Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano sắt từ Fe3O4 trong phân tách DNA

Các hạt có điện tích từ có thể được loại bỏ băng cách sử dụng nam châm vĩnhcửu trong ứng dụng từ trường.Trên cơ sở đó, trong phạm vi nghiên cứu nay, chúng tôi đã tién hành ứng dụngthu hồ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VAT LIEU NANO SÁT TỪ Fe30,4

TRONG PHAN TÁCH DNA

Chuyên ngành: Cong nghệ sinh hocMã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, tháng 7 năm 2018

Can b6 cham 8.700 ăằ:taa

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, DHQG Tp HCM ngày

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngànhsau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KTHH

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Thị Ngọc Hạnh MSHV: 1570054Ngày, thang, năm sinh: 24/11/1992 Noi sinh: Tiền Giang

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

I TÊN DE TÀI: Nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano sắt từ Fe:Ox trong phân táchDNA.

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG1 Tao hạt nano sắt từ FesO4 và Fes3Oa@SiOo.2 Thu nghiệm hat nano tạo được vào việc thu hồi DNA từ vi khuẩn, tảo, nắm,tế bào động vật

Il NGÀY GIAO NHIỆM VU: 07/2017Ill NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 07/2018IV CÁN BỘ HƯỚNG DÂN : TS Nguy n Thị Liên Thương, TS Hồ Viết Thế

Tp HCM, ngày thang năm 20

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

TRƯỚNG KHOA KTHH

(Họ tên và chữ ký)

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận chúng tôi nhận được sự giúp đỡhướng dan tận tình của Quy Thay Cô, gia đình và bạn bè Với lòng biết on sâu sắc,chúng tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Kỹ thuật hóa học, Đại họcBách Khoa, Ban chủ nhiệm, Trung tâm thực nghiệm Đại học Thủ Dầu Một, ban chủnhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật môi trường trường Đại học Công NghiệpThực Phẩm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ để chúng tôi hoànthành tốt luận văn cao học

Tôi xin chân thành cảm on TS Nguyễn Thị Liên Thương — DH Thủ Dau Một,Bình Dương và TS Hồ Viết Thế - ĐH Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh đãluôn tận tình hướng dan, giúp đỡ động viên, hỗ trợ kiến thức, đồng thời tạo mọi điềukiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo sát tiễn trình thí nghiệm Tôi đã họcđược nhiều điều hay ở thầy cô về lòng nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm trong côngviệc, và cả tình yêu thương đối với mọi người

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô và các anh chị phụ trách phòng thínghiệm ĐH Thủ Dâu Một và ĐH Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh đã tậntình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thí nghiệm tại trường

Ngoài ra, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn dén gia đình và bạn bè luôn bên cạnhđộng viên, tiếp thêm nghị lực cho chúng tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, tôi cũng xin gởi lời cám ơn đến các anh chị khóa trên, các bạn cùngkhóa và các bạn khóa dưới đã hỗ trợ nhiệt tình, trao đổi các kinh nghiệm trong tiễntrình thí nghiệm để tôi có thé hoàn thành tốt bài luận văn này

Do giới hạn về kiến thức và thời gian nên dé tài không tránh khỏi sự thiếu sót.Chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp của quý Thầy Cô để đề tài được hoànthiện.

tách DNA”.

Hat nano sắt từ được tạo băng phương pháp đồng kết tủa va sau đó bọc SiOzbăng phương pháp Stöber Với các đặc điểm đặc trưng, kích thước hạt nano FeaO¿ là6 — 8 nm và Fe304@SiOz2 là 80 — 100 nm, các hat nano này được sử dụng để thu nhậnDNA từ các đối tượng mẫu khác nhau: DNA sau PCR, vi khuẩn E coli DH5u, tảoSpirulina platensis, Cordyceps militaris, mau lợn Lượng hạt nano sử dụng khác nhaucho kết quả khác nhau Sử dụng hạt nano dé thu nhận DNA từ vi khuẩn Z# coli chokết quả thấp hơn khi sử dụng kit Tuy nhiên, ở các đối tượng còn lại (tao, nam, mau),lượng DNA thu nhận bang phương pháp sử dung hat nano sat từ Fe3Ou vaFesOa(@SiO¿ tương đương với khi sử dung kit thương mai (về mặt thống kê) Độ tinhsạch của DNA thu nhận được bang cach sử dung hat nano chưa được tinh sạch ở tấtcả các đôi tượng thử nghiệm Ở tat cả các trường hợp, thời gian thực hiện dé thu nhậnDNA khi sử dụng hạt nano là tối ưu nhất, ngoài ra, người thực hiện không phải tiếpxúc các hóa chất độc hại, đặc biệt hơn, khi sử dụng hạt nano dé tách DNA trên E colivà mau lợn, hoàn toan không cân sử dung máy ly tâm, có thé thực hiện ở các phòngthí nghiệm đơn giản và trong điều kiện không có điện năng Trên các đối tượng đãthử nghiệm, lượng DNA thu được băng phương pháp sử dụng hạt nano FesOx vaFe304@SiO> là như nhau, không có sai khác về mặt thong kê

li

Magnetic nanoparticles had formed by co-precipitation and coated with SiOz

by the Stéber method The size of Fes3O4 nanoparticles is 6 - 8 nm and FesO4@SiO2

is 80-100 nm which have specific characteristics These nanoparticles are used to

separate DNA from various samples: DNA after PCR, E coli DH5a, Spirulina

platensis, Cordyceps militaris, swine blood The amount of nanoparticles used varies

for different results The yield of DNA extracted from E coli by the method of using

magnetic nanoparticles is lower than kit However, in the remaining subjects (algae,

fungi, blood), the yield of DNA extracted by the method of using magnetic

nanoparticles from Fe304 and FesO4@SiO2 was the same as when using the

commercial kit (statistically) The purity of the extracted DNA by magnetic

nano-particles isnot high In all cases, method of using nanonano-particles is less time

consuming than kit and phenol — chloroform method, in addition, it eliminates the

danger of lab personnel being exposed to harmful chemicals Specifically, separation

of DNA from E coli and swine blood with magnetic nanoparticles, absolutely,

do not use the centrifuge, which can be done in simple laboratories or in the field

conditions when electricity is not available On the tested samples, the yield of DNA

extracted by using Fe304 and Fe304@SiOz2 nanoparticles was the same, with no

statistically significant difference.

1H

Tôi cam đoan rằng đề tài luận văn cao học này là do chính tôi thực hiện Cácsố liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từbat cứ dé tài nghiên cứu khoa học nao.

TP Hồ Chí Minh, ngày 11 tháng 07 năm 2018

Học viên thực hiện

IV

M.90058//160/90510))050 -1144 Ỏ viiiDANH MỤC BANG wu escsssssssssssesesesseesesssessascsuesssssesscsessssucaussucseesecseassassancaneseeseeseess ixDANH MỤC CHU VIET TẮTT ¿- ¿5c ©+S++E++EE2EE2EE2EEEEEEEerkerkrkerkerkerkerrerree X

95109) 2 |

\//9527 00 - - |LoL ao 1ˆ ˆ43 ÔÒỎ |1.2 Mục tiêu nghiÊn CỨU 0110301010301 01 1111111111111 18 1188223511111 1 re 2

1.3 Nội dung nghiÊn CỨU - 10110113101 11131111111119995 1888331111111 re rre 2

CHƯNG 2 - 2G 2G 22112311231 231 011131 0311011 g1 01H ng TH TH ng HT 3

TONG QUANN t1 1212121211111 11 111181111 1010111111111 1101 115111511111 11 111110111111 nkrki 32.1 Giới thiệu sơ lược vật liỆu nañO + << << << E1 SE rree 4

2.2 Các phương pháp thu nhận DNA S222 1112111836666 11111111 rkerrree 4

2.3 Tóm tắt lịch sử và ứng dụng cua hạt từ tinh - << «<< sseeesss 72.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của các nucleic acid được thu nhận 72.5 Vật liệu sử dụng tạo ra các hạt nano từ tính dé thu nhận DNA 82.5.1 Lõi từ tinh oxit sẵt/ Í©TTÏ(© 5-56 S2 SE SE E1 1 1111121111111 E1 cxe, 92.5.2 Các vật liệu phủ - + - c1 111111199 1111 11111 HH vn 10

2.6 Chuẩn bị hạt nano từ tính is te se SE St S3 ESESEEESESEEEESEEEEeErEreEserererrerersrd 112.6.1 Phương pháp tao hat nano sắt siêu thuận từ - - - se seseseseseee 112.6.2 Phương pháp bọc Silica - << c5 5 11 31333311111138856365515 111111111 eerrree 16

