Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát tác dụng dược lý của sản phẩm cao xương cá sấu

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Phân tích các thành phần của xương cá sấu nguyên liệu trước và sau loại tủy - Khảo sát các đặc điểm cảm quan, thành phần cao xương cá sấu, và các sản phẩm bổ sun

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN TRỌNG SINH

KHẢO SÁT TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SẢN PHẨM

CAO XƯƠNG CÁ SẤU

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2017

Công trình được hoàn thành tại: Trường đại học Bách Khoa – ĐHQG HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : GS TS Đống Thị Anh Đào Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Cán bộ chấm nhận xét 2 : PGS.TS Phan Ngọc Hòa Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 03 tháng 01 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 TS Hoàng Mỹ Dung

2 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng 3 PGS.TS Phan Ngọc Hòa 4 TS Hoàng Anh Hoàng 5 TS Huỳnh Ngọc Oanh Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo Sát Tác Dụng Dược Lý Của Sản Phẩm Cao Xương Cá sấu II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Phân tích các thành phần của xương cá sấu nguyên liệu trước và sau loại tủy - Khảo sát các đặc điểm cảm quan, thành phần cao xương cá sấu, và các sản phẩm

bổ sung cao xương cá sấu - Khảo sát độc tính và đánh giá một số tác dụng dược lý của cao xương cá sấu và

sản phẩm có bổ sung cao xương cá sấu

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/2016 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2016 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: Giáo Sư, Tiến Sĩ Đống Thị Anh Đào

Tp HCM, ngày 20 tháng 12 năm 2016

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Đống Thị Anh Đào đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Là một thành viên trong nhóm nghiên cứu, xin bày tỏ lòng cảm ơn ThS Phùng Võ Cẩm Hồng - chủ nhiệm đề tài cấp bộ ―Nghiên cứu quy trình chế biến thực phẩm bổ sung cao xương cá sấu nuôi và đánh giá tác dụng dược lý, độ an toàn trên chuột thí nghiệm‖, mã số B2016-NLS-03 đã hỗ trợ kinh phí và thiết bị phục vụ cho đề tài luận văn

Xin bày tỏ lòng cảm ơn tới các Thầy Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Đại học Bách Khoa TP HCM đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian khóa học

Xin cảm ơn các anh chị, cán bộ nhân viên tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành được luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, tập thể lớp cao học Công Nghệ Sinh Học khóa 2014 đã luôn động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Tháng 01 năm 2017 Nguyễn Trọng Sinh

TÓM TẮT

Nghiên cứu này nhằm xác định thành phần của xương cá sấu, cao thô và các sản phẩm từ cao xương cá sấu, sau đó đánh giá tính an toàn của các sản phẩm Kết quả cho thấy xương cá sấu là nguồn nguyên liệu sản xuất cao xương hiệu quả, đồng thời để thu được cao có chất lượng tốt thì bước loại tủy, béo là rất cần thiết Cao cá sấu thu được có hàm lượng acid amin chiếm 66,8%, hàm lượng collagen 66.0% (w/w trên khối lượng chất khô) Hai nhóm sản phẩm từ cao xương cá sấu đã được sản xuất thử nghiệm, kết quả phân tích cho thấy tính khả quan khi tạo sản phẩm cao cá sấu ở dạng sấy phun hoặc bổ sung vào bánh bích quy Đánh giá độc tính trên chuột thí nghiệm cho thấy CLT liều 37,0 g/kg, CSP liều 36,7 g/kg, CSPBS liều 36,6 g/kg đều không thể hiện độc tính cấp Trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn chuột được cho uống CLT (liều 1,85 g/kg/ngày và 3,70 g/kg/ngày), CSP (liều 1,84 g/kg/ngày và 3,68 g/kg/ngày), CSPBS (liều 1,84 g/kg/ngày và 3,68 g/kg/ngày) liên tục trong 2 tháng, kết quả cho thấy cao cá sấu và các sản phẩm không gây ảnh hưởng đến tăng trọng, không làm thay đổi các chỉ số huyết học, chỉ số sinh hóa gan, thận chuột nghiên cứu Khảo sát vi thể gan và thận đều bình thường so đối chứng Sản phẩm cao cá sấu sấy phun bổ sung gừng tươi và mật ong liều 1,84 g/kg, 3,68 g/kg đã thể hiện tác dụng tăng lực sau 7 ngày và 14 ngày trên mô hình chuột bơi kiệt sức và tác dụng tạo độ bền chắc cho xương chuột thí nghiệm tương đương với cao cá sấu thô liều 1,85 g/kg và 3,70 g/kg

ABSTRACT

This study aimed to determine the compositions of crocodile bone, crocodile bone glue and crocodile bone glue-derived products; as well as their safety for human consumption The results indicated that crocodile bone is a valuable source for bone glue production Besides, elimination of bone marrow and fat is a necessary step for obtaining high quality bone glue The contents of amino acid and collagen were accounted for 66.8% and 66.0% (on the dry weight basis), respectively In addition, we also studied the feasibility of producing two bone glue-derived products, including sprayed powder and biscuits supplemented with crocodile bone glue Our data clearly demonstrated that there weren’t any acute toxicities at doses of 37.0 g/kg CLT, 36.7 g/kg CSP and 36.6 g/kg CSPBS Subchronic toxicity was studied, with the doses CLT (dose of 1,85 g/kg/day and 3,70 g/kg/day), CSP (dose of 1,84 g/kg/day and 3,68 g/kg/day), CSPBS (dose of 1,84 g/kg/day and 3,68 g/kg/day) continuously for 2 months The weight gain, the indices of erythrocyte and leukocyte, the biochemical of the experimented mice seemed to be not different from the control in the sub-chronic toxicity tests In addition, the crocodile bone glue and bone glue-derived products did not cause any changes in histology of liver, kidney of experimented mice Moreover, supplementation of fresh ginger and honey into the bone glue powder at dose of 1,84 g/kg and 3,68 g/kg was effective in simultaneously strengthening bone structures and swimming capacity of the mice after 7 days and 14 days; which is equivalent to treatments using crocodile bone glue at doses of 1.85 g/kg and 3.70 g/kg, respectively

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong đề tài là do chính tôi thực hiện với sự hợp tác với các thành viên trong nhóm nghiên cứu

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã

đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Học Viên Nguyễn Trọng Sinh

1 Tính cấp thiết của đề tài xiv

2 Mục tiêu nghiên cứu xv

3 Nội dung nghiên cứu xv

4 Phương pháp thực hiện xvi

5 Phạm vi nghiên cứu xvi

6 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài xvi

7 Kết cấu của đề tài xvii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

2.1 Đặc điểm phân loại và phân bố của cá sấu 1

2.1.1 Đặc điểm phân loại và phân bố 1

2.1.2 Những loài cá sấu phân bố tại Việt Nam 1

2.1.2.1 Cá sấu Hoa Cà (crocodylus prosus ) 1

2.1.2.2 Cá sấu Xiêm (crocodylus siamensis ) 1

2.2 Sản phẩm từ cá sấu 2

2.2.1 Da cá sấu 2

2.2.2 Thịt cá sấu 2

2.2.3 Các sản phẩm phụ khác của cá sấu 3

2.3 Tình hình chăn nuôi cá sấu trên thế giới và Việt Nam 3

2.3.1 Tình hình nuôi cá sấu trên thế giới 3

2.3.2 Tình hình nuôi cá sấu tại Việt Nam 5

2.4 Cấu trúc của xương và collagen 6

2.4.1 Cấu trúc của xương 6

2.4.2 Cấu trúc collagen và ứng dụng 6

2.5 Ứng dụng kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý trên người 8

2.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 9

2.6.1 Ngoài nước 9

2.6.2 Trong nước 10

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị, động vật nghiên cứu 13

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 13

2.1.2.1 Hóa chất nghiên cứu 13

2.1.2.2 Thiết bị nghiên cứu 13

2.1.3 Động vật nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Khảo sát thành phần của xương cá sấu nguyên liệu 16

