CHUONG 3: KET QUA VA BAN LUAN
3.2. ĐỊNH DANH VI KHUAN BANG PHƯƠNG PHAP GIẢI TRINH TỰ
GEN 16S rDNA
3.2.1. Tách chiết DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn
Chúng tôi thử nghiệm 5 quy trình tách chiết DNA nhiễm sắc thé từ 5 mẫu vi khuẩn số 5333, 4145, 5247, 5270, 5197. Đề phá vỡ tế bào, cả 5 quy trình đều sử dụng dung dịch TE, EDTA có trong thành phần dung dịch TE có vai trò tạo phức VỚI ion Mg” hoặc Ca”” dạng hòa tan, vì vậy có thể ức chế hoạt động của enzyme phân hủy acid nucleic, đồng thời làm vỡ thành tế bào bộc lộ tế bào chất. Enzyme RNAase có tác dụng phá hủy RNA của tế bào, dé DNA chiết tách không bị lẫn RNA. Phenol hoặc phenol/chloroform/isoamyl aleohol có vai trò biến tính protein và loại tạp chất. Với quy trình 01, chúng tôi chỉ sử dụng TE để phá vỡ tế bào, tuy nhiên đã không thu được DNA nhiễm sắc thé có thể do EDTA không thé phá vỡ cấu
trúc thành của tê bào vi khuân.
Vi vậy, ở quá trình 02 chúng tôi bổ sung SDS 10%, proteinase K 20 mg/ml để gia tăng khả năng phá vỡ tế bào, nhưng kết quả cho thấy DNA thu được rất thấp và không 6n định.
Với quy trình 03, chúng tôi bố sung dung dịch CTAB (CTAB 10% trong NaCl 0,7 M) đun ở nhiệt độ 65 °C trong 10 phút. CTAB có tác dụng làm vỡ màng tế bào, giải phóng acid nucleic và biến tính protein, đặc biệt là enzyme phân hủy acid nucleic. Đồng thời, chúng tôi bố sung thêm NaCl 5 M để phức hợp DNA-CTAB hòa tan tốt trong dung dịch, tuy nhiên DNA thu được rất thấp và lẫn tạp chất.
Cả 3 quy trình thử nghiệm trên, lượng DNA nhiễm sắc thể thu được thấp, lẫn tạp và không 6n định. Vì vậy chúng tôi thử nghiệm quy trình 4. Quy trình 4 sử dụng TE, sarcosyl 20%, proteinase K 20 mg/ml dé phá vỡ tế bào, phương pháp này thu được DNA nhưng không tỉnh sạch, lẫn nhiều tạp chất. Nguyên nhân, có thể trong giai đoạn pha vỡ tế bảo không sử dung enzyme RNAase, do vậy RNA tổn tại cùng
với mâu DNA. Ngoài ra, mâu có độ nhớt rat cao sau khi ly giải tê bao, vì vậy
39
phenol khó tiếp xúc dé biến tính protein, do đó protein có thé lẫn vào dịch nổi chứa
DNA.
Dựa vào quy trình 4, chúng tôi tối ưu hóa các thành phan để xác định quy trình 5 (hình 2.2). Tăng gấp đôi thé tích TE và b6 sung RNAase 4 mg/ml trong giai đoạn phá vỡ tế vào, đồng thời biến tính protein với chloroform (lặp lại 03 lần). Kết quả thu được sản phẩm DNA rõ va sạch (hình 3.6).
25 kb
Hình 3.6. DNA nhiễm sắc thể của 5 mẫu vi khuẩn
M — thang đo 1kb plus
Nhu vay, DNA nhiễm sắc thé của vi khuẩn A. baumannii sẽ được tách chiết
theo quy trình 5:
- Pha vỡ tế bao bằng 800 pl đệm TE, 30 ul sareosyl 20%, 4 ul proteinase K
20mg/ml, 6 ul RNAase 4mg/ml.
- Bién tinh protein và loại tạp chat với 700 pl chloroform (3 lần).
- _ Kết tủa DNA bang 50 pl natri acetate 3 M và 800 ul ethanol 100%.
San phẩm được str sung dé tiễn hành khuếch dai DNA đích.