2.7 Nguyên tắc thu nhận DNA bang hat nano từ tính s s sec: 20

CHUONG 38 1 4 24

3.2 Sơ đồ quy trình thực hiện - - - + SSE#ESESESEEx Sư ng rreg 243.3 Phương pháp thí nghiỆm G E22 2222622121292131 1111111111111 11111 ng 22 25

3.3.1 Tong hợp hạt nano sắt từ FesO4 và FesOa(@SiO2 5-5555 se: 253.3.2 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA của hạt nano sắt tỪ ccccco 273.3.3 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA vi khuẩn E coli DH5ơ của hạt nanoFesO4 và F€aO4()S12 HH HH HH nh 30

3.3.4 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA của tao Spirulina platensis bằng hạtnano Fe3zO4 và Feas(O4()S12 LH HH HH nh 33

3.3.5 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA của nam Cordyceps militaris banghạt nano Fe3O4 và Fea(O4()S1Õ2 HH HH HH kg 34

3.3.6 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA của máu lợn bang hạt nano Fe304

CHƯNG 4 2-5-5613 1511 151521111111 1111 111111111111 11 1111111111111 1x0 41

KET QUA & THẢO LUAN ueecccccscsccscscscecscscscececececececscsesevevevavevevavavacucecesececeeeesavers 4]4.1 Tong hợp hat nano sắt từ FesO4 và FesO4@SiOo ceeecssesceessesesesseeeseeeees 364.2 Thử nghiệm kha năng thu nhận DNA của hat nano sắt tit 384.3 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA vi khuẩn E coli DH5a của hat nanoFezOx va Fe304@Si02 cece cece eee e eee e nent teen eee e eee e e e 40

4.4 Thử nghiệm kha năng thu nhận DNA của tao Spirulina platensis bằng hat nanoFe3O04 và FeasO4(S1Ö2 cọ HH HH re 42

4.5 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA của nam Cordyceps militaris bang hạtnano Fe3O4 và F€aO4()S1Ö2 - c1 1 v11 11H 11H 1T 11H 1H TH HH nhu 45

vi

CHƯNG 5 cieccecccccsscscscsscsssscssscsvcsssvcsssesscsecsssecsssecsvsssansscavsscatsecsnsessnsesstsesacsesesaseass 50

KẾT LUẬN & KIÊN NGHỊ oo.eeccccccccsccccccscsscscsssscscssscscsscscsssssscscssssesvssssssessssessassseans 505.1 Kết luận -¿- 5-52 1 E1 1 1511211115 1111511 1111511111511 1115110111101 1110111101 cv 535.2 {6 / 53TÀI LIEU THAM KHẢO 56c S223 15 32111511 2111111111151111111511 111111 te xiPHU LỤỤC - - - 5< E22 133316118303 110830 111100 11H HH TH HH cv re XV

vil

Hình 2.1 Hat nano Fe304 sau khi được phủ một lớp OA [TT] - 13

Hình 2.2 Mang lưới silica và su hình thành nhóm Silanol do TEOS ngưng tu không

000 ắ 4 17

Hình 2.3 Hat nano Fe3O4 sau khi được phủ một lớp sIÏica - - - 18

Hình 2.4 Sơ đỗ quá trình tinh sạch nucleic acid bang công nghệ hat nano từ (đượcmô tả bởi Công ty Chemagen vẻ công nghệ Biopolymer AC, Đức) [3] 20Hình 2.5 DNA liên kết với silica khi nồng độ muối cao theo Prakash Bisen [13] 22Hình 3.1 Sơ đồ nội dung thực hiện - + << St SEEEEEEESESESEEEkrkrrererees 24Hình 3.2 Sơ đồ các bước tổng hợp và xử lý bề mặt hạt nano sắt từ FesOa 25Hình 3.3 Sơ đồ các bước bọc silica hạt nano Fesa - ¿se se ssEsEsesezszsesez 26Hình 3.4 Sơ đồ thí nghiệm thu nhận mẫu DNA chuẩn ¿-2- 5 +s+cs£exe+xd 28Hình 3.5 Sơ đồ các bước tiễn hành điện di trên gel agarose 1% - s: 29Hình 3.6 Sơ đồ thu nhận DNA của E coli bang phương pháp phenol — chloroform

¬— AA.AAA 32

Hình 4.1 Ảnh chụp TEM của hạt nano Fe3Ou (a) và hạt nano Fe304@SiO> (b) 36Hình 4.2 Phố FT-IR của hạt nano Fe304 và FesOa(@SiO¿ -¿- 555552 37Hình 4.3 Kết quả thu nhận DNA từ mẫu M1 khi sử dụng hat nano 39Hình 4.4 Kết quả thu nhận DNA của vi khuân E coli DHãơ - 5-5-5552 40Hình 4.5 Kết quả thu nhận DNA của tảo Spirulina pÏAf€WSiS c5: 43Hình 4.6 Kết quả thu nhận DNA từ nắm Cordyceps tmiÏifqFiS - «se xxx: 45Hình 4.7 Kết qua thu nhận DNA của máu lợn 22s +k+E+E+Ee£E+E+Eezererered 47

Vill

Bảng 4.1 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA thu nhận từ dịch ly giải E.coli bang các phương pháp khác nhau - - - SE SE +E‡E£EeEeEetererseeree 41Bảng 4.2 Kết quả đo nồng độ va độ tỉnh sạch của DNA thu nhận từ dịch ly giảiSpirulina platensis bang các phương pháp khác nhau 5-5 + + £sesEsEerereei 44Bảng 4.3 Kết quả đo nồng độ va độ tỉnh sạch của DNA thu nhận từ dịch ly giảiCordyceps militaris băng các phương pháp khác nhau - - 55 +s+e+esescse 46Bảng 4.4 Kết quả đo nông độ và độ tính sạch của DNA thu nhận từ dịch ly giải máulợn bằng các phương pháp khác nhau - - + +EE SE £E+E‡E£EeEeEeeereeeeeree 48

IX

SDS = Sodium dodecyl] sulphate

SPION = Superparamagnetic iron oxide nanoparticless

DNA = Deoxyribonucleic acid

PCR = Polymerase chain reaction

OA = Oleic acid

E coli = Escherichia coli

S platensis = Spirulina platensis

C militaris = Cordyceps militaris

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vẫn đề

Đề nghiên cứu các dạng sống, bệnh dược phẩm và đi truyền học bắt buộc phảithu nhận được nucleic acid từ nguồn mẫu ban dau Tinh sạch nucleic acid là nền tảngcho sự thành công của các ứng dụng dựa trên phân tử như PCR, lai, array, giải trìnhtự và chuyển gen, Vi vậy, độ tin cậy và tính chính xác của các kết quả này phụthuộc rất nhiều vào hiệu quả của phương pháp tỉnh sạch DNA được sử dụng

Ước tính khoảng 20% thời gian các nhà nghiên cứu sử dụng trong phòng thí

nghiệm sinh học phân tử để thực hiện các công việc phi sản xuất để chuẩn bị mẫunucleic acid Quá trình thu nhận DNA thường phải trai qua hàng loạt các bước kếttủa và rửa phức tạp đòi hoi các bước ly tâm kéo dai, do đó, chúng khó khăn, tốn kém,tốn thời gian và phải tiếp xúc với hóa chất độc hại

Yếu tố quan tâm khi thu nhận DNA là chất lượng và SỐ lượng DNA Việc thunhận nucleic acid mong muốn sẽ đạt được khi lựa chọn phương pháp thích hợp đểthu nhận nucleic acid khỏi protein, polysaccharide và lipid thường có trong mẫu sinhhọc.

Quy trình thu nhận DNA bằng hạt nano sắt từ đã được nghiên cứu và ngàycàng hoan thiện với nhiều ưu điểm vượt trội như thu nhận DNA nhanh chong, ít tốnchỉ phí và an toàn hơn đối với kỹ thuật viên so với quy trình thu nhận DNA truyềnthống — sử dụng phenol/chloroform

Trong số các hạt nano sắt từ, hạt nano Fe3O4 ngày cảng được quan tâm do tiềmnăng của nó, nhất là các ứng dụng y sinh khác nhau Theo Runa Ghosh, 2011, đó làtính tương thích sinh học, có thể tiêm, 6n định về mặt hóa học trong những trườnghop sinh lý học và có thé kết tụ tại một vị trí [1] Ngoai những kết qua đáng chú ýtrong lĩnh vực sinh học và y học như thu nhận tế bào, có định enzyme, tinh sạchprotein va enzyme, xét nghiệm miễn dịch và sử dụng dan thuốc đến một vị trí cụ thể, Fe304 còn được sử dụng dé thu nhận các nucleic acid một cách đơn giản và hiệuquả.