2.2.2.Đánh giá cảm quan, khảo sát thành phần của cao xương cá sấu 16

2.2.3 Đánh giá cảm quan, khảo sát thành phần của, phân tích vi sinh các sản phẩm từ cao xương cá sấu 16

2.2.4 Các phương pháp phân tích cảm quan, thành phần hóa học, vi sinh 18

2.2.4.1 Nhóm chỉ tiêu cảm quan, hóa lý 18

2.2.4.2 Nhóm chỉ tiêu vi sinh 18

2.2.5 Khảo sát độc tính của sản phẩm cao xương cá sấu 19

2.2.5.1 Khảo sát độc tính cấp 19

2.2.5.2 Khảo sát độc tính bán trường diễn 20

2.2.6 Đánh giá tác dụng của sản phẩm cao lên cơ thể và xương chuột 21

2.2.6.1 Đánh giá khả năng tăng lực trên mô hình chuột bơi kiệt sức Brekhman 21

2.2.6.2 Đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm cao lên xương chuột 22

2.2.7 Phương pháp xử lý thống kê số liệu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24

3.1 Kết quả phân tích thành phần xương nguyên liệu và cao thô từ xương cá sấu 24

3.1.1 Kết quả phân tích thành phần của xương nguyên liệu 24

3.1.1.1 Kết quả phân tích thành phần cơ bản của xương nguyên liệu 24

3.1.1.2 Kết quả phân tích thành phần acid amin và hàm lượng collagen của xương nguyên liệu 24

3.1.1.3 Kết quả phân tích thành phần kim loại trong xương cá sấu nguyên liệu 26

3.1.2 Kết quả phân tích thành phần cao thô từ xương cá sấu 27

3.1.2.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần cơ bản của cao thô từ xương cá sấu 27

3.1.2.2 Kết quả phân tích thành phần acid amin và collagen của cao thô từ xương cá sấu 28

3.1.2.3 Kết quả phân tích thành phần kim loại trong cao thô từ xương cá sấu 29

3.2 Kết quả phân tích các sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 31

3.2.1 Kết quả đánh giá cảm quan và phân tích thành phần của sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 31

3.2.1.1 Kết quả đánh giá cảm quan 31

3.2.1.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần cơ bản của sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 33

3.2.1.3 Kết quả phân tích thành phần acid amin và collagen của sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 34

3.2.1.4 Kết quả phân tích thành phần kim loại trong sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 36

3.2.2 Kết quả phân tích vi sinh các sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 38

3.3 Kết quả khảo sát độc tính của cao xương thô và các sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 39

3.3.1 Kết quả khảo sát độc tính cấp 39

3.3.2 Kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn 42

3.3.2.1 Kết quả đánh giá tình trạng chung và trọng lượng chuột 42

3.3.2.2 Kết quả theo dõi các thông số huyết học 44

3.3.2.3 Kết quả theo dõi các thông số chức năng gan 46

3.3.2.4 Kết quả theo dõi các thông số chức năng thận 48

3.3.2.5 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu cholesterol và triglycerid 49

3.3.2.6 Trọng lượng tim, gan, thận và khảo sát vi thể 50

3.4 Kết quả xác định một số tác dụng dược lý của cao cá sấu và sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu 54

(Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)GOT : Glutamat Oxaloacetat Transaminase

GPT : Glutamat Pyruvat Transaminase HPLC : High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) LD50 : Lethal Dose (Liều làm chết 50% con vật thí nghiệm)

NNPTNT : Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn

DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần của thịt cá sấu nuôi 03 Bảng 1.2 Hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và các loài

Bảng 3.3 Hàm lượng hydroxylprolin và collagen trong mẫu xương xương trước và

sau loại tủy 26

Bảng 3.4 Kết quả phân tích một số thành phần kim loại trong mẫu xương cá sấu

trước và sau loại tủy 26

Bảng 3.5 Kết quả phân tích một số thành phần, pH mẫu cao thô 27 Bảng 3.6 Kết quả phân tích thành phần acid amin trong mẫu cao từ xương chưa loại

tủy và xương đã loại tủy 28

Bảng 3.7 Hàm lượng hydroxylprolin và collagen trong mẫu cao từ xương chưa loại

tủy và xương đã loại tủy 29

Bảng 3.8 Kết quả phân tích một số thành phần kim loại trong mẫu cao từ xương chưa

loại tủy và xương đã loại tủy 30

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá cảm quan bột sấy phun cao xương cá sấu và bột sấy

phun cao xương bổ sung 31

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá cảm quan bánh bích quy bổ sung cao xương cá sấu và

đối chứng 32

Bảng 3.11 Kết quả phân tích một số thành phần, pH bột sấy phun cao xương cá sấu

và bột sấy phun cao xương bổ sung 33

Bảng 3.12 Kết quả phân tích một số thành phần, pH bánh bích quy bổ sung cao

xương cá sấu và đối chứng 33

Bảng 3.13 Kết quả phân tích thành phần acid amin trong mẫu bột sấy phun cao

xương cá sấu và bột sấy phun cao xương cá sấu bổ sung gừng, mật ong 34

Bảng 3.14 Hàm lượng hydroxylprolin và collagen trong mẫu bột sấy phun cao xương cá sấu và bột sấy phun cao xương cá sấu bổ sung gừng, mật ong 35

Bảng 3.15 Kết quả phân tích thành phần acid amin trong mẫu bánh bích quy bổ sung cao xương cá sấu và đối chứng 35

Bảng 3.16 Hàm lượng hydroxylprolin và collagen trong bánh bích quy bổ sung cao xương cá sấu và đối chứng 36

Bảng 3.17 Kết quả phân tích một số thành phần kim loại trong mẫu bột sấy phun cao xương cá sấu và bột sấy phun cao xương cá sấu bổ sung gừng, mật ong 36

Bảng 3.18 Kết quả phân tích một số thành phần kim loại trong bánh bích quy bổ sung cao xương cá sấu và đối chứng 37

Bảng 3.19 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong các sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu và đối chứng 38

Bảng 3.20 Khối lượng của chuột trước và sau thử nghiệm độc tính cấp 40

Bảng 3.21 Phân suất tử vong của chuột trong thí nghiệm độc tính cấp 41

Bảng 3.22 Biến đổi trọng lượng các nhóm chuột trong quá trình uống cao và thực phẩm bổ sung cao cá sấu 43

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát số lượng hồng cầu trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 44

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát hàm lượng hemoglobine trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 44

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát hàm lượng hematocrit trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 45

Bảng 3.26 Kết quả khảo sát số lượng bạch cầu trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 45

Bảng 3.27 Kết quả khảo sát số lượng tiểu cầu trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 46

Bảng 3.28 Nồng độ bilirubin trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 47

Bảng 3.29 Chỉ số SGOT trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 47

Bảng 3.30 Chỉ số SGPT trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 47

Bảng 3.31 Hàm lượng protein toàn phần trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 48

Bảng 3.32 Chỉ số urea trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 48

Bảng 3.33 Chỉ số Creatinin trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 49

Bảng 3.34 Chỉ số Cholesterol trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 49

Bảng 3.35 Chỉ số Triglycerid trong máu chuột ở các lô thí nghiệm 50

Bảng 3.36 Tỉ trọng gan, tim, thận so với khối lượng cơ thể chuột ở các lô thí nghiệm 50

Bảng 3.37 Thời gian bơi của chuột tại các thời điểm ở các lô thử nghiệm 54

Bảng 3.38 Tỉ lệ % thời gian bơi ở các thời điểm T60 phút, T7 ngày, T14 ngày so với To ở các lô thử nghiệm 55