3.2.2. PCR khuếch đại gen 16S rDNA s*_ Tối ưu hóa nhiệt độ gan moi
Chúng tôi thử nghiệm nhiệt độ gắn mỗi tối ưu ở 5 nhiệt độ 48 °C, 50 °C, 52
°C, 54°C va 56 °C. O 48 °C, 54 °C và 56 °C không thu được sản phẩm PCR. Ở
40
nhiệt độ 50 °C và 52 °C xuất hiện nhiều sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Tuy nhiên, với nhiệt độ gan mdi ở 52 °C cho sản phẩm DNA đích rõ hơn.
Do vay, chúng tôi chọn nhiệt độ gan môi 52 °C dé tiên hành tôi ưu các điêu kiện khác cua phản ứng PCR.
s* Tối ưu hóa nồng độ MgSO,
Theo Williams và cộng su, Mg” đóng vai trò là co-factor của Tag DNA polymerase, đồng thời ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính của DNA khuôn mẫu, nhiệt độ gan mỗi, cũng như tính đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại [41]. Do đó, chúng tôi khảo sát 5 nồng độ MgSO, 1,0 mM, 2,0 mM, 3,0 mM, 4,0 mM và 5,0 mM. Kết quả khuếch dai cho thấy, nông độ MgSO, thấp (1,0 mM) không đủ làm tác nhân cho Taq DNA polymerase hoạt động, gây mat cân bang trong dung dich phản ứng, san phẩm thu được không đặc hiệu [41]. Các nồng độ từ 3,0 - 5,0 mM là kha cao lam cho DNA khuôn mẫu liên kết chặt hơn nên không biến tính hoản toàn, chính vì thế các cặp tương đồng không thé bắt cặp với nhau, trong khi đó chúng có thé bắt cặp tai các vị trí không tương đồng một cách bền vững, qua nhiều chu kỳ khuếch đại một số lượng lớn DNA không đặc hiệu. Tuy nhiên, ở nông độ MgSO, 2,0 mM cho sản phẩm PCR tốt nhất, chứng tỏ nồng độ này tương thích cho phản ứng khuếch đại và kết quả phù hợp với công bố của Eckert và cộng sự (1990) [52].
Nông độ MgSO, 2,0 mM được chon dé thực hiện tối ưu hóa các khảo sát tiếp
theo.
s* Tối ưu hóa nồng độ Tag DNA polymerase
Khao sát 5 nông độ Tag DNA polymerase 0,2 UI, 0,6 UI, 1,0 UI, 1,4 UI và 1,8 UI cho thay nồng độ 0,6 UI là tối ưu nhất. Nồng độ Tag DNA polymerase 0,2 UI không thu được san phẩm PCR. Nguyên nhân do nồng độ Tag DNA polymerase thấp dẫn đến Mg”” dư thừa sẽ bao vây và biến đổi trung tâm hoạt động của Taq DNA polymerase, làm ức chế Zag DNA polymerase. Các nông độ Tag DNA polymerase 1,0 UI, 1,4 UI va 1,8 UI khuéch dai băng không đặc hiệu, do các nông
41
độ này không tương thích với những thành phan còn lại trong phan ứng nên chúng có thể ức chế lẫn nhau [61].
Do đó, chúng tôi chọn nông độ Tag DNA polymerase 0,6 UI cho khảo sát tiếp theo.
s* Tối ưu hóa nồng độ dNTPs
Tiến hành phản ứng PCR với 5 nông độ dNTPs khác nhau 0.1 mM, 0,2 mM, 0.3 mM, 0,5 mM và 0,7 mM. Nhiệt độ gắn môi 52 °C với nồng độ dNTPs 0,2 mM cho kết quả tối ưu, phù hop với công bố của Innis và cộng su [62]. Với nồng độ dNTPs 0,1 mM, san pham thu được có hàm lượng rat thap và giảm độ đặc hiệu.