Các hạt có điện tích từ có thể được loại bỏ băng cách sử dụng nam châm vĩnhcửu trong ứng dụng từ trường.

Trên cơ sở đó, trong phạm vi nghiên cứu nay, chúng tôi đã tién hành ứng dụngthu hồi DNA của một số đối tượng bang hat nano FezOx với mục tiêu áp dụng kỹ thuậtmới nhằm thu nhận DNA nhanh chóng, đạt hiệu quả cao

Hiệu rõ đôi tượng và mục tiêu, chúng tôi thực hiện dé tài “Nghiên cứu ứngdung vật liệu nano sắt từ Fe3O4 trong phân tách DNA”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu tạo hat nano sắt từ FesO4 và Fe304@Si02với các đặc tinh đặc trưng và sử dung hạt nano vừa tong hop được dé thu nhận DNA

Đánh giá hiệu quả thu nhận DNA của phương pháp su dụng hat nano với cácphương pháp khác đã có trên các đối tượng khác nhau: vi khuẩn, tao, nam, máu động

^

vật.

1.3 Nội dung nghiên cứu

1 Tổng hợp hạt nano sắt từ Fe3O4 và FeaOa(@SiO¿.2 Thử nghiệm khả năng bắt giữ DNA của hạt nano sắt từ3 Thử nghiệm khả năng thu nhận DNA vi khuẩn £.coli DH5a của hạt nano

Fe304 và Fes304@SiOz24 Thử nghiệm kha năng thu nhận DNA của tao Spirulina platensis bang hạt nano

Fe304 va Fes0a@Si025 Thử nghiệm kha nang thu nhận DNA của nắm Cordyceps militaris bang hạt

nano FezOx và Fes3O4@SiOz26 Thu nghiệm kha nang thu nhận DNA cua máu động vat bang hạt nano Fe3O4

và Fes04@Si02

TONG QUAN

2.1 Giới thiệu sơ lược vat liệu nano

Công nghệ nano (Nanotechnology) là ngành công nghệ liên quan đến việc thiếtkế, chế tạo, phân tích và ứng dụng các cau trúc, thiết bị, hệ thống vật liệu ở kích thướcnanomet Khoa học nano ngày nay gắn liền việc mở rộng liên kết của ngành khoa họcvật liệu đã có bang cách bổ sung các tính chất sinh học và hóa sinh học Do đó, ngànhcông nghệ nano là một khoa học ngang tích hợp liên ngành trên tất cả các ngành khoahọc và ngành kỹ thuật Công nghệ nano ngày càng được tập trung nghiên cứu trongnhiều lĩnh vực cũng như ứng dụng của công nghệ nano đã và đang trở thành nhữngchủ dé thu hút sự quan tâm va tập trung nghiên cứu của nhiều quốc gia phát triểncũng như các quốc gia đang phát triển

Các vật liệu nano là vật liệu có kích thước từ 1-100 nm Ở kích thước nano,vật liệu sẽ có nhiều tính chất đặc biệt mà không xuất hiện ở vật liệu có kích thước lớnhơn (m, mm, um ) Đó 1a tính siêu dẫn, tính siêu phân tử, hiệu ứng bề mặt và tínhnhận biết phân tử miễn dịch Dựa vào cau trúc hình học vật liệu nano được phân loạithành nhiều nhóm: vật liệu 3 chiều < 100 nm (vật liệu nano composite), vật liệu 2chiều < 100 nm (màng mỏng), vật liệu 13 chiều < 100 nm (nano ống, nano sợi), vậtliệu 0 chiêu — đăng hướng (hat nano)

2.2 Các phương pháp thu nhận DNA

Việc thu nhận nucleic acid chất lượng cao hiệu quả từ mẫu vật liệu rat quantrọng cho su thành công của các phân tích về sau bao gồm PCR, giải trình tự và tạodòng Có bốn nguyên tac chủ yếu thúc day sự đổi mới trong thực hanh thu nhậnnucleic acid: hiệu quả thu hồi, tốc độ xử lý, phương pháp dễ dàng và độ tinh sạch củasản phâm được thu nhận [2]

Quá trình thu nhận nucleic acid thường xảy ra qua hai bước: giải phóng nucleicacid qua việc ly giải tế bao và tỉnh sạch nucleic acid được giải phóng từ dịch ly giải.Việc giải phóng có thể đạt được băng cách sử dụng bất kỳ sự kết hợp nảo của cácphương pháp ly giải bằng cơ học, enzym và hóa học

Cac nucleic acid là một nguồn thông tin di truyền và vì vậy, chúng là nguyênliệu dé phân tích gen và kỹ thuật di truyền Chỉ có một vai ứng dụng như PCR khuẩnlạc hoặc genotype ở chuột có thể được thực hiện mà không có quá trình làm sạchhoàn toàn Phan lớn phân tích cần chất lượng va số lượng nucleic acid thích hợp Việctỉnh sạch nucleic acid mong muốn sẽ đạt được khi lựa chọn phương pháp thích hợpdé thu nhận nucleic acid khỏi protein, polysaccharide và lipid thường có trong mẫusinh học Các phương pháp tinh sạch được chia thành hai loại chính: các phương pháppha lỏng và các phương pháp pha răn [2, 3, 4].

Một loạt các phương pháp được biết đến dé thu nhận nucleic acid trong phalỏng, nhưng chúng thường dựa trên hàng loạt các bước kết tủa và rửa phức tạp, đòihỏi các bước ly tâm kéo dai, do đó, chúng khó khăn, tốn kém và tốn thời gian [3, 4,5, 6, 2] Tinh sạch bằng pha lỏng là phương pháp được lựa chọn khi cần số lượngnhiều, độ tinh khiết va tính toàn vẹn Thu nhận bang phenol — chloroform da đượccoi là tiêu chuẩn vàng từ năm 1956 [2]

Theo Berensmeier, 2006, phương pháp phân lập nucleic acid cô điển từ vậtliệu phức hợp ban đầu như máu hoặc mô, liên quan đến sự phân hủy của vật liệu sinhhọc bang chat tay rửa hoặc những co chất chất chaotropic, có thể có sự hiện diện củacác enzyme làm suy thoái protein, tiếp theo là một số bước xử lý ứng dụng dung môihữu cơ chắng hạn như phenol và/hoặc chloroform hoặc ethanol, rất độc và đòi hỏiphương pháp xử lý đặc biệt do đó đắt tiền Ví dụ, loại bỏ hoàn toàn các protein từnucleic acid có thé đạt được bang cách thêm natri perchlorate Việc thu nhận RNAkhỏi DNA đòi hỏi các bước kết tủa chon lọc với LiCl hoặc thu nhận nuclease tự dovới guanidinium hydrochloride hoặc guanidinium thiocyanate, kết hợp với thu nhậnbăng phenol và kết tủa bằng ethanol [7] Những phương pháp này không chỉ côngkénh va tốn thời gian, mà còn yêu cầu phải thực hiện tương đối nhiều bước làm tăngnguy cơ suy thoái, mắt mẫu hoặc nhiễm chéo mẫu đặc biệt là khi một số mẫu đượcxử lý đồng thời Trong trường hợp phân lập RNA, nguy cơ nhiễm DNA là tương đốicao [3 |.

Như một quy trình thay thé cho cách truyền thống, kỹ thuật thu nhận hấp phụđã được áp dụng dé tinh sạch DNA [5], giải quyết van đề liên quan đến việc chiếtlỏng-lỏng như tách pha không hoan toan [7] Hệ thong pha ran sẽ hap thu nucleic acidtrong quá trình thu nhận tùy theo pH và hàm lượng muối của dung dịch đệm [7] bằngcách sử dụng các loại nhựa đặc biệt và matrix vô cơ, trong sự hiện diện của một sốthuốc thử hóa học, tạo điều kiện liên kết nucleic acid thuận nghịch [3] Phần lớn cáckit tinh sạch nucleic acid dựa trên việc thu nhận bang mang, resin hoặc hat từ tính.Nang suat phụ thuộc vào loại mẫu, đầu vào của mẫu, hiệu quả liên kết của nucleicacid với bé mặt tích điện và thành phan dung dịch đệm [2].

