Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Góp phần xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn fructophilic lactic acid (FLAB) phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật và thử nghiệm tạo chế phẩm

Trang 1

ĈҤI HӐC QUӔC GIA TP HCM

75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA

-

CAO THANH NHҼ

GÓP PHҪN XÂY DӴNG BӜ 6Ѭ87ҰP GIӔNG VI KHUҬN FRUCTOPHILIC LACTIC ACID (FLAB) PHÂN LҰP TӮ Hӊ TIÊU HOÁ ONG MҰT VÀ THӰ

NGHIӊM TҤO CHӂ PHҬM

ISOLATION OF FRUCTOPHILIC LACTIC ACID BACTERIA (FLAB) FROM THE HONEY BEE DIGESTIVE SYSTEM CREATES A COLLECTION OF

FLAB AND EXPERIMENTS TO MAKE PRODUCTS

Chuyên ngành: Công NghӋ Sinh Hӑc Mã sӕ: 60420201

TP HӖ CHÍ MINH, Tháng 09 QăP21

Trang 2

&Ð1*75Î1+ĈѬӦC HOÀN THÀNH TҤI:

75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA ±Ĉ+4*-HCM

Cán bӝ Kѭӟng dүn khoa hӑc: PGS TS NguyӉQ7K~\+ѭѫQJ

Cán bӝ chҩm nhұn xét 1: PGS.TS Phan Thӏ 3Kѭӧng Trang

Xác nhұn cӫa Chӫ tӏch Hӝi ÿӗQJÿiQKJLi/9Yj7Uѭӣng Khoa quҧn lý chuyên ngành sau khi luұn văn ÿã ÿѭӧc sӱa chӳa (nӃu có)

CHӪ TӎCH HӜ,ĈӖNG 75ѬӢNG KHOA KӺ THUҰT HÓA HӐC

Trang 3

I 7Ç1Ĉӄ TÀI:

Góp phҫn xây dӵng bӝ VѭXWұp giӕng vi khuҭn Fructophilic Lactic Acid

(FLAB) phân lұp tӯ hӋ tiêu hóa ong mұt và thӱ nghiӋm tҥo chӃ phҭm

II NHIӊM VӨ VÀ NӜI DUNG:

- Phân lұp vi sinh vұt FLAB tӯ hӋ tiêu hóa ong mұt

- Khҧo sát mӝt sӕ hoҥt tính probiotic cӫa các vi sinh vұt phân lұp - 7KăPGzNKҧ QăQJWҥo chӃ phҭm probiotic tӯ vi khuҭn tuyӇn chӑn

III NGÀY GIAO NHIӊM VӨ : 21/09/2020

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIӊM VӨ: 19/04/2021 V CÁN BӜ +ѬӞNG DҮN: PGS TS NguyӉQ7K~\+ѭѫQJ

Nӝi dung và yêu cҫu luұQYăQÿmÿѭӧc thông qua bӝ môn

Trang 4

LӠI CҦ0Ѫ1

ĈӇ ÿӅ WjL ÿѭӧc hoàn thiӋQ QKѭ QJj\ K{P QD\ QJRjL Vӵ nӛ lӵc cӫa bҧn WKkQW{LÿmQKұQÿѭӧc nhiӅu sӵ ÿӝQJYLrQFǊQJQKѭVӵ JL~Sÿӥ tӯ JLDÿuQKWKҫy cô, bҥn bè, và nhӳng vұt dөng xung quanh mình

Ĉҫu tiên, con vô cùng biӃWѫQ*LD ÿuQK&KD0ҽ OX{QOjÿLӇm tӵa vӳng chҳc nhҩWÿӇ con vӳQJWLQEѭӟc qua nhӳng thӱ thách, nhӳQJNKyNKăQWURQJFXӝc sӕng Con xin cҧPѫQ&KD0ҽ ÿmÿѭDFRQÿӃn thӃ giӟi này và luôn khӓe mҥnh bên con Em xin cҧPѫQ&Kӏ hDLYj$QKEDÿmOX{Qӫng hӝ HPWUrQFRQÿѭӡng hӑc tұp và hoàn thành tӕt bài luұQYăQQj\