Bảng 3.39 Lực gãy xương của các lô chuột thí nghiệm 56

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của collagen 08

Hình 2.1 Chuột nhắt trắng 14

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 15

Hình 2.3 Cao từ xương chưa loại tủy (a), cao từ xương loại tủy (b) 16

Hình 2.4 Cao sấy phun (a), cao sấy phun bổ sung gừng, mật ong (b), bánh bích quy đối chứng (c), bánh bích quy bổ sung cao cá sấu (d) 17

Hình 2.5 Chuột trong mô hình bơi kiệt sức 21

Hình 3.1 Biến đổi khối lượng chuột thí nghiệm ở các lô nghiên cứu và đối chứng 42

Hình 3.2 Tiêu bản vi thể gan, tim, thận chuột ở các lô nghiên cứu 52

Hình 3.3 Tỉ lệ % thời gian bơi ở các thời điểm T60 phút, T 7 ngày, T 14 ngày so với T0 ở các lô thử nghiệm 55

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Thành phố Hồ Chí và các vùng lân cận có điều kiện khí hậu phù hợp cho sự phát triển và sinh trưởng của cá sấu Theo thống kê năm 2011, Việt Nam có trên 1.000 trại cá sấu với quy mô khác nhau từ một vài cá thể tới những trại có hàng nghìn cá thể [14] Đến năm 2011, tổng đàn cá sấu ở Tp HCM đạt 175.115 con trong khi vào năm 2004 thành phố chỉ có khoảng 36.528 con [12],[14] Còn ở vùng lân cận như Đồng Nai đến năm 2015, toàn tỉnh có 240 trại nuôi cá sấu với tổng đàn hơn 109.000 con [7]

Theo quyết định phê duyệt chương trình phát triển cá sấu trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh giai đoạn 2011-2015, phấn đấu đến năm 2015, tổng đàn cá sấu gây nuôi sinh sản đạt tiêu chuẩn xuất khẩu trên địa bàn thành phố là 190.000 con, trong đó cá sấu thương phẩm đạt 100.000 con Về thị trường, yêu cầu đặt ra phải đa dạng hóa nguồn tiêu thụ sản phẩm, bao gồm cá sấu sống và sản phẩm cá sấu đã chế biến [36] Thực tế theo thống kê của chi cục kiểm lâm (Sở NNPTNT Tp Hồ Chí Minh) vào đầu năm 2015, tổng số lượng cá sấu nước ngọt nuôi trên địa bàn thành phố đạt khoảng 160.000 con, nhưng bình quân hàng năm thành phố Hồ Chí Minh chỉ xuất khẩu hơn 20.000 con cá sấu [31], do vậy cá sấu nguyên liệu tồn dư cũng khá nhiều

Những lợi nhuận chủ yếu hiện nay của ngành nuôi cá sấu đến từ bộ da, cho đến sản phẩm thịt chung cấp cho các nhà hàng, quán ăn…Yêu cầu làm đa dạng hơn các sản phẩm làm tăng giá trị của cá sấu càng cấp thiết, khi mà hiện nay chăn nuôi cá sấu đang lâm vào tình cảnh xấu Lượng da cá sấu và cá sấu con xuất khẩu có dấu hiệu đi xuống, sau một thời gian không tìm được đầu ra, một số doanh nghiệp chăn nuôi cá sấu ở Tp Hồ Chí Minh đã chuyển hướng kinh doanh [31]

Sau khi chế biến, xương cá sấu được coi là phế phẩm và chiếm một khối lượng khá lớn so với các sản phẩm còn lại Thông thường xương sẽ được bán cho các nhà máy chế biến thức ăn gia súc, nhưng hiệu quả kinh tế không cao Do vậy việc tạo sản phẩm đến từ xương cá sấu rất có ý nghĩa kinh tế

Các sản phẩm cao xương hiện nay xuất hiện khá nhiều trên thị trường Việt Nam, cũng như những quảng cáo với nhiều tác dụng cho sức khỏe Đặc biệt hiện nay ở Việt Nam, Công ty TNHH Cá Sấu Hoa Cà là công ty duy nhất nấu cao xương cá sấu làm thực phẩm bổ sung và đã bán ra thị trường

Từ những vấn đề trên cùng với yêu cầu cần nghiên cứu phát triển thêm những sản phẩm mới từ cao xương cá sấu và khảo sát tác dụng của sản phẩm cao xương cá

sấu, chúng tôi đề xuất nghiên cứu ―Khảo sát tác dụng dược lý của sản phẩm cao

xương cá sấu”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân tích các thành phần của xương cá sấu nguyên liệu trước và sau loại tủy để đánh giá tác dụng của quá trình loại tủy đến nguyên liệu

- Khảo sát các đặc điểm cảm quan, thành phần cao thô xương cá sấu để xác định mức độ ảnh hưởng của quá trình loại tủy đến cao xương thô, đồng thời khảo sát được các thành phần hóa học đáng chú ý của cao xương

- Khảo sát các đặc điểm cảm quan, các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh, đồng thời thử nghiệm độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, một vài tác dụng dược lý của cao xương cá sấu và sản phẩm có bổ sung cao xương cá sấu để đánh giá hiệu quả của sản phẩm

3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các thành phần của xương cá sấu nguyên liệu trước và sau loại tủy - Khảo sát các đặc điểm cảm quan, thành phần cao thô xương cá sấu

- Khảo sát các đặc điểm cảm quan, thành phần hóa học, vi sinh của sản phẩm bổ sung cao xương cá sấu

- Khảo sát độc tính sản phẩm cao xương cá sấu + Khảo sát độc tố cấp tính

+ Khảo sát độc tính bán trường diễn - Đánh giá tác dụng của sản phẩm cao lên cơ thể và xương chuột

+ Đánh giá khả năng tăng lực + Đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm cao lên xương chuột

Dựa vào góp ý từ các chuyên gia trong lĩnh vực y học, thực phẩm về cao cá sấu để chọn các bố trí thí nghiệm cho phù hợp và chế biến thực phẩm chức năng theo yêu cầu Tìm hiểu các nghiên cứu về độc tính cấp và bán trường diễn của các sản phẩm cao xương trong và ngoài nước

Dựa vào trang thiết bị hiện có của đơn vị như máy máy sắc ký lỏng cao áp, và các thiết bị, máy móc, dụng cụ tại phòng thí nghiệm vi sinh, sinh hóa trong Trường để lựa chọn các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng chuẩn, hợp lý

Nghiên cứu này được kế thừa các kết quả của những nghiên cứu trước đây của chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham gia đề tài như nghiên cứu phát triển các sản phẩm thực phẩm giá trị gia tăng từ cá sấu

6 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài

+ Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả của nghiên cứu có thể thấy được tác dụng của sản phẩm cao xương cá sấu, kết quả này có thể cung cấp cho người tiêu dùng một số thông tin cần thiết khi sử dụng sản phẩm

Tạo ra các sản phẩm bổ sung cao cá sấu tăng tính tiện lợi, dễ sử dụng cung cấp cho thị trường

+ Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu giúp đánh giá được một số chỉ tiêu hóa lý, các tác dụng dược tính, độc tính của sản phẩm cao xương cá sấu

Kết quả nghiên cứu có thể định hướng để xây dựng tiêu chuẩn của sản phẩm cao xương cá sấu

7 Kết cấu của đề tài

Ngoài phần mở đầu, danh mục tài liệu tham khảo, phụ lục, đề tài bao gồm 4

chương và 14 mục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm phân loại và phân bố của cá sấu

2.1.1 Đặc điểm phân loại và phân bố

Cá sấu là loài động vật có xương sống, thuộc lớp bò sát (Reptile), bộ cá sấu

(crocodilians), gồm 3 họ chính: Alligatoridae, Crocodiliae và Gavialidae được phân

thành 7 nhóm và 21 loài Các đặc điểm để phân biệt giữa 3 họ này dựa vào kích thước cơ thể, hình dạng mõm, sự sắp xếp của răng, hình dạng tổ, đặc tính của da và phân bố địa lý [40]