Điều này có thể giải thích là do số chu kỳ phản ứng tăng sẽ tỷ lệ nghịch với các thành phần tham gia tổng hợp chuỗi DNA đích, trong đó dNTPs sẽ cạn kiệt, không đủ bắt cặp bé sung với DNA khuôn mau. Ba nông độ dNTPs 0,3 mM, 0,5 mM va 0,7 mM tương đối cao nên có thé làm tăng ty lệ bắt cặp sai của DNA và thậm chí ức chế sản phẩm tạo thành, vì vậy khuếch đại băng DNA không đặc hiệu [62].
Từ kết quả khảo sát nông độ dNTPs, dNTPs 0,2 mM được chọn dé thử
nghiệm tôi ưu các thành phân khác.
s* Tôi ưu hóa nông độ moi
Sau khi xác định được nồng độ MgSO,, dNTPs, enzyme Tag DNA polymerase và nhiệt độ gắn môi, chúng tôi tiếp tục tối ưu hóa nông độ môi với 5 nông độ 0,1 uM, 0,4 uM, 1,0 uM, 1,2 uM và 1,6 uM. Với nồng độ mỗi 0,4 uM, đã khuếch đại thành công băng DNA đặc hiệu có kích thước ~ 1.500 bp va không có sản phẩm không đặc hiệu. kết quả này phù hợp với một số tác giả đã công bố [25, 47, 82]. Nồng độ môi 0,1 uM không khuếch đại được DNA đích do nông độ môi quá thấp không đủ bat cặp với DNA khuôn mau, chúng sẽ hết trước khi kết thúc phản ứng khuếch đại nên sản phẩm DNA thu được không đặc hiệu. Tại nông độ môi cao hơn (từ 1,0 đến 1,6 uM) gây ra hiện tượng primer-dimers làm ức chế sản phẩm tạo thành [51]. Vì sản phẩm PCR được sử dụng để giải trình tự nên chúng tôi
42
tiễn hành tinh sạch gen 16S rDNA bằng bộ kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-
Up System” (hình 3.7).
1500
Hình 3.7. Gen 16S rDNA được khuếch đại
M — thang đo 1kb plus
Nhu vay, với nồng độ mỗi 0,4 uM, đã khuếch đại băng 16S rDNA kích
thước ~ 1.500 bp.
Tóm lại, chúng tôi đã tối ưu hóa được phản ứng PCR 16S rDNA với các thành phần và điều kiện tối ưu được trình bảy trong bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bang 3.1. Thành phan tối ưu của phan ứng PCR
Thành phan Nong độ Thể tích (ul)
Dung dịch đệm PCR 10x 2.5 dNTPs 10 mM 0.5
MgSO, 25 mM 2,0
Mỗi xuôi 27F 10 uM 1,0 Mỗi ngược 1492R 10 uM 1,0
Taq DNA polymerase 5 Ul/ul 0,12
DNA mau 1,0
dH;O vừa đủ 25 ul 15,88
43
Bảng 3.2. Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR
. , , Bao Bién Bién Gan Kéo dai
Bước : Kéo dài „ quản
tính tính moi cudi cùng -
mau
Nhiệt độ (°C) 94 94 52 72 72 4
Thời gian 5sphút 60giây 45giây 90 giây 5 phút œ
Số chu kỳ | 35 |
3.2.3. Giải trình tự 16S rDNA vi khuẩn
5 gen 16S rDNA sau khi giải trình tự được xử lý bang phần mềm DNA Star.
Chúng tôi so sánh các trình tự này với ngân hàng dữ liệu HOMD 16S rRNA
Sequence Identification, phiên ban 16S rRNA RefSeq Version 13.2. Kết quả cho thay, tất cả các trình tự 16S rDNA của 4 mẫu vi khuẩn kiểm tra là Acinetobacter baumannii strain DSM 30007 (bảng 3.3). Trong đó, 02 mẫu có tỷ lệ tương đồng cao nhất là 5197 (99.6%) và mẫu 5270 (99,4%). Theo dé xuất của Janda va Abbott, với ty lệ tương đồng > 99% và lý tưởng nhất > 99,5% có thé định danh vi khuẩn đến mức độ loài [55]. Do đó, có thé kết luận vi khuẩn thuộc 02 mẫu 5197 va 5270 là loài Acinetobacter baumannii strain DSM 30007. Mẫu 4145 có tỷ lệ tương đồng thấp hon đạt 98,2%. Nhung theo Turenne và cộng su, ty lệ tương đồng 98-99%
cũng có thé được chấp nhận ở mức độ loài [26]. Mẫu 5247 có tỷ lệ tương đồng là 972%, với tỷ lệ này chúng tôi chưa thể kết luận mẫu vi khuẩn 5247 là Acinetobacter baumannii strain DSM 30007. Đáng lưu ý là mẫu 5333 cho tỷ lệ tương đồng khá thấp 93,2%, với tý lệ < 97% không cho phép xác định vi khuẩn ở
mức độ loài [30].