Do một số lượng lớn các mẫu được thực hiện trong phòng thí nghiệm ngàynay, tự động hóa đã trở thành điều không thể thiếu Các phương pháp tự động rẻ hơnnhiều va loại bỏ nguy cơ khi nhân viên phòng thí nghiệm tiếp xúc với các hóa chấtđộc hại Vì lý do này, robot tự động là một phần thiết yếu của bất kỳ nghiên cứu, điềutra pháp y, chân đoán lâm sảng, genotype thực vật và các xét nghiệm kiểm tra thựcphẩm, đất, nước Mặc dù mảng và nhựa được sử dụng cho một số phương pháp tựđộng, các vật liệu này thường bị tắc nghẽn Hạt từ tính cho phép dễ dàng tự động hóacác quy trình tinh chế NA Chúng có thé áp dụng được cho việc thu nhận bang taytrong phòng thí nghiệm hoặc trong điều kiện thực địa khi không có điện [2]

Việc sử dụng ngày càng tăng của các chất mang từ tinh ran trong sinh hóa vàquá trình sinh học phân tử có nhiều ưu điểm so với các quy trình thu nhận khác khôngáp dụng từ tính Các thuật ngữ “từ” có nghĩa là sự hỗ trợ của moment từ khi được đặttrong từ trường, do đó, nó có thé dịch chuyền Nói cách khác, các hạt có moment từcó thé được loại bỏ dé dang bang cách áp dụng từ trường, ví dụ: bang cách sử dụngnam châm vĩnh cửu Đây là một cách nhanh chong, đơn giản và hiệu quả dé thu nhậncác hạt sau bước liên kết hoặc rửa giải nucleic acid va là phương pháp ít nghiêm ngặthơn hơn nhiều so với các kỹ thuật truyền thống, chắng hạn như ly tâm, tạo ra lực cắtcó thé dẫn đến suy thoái các nucleic acid Ngoài ra, phương pháp hat nano từ cũng cóthé thu nhận thành phan ly giải của tế bào mà gây ức chế, ví dụ DNA polymerase củaphản ứng PCR, như polysaccharides, hợp chat phenolic hoặc co chất humic [3] Theo

cách thông thường, ta chi cần sử dụng một nam châm đặt vào một bên của bình chứahỗn hợp mẫu để tập hợp các hạt gần thành bình và đồ đi phần còn lại của mẫu.2.3 Tóm tắt lịch sử và ứng dụng của hạt từ tính

Hạt từ sớm đã được thực hiện thông qua quá trình trùng ngưng của acrylamideva agarose với vật liệu paramagnetic Những hạt này không đồng nhất về kích thướcvà thành phan magnetite; do đó, việc liên kết và tỉnh sạch không phải là tối ưu Cácbước đột phá lớn trong sự phát triển của hạt từ là sự hình thành các hạt hình cầu Kíchthước đồng đều cho phép những kết quả được lặp lại và được tiêu chuẩn hoá Nhữnghạt dau tiên có rất nhiều liên kết không đặc hiệu nhưng tiềm năng ứng dụng to lớncủa chúng đã được công nhận ngay lập tức Các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng khibề mặt polymer được thay đôi một phân tử phản ứng sinh học như nhóm amin, phốitử hoặc một kháng thể có thể được sử dụng để thu nhận nucleic acid, protein, khángthể hoặc các tế bào Hiện nay, hạt từ tính magnetite được sử dụng không chỉ để thunhận các phân tử sinh học, mà còn dùng để cố định, phân phối thuốc, chụp ảnh NMR,giải độc, tạo mã vạch và như các cảm biến sinh học Tất cả những điều này, đặc biệtlà ứng dụng in vivo, giúp tăng cường thêm những nghiên cứu vé vật liệu và sửa đôibề mặt Vì lý do này, chúng ta có thể mong đợi những vật liệu tốt hơn trong tương laigan [2]

2.4 Các yếu tô ảnh hưởng đến chất lượng của các nucleic acid được thu nhận

Các tiêu chí cho phương pháp cách ly DNA tốt bao gồm tính toàn vẹn, độ tinhkhiết, năng suất và thời gian cho một quy trình [2] Chất lượng va tính toàn vẹn củanucleic acid được thu nhận sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả tiếp theo của tat cả cácnghiên cứu khoa hoc [7] Nucleic acid mục tiêu không chứa các chat gây ô nhiễm baogồm protein, carbohydrate, chất béo hoặc nucleic acid khác, vi du, DNA không cóRNA hoặc RNA không có DNA [7].

Các quy trình thu nhận khác nhau ảnh hưởng lớn đến tính toan ven của bộ genDNA sau khi tinh sạch DNA nhiễm sắc thé của động vật có vú có kích thước vaitrăm megabasepair (mbp) lớn hơn rất nhiều lần khi so với một vài kilobasepair (kbp)

của DNA plasmid nên sé dễ đứt gãy khi tiếp xúc với lực cắt co học trong quá trìnhphá vỡ tế bào để chiết xuất tế bào thô mà nhân DNA được gỡ ra khỏi các proteinchromatin Các kỹ thuật nhờ ly tâm dựa trên thao tác pipet can thận cho phép thunhận nucleic acid một cách nhẹ nhàng dân đền sự toàn vẹn cua nucleic acid [2].

Các hạt từ tính hiện có khác nhau về kích thước, tính đồng nhất, vật liệu, vàsự kết hợp của bộ đệm mà chúng được sử dụng Tất cả các yếu tố này ảnh hưởng đếnsản lượng, tính toàn vẹn, và độ tinh khiết của nucleic acid, đây là những thuộc tínhchính ảnh hưởng đến các ứng dụng về sau [2]

2.5 Vật liệu sử dụng tạo ra các hạt nano từ tính để thu nhận DNA

Hạt từ tính bao gồm chủ yếu là lõi siêu thuận từ được bao trong vỏ polymerdé bảo vệ chat phân tích khỏi tiếp xúc trực tiếp với oxit kim loại (chủ yếu là sắt) Lợithế của vỏ polymer xung quanh lõi từ tính bao gồm kha năng chức năng hóa bề mặtvà sau đó cố định phân tử sinh học mục tiêu Dạng keo từ (ferrofluid) là một thànhphân khởi đầu quan trọng trong việc chuẩn bị hạt từ polymer Các phương pháp vàvật liệu đa dạng được sử dụng dé tong hợp của chúng Các yếu tố, chăng hạn như loạichất mang (thành phan hóa hoc, kích thước hạt, độ xốp, đặc tính ưa nước hoặc kynước, tính chat từ và hap phụ không đặc hiệu tối thiểu với chất phân tích) và các bướccố định có thé được đa dạng rộng rãi Tính chất từ tính của các vi cầu được xác địnhchủ yếu bởi việc lựa chọn vật liệu từ, nông độ khối lượng va phan bố bên trong cáchạt polymer [4].

Rittich và Spanova [2] đã phan biệt rõ ràng ba loại của hạt thuận từ:

1 Một thành phần có khả năng từ tính duy nhất đóng vai trò là vật liệu matrix.2 Một thành phân có khả năng từ tính hình thành lõi của hạt và sau đó đượcđóng gói trong vật liệu matrix.

3 Một thành phần có kha năng từ tính được phân tán đồng đều trong phan lớncủa vật liệu matrix.

Cac hạt từ tinh thông thường được tạo thành bang cách bao gói các lõi từ,magnetite hoặc paramagnetite với một polymer Lõi của hạt từ tính được làm oxit sắt,thường mang đặc tính siêu thuận từ Lõi này sau đó được phủ bằng lớp polymer tựnhiên hoặc tổng hợp.