Em xin gӱi lӡi cҧP ѫQ VkX Vҳc nhҩW ÿӃn Cô PGS TS NguyӉn Thúy +ѭѫQJ&{NK{QJFKӍ truyӅn dҥy kiӃn thӭc, niӅPÿDPPrQJKLrQFӭu, mà còn \rXWKѭѫQJYjÿӗng cҧm vӟi em tӯ nhӳQJEѭӟc chұp chӳQJÿҫXWLrQYjRWUѭӡng %iFK.KRDÿӃn ngày cuӕLFQJÿӇ KRjQWKjQKFKѭѫQJWUuQK7Kҥc sӻ Lӡi cҧPѫQcó lӁ OjNK{QJÿӫ vӟi nhӳQJ\rXWKѭѫQJ&{GjQKFKRHPHPVӁ NK{QJÿӇ uәng phí nhӳng kiӃn thӭc, trҧi nghiӋm cӫa nhӳng ngày tháng hӑc tұp và làm viӋc, sӱ dөng nhӳQJÿLӅu ҩ\ÿӇ giúp ích cho xã hӝi và trӣ thành mӝt công dân có trí tuӋ, nghӏ lӵFYjÿҥRÿӭc

Em xin chân thành cҧP ѫQÿӃn Quý Thҫy Cô khoa Công nghӋ Hóa hӑc, Thҫy Cô Bӝ môn Công nghӋ Sinh hӑc, thҫy ThiӋQÿmKӛ trӧ em trong quá trình hӑc tұS HP 0DL +ѭѫQJ ÿm OX{Q ÿӗng hành cùng anh thӵc hiӋQ ÿӅ tài này, bҥn +RjL1KkQÿmOX{QErQFҥnh ӫng hӝ Nhҽ trong suӕt quá trình hӑc ThҥFVƭYjFiFanh chӏ, các bҥn cùng làm viӋc trong phòng thí nghiӋm cӫa Bӝ môn

Quá trình thӵc hiӋn luұQ YăQ Wӕt nghiӋp vӟi sӵ hҥn chӃ vӅ thӡi gian và kiӃn thӭc, bài luұQYăQNK{QJWUiQKNKӓi nhӳng sai sót Em mong nhұQÿѭӧc sӵ góp ý cӫa Thҫ\&{ÿӇ em có thӇ hoàn thiӋn bài luұQYăQKѫQJL~SNLӃn thӭc cӫa bҧQWKkQÿѭӧFQăQJFDRKѫQ

Trang 5

TÓM TҲT LUҰ19Ă17+Ҥ&6Ƭ

ĈӅ WjL³*ySSKҫn xây dӵng bӝ VѭXWұp giӕng vi khuҭn Fructophilic Lactic Acid (FLAB) phân lұp tӯ hӋ tiêu hoá ong mұt và thӱ nghiӋm tҥo chӃ phҭP´ÿѭӧc thӵc hiӋn vӟi mөFWLrXÿyQJJySYjREӝ VѭXWұp giӕng FLAB và EѭӟFÿҫu xây dӵng quy trình sҧn xuҩt chӃ phҭm probiotic cho ong mұt tiӃQÿӃn viӋc dҫn dҫn thay thӃ thuӕFNKiQJVLQKÿLӅu trӏ bӋnh cho ong mұWĈӅ WjLÿҥt kӃt quҧ QKѭsau:

