CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIEU
1.6. PHƯƠNG PHÁP PCR 1. Nguyên tắc
PCR là kỹ thuật tong hop DNA in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại các đoạn DNA thành hang triệu ban sao nhờ vào sự tham gia của các thành phần: DNA khuôn mẫu chứa đoạn DNA cần khuếch đại DNA polymerase có vai trò xúc tac tổng hop DNA, 4 loại deoxynucleotide (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), mỗi xuôi va mỗi ngược có trình tự bố sung với hai đầu của chuỗi DNA cần khuếch đại, ngoài ra còn có sự tham gia của ion Mg” và dung dịch dịch đệm phản ứng PCR [1, 11].
Phản ứng PCR gồm khoảng 30-40 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước (hình 1.4). Bước 1: DNA khuôn mẫu được biến tính ở 94-95 °C trong thời gian từ 30 giây đến 1 phút, sợi đôi DNA tách nhau hoàn toàn, tạo thành các sợi don dùng làm khuôn cho tong hop DNA. Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp còn khoảng 40-70
°C (thấp hơn Tm của các mỗi). Giai đoạn này 2 cặp mỗi xuôi và mỗi ngược sẽ bắt cặp với DNA khuôn mẫu trong khoảng 30 giây đến 1 phút. Bước 3: nhiệt độ tăng lên 72 °C, đây là nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme DNA polymerase.
Giai đoạn này sợi đơn DNA được tổng hợp theo chiều 5’-3’ trong khoảng thời gian 30 giây đến vài phút. Sau một chu kỳ, một DNA đích đã được nhân lên thành hai ban sao và như vậy sau n chu kỳ sẽ tao được 2” bản sao.
16
30 - 40 chu kỳ, gồm 3 bước
Sợi đơn DNA 94-95 °C/30 giây-1 phút
Môi xuôi —> N —. Bước: gắn mỖIMỗi _ 40-70 °C/30 giây-I phút
ngugc
72 °C/30 giây-vài phút
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR
1.6.2. Ưu nhược điểm của phương pháp PCR 1.6.2.1. Uu điểm
- _ Thời gian thực hiện nhanh, chỉ mat khoảng 3 giờ dé khuếch đại một trình tự
DNA đích.
- _ Độ nhạy của phản ứng cao, chi cần 0,1-1,0 pg DNA khuôn mẫu cũng có thé thu được sản phẩm [1].
1.6.2.2. Nhược điểm
- — Ngoại nhiễm là một trong những nhược điểm của kỹ thuật PCR. Ngoại nhiễm có thể gây khuếch đại các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Nguyên nhân ngoại nhiễm thường do nhiễm chéo DNA giữa các lần thao tác. Ngoại nhiễm có thé khắc phục băng cách sử dung dUTP thay dTTP b6 sung thành phan uracil DNA glycosylase (UNG), UNG sẽ phân hủy tất cả DNA ngoại nhiễm có dUTP. UNG sé bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần bién tính đầu tiên
[1. 15].
- Can trang bị máy luân nhiệt PCR, hóa chất chuyên biệt và kỹ thuật viên
phải có trình độ chuyên môn.
17
1.7. MULTIPLEX PCR
1.7.1. Nguyén tac
Multiplex PCR ra doi năm 1988, là một kỹ thuật được cai tién từ phuong pháp PCR don giản [45]. Phuong pháp này sử dung nhiều cặp môi trong một phản ứng PCR cho phép khuếch đại cùng lúc nhiều đoạn DNA đích có kích thước khác nhau. Hiện nay, multiplex PCR được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chan đoán các bệnh nhiễm khuẩn [21, 45].
1.7.2. Một số thay đối nhằm tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR
Đề thu được toàn bộ sản phẩm PCR đích mong muốn, điều kiện thực hiện multiplex PCR can được tối ưu hóa. Khi xảy ra sự cô như các sản phẩm khuếch đại không rõ hay không có sản phẩm thì có những giải pháp như thay đổi nhiệt độ gắn môi, thay đổi thành phần phản ứng PCR....(bảng 1.5) [2, 66].
Bang 1.5. Một số thay đôi nhằm tối ưu hóa phan ứng multiplex PCR Vấn đề Giải pháp
- Tăng thời giai đoạn kéo dài - Giảm nhiệt độ giai đoạn kéo dài (62-68 °C)
- Giảm nhiệt độ bắt cặp môi (2 °C) hoặc giảm đến mức thấp
Sản phẩm khuếch đại nhất có thể
không rõ - Tăng nông độ môi
- Tăng nông độ DNA khuôn mẫu - Thay đôi nông độ Tag polymerase - Tăng nồng độ MgCl ~ 3,0-4,5 mM
Sản phẩm cókích - lãng nông độ dung dịch đệm từ 1,0X lên 1,4-2,0X
thước ngăn không rõ - Giảm nhiệt độ bắt cặp môi hoặc nhiệt độ giai đoạn kéo dài
18
Van đề Giải pháp
Sản phẩm có kích thước ngăn không rõ
- Tang nông độ môi của san phâm không rõ
Sản phẩm có kích
thước lớn không rõ
- Tang thời gian ở giai đoạn kéo dai
- Tăng nhiệt độ bắt cặp môi hoặc giai đoạn kéo dài
- Giảm nông độ dung dịch đệm 0,7-0,8X, giữ nguyên nồng
độ MgCl, 1,5-2,0 mM
Không có san phẩm
DNA đích
- Nếu sản phẩm có kích thước lớn: tăng nồng độ dung dịch
đệm 1,4-2,0X
- Nêu sản phâm có kích thước ngăn: giảm nông độ dung dịch đệm 0,7-0,9X
- Tăng dần nhiệt độ bắt cặp mỗi
- Giảm nông độ DNA khuôn mẫu và enzyme Tag
polymerase
- Tăng nông độ MgCl, 2,0-12 mM
Không có băng DNA
- Bồ sung BSA 0,1-0,8 pg/ul - Bồ sung DMSO 5% hoặc glycerol - Kiểm tra các cặp môi
- Thay đổi tất cả các thành phan phan ứng PCR mới
1.7.3. Ưu điểm và nhược điểm của multiplex PCR
So với phương pháp PCR đơn giản, kỹ thuật multiplex PCR có một số ưu
điểm và nhược diém sau:
s* Uu điểm - Phat hiện cùng mot lúc nhiêu vùng của bộ gen hoặc nhiêu sinh vật trong
19
- Dé thao tác, tự động hóa.
- Giam giá thành so với PCR.
- Tiét kiệm hóa chất và thời gian thực hiện.
s* Nhược điểm - Kho khăn khi thiết kế và lựa chọn các mỗi phù hợp trong một phản ứng.
Bên cạnh hai phương pháp PCR va multiplex PCR, phương pháp colony-PCR cũng
được sử dụng khá phổ biến. Khác với hai phương pháp PCR trên, colony-PCR thực hiện trực tiếp trên các khuẩn lạc - nguồn cung cấp DNA khuôn mẫu cho phản ứng.
Vì vậy, colony-PCR rất tiện lợi, nhanh chóng và tiết kiệm thời gian do không cần vi sinh vật thuần chủng, không cần tách chiết DNA nhiễm sắc thể.