2.5.1 Lõi từ tính oxit sắt/ ferrite

Thuật ngữ "oxit sắt" bao gồm nhiều họ chất thường được mô tả bằng côngthức FexOvH; (trong hau hết của các trường hop, z= 0) Công thức hóa học của ferritethường được biéu diễn bằng MO.Fe203 Kim loại chuyển tiếp như Mn, Co, Zn, Cuva Ni là các nguyên tử M điển hình trong cấu trúc ferrite Vật liệu (với M = Fe) gọila magnetite thuộc ho ferrite Trong số các vật liệu, magnetite (FezOa) và maghemite(y - Fe2O3) có tam quan trọng đặc biệt Chúng có độ từ hóa bão hòa cao nhất (80—100 ANm?kg''), độ lớn cao hơn hai bậc so với các oxit sắt khác Tính siêu thuận từđã được quan sát cho các tinh thé của chúng với đường kính dưới 30 nm Những tinhthể như vậy thường được đặt tên các hạt nano oxit sat siêu thuận từ (SPION) [4]

Từ hóa bão hòa của SPION thường thấp hon 20-50% so với trạng thái dạngkhối Tính tương thích sinh học của SPION đã được xem xét gần đây Cả hai chấtsiêu thuận từ đều dễ chuẩn bị ở mức giá hợp lý [4] Những dạng keo sat từ dựa trênoxit sắt thường chứa hỗn hợp maghemite và magnetite

Magnetit, FezOa (FeO FezOa) là một chất oxit sắt từ mau đen với cấu trúc spinđảo ngược chứa cả hai ion Fe (II) và Fe (III) Nó thường được sử dụng như một tiềnchất của maghemite Cac tinh thé kích thước micromet của nó đã được sử dụng rộngrãi để sản xuất các băng từ tính và trong các ứng dụng công nghiệp khác do MS cao.Tuy nhiên, cần lưu ý rang magnetite có kích thước micro có độ từ dư khác không Dođó, các hạt SPION chiếm ưu thế như là vật liệu lõi trong quá trình thu nhận /vậnchuyền [4]

Ngoài ra maghemit, y -Fe2Os, là một vật liệu sat từ màu nâu đỏ, cấu trúc đăngtrương với magnetit, nhưng thiếu cation Nó là một sắc tố từ quan trọng có tính chấttương tự Fe304 Do nó tương tự với magnetite, nó thường được phân loại là ferrite,

mặc dù nó không có thành phan thích hop Nó thường được chuẩn bi từ magnetitebăng quá trình oxy hóa Tác nhân oxy hóa như hydrogen peroxide, nitrat sắt và khôngkhí Maghemite phù hợp hơn cho các ứng dụng sinh học do tính 6n định cao hơn [4].

Kim loại để làm hạt từ tính có đặc tính siêu thuận từ Một giải thích đơn giảnvề tính siêu thuận từ là khi không có nam châm bên ngoài, các vật liệu này không chothấy các tính chất từ tính, nhưng khi trong sự hiện diện của thanh nam châm bênngoài, các hạt từ tính cùng lúc có động thái từ tính mạnh mẽ (hình 1.1) Tính năngnày cho phép chúng được phân tán đồng đều trong chất lỏng khi không có nam châm.Sự phân tán đồng nhất là đặc điểm chung của dung dịch sắt Các vật liệu thích hợpnhất cho các hạt siêu thuận từ là magnetite (Fe:Oa) và Maghemite (y-EezOa) Oxit sắttỉnh khiết là thích hợp nhất vì chúng không độc như những chất chứa kim loại nặng[2] Hơn nữa, Fe, Co và Ni là không ôn định về mặt hóa hoc tại các độ pH của dịchcơ thể [8]

2.5.2 Các vật liệu phú

Các vật liệu phủ khi thu nhận nucleic acid thông thường là aminosilane,

streptavidin, dextran, carboxylate, rượu polyvinyl, silica, cellulose, va polystyrene.Các vật liệu phủ tự nhiên và tổng hop khác không tìm thay ứng dụng thương mai chocác mục đích thu nhận vì chúng đòi hỏi phải ủ thời gian lâu hoặc rửa giải không hiệuquả [2] Ngoài ra, các lớp phủ vật liệu được nghiên cứu là polymer bao gồmpolysaccharide, polyethylene glycol (PEG), dextran, albumin, poly (axit lactic) cáclop kim loai chang hạn như Au va Ag hoặc các vật liệu vô cơ khác cũng được sudụng trong các nghiên cứu y sinh, giúp chức năng hóa hạt từ tính [8, 4].

Silica là một trong những vật liệu phố biến để phủ các hạt nano từ tính vì tínhôn định sinh học cao, không độc và khả năng linh hoạt để chức năng hóa bề mặt docó các nhóm silanol thường được sử dung cho các ứng dung trong cơ thé [8] Silicacũng là một trong những nguyên liệu phố biến nhất được sử dụng cho thu nhận DNAlà do chúng liên kết nhanh với nucleic acid khi có mặt muối chaotropic, cũng nhưđược rửa giải nhanh chóng bằng dung dịch đệm có nông độ muối thấp [2]

10

Không có hat từ nào là hoàn hảo và phổ quát có thé được sử dung cho tat cacác ứng dụng cân thiết Vì lý do đó, nhiều vật liệu được sử dụng đã được xem xét [2].

Phần lớn các vật liệu phủ không được sử dụng ở dạng tự nhiên, thay vào đó,bề mặt chúng được biến đổi với các nhóm chức năng thích hop dé liên kết nucleicacid Có thể thu nhận riêng nucleic acid tong số hoặc nucleic acid đặc hiệu Vi dụ loạivật liệu phủ Streptavidin sửa đôi cho phép tinh sạch mRNA hoặc trình tự DNA/RNAthấp khác từ các mẫu lâm sang (máu, phân, dịch tủy não) [2]

Một ví dụ khác là một phương pháp dựa trên việc sử dụng vật liệu chuyển đôiđiện tích Kim loại và các polymer hữu cơ có thé được thay đổi bang vật liệu chuyểnđối điện tích dé nucleic acid liên kết ở pH dưới hoặc gần bang với pKa, khi vật liệutích điện dương Trong trường hợp này, nucleic acid sẽ được phóng thích ở pH caohơn (thường là trên pKạ) khi vật liệu chuyền đổi điện tích tích điện dương, hoặc tíchđiện am [2].

2.6 Chuan bi hat nano tir tinh2.6.1 Phương pháp tạo hat nano sắt siêu thuận từ

Việc sử dụng vật liệu từ tính trong thực tế phụ thuộc vao tính chất của chúng,bao gồm độ từ hóa, hình thái học, hình dạng, kích thước, độ phân tán Trong số cáchình dạng có thé tuong tuong duoc (thanh, day, ống, màng, tam hoặc không theo quyluật nào), dạng hạt là rất cần thiết cho các ứng dụng thực tế néu yêu cầu các đặc tínhthủy động lực (dạng keo) tốt nhất có thể Nó có những lợi thé thực tế quan trọng trongviệc dễ dàng xử lý trong cả quá trình thu nhận dạng mẻ - batch và liên tục -continuous Các hạt có hình dạng không đều dé bị mòn cơ học va gãy thành bụi hạthơn so với các hạt hình cầu [4] Ngược lại với các hạt thông thường có kích thước hạtphân bố rộng, những hạt đồng đều (hoặc ít nhất phân bố kích thước hep) mang lại lợithế lớn, bởi vì chúng có thể đồng nhất tính chất vật lý và hóa học không kết tụ trongchat long dễ dang Các hạt lớn có những bat lợi của một diện tích bề mặt riêng nhỏcho việc gắn các nhóm chức hoặc có định các phân tử sinh học (kế cả các enzym).Đây là lý do tại sao microspheres (những hạt có kích thước micromet và nhỏ hơn) là

11

bắt buộc, bởi vi chúng đảm bảo diện tích bề mặt riêng đủ cao cho việc cố định cácnhóm phản ứng, enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác và thúc day hoạttính xúc tác trong phản ứng chuyển pha Tuy nhiên, một hạt quá nhỏ có thể khôngcòn phản ứng từ tính Tính man cảm từ tính của những hạt microspheres từ cần phảicàng cao càng tốt Trong thực tế, bề mặt hoạt động và kha năng mang tính chất từphải được cân bằng [4].

Nhiều phương pháp có sẵn để điều chỉnh kích thước, độ phân tán và tính chấttừ của các hạt nano bằng cách kiểm soát các thông số quá trình phản ứng Thật khôngmay, các phương pháp tạo ra các hạt nano đơn với tính chất từ tuyệt vời thường khôngthé sửa đôi hóa học (chức năng hóa) bề mặt vật liệu Vì vậy, cần một sự điều chỉnhcân bằng tùy thuộc vào tiềm năng ứng dụng Trong số các kỹ thuật được phát triểndé chuẩn bị vật liệu từ tính, chỉ những vật liệu thích hợp dé cho môi trường thu nhậnđược thảo luận thêm.

