A hoặc C), M (G hoặc C) và S (G hoặc T)
[45]. Vì vậy ảnh hưởng đến quá trình so sánh với các trình tự 16S rDNA khác.
Phát hiện 4. baumannii bằng kỹ thuật multiplex PCR từ khuẩn lạc có ưu điểm là không đòi hỏi vi khuẩn thuần chung, không cần tăng sinh vi khuẩn mà vẫn có thé trực tiếp tiền hành PCR. Do đó, phương pháp nay cho kết quả nhanh, chi mat 18-24 giờ so với phương pháp sinh hóa mất từ 2 ngày hoặc nhiều hơn, giúp tiết
kiệm được nhiêu thời gian, công sức, chi phí và hóa chât sử dụng.
35