2.1.2 Những loài cá sấu phân bố tại Việt Nam

Cá sấu là loài bò sát lưỡng cư, sống được trên cạn lẫn dưới nước, ở cả đầm lầy nước ngọt và vùng nước lợ, ở Việt Nam có 2 loài cá sấu chính là cá sấu Hoa Cà và cá sấu Xiêm

2.1.2.1 Cá sấu Hoa Cà (crocodylus prosus )

Phân bố: Australia, Banglades, Brunei, Mianma, Cambodia, Indonesia, Philippines, Thailand, Việt Nam

Đây là một trong những loài cá sấu có kích thước lớn nhất, trung bình dài 6 – 7m, hung dữ, tấn công người Chúng sinh sống ở khu vực ven bờ biển nước lợ và và còn thấy ở các vùng nước ngọt như cửa sông, đầm lầy… Trước nay chúng có vùng phân bố rộng tại Đông Nam Á Tại Việt Nam, trước đây cá sấu nước lợ phân bố từ Vũng Tàu, Cần Thơ đến Kiên Giang, Phú Quốc, Côn Đảo… do tình trạng săn bắt quá mức nên loài này đang bị đe dọa tuyệt chủng, hiện không còn thấy ngoài tự nhiên mà chỉ còn khoảng 70 con nuôi tại Cần Giờ Cá sấu Hoa Cà cái thành thục lúc 6-10 tuổi, dài 2,2 - 2,5m Chúng làm tổ đẻ trứng vào mùa mưa, mỗi lần đẻ khoảng 40- 60 trứng và ấp nở trong 80 – 90 ngày Cá sấu Hoa Cà là loài bộ da có giá trị thương phẩm cao nhất

2.1.2.2 Cá sấu Xiêm (crocodylus siamensis )

Cá sấu Xiêm sinh sống ở các vùng đầm lầy nước ngọt, hồ, sông, suối có dòng chảy chậm Kích thước nhỏ, chiều dài tối đa có thể lên tới 4m, trung bình khoảng 3m Chúng giao phối từ tháng 12 đến tháng 3, mỗi năm đẻ 1 lần từ tháng 4 đến tháng 10, đào hố làm tổ trước khi đẻ khoảng 1 tuần Mỗi lần đẻ khoảng 20 – 50

trứng và ấp nở sau 75 – 85 ngày Trước đây cá sấu nước ngọt được tìm thấy nhiều ở sông Đồng Nai, Tây Nguyên và khắp Nam bộ Do hiện tượng săn bắt quá mức nên phạm vi sống thu hẹp dần và còn thấy rất ít ở Kontum, Đaklak Đây là loài cá sấu dễ thuần hóa và nuôi dưỡng, hiện đang được chú ý phát triển trong chăn nuôi cá sấu lấy da và thịt thương phẩm tại Việt Nam

Da cá sấu là nguyên liệu đắt giá của ngành công nghiệp thuộc da Sau khi được xử lý bằng hoá chất da cá sấu sẽ nổi vân óng ánh, là nguyên liệu làm ra các đồ trang sức đắt tiền như thắt lưng, ví xách tay, giầy dép, mảnh áo khoác Từ mảnh da đã thuộc và trau chuốt có thể làm ra nhiều sản phẩm có giá trị rất cao

2.2.2 Thịt cá sấu

Mục đích chính của việc nuôi cá sấu là lấy da, nhưng trong nhiều trường hợp việc bán các sản phẩm phụ, nhất là thịt đôi khi cũng thu được kết quả rất đáng kể Thịt cá sấu trắng hồng, thớ sợi tương tự như thịt lợn, bê

Loại thức ăn cá sấu ăn có ảnh hưởng đến mùi vị của thịt cá sấu Nếu được nuôi bằng thức ăn là cá, ít nhiều thịt sẽ có mùi vị của cá Cá sấu thường có lớp mỡ rất dày, nhất là ở đuôi và đặc biệt ở những cá sấu nuôi nhốt trong chuồng Lượng đạm trong thịt cá sấu khá cao, tỷ lệ phần trăm của mỡ cũng khá cao Để có thể thấy được tỷ lệ các thành phần trong thịt của cá sấu có thể so sánh với thành phần của thịt lợn, ở thịt lợn thành phần trung bình của các chất như sau: đạm 13%, mỡ 20%, nước 57%

Bảng 1.1 Thành phần của thịt cá sấu nuôi [64]

2.3 Tình hình chăn nuôi cá sấu trên thế giới và Việt Nam 2.3.1 Tình hình nuôi cá sấu trên thế giới

Cá sấu là động vật quý hiếm, da được dùng làm hàng mỹ nghệ cao cấp, thịt làm thực phẩm, vì lý do đó số lượng cá sấu trong tự nhiên đã giảm nhanh và có nguy cơ tuyệt chủng do bị săn bắt nhiều Cách đây 40-50 năm sau chiến tranh thế giới thứ hai, tất cả các loài cá sấu trên thế giới đều là mục tiêu để con người săn lùng ráo riết Lúc đó cá sấu bị coi là những con vật có hại, gây nguy hiểm cho người và gia súc nên ở nhiều nơi mọi người được phép tự do săn bắt vì vậy chúng ngày một khan hiếm Thực tế một số loài cá sấu đã bị tuyệt chủng như cá sấu sông ở Bắc Mỹ Vào năm 1971 do nạn săn bắt, số cá sấu trên thế giới còn ít tới mức các nước đã nhất trí áp đặt lệnh cấm xuất khẩu các sản phẩm cá sấu Cá sấu được bảo vệ bằng cách được liệt vào phụ lục 1 của CITES (Công ước buôn bán quốc tế các loài bị đe doạ) Tuy nhiên vào năm 1986 chúng được đưa sang phụ lục II nghĩa là sản phẩm cá

sấu nuôi có thể được xuất khẩu

Để khắc phục tình trạng săn bắt cá sấu trong tự nhiên, việc nuôi cá sấu có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển loài động vật hoang dã nhưng có

nhiều lợi ích này Để bảo tồn, phát triển cũng như khai thác lợi ích của cá sấu, ở một số nước như Thái Lan, Campuchia, Malaixia, Cuba, Hoa Kỳ, Việt Nam, các trại nuôi cá sấu tập trung với số lượng lên đến hàng nghìn con đã được xây dựng Tại Ấn độ và Papua New Guinea, hai dự án đầu tiên trên thế giới về nuôi cá sấu đã được tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm của Liên hợp quốc (FAO) triển khai vào những năm 70 Ở ấn độ người ta đã nuôi thử nghiệm hàng trăm con cá sấu mõm dài sông Hằng

(Gavialis gangeticus) để cứu loài vật này khỏi bị tuyệt chủng Ở Papua New Guinea

cũng đã tiến hành những biện pháp mới đưa cá sấu vào chương trình bảo vệ các động vật quí hiếm Sau hai dự án này, tổ chức FAO còn giúp nhiều nước khác ở châu Á-Thái Bình Dương, châu Phi và Mỹ La Tinh cùng phát triển nghề nuôi cá sấu

Khi cá sấu được đặt dưới sự bảo vệ chính thức vào năm 1967, cá sấu nuôi lấy da trở thành lựa chọn khả thi nhất cho sản xuất da, chủ yếu tập trung ở miền nam Hoa Kỳ, Louisiana, Florida và Georgia Việc chăn nuôi cá sấu nhanh chóng lan sang các quốc gia khác Cả Mỹ và Trung Quốc, cá sấu đang được nuôi với số lượng lớn [39], [67], [78]

Ở Châu phi có nhiều trại chăn nuôi cá sấu sông nile, cá sấu nước mặn được nuôi nhiều ở Úc, còn cá sấu caiman nói chung có giá trị kinh tế nhỏ vẫn được nuôi và gây giống ở miền nam nước Mỹ [72], [76], [79]