44
Bang 3.3. Kết qua so sánh trình tự 16S rDNA
Nucleotide
x Chiều . z vi tri khong Ty lệ
Mau bp) Vị khuan Gen fim “ tương đồng
đồng Acinetobacter 16S
5197 1468 baumannii strain ribosomal 8-1446 6/1436 99.6%
DSM 30007 RNA gene Acinetobacter 16S 5270 15231 baumannii strain ribosomal 11-1451 9/1440 99.4%
DSM 30007 RNA gene Acinetobacter 16S 4145 1630 baumannii strain ribosomal 1-1460 26/1451 98,2 %
DSM 30007 RNA gene Acinetobacter 16S 5247 1472 baumannii strain ribosomal 11-1155 30/1143 97.4%
DSM 30007 RNA gene Acinetobacter 16S 5333 1476 baumannii strain ribosomal 11-720 48/706 93.2%
DSM 30007 RNA gene
Dé nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài dựa vao trình tự gen 16S rDNA
của 5 mau vi khuân, chúng tôi tiên hành su dụng hệ thông cây phân loài của ngân
hàng dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy, 4 mẫu 5197, 5270, 4145, 5247 đều có chung sốc với A. baumannii; ké cả mẫu 5247 có ty lệ tương đồng < 98%. Dựa vào cây phân loài, chúng tôi vẫn chỉ có thể kết luận mẫu 5333 thuộc chi Acinetobacter, không thể định danh ở mức độ loài (hình 3.8 - 3.10).
45
Acinetobacter sp. enrichment culture clone CL-11(gbJHM459848. 1)
F —* Acinetobacter baumannii(dbj|ABIO9775.1) Acinetobacter sp. Everest-ews-38(eb|EU584520. 1) Acinetobacter baumannii(gb|EU 760624. 1) Acinetobacter baumannii(gb|EUS83588. 1)
£-proteobacteria | § leaves uncultured bacterium (gb{JQ73 1890.1) uncultured bacterium (gb|K:C894569. 1) Acinetobacter baumannii(ref{NR_11 7677.1) uncultured soil bacterium(gb|JN990095. |) Acinetobacter baumannii(re {NR_117620.1) Acinetobacter baumannii OIEC 143(gb|IN668887. 1) Acinetobacter baumannii Naval-1 8(eb|JN668052. 1) Acinetobacter baumannii(gb|FI867359.1)
g-proteobacteria | 4 leaves Acinetobacter baumannii OIFC 143 (gb N668838. 1]
——+ Acinetobacter baumannii Naval-1§(gb|JNG66805 1.1)
Acinetobacter baumannii Naval-18(gb|JNG68022.1) Acinetobacter baumannii Canada BC-S(gb|JN@67948. 1) Acinetobacter baumannii Canada BC-5(gb|JN667929. 1) Acinetobacter baumannii Canada BC-5(gb|IN66792 1.1) Acinetobacter baumannii(gb|JN644533.1)
Acinetobacter baumannii(gb|JN162445. 1) Acinetobacter haumanniifemb|FRT50378. 1) Acinetobacter baumannii(re fNR_113237.1) Acinetobacter baumanniite mb|FN563424. 1}
Acinetobacter baumannii(emb|FN563423.1) inetobacter baumannii(gb|FJ867361.1) Acinetobacter baumannii(gb|FI867360.1) Acinetobacter baumannii{eb|FJ867358.1) Acinetobacter baumannii(gb|FJ867357.1) Acinetobacter baumannii(gb|FJ867355.1) Acinetobacter baumannii(gb|FI860865.1) Acinetobacter baumannii(gb|EU883589.1)