x ĈӅ tài phân lұSÿѭӧc 14 chӫng LAB và sàng lӑFÿѭӧc 4 ӭng viên FLAB là M4, M5, M6, M8 cùng vӟi 1 chӫQJ)/$%Oj)ÿѭӧc cung cҩp bӣi bӝ môn ÿѭӧFÿHPÿLWKӱ nghiӋm Cҧ 5 chӫng FLAB có khҧ QăQJNKiQJYLNKXҭn gây bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong mұt vӟLÿѭӡng kính vòng kháng khuҭn tӯ 8,67 ± PPÿӃn 15,33 ± 0,58 mm

x 1ăPFKӫQJ)/$%Oj0000Yj)FyFiFÿһFÿLӇm sau: có khҧ QăQJFKӏu pH thҩp, chӏu nhiӋt, khҧ QăQJEiPGtQKWӕt và không nhҥy cҧm vӟi streptomycin và kanamycin

x Bӕn chӫng FLAB là M4, M5, M6 và M8 có khҧ QăQJWәng hӧp acid lactic, acid acetic vӟi nӗQJ ÿӝ tӯ 2011 ± PJNJ WURQJ ÿy FKӫng M8 có khҧ QăQJWәng hӧp cҧ 2 loҥi acid cao nhҩWWURQJFQJÿLӅu kiӋn thí nghiӋm

x KӃt quҧ ÿӏnh danh theo trình tӵ 6U51$[iFÿӏnh cҧ 4 chӫng phân lұp mӟi

000Yj0ÿӅu là Lactobacillus kunkeei vӟLÿӝ WѭѫQJÿӗng lҫQOѭӧt

là 99,24%, 99,43%, 99,44% và 99,43%

x Trong các chӫng vi khuҭn khҧo sát, chӫng L kunkeei M8 mang nhiӅXѭXWKӃ

KѫQÿӇ thӱ nghiӋm tҥo chӃ phҭm probiotic vӟi các thông sӕ phù hӧp trong quá trình sҩy bao gӗm: tӹ lӋ bӝWÿұu nành phӕi trӝn 15%, nhiӋWÿӝ không khí ÿҫu vào 1000&YjOѭXOѭӧng dӏch phun 1,5 cm3/s ChӃ phҭPWKXÿѭӧFÿҥt tiêu chuҭn probiotic vӟLÿӝ ҭm nhӓ KѫQYjPұWÿӝ vi khuҭn sӕng cao 9,63 log CFU/g

Trang 6

SUMMARY

The topic "Isolation of Fructophilic Lactic Acid Bacteria (FLAB) from the honey bee digestive system creates a collection of FLAB and experiments to make products" was carried out with the aim of contributing to the collection of FLAB varieties and started creating a process to produce probiotic products for honey bees, gradually replacing antibiotics to treat diseases for honey bees The topic achieved the following results:

x Isolated 14 LAB strains and screened four FLAB candidates, namely M4, M5, M6, M8 along with one FLAB strain F4 provided by the department to be tested All five strains of FLAB were resistant to bacteria causing

foulbrood disease on honey bees with antibacterial circle diameters from 8,67 ± 0,58 mm to 15,33 ± 0,58 mm

x Five FLAB strains M4, M5, M6, M8, and F4 have the following

characteristics: low pH tolerance, heat resistance, good adhesion ability, and insensitive to streptomycin and kanamycin

x Four FLAB strains, M4, M5, M6, and M8, have the ability to synthesize lactic acid, acetic acid with concentrations from 2011 to 2463 mg/kg, in which strain M8 has the highest ability to synthesize both acids in the same condition

x The results of 16S rRNA sequencing identified all four new isolates M4, M5,

M6, and M8 as Lactobacillus kunkeei with similarity of 99,24%, 99,43%,

99,44%, and 99,43% respectively

x Among the surveyed bacteria strains, strain L kunkeei M8 has more

advantages for testing to create probiotic products with suitable parameters during the drying process including percentage of mixed soybean meal 15%, the inlet air temperature is 1000C and the spray fluid flow is 1,5 cm3/s The product obtained met probiotic standards with moisture content less than 5% and a high density of live bacteria 9,63 log CFU/g