Cá sấu (Crocodylus niloticus) đã được nuôi ở Nam Phi 25 năm qua Tại Nam

Phi, nuôi cá sấu bắt đầu từ cuối những năm 1960 với 40 trang trại được cấp phép năm 1992 Ngành công nghiệp truyền thống tập trung sản xuất những sản phẩm từ da cung cấp những phụ kiện cho ngành thời trang, chính sự thu hút này đã thúc đẩy quá trình chăn nuôi cá sấu tại đây Đóng góp vào thu nhập từ nguồn lợi cá sấu tại Nam Phi bây giờ phải kể đến du lịch và nguồn thịt cá sấu cung cấp cho thị trường Nguồn thịt cá sấu thu được thường bán cho các nhà hàng hoặc bán cho các trang trại cá sấu [51]

Thái Lan là một trong những nước nổi tiếng thế giới về nuôi cá sấu Trại nuôi cá sấu đầu tiên của Thái Lan và cũng là của châu Á do ông Utai Yangprakom thành lập năm 1950 tại tỉnh Samut Prakan, một tỉnh lỵ cách Băng Cốc về phía Tây Nam 10 km Năm 1960 trại mới chỉ xuất được 150 con cá sấu nhỏ, đến nay trại đã có hơn

40.000 con cá sấu với đủ các kích cỡ (mỗi ngày cần tới 4-5 tấn thịt gà làm thức ăn) Thành công của trại Samut Prakan đã không những cứu cá sấu nước này khỏi bị tuyệt chủng mà còn liên tục cung cấp da và các sản phẩm phụ của cá sấu cho thị trường trong và ngoài nước

2.3.2 Tình hình nuôi cá sấu tại Việt Nam

Tính đến năm 2004 ở thành phố Hồ Chí Minh tổng đàn cá sấu của 4 doanh nghiệp đăng ký xuất khẩu (Trại cá sấu thuộc công ty trách nhiệm hữu hạn xuất nhập khẩu Suối Tiên, công ty trách nhiệm hữu hạn chăn nuôi kinh doanh cá sấu Tồn Phát ở Củ Chi, Trại cá sấu Forimex thuộc công ty Lâm nghiệp Sài Gòn, công ty trách nhiệm hữu hạn Cá sấu Hoa Cà) khoảng 31732 con Ngoài ra còn khoảng 23 – 25 trại nuôi cá sấu quy mô hộ gia đình, tổng đàn cá sấu của các hộ này là 4796 con Tuy rằng đây là ngành không phổ biến, xoay vòng vốn chậm, đầu ra và giá cả thu mua còn chưa ổn định Nhưng vì cá sấu rất dễ nuôi và dễ sinh sản, đặc biệt thích nghi với khí hậu nước ta, nên ngành này vẫn đang phát triển rất nhanh và đem về lợi nhuận khá lớn (10 tỷ đồng từ 2001 – 2004) [11]

Tại Tp Hồ Chí Minh, trong chương trình phát triển đàn cá sấu giai đoạn 2010, phấn đấu đến 2010 đàn cá sấu gây nuôi đạt tiêu chuẩn xuất khẩu trong các trang trại đạt khoảng 80.000 – 100.000 con Đến năm 2011, tổng đàn cá sấu ở Tp HCM đạt 175.115 con, trong khi đến tháng 10/2008 tổng đàn cá sấu tại Tp Hồ Chí Minh là 168.922 con [13]

2001-Cho đến những tháng đầu năm 2015, theo thống kê của chi cục kiểm lâm (Sở NNPTNT Tp Hồ Chí Minh), tổng số lượng cá sấu nước ngọt nuôi trên địa bàn thành phố đạt khoảng 160.000 con nhưng bình quân hàng năm thành phố Hồ Chí Minh chỉ xuất khẩu có hơn 20.000 con cá sấu [31]

Hiện nay tại nước ta, cá sấu được nuôi chủ yếu chỉ để lấy da, da cá sấu là nguồn thu chính của các trang trại nuôi cá sấu, thường được dùng để làm ví, thắt lưng, túi xách, Thịt thì được bán cho các nhà hàng với giá rẻ, tuy nhiên loại thịt này vẫn chưa được đa phần người dân sử dụng như thức ăn hằng ngày, xương thì hầu như bị bỏ qua Nghành nuôi cá sấu ở Việt Nam cũng đang lâm vào cảnh khó khăn, giá trị từ con cá sấu đang giảm xuống, trong lĩnh vực xuất khẩu da cũng gặp

tình trạng tương tự khi tính đến giữa năm 2015, sản lượng da cá sấu xuất khẩu chỉ được 610 tấn, đạt 1,5% kế hoạch xuất khẩu đề ra cả năm 2015 của TP.HCM [31]

Ngành chăn nuôi cá sấu có rất nhiều tiềm năng với nước ta, hứa hẹn tạo ra nhiều công ăn việc làm cho người dân, đồng thời gia tăng khả năng cạnh tranh trong các mặt hàng xuất khẩu, đem về nguồn lợi to lớn cho đất nước chỉ khi được quan tâm đầu tư, tạo nguồn ra ổn định và phát triển phong phú các sản phẩm từ cá sấu

2.4 Cấu trúc của xương và collagen 2.4.1 Cấu trúc của xương

Xương có vai trò nâng đỡ cơ thể và nhiều chức năng khác trong cơ thể động vật Xương được đặc trưng với độ cứng cao, khả năng phục hổi, tăng trưởng, và tự sửa chữa [50] Được coi là một kiệt tác của tạo hóa, xương là loại mô có cấu trúc phức tạp với thành phần gồm các chất vô cơ và mạng lưới chất hữu cơ đã tạo nên tính bền cơ học, tính nén vững chắc cho xương [68]

Cấu trúc của xương được xen lẫn các thành phần hữu cơ (chủ yếu là

khoảng 10 - 20% nước Collagen loại I chiếm khoảng 20% khối lượng xương và 35% theo thể tích [69], và hơn 90% chất nền hữu cơ của xương

2.4.2 Cấu trúc collagen và ứng dụng

Collagen có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, ―kola‖ nghĩa là keo dán và ―gen‖ nghĩa là sản xuất Collagen là một cấu trúc protein có trong chất nền ngoại bào và mô liên kế của động vật [71] Là protein được tìm thấy trong giới động vật và không tìm thấy ở thực vật và sinh vật đơn bào Ở động vật không xương sống collagen hiện diện trong thành cơ thể và lớp biểu bì Collagen chiếm 25-30% protein tổng số của cơ thể động vật có vú [65] Collagen hiện diện trong giác mạc, xương, mạch máu, sụn, ngà răng…Trong các mô xơ như da, gân và dây chằng [45], [54]

Collagen có cấu trúc phức tạp, Collagen (hay TropoCollagen) là một sợi dài khoảng 300 nm có đường kính 1,5 nm, tạo thành bởi ba chuỗi polypeptit (chuỗi anpha), các chuỗi xoắn với nhau tạo nên cấu trúc xoắn của collagen, các chuỗi polypeptit liên kết với nhau trong chuỗi bởi liên kết hydro Các chuỗi polypeptit được tổng hợp tương tự như các protein khác [47]

Thành phần acid amin có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc của collagen, nhưng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy nhất cho tất cả collagen Trong thành phần collagen không chứa cystein và trytophan, nhưng chứa một lượng lớn glycine (Gly) chiếm khoảng 30% và proline (Pro) chiếm tỉ lệ 12% và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 12,8 – 14,7% [53] Collagen là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành phần collagen còn chứa khoáng chiếm tỉ lệ 1% [38] Hyp là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có và tùy theo nguồn gốc collagen mà lượng Hyp khác nhau [77]

Gần đây 28 loại collagen đã được nhận diện gồm 46 chuỗi polypeptide riêng biệt, tất cả các collagen này đều có một chuỗi xoắn ba đặc trưng nhưng độ dài, kích thước, tính chất của phần còn lại khác nhau tùy loại collagen Theo các nghiên cứu đã công bố, trong xương chỉ có hai loại collagen chủ yếu là loại I: [α1(I)]2α2(I) và một ít loại V: α1(V)α2(V),α3(V) [47]