p-proteobacteria | 4 leaves Acinetobacter baumannii(re fINR_026206.1)
—
“® Acinetobacter sp. No%gb|JX5 15566. 1) Acinetobacter sp. LTS(gb|KI539115.1)
uncultured bacterium (gb{EFS 10228. 1) , g-proteobacteria | 3 leaves ẽ @ Acinetobacter sp. LT3(gb|KI529113.1)
Acinetobacter baumannii AC30(gb|CPOO7S77.1)
* Acinetobacter baumannii AC12(gb|CPO07549. 1) Acinetobacter baumannii ATCC 17978(ref[NR_074737.1) uncultured bacterium(gb|EFS09833.1)
Acinetobacter baumanniit ứh| KF254610.1) 4 £-proteobacteria | 13 leaves
ec baumannii(emb|FRT74573 l1)
—>
Acinetobacter baumannii(gb|KR)55001.1) Acinetobacter baumannii(emb|HE65 1910.1) 5 —9 Acinetobacter baumannii Canada BC-5(gb|JN667927.1)
bacterium CR 150(gb|EU6035 14.1) g-proteobacteria | 3 leaves Acinetobacter baumannii(gb|TN163443. |}
Acinetobacter sp. 8(eb|KC257007.1) g-proteobacteria | 4 leaves bacterium CR 142(pb|EU6035 13.1) Acinetobacter baumannii(gb| A ¥738399.2) Acinetobacter baumannii(gb|JF75 1054.1)
——#_ > —dl p-proteobacteria | 4 leaves (0.00000 ¥ #-proteobac teria WES ~ . 2
FEEcc— lộng >| Mau vi khuân 51978 Acinetobacter bau mannii gb|KJ489430. 1) ”
Hinh 3.8. Cay phan loai mau vi khuan 5197
46
Mẫu vi khuẩn 5247
° '# Acinetobacter baumannii ABOOS7(gb|CPOO1 182.1)
— |
% Acinetobacter baumannii TYTH-1{gb|CP003856.1)
® Saar sere baumannii ACICU(gb\CP000863.1)
Acinetobacter baumannii NCGM 237(dbj|AP013357.1) 4 Ÿ Acinetobacter baumannii TCDC-A B0715(gb|CRMI2522.2)
|. „—*uneultured bacterium (gb|E F5 10247. 1) Acinetobacter baumannii PRABO7(gb|(CP006963.1)
# uncultured bacteriun(gb|KF073677. 1]
Acinetobacter baumannii MDR-Z106(gb|iCP001937. 1)
“4 g-proteobacteria | 2 leaves
# Acinetobacter baumannii BJA BO7104(gbjCP003846. 1) Acinetobacter bauma nniif gb|CP007535.1) Acinetobacter sp. X1(gb|EU236725. 1) Acinetobacter baumannii(gb|JX254649. 1) Acinetobacter baumannii(gb|JX290086. 1) Acinetobacter baumannii ATOC 17978(ref[NR_074737.1) 4 Acinetobacter baumannii OIFCO32(gb/N668362. 1)
# Acinetobacter bị ii OIFCIS9(gbll 1)
% Acinetobacter baumannii OIFC189(gb[JN669010. 1) 9 Acinetobacter baumannii OIEC189(gb|TN669051. 1)
# Acinetobacter baumannii Naval-17(gb|JN@692 13.1)
~ Acinetobacter baumannii Naval-17(gb|JNG@692 14.1) 9 Acinetobacter baumannii Naval-17(gb|JN6@69233.1) Š Acinetobacter baumannii(gb|JQ839145.1
% Acinetobacter baumannii AC12(gb|CPQ07549. 1) 'ù Acinetobacter baumannii AC30(gb|CHWY7577.1)
$ Acinetobacter sp. LT3(gb|KI529113.1) Š Acinetobacter sp. LT5(gb|KI529115.1) 9 uncultured bacterium (gb|EFS 10305. 1) 4 Itured bacterium (gb|EF5 10306. 1) 9 Acinetobacter sp. GX ¥-2(gb|EF5 14909. 1) Š Acinetobacter sp. R3(gb|EU23673 1.1) 8 Acinetobacter baumannii(gb|/EU 760630. 1) ÿ Acinetobacter baumannii(gb|FI860867.1)