Trang 7

LӠ,&$0Ĉ2$1

7{L [LQ FDP ÿRDQ ÿӅ WjL ³Góp phҫn xây dӵng bӝ VѭX Wұp giӕng vi khuҭn

Fructophilic Lactic Acid (FLAB) phân lұp tӯ hӋ tiêu hóa ong mұt và thӱ nghiӋm tҥo chӃ phҭm´OjF{QJWUuQKQJKLrQFӭu cӫa tôi Tҩt cҧ sӕ liӋu sӱ dөng trong luұn YăQYjNӃt quҧ nghiên cӭu này là do tôi tӵ thӵc hiӋn, tӵ tìm hiӇu tài liӋu có nguӗn gӕc, trích dүn rõ ràng và hoàn toàn trung thӵc Tôi xin chӏu hoàn toàn trách nhiӋPWUѭӟc bӝ P{QNKRDYjQKjWUѭӡng vӅ sӵ FDPÿRDQQj\

Tp Hӗ &Kt0LQKQJj\WKiQJQăP Tác giҧ ÿӅ tài

Cao Thanh Nhҽ

Trang 8

&+ѬѪ1*7ӘNG QUAN TÀI LIӊU 3

1.1 Tình hình bӋQKYjÿLӅu trӏ bӋnh trên ong mұt 3

1.1.1 Các loҥi bӋnh phә biӃn 3

1.1.2 BӋnh thӕi ҩu trùng châu Âu (European foulbrood) 3

1.1.3 BӋnh thӕi ҩu trùng châu Mӻ (American foulbrood) 5

1.1.4 ĈLӅu trӏ bӋnh trên ong mұt 6

1.2 Các vi sinh vұt gây bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong mұt 7

1.2.1 Melissococcus pluton 7

1.2.2 Paenibacillus larvae 8

1.3 HӋ vi sinh vұt trong hӋ tiêu hóa ong mұt 9

1.3.1 HӋ tiêu hóa ong mұt 9

1.3.2 HӋ vi sinh vұt trong hӋ tiêu hóa ong mұt 10

1.4 Vi khuҭn Fructophilic Lactic Acid (FLAB) 11

2.1 ThӡLJLDQYjÿӏDÿLӇm nghiên cӭu 19

2.2 Vұt liӋXP{LWUѭӡng, hóa chҩt và thiӃt bӏ 19

2.2.1 Vұt liӋu 19

2.2.2 0{LWUѭӡng và hóa chҩt 19

2.2.3 Trang thiӃt bӏ 20

Trang 9

2.3 6ѫÿӗ nghiên cӭu tәng quát và thuyӃt minh quy trình 21

2.3.6 Bҧo quҧn bӝ giӕng 25

2.3.7 7Kăm dò khҧ QăQJWҥo chӃ phҭm probiotic cho ong mұt 25

&+ѬѪ1*.ӂT QUҦ VÀ BIӊN LUҰN 30

3.1 Phân lұp và sàng lӑc vi khuҭn FLAB 30

Trang 10

3.5 Phân tích các yӃu tӕ có khҧ QăQJNKiQJYLNKXҭn gây bӋnh trên

ong mұt cӫa chӫng tuyӇn chӑn 41

3.6 7KăPGzNKҧ QăQJWҥo chӃ phҭm probiotic cho ong mұt 42

3.6.1 Khҧo sát ҧQKKѭӣng cӫa tӹ lӋ bӝWÿұXQjQKÿӃn chҩWOѭӧng chӃ phҭm

Trang 11

DANH MӨC BҦNG

Bҧng 1 Các loҥi bӋnh phә biӃn ӣ ong mұt 3

Bҧng 2 ĈһFÿLӇm hình thái cӫa mӝt sӕ vi khuҭn FLAB 13

Bҧng 3 0{LWUѭӡQJÿѭӧc sӱ dөQJWURQJÿӅ tài 19

Bҧng 4 Hóa chҩWÿѭӧc sӱ dөQJWURQJÿӅ tài 20

Bҧng 5 Các nghiӋm thӭc khҧo sát khҧ QăQJWҥo chӃ phҭm probiotic cӫa FLAB 26

Bҧng 6 KӃt quҧ ÿR2'610nm các chӫng phân lұSWăQJVLQKWUrQP{LWUѭӡng FYP lӓng (sau 24 giӡ, 37oC) 30