Các collagen loại I, II, III, IV chiếm tới hơn 90% tổng số collagen trong cơ thể Collagen loại I có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính của xương) Collagen loại II có trong sụn xương, là thành phần chính của sụn Collagen loại III có trong cơ Collagen loại IV là thành phần chính cấu tạo màng tế bào [43], [47]

Hình 1.1 Cấu trúc của collagen [75]

Collagen có nhiều ứng dụng trong nghiệp dược phẩm, công nghệ mô, công nghiệp thực phẩm…Trong lĩnh vực y học hiện đại collagen được ứng dụng rộng rãi như tái tạo sụn và xương, mạch máu, làm nhanh lành vết bỏng, các khuyết tật giác mạc, nha khoa, ghép xương, viêm khớp… [44], [74]

Các collagen khác nhau có những ứng dụng khác nhau trong mục đích sử dụng như tim mạch (van tim), da liễu (để thay thế da, điều chỉnh biểu bì mô, kỹ thuật mô da, hạ bì da nhân tạo), phẫu thuật (như là tác nhân cầm máu, chữa lành vết thương, tái tạo dây thần kinh), chỉnh hình (gân, xương, dây chằng), mắt (ghép giác mạc) [73]

2.5 Ứng dụng kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý

Một thuốc trước khi được sử dụng, phải nghiên cứu trên động vật thí nghiệm nhưng kết quả lại được sử dụng trên người Một trong những điều kiện quan trọng là phải xác định liều có tác dụng tối ưu dành cho người (có hiệu quả nhất nhưng lại không độc) Vì vậy, phép ngoại suy từ các kết quả thí nghiệm với động vật chuyển sang người có một ý nghĩa rất quan trọng [32]

Các yếu tố ảnh hưởng đến liều có hiệu quả tương đương giữa các loài động vật

 Sự chuyển hóa thuốc

 Nồng độ tối thiểu có hiệu quả trong huyết tương

 Thời gian có hiệu quả tác dụng

 Sự hô hấp tế bào

 Diện tích bề mặt cơ thể Cách suy liều có tác dụng dược lý, ví dụ biết liều có đáp ứng trên người là 10 mg/kg, tính liều có đáp ứng trên chuột nhắt: 10 mg/kg x 11,76 = 117,6 mg/kg Vậy liều dùng cho chuột nhắt nặng 20 g là: 117,6 mg/kg x 20 : 1000 = 2,352 mg Tương tự, nếu tính ngược lại: biết liều có đáp ứng trên chuột cống là 15 mg/kg Tính liều có đáp ứng tương đương trên người: 15 mg/kg x 0,15 = 2,25 mg/kg Nếu tính cho người có trọng lượng khoảng 50 kg, liều có tác dụng là: 2,25 mg/kg x 50 = 112,5 mg (hệ số chuyển theo bảng 1.2)

Bảng 1.2 Hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và các loài

động vật thí nghiệm [4] Từ - sang Chuột nhắt

thể khẳng định các tính chất có lợi cho sức khỏe phát hiện đến nay trong cao xương cá sấu là chỉ do collagen hay còn thành phần hàm lượng thấp nào đó khác

Tính ứng dụng của cao xương (collagen từ xương) cá sấu cũng cần được quan tâm Các quan sát thực tế cho thấy các sản phẩm cao xương hiện nay đặc sệt, khó hòa tan trong nước và khi phân tán trong nước thì cho dung dịch có độ đục cao [68] Các đặc tính như vậy sẽ giới hạn khả năng ứng dụng cao xương vào các sản phẩm thực phẩm khác nhau Collagen loại I trong xương có cấu trúc 3 sợi xoắn lẫn nhau Cấu trúc như vậy làm cho collagen khó được tiêu hóa hiệu quả trong đường ruột khi được tiêu thụ Một số nghiên cứu chỉ ra rằng pepsin (enzyme thủy phân protein trong bao tử) không thể phá vở hoàn toàn cấu trúc xoắn 3 của collagen Trypsin (một trong hai enzymes chính chịu trách nhiệm thủy phân peptit trong ruột non – trypsin và chymotrypsin) cũng không thủy phân được collagen loại 1 một cách hoàn toàn [42], [55], [60]

Collagen là protein nên dịch thủy phân collagen cũng có các tính chất có lợi cho sức khỏe Một số nghiên cứu còn cho thấy collagen có thể cải thiện sức khỏe da và giúp chữa lành tổn thương da, chống mệt mỏi, cho chuột ăn collagen có thể cải thiện được khả năng học tập của chuột Theo các nghiên cứu của Gungormus và Kaya , collagen tuýp 1 khi được đắp vào xương trong quá trình phẩu thuật có thể làm tăng tốc quá trình lành xương [46], [49], [61], [82], [84]

Bằng phương pháp trích ly bằng axít và pepsin, Wood và cộng sự đã trích collagen từ xương cá sấu (Alligator mississippiensis) Kết quả cho thấy, collagen

kDa và 356 kDa Thành phần axit amin trong collagen rất phong phú với 18 loại axit amin, đặc biệt chứa nhiều glycine, proline, alanine và hydroxylprolin [80]

2.6.2 Trong nước

Xương của các loài động vật như hổ, báo, gấu, khỉ…đã được người dân Việt Nam sử dụng để nấu cao từ lâu Xương của các động vật này có cách nấu cao tương tự nhau, xương khi vừa lấy ra đem cạo hết thịt rồi cho vào một cái giỏ lớn bằng tre đem ngâm trong dòng suối 15 – 20 ngày Sau đó người ta treo giỏ xương lên cho khô và loại bỏ mùi hôi của thịt thối rữa khi ngâm trong nước, trước đây người ta gọi

là ―khu phong‖ Sau đó đập xương thành các mảnh nhỏ để dễ rửa sạch tủy, rồi ngâm trong nước 24 giờ Xương được rửa lại bằng nước rồi ngâm vào rượu có gừng (đỡ mùi tanh) Cuối cùng xương lấy ra để khô rồi cho vào nồi đồng, đổ nước vào cho ngập rồi nấu nhiều lần, tiến hành cô đặc để thu được cao xương Cao hổ cốt, cao gấu, cao khỉ…là vị thuốc thường được sử dụng trong dân gian, chủ yếu dùng trong các bệnh về đau xương, tê thấp, đi lại khó khăn ngoài ra còn được dùng trong những bệnh cảm gió, điên cuồng, dùng làm thuốc bổ khi cơ thể suy yếu Liều lượng sử dụng hàng ngày tương ứng, cao hổ cốt 4 – 6g, cao khỉ 5 – 10g, cao gấu 8 – 12g [6]

Đến cuối năm 2015, Công ty TNHH Cá sấu hoa cà vẫn là công ty duy nhất nấu cao xương cá sấu và bán ra thị trường Phương pháp nấu cao vẫn sử dụng phương pháp truyền thống, xương nguyên liệu được nấu trong nước sôi 100oC, sau mỗi ngày nấu dịch chiết được lấy ra (cho lên tầng trên của nồi để cô đặc) và nước mới được cho vào xương để nấu lần tiếp theo, quá trình này được lặp lại 7 lần nghĩa là thời gian nấu là 7 ngày Nồi nấu có hai tầng, hơi nóng trong tầng dưới được sử dụng làm tác nhân cô đặc cho tầng trên Sản phẩm cao thu được có dạng sệt, màu sẫm đen, mùi tanh

Trong chương trình ―Kim Cương Tươi Đẹp‖ năm 2013, cao xương cá sấu được dùng để hỗ trợ điều trị bệnh tạo xương bất toàn (xương thủy tinh) ở trẻ em và cho kết quả rất có tiềm năng Các kết quả bước đầu từ phân tích chất biểu hiện quá trình tạo xương trong huyết thanh máu cho thấy rằng việc uống cao xương cá sấu trong một khoảng thời gian có thể làm tăng lên quá trình sinh tổng hợp collagen trong xương của bệnh nhân xương bất toàn Điều này giúp cải thiện rõ rệt sức khỏe, giảm sự đau nhức và giảm tần suất bị gãy xương ở các bệnh nhân này [8], [29]