“uncultured bacterium (gb|GQ078415.1) 4 Acinetobacter baumannii(emb|FN563420. 1) 8 uncultured bacterium (gblF 187392. 1) 3 uncultured bacterium (gb[JF 187704.1)
‘uncultured bacterium (gb[JF 187782. 1) 4 7# Acinetobacter baumannii Canada BC-5(gb]JN667900. 1)
"3# Acinetobacter baumannii(gb|G.Q200824. 1)
@ Acinetobacter sp. TW(gb|FI753401.1)
@ Acinetobacter sp. 40(gb|GQ289378. 1)
& Acinetobacter baumannii(emb|FN563422. 1)
*
` Ề
# Acinetobacter baumannii(gb|F1550344. 1) + Acinetobacter baumannii(gb|EU760628. 1) + Acinetol 1 ii(gb|EU760627. 1)
——## Acinetobacter sp. PND-4(gb|EF494199.1)
> Acinetobacter baumannii( gb|EU760626. 1)
— Đbebsskaorrip0eebice24K)
eae h
q ii(gb|JQ337945.1)
3A inetobacter Ì ii(eb|EU078177.1) 3 Acinetobacter baumannii 1656-2(gb|CP00192 1.1)
“uncultured bacterium(gb|DQ447818.1)
“@p-proteobacteria | 3 leaves
“al p-proteobacteria | 3 leaves
@ uncultured bacterium(gb|GQ073327.1) š bacterium CR 142(gb|EU603513.1)
“# Acinetobacter baurmannii(gb|HQ632001.1)
¢ unculmred bacterium (gb\GQ056928. 1)
uncultured bacterium(gb|HM257566.1)
? Acinetobacter baumannii(emb|FR774572. 1) 9 Acinetobacter baumannii(gb|A Y738399.2)
uncultured bacterium(gb/KF088563. 1)
~® Acinetobacter baumannii(emb|FR77458 1.1)
————* uncultured bacterium(gb|KF 101990. 1)
“4 g-proteobacteria | 2 leaves g bacterium CRI50(gb|EU603514. 1)
“# Acinetobacter baumannii Canada BC-5(gb|JN6@67927.1)
® Acinetobacter baumannii(emb|FR774573. 1) S uncultured bacterium(gbJF1277 11.1)
° Acinetobacter baumannii(gb|JN162444.1) 4 bị ii
q q _ 8
> Acinetobact b| HE 65 1910.1)
? Acinetobacter baumannii(gb|K F0SS001.1)
? Acinetobacter sp. 8(gb|KC257007.1)
# Acinetobacter sp. 147(gb|KC257008,1)
* Acinetobacter sp. 148(gb|KC257009.1) Acinetobacter baurmannii(gb|FI263925. 1)
bacteria | 16 leaves
Hình 3.9. Cây phân loài mau vi khuẩn 5247
47
ce]
Mẫu vi khuẩn 5333
ƒ——®uneu ltured Acinetobacter sp.(gb|KJ842110.1)
0.004 |
I * Acinetobacter sp. MUBIgb|A ¥273199.1) bacterium ARD45(gb|EU 603506. 1)
Sbacterium ARD@6tgb|EU603507.1) '# Acinetobacter sp. TKOO6(gb|GU201827.1) S uncultured baeteriun(gb|HM341779. 1)
$ Acinetobacter sp. 160(gb]KC257020. 1)
# Acinetobacter sp. IRO(pb|KC257035.1)
# Acinetobacter sp. 181(gb]KC257036.1)
đ Acinetobacter sp. 1ủ3(gb|KC257022.1) uncultured soil bacteriurn(gb|HM 13 1953. 1]
'* Acinetobacter calooaceticus(gb}|GU385012.1)
¥ bacterium DR206(gb| EU6035 16.1)
ˆ
I
¿| # Ly
uncultured bacterium (gb|IF835737. 1)
mm.