Phương pháp cơ học

Trong lịch sử, magnetite siêu thuận từ đã được chuẩn bibang cach nghién ướtkhối magnetite trong dung môi hữu covoi sự hiện diện cua một lượng lớn axit oleicnhư chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động bề mặt tạo điều kiện nghiền và cũng ứcchế sự tích tụ hạt Quá trình này được thực hiện trong một máy nghiền bi và thànhphân điền hình là 4% magnetit, 10-20% chất hoạt động bé mặt và phan còn lại là dungmôi [4] Bởi vì quy trình tốn kém và tốn thời gian và các hạt có phân bố kích thướcrộng, đã được thay thé bằng phương pháp hóa học va nhiệt

Phương pháp hóa học

Dong kết tua với base

Theo Mahnaz Mahdavi va cong su, 2013 [9], qua trinh kết tủa Fe:Oa từ hỗnhợp muối Fe?" và Fe?! có thé xảy ra hai phản ứng riêng biệt sau khi bồ sung hydroxide,đó là Fe(OH); va Fe(OH); được hình thành ở pH > 8 bang cách hydroxyl hóa các ionsắt Fe?' và Fe** trong điều kiện yém khí Do đó, sự hình thành của các hạt nano sat từ

12

FesOa xảy ra với kết tủa màu đen Phản ứng có thé xảy ra khi hình thành các hạt nanoFe304 như sau:

Fe? + 30H — Fe(OH)a

Fe(OH)3 — FeOOH + H20

Fe** + 20H” — Fe(OH):

2FeOOH + Fe(OH)2 — Fe3O4 | + 2H20

Sản phẩm nano sat từ được phủ một lớp oleic acid Oleic acid (OA) là mộtchất hoạt động bề mặt thường được sử dụng dé 6n định các hạt nano từ tinh bang liênkết hóa học giữa carboxylic acid và các hạt nano sắt từ, axit oleic làm phân tử sinhhọc phủ bề mặt của FezOx dé kiểm soát kích thước hạt, ngăn chặn các hạt nano từ kếtlăng, để đạt được tính tương thích sinh học, để tăng tính ưa béo lipophilicity va ồnđịnh [9] Oleic acid có 2 đầu, đầu -COOH tích điện sẽ tiếp xúc với bé mặt của hạtFe304, đầu CH3 sẽ xoay ra ngoài tạo một lớp vỏ bọc bao quanh hạt Fe3O4 [10]

{_ Cc Hạ ro Hạ

/Ƒ/' HÀ — „mm \ /

/

'; /

Thông thường, dung dich amoniac được thêm vào dưới điều kiện khuấy dungdịch nước của các muối sắt hóa trị ba và hóa trị hai theo tỷ lệ mol của Fe (IID/ Fe (ID)gân 2, hoặc ngược lại Quy trình này phụ thuộc vào loại và nồng độ muối (thường làclorua) và base, bổ sung các tác nhân chelating, nhiệt độ, tốc độ bổ sung và sự kếttủa Kết tủa được tạo và sau đó rửa liên tục bang nước cất bằng cách tách từ cho đếnkhi dạng keo được hình thành bởi qua trình gọi là peptization - sự peptit hóa.

13

San pham hình thành và hình thái hat bị ảnh hưởng bởi các thông số khác nhaucủa quá trình đồng kết tủa Độ pH tăng nhanh trong khoảng 8,5 — 10 là cần thiết Việcbồ sung chậm base có thé dẫn đến sự hình thành kết tủa màu nâu không phải magnetit,ma là hydroxit Nhanh chóng đưa kiểm vào dung dịch dưới sự khuấy động sâu chophép kết tủa đồng thời cả hai Fe (II) va Fe (II) hydroxit dẫn đến một kết tủa magnetitemàu đen Ngoài ra, dung dịch muỗi sắt có thé được thêm từ từ vào base Nếu các basemạnh như NaOH, KOH, và LIOH được sử dụng có thể làm cho việc thu các sản phẩmkhông mang từ tính Do đó, amoni hydroxit được ưu tiên, chất mà hiệu ứng đó đãkhông được quan sát thấy Việc kết tủa và lão hóa kết tủa cũng phụ thuộc vao nhiệtđộ khoảng thích hợp thường là 25-80°C để thu được các hạt nhỏ hơn 10 nm [4].

Oxit dạng keo gốc nước chủ yếu được chuẩn bi khi không có chất hoạt độngbề mặt Sự 6n định sau đó đạt được bang các điện tích trên các hat, vi du, từ các ionperchlorate, citrate, nitrate hoặc tetramethylammonium, cung cấp ferrofluid kiềmhoặc axit Sự phân tán sau đó ôn định do lực đây tĩnh điện của các hạt mang cùngđiện tích Sự ôn định của nó, tuy nhiên, rat nhạy cam với các chất điện giai có trongmôi trường va chỉ giới han ở độ pH cực cao hoặc thấp và cường độ ion thấp Các hạtkeo hình thành từ việc kết tụ 5-100 hạt nano magnetite phụ thuộc vào điện tích bềmặt Các hạt nano kết tủa có thé được ồn định (peptized) trong nước hoặc chất lỏngkhông phân cực bằng cách thêm một chất hoạt động bề mặt cân băng tính ưa nước/ky nước [4].

Chất hoạt động bề mặt là các hop chất có trọng lượng phân tử thấp khác nhau,chắng hạn như các axit béo cao phân tử và saccharides đã được báo cáo [4, 6, 12].Ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt khác nhau về kích thước và tính chất từcủa hạt nano maghemite đã được báo cáo Ferrofluid có thé được 6n định băng cáchbồ sung các polymer khác nhau, chang hạn như polysaccharides, thường là dextran,poly- (rượu vinyl) (PVA), poly (etylen glycol) (PEG) [5, 6], poly (oxyethylene-co-propene) bisphosphonate, poly (axit metacrylic), polyacrylamit Phủ bang PEG đã trởthanh phé bién do kha năng tương thích sinh học rất tốt Đề cải thiện sự hấp phụ củaPEG lên các hạt trong suốt quá trình đồng kết tủa, liên kết hóa học bằng cách silan

14

hóa magnetite với (trimethoxysilyl) PEG đã được dé xuất [10] Sự 6n định nói chungđạt được hoặc bằng cách đồng kết tủa muối ferrous/ferric trong dung dich polymer(tổng hợp tại chỗ), hoặc một dung dịch polymer được thêm vào sau khi kết tủa (sửađổi sau tong hợp) Sự hiện diện của một polymer hòa tan trong quá trình hình thànhhạt từ ảnh hưởng đến việc kết tủa, tạo mầm và Ôn định của các hạt keo tạo thành Chấtồn định polymer cải thiện không chỉ sự ôn định của keo, mà còn tăng tính chất bề mặtcủa các hạt và góp phan vao khả năng tương thích sinh học của chúng [4].

Ngoài magnetite, các hạt khác của ferrite được điều chế bang cách đồng kếttủa các muối kim loại hóa trị hai tương tng, chăng hạn như Co (ID, Cu (ID), Ni (ID,Mn (II) và Fe (III) với một kiềm Không giống như magnetite, Co và Ni ferrite đượchình thành ở nhiệt độ cao hơn (80—100°C) Cả thời gian lão hóa và độ pH của môitrường ảnh hưởng đến đường kính của các hạt tạo rasau khi kết tủa Các thông sốkhác ảnh hưởng đến quá trình đồng kết tủa của Co (II) và Fe (IIL) muối bao gồm nhiệtđộ và bản chất của chất kết tủa Kiềm mạnh hydroxit (LIOH, KOH, NaOH) được ưutiên dùng hơn NHạOH trong sự chuẩn bị của ferrites Co, Mn, va Ni ferrite nói chungđộ nhạy từ tính và từ hóa bão hòa cao hon magnetite một chút Tuy nhiên, ứng dụngcủa chúng trong sinh học và y học bị hạn chế do độc tính của kim loại hóa trị hai [4].Nhiệt phân các tiền chất hữu cơ chứa sat

Phân hủy nhiệt hai bước của pentacarbonyl sắt với sự có mặt của một polymerồn định hóa tạo ra các hạt nano magnetite đơn 10-20 nm (cách khác tới 25 nm) Quátrình này dựa trên sự hình thành các hạt nano Fe sơ cấp trong một chất lỏng khôngcực, tiếp theo là xảy ra quá trình oxy hóa chúng thành các hạt magnetite Nhiệt độphân hủy đóng vai trò quyết định để xác định kích thước hạt và độ phân tán Chấthoạt động bề mặt (ví dụ: oleic acid) phải được sử dụng: tuy nhiên, nó có thé cản trởviệc sửa đối bề mặt tiếp theo Phân hủy pentacarbonyl sắt cũng được sử dụng choviệc tạo maghemite Ngoài ra, các hat nano maghemite hình cầu được hình thànhbang cách bơm phức hợp sắt cupferon trong trioctylamine nhanh chóng tai 300°C [4].Phan li nhiệt độ cao

15

Nói chung, các quá trình phân li nhiệt là phản ứng của hỗn hop oxit hoặchydroxit sat và kim loại được chon khác được thực hiện trong nước dưới điều kiệnsiêu tới hạn, tức là ở nhiệt độ trên 200°C và dưới áp suất cao hơn 14 MPa Nước đóngvai trò của một chất phản ứng thủy phân Kích thước và hình thái của sản phẩm đượckiểm soát bởi thời gian phản ứng và nhiệt độ Độ tinh khiết của pha rắn hình thànhphụ thuộc vao pH Hai quá trình hóa học chính dẫn đến sự hình thành các ferrite dướiđiều kiện thủy nhiệt: (i) trung hòa (hoặc thủy phân) và quá trình oxy hóa Fe (ID) vacác ion kim loại hóa trị hai và (ii) trung hòa các hydroxit kim loại hỗn hợp Thay đổithay thế bao gồm việc sử dụng hỗn hợp oxit kim loại hoặc ethylene glycol trong điềukiện siêu tới hạn [4].