Bên cạnh đó, theo ghi nhận của Viện Y Dược Học Dân Tộc Tp HCM thì sản phẩm này cũng có hiệu quả tốt với một số bệnh nhân về xương khớp (loại bệnh nan giải và ngày càng nhiều người lớn tuổi mắc phải) và thông tin này cần được thông báo rộng rãi hơn đến người sử dụng [29]

Trong các năm 2014, 2015 các nghiên cứu đã cho thấy cao xương cá sấu liều 3,77 g/kg có khả năng làm tăng khả năng thực bào, tăng trọng lượng tương đối cơ quan miễn dịch và tăng số lượng bạch cầu tổng, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân; trong khi liều 1,89 g/kg chỉ làm tăng khả năng thực bào đạt ý nghĩa thống kê

so với nhóm chứng bệnh lý [34] Cao xương cá sấu hoa cà liều 1,89 g/kg và 3,77 g/kg, có tác động làm giảm thiểu các khuyết hỏng do prednison gây ra trong cấu trúc xương [33] Cao xương cá sấu hoa cà cũng có tác dụng tăng lực và hạ acid uric máu trên thực nghiệm [35]

Như vậy, các nghiên cứu khoa học đã cho thấy tác dụng rất tốt của cao xương cá sấu Bên cạnh đó, đa số các sản phẩm, được sản xuất theo phương pháp truyền thống, không được quản lý chặt chẽ về mặt chất lượng và vệ sinh Trong quá trình chế biến cao, nếu không tuân thủ các quy tắc chế biến và bảo quản nhất định, các loại acid amin sẽ bị hư hỏng và không tạo được tác dụng mong muốn mà có thể gây tác dụng không tốt cho sức khỏe người tiêu dùng Hiểu biết về các thành phần trong cao cá sấu còn hạn chế, do đó cần có những nghiên cứu sâu hơn về thành phần của cao và xương cá sấu

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị, động vật nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Xương cá sấu thô chưa loại tủy và đã loại tủy được cung cấp bởi công ty Cá Sấu Hoa Cà (Q12, TP HCM)

- Cao thô và nhóm sản phẩm từ xương cá sấu được nấu, chế biến tại khoa Công Nghệ Thực Phẩm – ĐH Nông Lâm TP HCM, Viện CNSH và MT

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 2.1.2.1 Hóa chất nghiên cứu

- Nhóm hóa chất dùng cho phân tích các chỉ tiêu hóa lý: Nước cất; Nước khử ion; HCl (Merck); H2O2 (Merck); HNO3 (Merck); Chất chuẩn kim loại (Merck); H2SO4 (Merck); NaOH (TQ và Merck); K2SO4 (TQ); CuSO4 (TQ); Metyl đỏ (TQ), Xanh metylen (TQ); H2SO4 0,05M (Merck); H3BO3 (Scharlau); Citric acid (Merck); Na(CH3CO2) (Merck); Propan-1-ol (Merck); Cloramin-T (Merck); p-Dimetylaminobenzaldehyt (Merck); Ethanol (Scharlau); Hydroxylprolin (Sigma); Triethylamin (Sigma); Phenylisothiocyanate (Sigma); Acetonitrile (Scharlau); CH3COONa.3H2O (Merck); Acetic acid (Merck); Chuẩn acid amin 17 chất (Sigma); Petroleum ether (TQ)

- Nhóm hóa chất dùng phân tích sinh hóa máu: Ống EDTA, Serum (Hồng Thiện Mỹ); Bộ hóa chất phân tích Birilubin (Spinreact); Bộ hóa chất phân tích GOT (Spinreact); Bộ hóa chất phân tích GPT (Spinreact); Bộ hóa chất phân tích Protein toàn phần (Spinreact); Bộ hóa chất phân tích Urea (Cormay); Bộ hóa chất phân tích Creatinin (Spinreact); Bộ hóa chất phân tích Cholesterol (Spinreact); Bộ hóa chất phân tích Triglycerid (Cormay)

- Nhóm hóa chất nhuộm tiêu bản vi thể và phân tích vi sinh

2.1.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Bình hút ẩm - Máy UV-Vis (8453 - HP)

- Máy AAS (SpectrAA 220 – Varian) - Máy huyết học (Celltac α – Nihon Kohden) - Máy AAS (SpectrAA 220Z – Varian) - Máy sinh hóa (Prietest smart – Robonik) - Máy vi cắt tay quay (HM 325 – Thermo) - Bàn giữ tiêu bản 42oC

Máy phân tích thủy ngân (DMA80 Milestone)

Các thiết bị thủy tinh thông thường

2.1.3 Động vật nghiên cứu

Hình 2.1 Chuột nhắt trắng

- Chuột nhắt trắng Swiss albino, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng trung

bình khoảng 20 ± 2 g, mua từ viện Pasteur Tp HCM, nuôi và thí nghiệm tại phòng thí nghiệm phôi – Viện Công nghệ Sinh Học và Môi trường Chuột được nuôi trong phòng sạch, nhiệt độ ổn định (24 – 260C), chế độ sáng tối 12/12, chuột được nuôi đầy đủ bằng thức ăn dạng viên do viện Pasteur cung cấp Thời gian cho chuột uống các sản phẩm thử nghiệm khoảng 8 – 9 giờ sáng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Bảng 2.1 Yếu tố phân tích theo mỗi nguyên liệu và sản phẩm

Vật liệu cảm quan Đánh giá Phân tích các thành phần hóa học Phân tích

vi sinh

Đánh giá độc tính và tác dụng dược lý

Xương cá sấu (XCLT)

Nấu chiết cao

Xương loại tủy, béo (XLT)

Loại béo, tủy

Cô đặc

Sấy phun

CSPBS BQBS

Cô đặc 10%

Sấy phun Bổ sung, chế biến

2.2.1 Khảo sát thành phần của xương cá sấu nguyên liệu

Xương cá sấu gồm hai nhóm, xương thô chưa loại tủy, xương thô đã loại tủy Quá trình loại tủy và các nguyên liệu xương được cung cấp bởi Công ty Cá Sấu Hoa Cà (Q12, TP HCM) Xương sau đó được xay nhỏ để làm các thí nghiệm liên quan

Các chỉ tiêu phân tích: Độ ẩm, pH, tro tổng, tro không tan trong axít, nitơ tổng, protein thô, hàm lượng chất béo, thành phần acid amin, hydroxylprolin và collagen, hàm lượng kim loại

2.2.2.Đánh giá cảm quan, khảo sát thành phần của cao xương cá sấu

Xương cá sấu từ 2 nhóm được sử dụng để nấu chiết cao Xương nguyên liệu được phân loại kích thước, sau đó được nấu chiết cao 2 lần ở nhiệt độ 121o

C trong thời gian 2 giờ Với tỉ lệ xương/nước (theo khối lượng) nấu chiết cao lần 1 là 1/3, lần 2 là 1/2, dịch thu được trong hai lần chiết được trộn lại và được cô đặc (ở điều kiện nhiệt độ 95oC, áp suất -0,8 kg/cm2

) thu được các sản phẩm tương ứng: cao từ xương chưa loại tủy (CCLT), cao từ xương đã loại tủy (CLT) [30]

Hình 2.3 Cao từ xương chưa loại tủy (a), cao từ xương loại tủy (b)

Các chỉ tiêu phân tích: Cảm quan (về màu sắc, mùi, vị), độ ẩm, pH, tro tổng, tro không tan trong axít, nitơ tổng, protein thô, hàm lượng chất béo, thành phần acid

amin, hydroxylprolin và collagen, hàm lượng kim loại 2.2.3 Đánh giá cảm quan, khảo sát thành phần, phân tích vi sinh các sản phẩm từ cao xương cá sấu