a uncultured bactertum(gb|K P07 1840.1) Acinetobacter baumannii(gb|JQ312010.1)
“uncultured bacterium(2b/EF615004. 1) Suncultured Acinetobacter sp.(gb(GU300208.1)
* Acinetobacter sp. JDC-17(gb|FI975125.1) g-proteobacteria | 5 leaves
; a g-proteobacteria | 2 leaves
| ——————————3 uncultured bacterium (emb|HG764490. 1) ) __ ÿbaclerium Lee4(gb|GQ289138,1)
-đ
L4 TT $ uncultured bacteium(gb|KI545988.1)
w uncultured bacteriurn{gb|KI548947.1]
Acinetobacter calcoaceticus( gb|KJ 174340, 1) ee sp. 157(gb|KC257017.1)
bacteria | 2 leaves
$ ~9 Acinetobacter cal coaceticus(gb|KF89 1964.1) FS uncultured bacterium(emb|HE984698. 1) Funcultured bacterium(gb/K FO8 1444.1)
lề Acinetobacter sp. 262(gb|KC257046. 1)
* Acinetobacter sp. 257(gb|KC257045. 1) '# Acinetobacter sp. 256(gb|KC257044. 1)
* Acinetobacter sp. 255(gb|KC257043. 1)
> Acinetobacter sp. 254(gb|KC257042.1)
* Acinetobacter sp. 25 1(gb|KC257040.1)
* Acinetobacter sp. 24R(pb|KC257037.1)
* Acinetobacter sp. 17 1(gb|KC257030.1)
? Acinetobacter sp. 167(gb|KC257026.1)
* Acinetobacter sp. 166{gb|KC257025.1)
* Acinetobacter sp. 165(gb|KC257024.1)
* Acinetobacter sp. 158(gb|KC257018.1)
# Acinetobacter sp. 154(gb]KC257014.1) '# Acinetobacter sp. 153(gb|KC257013.1)
® Acinetobacter sp. 149(pb|KC257010.1)
@p-proteobacteria | 2 leaves Suncultured gamma proteobacterium(dbj|AB809950. 1)
# Acinetobacter sp. 213(dbj|AB513733.1) pesca bacterium(gblJ/F830150.1)
“l o-proteobacteria | 6 leaves
© Acinetobacter sp. 79(dbj|AB513732.1)
‘bacteria | 2 leaves o——~* uncultured bacterium (gb|KFO758 11.1) i g-proteobacteria | 2 leaves
Acinetobacter sp. AU783(gb|AY(043368.1) sO © incultured baeterrim(gb|KFI(871.11 {Acinetobacter senomosp. 13(pb|FI694759. 1)
———————————#UIneulttred bacterium(2b|K F07 1745.1)
* uncultured bacterium(gb|HM341694. 1)
® Acinetobacter cal ooaceticus(gb|FI263918.1) bacterium BR126(gb|EU603512.1)
Acinetobacter baumannii(eb|HM5 84008. 1) bacterium fjat-sel-2(gb|HQ873722.1)
® Acinetobacter sp. 176(gb|KC257032.1) Š Acinetobacter sp. 155(gb|KC257015.1)
———* nncultured bacterium (ebUN 882038. 1]
# Acinetobacter sp. 177(gb|KC257033.1)
“bacteria | 2 leaves
& Acinetobacter sp. 2491 gb|KC257038.1)
@ Acinetobacter sp. 168(gb|KC257027.1) uncultured soil bacteritum(gb|HM 13 1962.1) Suncultured bacterium(pb|HM339701.1)
> ®uncultured Acinetobacter sp.(emb|HG917251.1) Acinetobacter sp. 178(pb|KC237034.1)
“@ bacteria | 2 leaves
Ÿ Acinetobacter sp. 253(pb|KC257041.1)
Acinetobacter sp. 164(gb|KC257023.1) bacteria | 3 leaves
'* Acinetobacter sp. 170(gb|KC257029.1) 8 Acinetobacter sp. 136(gb|KC257016. 1)
———Suneultured bacteriumemb|HG764489. 1)
Hinh 3.10. Cay phan loai mau vi khuan 5333
48