2.6.2 Phương pháp bọc silica

Từ khi bài viết đầu tiên mô tả phương pháp tổng hợp từ hạt nano của Massart,1981 được xuất bản, sự quan tâm đến các loại hạt nano ngày càng tăng Một sốphương pháp tong hợp đã được được phát triển để tạo hạt nano bao gồm phương phápđồng kết tủa - coprecipitation, polyol, nhũ tương hóa - microemulsion, phân hủy tiềnchất hữu cơ ở nhiệt độ cao và phun/ nhiệt phần bang laser [8] Theo Park, et al 2004,phương pháp phân hủy nhiệt dựa trên sat oleate như một tiền chất là một kỹ thuật dédàng, không độc hại và thân thiện với mdi trường để tạo ra hạt nano oxit sắt phủ oleicacid năng suất cao và có kích thước từ 5 nm đến 22 nm [8]

Lớp phủ silica của các hạt nano oxit sat có thé được thực hiện bởi các phươngpháp tong hợp khác nhau, trong số đó, hai phương pháp phô biến nhất là phương phápStöber và quá trình vi nhũ tương hóa — microemulsion [8].

Phương pháp Stéber

Phương pháp Stöber được sử dụng chủ yếu dé tạo các hạt nano silica, cũngđược áp dụng cho sự hình thành cau trúc lõi-vỏ của hạt nano Độ dày vỏ có thể đượckiểm soát bởi các tham số liên quan đến quá trình (nhiệt độ, nồng độ, thời gian, v.v ).Mặc dù phương pháp tương đối đơn giản, các hạt nano lõi — vỏ tong hợp băng phương

16

pháp nay hién thi cau trúc đa lõi với độ dày không đồng nhất cua silica, cả hai yếu tốquan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất của chúng [10].

Phương pháp nay dựa trên nguyên tắc: Tetraethyl orthosilicate (Si(OEt)s TEOs) là chất tiên thân của Silica bị thủy phân trong môi trường côn (thường làmethanol hoặc ethanol) cùng với ammonia (NHs) là chất xúc tác Sau đó, quá trìnhngưng tụ xảy ra tạo ra mạng lưới silica biểu hiện qua các nhóm silanol Các phươngtrình phản ứng như sau:

-Quá trình thủy phân:

Si(OEt)4 + H20 — Si(OEt)30H + EtOH

Si(OEt)4+ 2 H2O0 — Si(OEt)2(OH)2+ 2EtOH

Qua trinh ngung tu:

2 Si(OEt)30H — (EtO)3Si-O-Si(OEt)3 + H20

Si(OEt)30H + Si(OEt)4 — (EtO)3Si-O-Si(OEt)3 + EtOH

Si(OEt)30OH + Si(OEt)2(OH)2 — (EtO)3Si-O-Si(OEt)20H + H20

Như vay, qua trình boc silica lên hat nano FezO4-OA được thé hiện như sau:

Hình 2.2 Mang lưới silica và sự hình thành nhóm Silanol do TEOS ngưng tụ không

hoàn toàn

17

Như vậy, quá trình boc silica lên hạt nano Fe3O4-OA được thé hiện như sau:

lộ)

|SI

Oo” Mr l CHŠC_(CH,);CH:CH-(CH);CH, + O——SÌ Ƒ”: ——> N0-Crad '

o | oH

HO

Fe¿O,-OA TEOs Fe,0,@Si0)

Hình 2.3 Hat nano Fe3O4 sau khi được phủ mot lop silica

Phuong pháp vi nhii trong

Phương pháp vi nhũ tương là một phương án thay thé cho phương pháp Stöber.Vi nhũ tương nước trong dau, hoặc nhũ tương nghịch đảo - inverse microemulsionđã được nghiên cứu và được sử dung rộng rãi dé tong hợp hat nano silica Phuongpháp nay cũng đang ngày càng trở nên được ưu tiên cho việc tong hợp phức hợp cautrúc lõI-vỏ va gân đây đã được sử dụng để tạo các hat nano oxit sắt cau trúc lõi — vỏ.Tuy nhiên, đối với trường hợp tong hợp hạt nano silica, phương pháp vi nhũ tươngtạo ra các hạt nano lõi — vỏ bị co thắt mạnh, do phản ứng ngưng tụ vẫn tiếp tục trongsuốt quá trình thu nhận Ngoài ra, một phan quan trọng của những báo cáo trước đólà các hạt là các hạt nano cấu trúc lõi — vỏ có đa lõi Việc hình thành các hạt nano đalõi và co thắt mạnh dẫn đến tăng kích thước tong thé, giam dién tich bé mat va giamsự 6n định trong dung dịch Những những han chế sẽ cản trở tiềm năng sử dụng chúngcho in vivo và các ứng dung in vitro có kích thước tổng thể nhỏ hơn hơn 50 nm, độđồng đều cao và không kết tụ

Tuy nhiên, Vogt và cộng sự [8] đã tạo được hạt nano sắt từ silica với việc kiểmsoát tuyệt vời độ dày vỏ, mức độ phân tán cao và đồng đều, đạt đến độ day vo silica~ 13 nm (kha năng có thé tiếp tục giảm độ day vỏ) dựa trên phương pháp hai bước:(i) tong hợp lõi SPION có phủ oleic axit bang cách phân hủy nhiệt: (ii) tiếp theo làphủ lớp phủ silica trên lõi băng kỹ thuật vi nhũ tương hóa ngược băng cách thêm mộtbước tong hợp mới khi hiểu rõ được cơ chế hình thành lõi — vỏ Những phản ứng dutrong quá trình tạo hạt bị ức chế băng việc kết hợp kiểm soát pH với sốc đóng băng

18

và siêu ly tâm Đồng thời, ảnh hưởng của tốc độ khuấy trong qua trình tong hop vàthời gian ngưng tu được kiểm soát dé tinh chỉnh độ dày của vỏ silica trong cau trúclõi — vo.

Ding va cộng sự [10] đã tạo được các hạt nano Fe304@SiO2 có lõi đơn va độdày vỏ khác nhau và đặc biệt có thé được ứng dụng cho các kích cỡ hạt Fe304 khácnhau và tránh được sự hình thành các hat silica không có lõi Các thông số lớp phủsilica thích hợp cho các Fe3O4 với kích thước cụ thé và không chắc chắn áp dụngđược cho các kích thước khác và số lượng tương thích của các hạt nano FezOa vớidung dich nước là rất cần thiết Vùng ưa nước nhỏ phù hợp với lớp vỏ silica siêumỏng, trong khi các vùng ưa nước lớn là phù hợp cho lớp vỏ phủ day hơn Dé tránhsự hình thành các hat silica không có lõi, độ dày vỏ silica có thể đạt được bang cachtăng ham lượng cua TEOS nhỏ giọt hoặc amoniac - với việc giảm TEOS Có sự traođối phối tử giữa các quy trình trung gian của lớp phủ silica [10]

Đối với các ứng dụng trong sinh học, chân đoán y khoa và điều trị các hạt nanooxit sat siêu bền từ (superparamagnetic iron oxide nanopartieless — SPION) là mongmuốn Bat kế ứng dụng in vivo hoặc in vitro, SPION phải sở hữu một số tính chất cơbản, cụ thé: kích thước nhỏ hơn 20 nm; diện tích bề mặt lớn được chức năng hóa; độôn định dạng keo cao; và khả năng vượt qua các rào cản sinh hoc [8] Tuy nhiên, đặcbiệt đối với các ứng dụng in vivo, các hạt phải tuân thủ yêu cầu nghiêm ngặt hon:không độc tính, không miễn dịch, lưu giữ lâu dài trong tuần hoàn mau, khả năng tiếpcận và đi qua nội mô mang mao quản mà không thuyên tac Những yêu cầu bồ sungnày chỉ đạo nghiên cứu hướng tới sự phát triển các phương pháp tạo ra hạt nano từtính mới với kích thước, hình dạng và độ kết tỉnh cao được xác định rõ [8]