Dịch chiết nấu từ xương cá sấu được cô đặc đến 10% collagen (w/w), sau đó thủy phân bằng 2 loại enzyme Neutral 0,125% + Alcalase 0,125% [70] trong thời gian 10h, khuấy 100 vòng/phút, nhiệt độ 61oC và pH 7,1 Sau khi thủy phân đem bất hoạt enzyme tại nhiệt độ 900

C trong 10-15 phút Tiến hành phối trộn với chất trợ

sấy 19,6% maltodextrin, sau đó mang đi đồng hóa để dịch đồng nhất bằng máy đồng hóa (IKA T18, Đức) với tốc độ 13000 vòng/phút, 2 lần, mỗi lần 3 phút Đem dịch qua máy siêu âm để loại bỏ bọt khí, để dịch ổn định trong 15-10 phút, sau đó đem sấy phun (sử dụng máy sấy phun LabPlant - UK), nhiệt độ đầu vào 150oC, tốc độ bơm mức 3, áp suất bơm 0,2 MPa) thu được sản phẩm cao sấy phun (CSP) Tiến hành tương tự, nhưng sau khi bất hoạt enzyme dịch thủy phân được bổ sung thêm gừng tươi 5% (0,29% vck), 5% mật ong (78,66% vck), tiến hành sấy phun được sản phẩm cao sấy phun bổ sung gừng, mật ong (CSPBS)

Hình 2.4 Cao sấy phun (a), cao sấy phun bổ sung gừng, mật ong (b), bánh

bích quy đối chứng (c), bánh bích quy bổ sung cao cá sấu (d) Bánh bích quy được bổ sung 5% CLT theo công thức 100g bột mì; 5% CLT, 50g đường; 1 quả trứng (khoảng 50 g); 28,0 g shortening; 0,93g muối; 1,11g sodium bicarbonate; 1g vanilla và 15 ml sữa nguyên kem Trứng được đánh bằng máy khuấy cầm tay trong vài giây, thêm đường và shortening tiếp tục đánh trong 20 giây, một nửa bột mì và các thành phần khác bao gồm cao cá sấu được cho vào đánh tiếp 20 giây Thêm phần còn lại của bột mì, nhào tiếp 140 giây đến khi thu

được hỗn hợp đồng nhất Tiến hành tạo hình theo khuôn, bề dày của bánh dày khoảng 5mm, và nướng bánh tại 180oC trong 20 phút bằng lò nướng [52], [62] được bánh quy bổ sung cao cá sấu (BQBS), mẫu bánh đối chứng tiến hành tương tự

nhưng không bổ sung cao cá sấu (BQĐC)

Các chỉ tiêu phân tích: Cảm quan, độ ẩm, pH, tro tổng, tro không tan trong axít, nitơ tổng, protein thô, hàm lượng chất béo, thành phần acid amin,

hydroxylprolin và collagen, hàm lượng kim loại, một số chỉ tiêu vi sinh vật 2.2.4 Các phương pháp phân tích cảm quan, thành phần hóa học, vi sinh 2.2.4.1 Nhóm chỉ tiêu cảm quan, hóa lý

Đánh giá cảm quan theo TCVN 11184:2015 [28] Độ ẩm theo TCVN 4326:2001 [15]

Hàm lượng tro tổng theo TCVN 7142:2002 (ISO 936:1998) [24] Hàm lượng tro không hòa tan trong axít theo TCVN 9474:2012 (ISO 5985:2002) [27]

Hàm lượng kim loại theo AOAC (AAS) [66] Hàm lượng Hg bằng thiết bị phân tích thủy ngân trực tiếp (DMA 80, Milestone)

Hàm lượng N tổng và protein thô theo TCVN 4328-1:2007 (ISO 1:2005) [16]

05983-Hàm lượng hydroxylprolin và collagen theo TCVN 8142:2009 (ISO 3496:1994) [25], N.Yu và các cộng sự (2007) [53]

Hàm lượng các acid amin (HPLC) (Phụ lục)

2.2.4.2 Nhóm chỉ tiêu vi sinh

Tổng số vi khuẩn hiếu khí theo TCVN 4884 (ISO 4833-1) [19]

E.Coli theo TCVN 6846:2007 (ISO 7251:2005) [22] Coliforms theo TCVN 6848 (ISO 4832:2007) [23] Staphylococcus aureus theo TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1 : 2003) [18] Salmonella spp theo TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2004) [17]

Clostridium perfringens theo TCVN 4991 : 2005 (ISO 7937 : 2004) [20]

Tổng nấm men – nấm mốc theo TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) [26]

2.2.5 Khảo sát độc tính của sản phẩm cao xương cá sấu 2.2.5.1 Khảo sát độc tính cấp

Xác định LD50 của trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon [4], [37], [59]

Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm, nước uống theo nhu cầu Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm, chuột đạt các yêu cầu cân nặng được đưa vào thử nghiệm

Từng lô chuột nhắt trắng, mỗi lô ít nhất 10 con được cho uống mẫu cao cá sấu pha trong nước cất theo các liều tăng dần và được đưa vào dạ dày bằng một kim cong đầu tù qua đường miệng (thể tích hằng định 0,25 ml/10g thể trọng) Tìm liều cao nhất không gây chết chuột (0 %), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100 %) và các liều trung gian

Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của mẫu thử Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống mẫu nghiên cứu Đánh giá phân loại độc tính cấp theo Bảng 2.2

Bảng 2.2 Phân loại độc tính cấp theo giá trị LD50 gần đúng [2]

phản xạ của các giác quan như mắt mũi, biểu hiện tình trạng chất bài tiết…của chuột thí nghiệm

- Xác định số lượng chuột có biểu hiện ngộ độc, thời gian bắt đầu thể hiện triệu chứng độc, thời gian kéo dài các triệu chứng, khả năng phục hồi

Số lượng chuột thí nghiệm bị chết (nếu có) thời gian chết ứng với mỗi mức liều đã thử Chuột thí nghiệm ở tình trạng suy kiệt, hấp hối kéo dài, không có khả năng sống sót (chuột không thể ăn uống trong khoảng thời gian theo dõi, được tiên đoán là sẽ chết), thì được tính như trường hợp chuột bị chết

Các cá thể chuột chết (nếu có) sau thí nghiệm được giải phẫu làm tiêu bản để đánh giá độc tính đối với các nội quan

2.2.5.2 Khảo sát độc tính bán trường diễn [4], [5], [37], [48]

Cao thử nghiệm được hòa tan trong nước cất và cho chuột uống với thể tích 0,1 ml/ 10g thể trọng chuột liên tiếp trong 60 ngày Liều sử dụng cho nghiên cứu gồm mức liều thấp và liều cao, liều này được tính từ thí nghiệm độc tính cấp Lô chuột đối chứng được cho uống nước cất liều 0,1 ml/10 g thể trọng/ngày

Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng cân nặng khoảng 20 ± 2 g, được chia thành các lô, mỗi lô 10 cá thể chuột Chuột ở các lô được nuôi ở điều kiện, dinh dưỡng giống nhau Các chuồng được cho ăn cùng một lượng thức ăn 5 g/con/ngày, uống nước đầy đủ

Lấy máu chuột xét nghiệm các chỉ tiêu huyết học và sinh hóa tại các thời điểm: trước khi bắt đầu làm thí nghiệm, sau khi thí nghiệm được bốn tuần và cuối cùng là 8 tuần Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:

- Trọng lượng chuột - Chức năng gan (Định lượng GOT, GPT huyết, protein toàn phần) - Chức năng thận (Định lượng Urea, creatinin huyết thanh)

- Triglycerid huyết, cholesterol - Công thức máu

- Cân trọng lượng tim, gan, thận sau khi kết thúc quá trình thí nghiệm để so sánh với mẫu đối chứng (tiến hành khi kết thúc thí nghiệm)

- Giải phẫu chuột làm tiêu bản để xác định những ảnh hưởng với các nội quan