Tuy nhiên, ngay cả SPION thé hệ mới với kích thước va độ phân tán đồng đềuvà đặc tính từ tính đặc biệt không thé được sử dụng như khi tao hạt, việc sửa đối bềmặt là một điều cần thiết không chỉ để tránh sự kết tụ mà cũng để tăng tính tươngthích sinh học và lưu giữ thời gian trong dòng máu Phủ hạt bằng một lớp bố sung làcách tiếp cận pho biến nhất dé đạt được mục tiêu SPION sửa đôi bề mặt vật liệu đượcFDA chấp thuận cho các ứng dụng sinh học [8]

19

2.7 Nguyên tac thu nhận DNA bang hat nano từ tinh

Nucleic acid duoc gan vào bề mặt có hạt điện tích thuận từ xảy ra khi có mặtmột số mudi [2] Vật liệu có diện tích bề mặt lớn được ưu tiên sử dụng trong việc liênkết nucleic acid Các vật liệu dạng hạt được ưu tiên hơn để hỗ trợ trong quá trình thunhận vì khả năng liên kết lớn hơn của chúng [7| Các hạt có điện tích từ có thể đượcgiữ lại/ loại bỏ bằng cách sử dụng nam châm vĩnh cửu trong ứng dụng từ trường

Sử dụng một nam châm giúp thu nucleic acid từ các chat tạp nhiễm khác bangcách áp vào thành bình chứa hon hợp mẫu dé kết tụ các hạt gần thành bình đồ đi phầncòn lại của mẫu [7] Tiếp theo rửa côn, sau đó đã được hòa với dung dịch muối, chođến khi các nucleic acid tinh khiết được giải phóng khỏi hạt thuận từ trong sự có mặtcủa nước muối hoặc nước Sự thu nhận, rửa và rửa giải nucleic acid thành công màkhông can ly tâm hoặc loc [2]

Bốn bước quan trọng liên quan đến việc chiết pha răn là ly giải tế bào, hấp phụnucleic acid, rửa và rửa giải theo sơ do hình 2.4.

Sample M-PVA Wash buffer Elution buffer Pure DNA

Lysis buffer Magnetic beads / Discard§ i & binding buffer a supernatant ũ it

= = ¡=1

=> € Ỳ

> > cŸ > |

Hình 2.4 Sơ đồ guá trình tinh sạch nucleic acid bằng công nghệ hat nano từ (được

mô tả bởi Công ty Chemagen vé công nghệ Biopolymer AC, Đúc) [3]Việc thu nhận nucleic acid ra khỏi các phân tử không mong muốn khác dựatrên tính chất liên kết thuận nghịch của nó với bề mặt có điện tích khi được xử lý vớinông độ muối nhất định [2], Quá trình liên kết axit nucleic lên vật liệu nano có théđược thực hiện băng việc nucleic acid “bao quanh” vật liệu [7]

Tuy thuộc vào tính chất của các hạt, việc thay đôi nó và có mặt dịch đệm, sựtương tác của nucleic acid và bề mặt của hạt từ tính (quá trình hấp phụ) xảy ra thôngqua một số nguyên tắc cơ bản theo Kovaševié và cộng sự [2] và Tan và cộng sự [7]liệt kê dưới đây:

20

1 Trao đối ion bang một chat trao đôi anion đưới điều kiện dung dịch.2 Tương tác qua liên kết hydro với một matrix ưa nước ở điều kiện chaotropic.3 Tương tác của silica với DNA trong trạng thái cô đặc ở nồng độ NaCl vàPEG 6000 cao.

4 Cơ chế loại trừ ái lực và kích thước.Trong các nguyên tắc này, nguyên tắc thứ hai đã được khai thác rộng rãi [2].Do cả nucleic acid và silica được tích điện âm nên cần thiết dé áp dụng nồng độ caocủa muối chaotropic, loại bỏ hydrat hóa và cho phép liên kết thông qua việc hìnhthành các cau dication.

Bé mặt silica có thé được sửa đối với nhóm amine -NH;, tích điện dương.Trong những trường hop này, muối chaotropie không can thiết dé nucleic acid gankết Aminosilane [2]

Nguyên tac tinh sạch bang matrix silica dựa trên ái lực cao của xương sốngDNA mang điện tích âm với các hat silica tích điện dương Natri đóng một vai tronhư một câu cation thu hút oxy tích điện âm trong xương sống phosphate cua nucleicacid Cation natri phá vỡ liên kết hydro giữa hydro trong nước và các ion oxy tíchđiện âm trên silica trong điều kiện muối cao (pH < 7) DNA được gan chặt và đượcrửa nhiều lần để loại bỏ tat cả tạp chất Các phân tử DNA tinh khiết có thé được giảihấp dưới cường độ ion thấp (pH > 7) sau đó bang cách sử dụng đệm TE hoặc nướccất [7]

21

Cationbridge HE

HO Í ee ?

“Ore ? ao ph a Base< ö F4

ete on Sugar

—

ONa'O—P-œ-Silica “OH | » ONa'O—P-œ-Silica G PS

— He” Chaotropic salt 0 ~ Sugar

Sử dụng từ tính là một cách đơn giản và hiệu quả được sử dụng trong thu nhậnnucleic acid ngày nay Các hạt có điện tích từ có thể được loại bỏ băng cách sử dụngnam châm vĩnh cửu trong ứng dụng từ trường v.v

Việc thu nhận axit nucleic là một công cụ ngày càng quan trọng đối với sinhhọc phân tử Khi sử dung các hạt nano Fe:Oa cho các kết quả khả quan bởi vì chúngcó thé dé dàng được thu nhận bang từ trường ngoai của nam châm; và có thé gắn cácphối tử thích hợp như một công cụ hiệu quả để đạt được thu nhận sinh học nhanhchóng, đơn giản Đề ứng dụng được hạt nano sắt từ, những tính chất rất cần thiết khitạo hạt từ như không kết tụ, có kích thước nano, có tính siêu thuận từ đồng nhất vàcao va không độc hại [1].

Mặt khác, các hạt nano từ tính có kích thước tương ứng với kích thước của cácphân tử nhỏ (1-10 nm) hoặc kích thước của các vi rút (10-100 nm) Chính vì thế màhạt nanô có thể thâm nhập vào hầu hết các vị trí khác nhau và giúp cho chúng ta có

22

thé thao tac ở qui mô phân tử và tế bào Diện tích bề mặt lớn của các hạt nano giúpcho các hiệu ứng xảy ra bên trên bề mặt diễn ra rất mạnh mẽ [11].

Chính vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành tạo hạt nano sắt từ FesO4 vàFe304@Si0O2 và thử nghiệm vào việc thu nhận DNA của các đối tượng sinh học: vikhuan, tao, nam, máu động vật.

23

VAT LIEU & PHƯƠNG PHAP

3.1 Đối tượng nghiên cứu- Hạt nano oxit sat từ FesO4 và Fe:Ou(SiOa.- Mẫu MI: Mẫu DNA từ kết quả PCR của tôm (848 bp và 379 bp).- Mau vi khuẩn E coli DHS5a, tao Spirulina platensis, nam Đông trùng hạ thảoCordyceps militaris thu nhận tai trường Dai hoc Thu Dau Mot, Binh Duong.

- Mau mau lon

3.2 So đồ quy trình thực hiện

Đề tài nghiên cứu được chia thành 6 nội dung chính theo sơ đồ hình 3.1

Thử nghiệm hat nano sắt từ FesO4 và FesOa(@SiO2

dé thu nhận DNA từ mẫu PCR

Thử nghiệm hat nano sắt từ FesO4 và FesOa(@SiO2

dé thu nhận DNA từ E coli DH5aTong hop hat nano

oxit sắt Fe3O4 va Thu nghiém hat nano sat từ Fe3O4 va Fe304@Si02Fe304@SiO2 dé thu nhận DNA từ tao Spirulina platensis

Thử nghiệm hat nano sắt từ Fe3O4 va FeaOa(@SiO;dé thu nhận DNA từ nắm Cordyceps militaris

Thử nghiệm hat nano sắt từ Fe3O4 và FeaOa(@SiO;

để thu nhận DNA từ máu lợn

Hình 3.1 Sơ đồ nội dụng thực hiện

24