Bҧng 7 KӃt quҧ ÿR2'610nm các chӫng nghi ngӡ )/$%WăQJVLQKWUrQP{LWUѭӡng FYP và GYP lӓng (ӫ ӣ 370C sau 18, 24, 30 giӡ) 31

Bҧng 8 ĈһFÿLӇm hình thái cӫa các FLAB sàng lӑFÿѭӧc phân lұp tӯ hӋ tiêu hóa ong mұt 32

Bҧng 9 KӃt quҧ ÿѭӡng kính vòng kháng khuҭn trong thí nghiӋPÿӕi kháng vӟi chӫng chӍ thӏ 34

Bҧng 10 KӃt quҧ tӍ lӋ bám dính cӫa các chӫng FLAB 36

Bҧng 11 KӃt quҧ ÿiQKJLiNKҧ QăQJNKiQJNKiQJVLQKFӫa 5 chӫng FLAB 38

Bҧng 12 KӃt quҧ ÿR2'610nm dӏch khuҭQWăQJVLQKFiFFKӫng tuyӇn chӑn ӣ các nhiӋWÿӝ khác nhau 39

Bҧng 13 KӃt quҧ phân tích chӍ tiêu acid 42

Trang 12

DANH MӨC HÌNH

Hình 1 Hình ҧQKÿҥi thӇ và vi thӇ cӫa M pluton WUrQP{LWUѭӡng Basal 4

Hình 2 TriӋu chӭng bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong mұt 4

Hình 3 Nhӝng khӓe (trái) và nhӝng bӏ bӋnh (phҧi) cùng tuәi 6

Hình 4 Ҩu trùng và tә ong bӏ nhiӉm bӋnh thӕi ҩu trùng châu Mӻ 6

Hình 5 TӃ bào vi khuҭn Melissococcus pluton 8

Hình 6 TӃ bào vi khuҭn Paenibacillus larvae 8

Hình 7 HӋ tiêu hóa cӫa ong mұt 9

Hình 8 6ѫÿӗ nghiên cӭu 21

Hình 9 HӋ thӕng sҩy phun mini B-290 26

Hình 10 Hình thái khuҭn lҥc các vi khuҭn FLAB sàng lӑFWUrQP{LWUѭӡng MRS 32

Trang 13

DANH MӨC CHӲ VIӂT TҲT

FLAB Fructophilic lactic Acid Bacteria

LAB Lactic Acid Bacteria

MRS Rogosa and Sharpe agar

GYP Glucose Yeast Peptone

FYP Fructose Yeast Peptone Ĉ.99 ĈѭӡQJNtQKYzQJY{NKXҭQ

Trang 14

LӠI MӢ ĈҪU

NghӅ nuôi ong mұt ӣ ViӋW1DPÿDQJSKiWWULӇn nhanh chóng nhӡ YjRÿLӅu kiӋn thiên nhiên thuұn lӧi vӟi hӋ thӵc vұt phong phú và sӵ phát triӇn mҥnh mӁ cӫa khoa hӑc công nghӋ ӭng dөng vào nông nghiӋS 1ѭӟc ta có khoҧng 1,26 triӋXÿjQRQJ7әng sҧQOѭӧng mұt onJQăPÿҥt 49.000 tҩn, ViӋt Nam trӣ thành quӕFJLDÿӭng thӭ 6 trên thӃ giӟi và thӭ 2 châu Á vӅ xuҩt khҭu mұt ong chiӃm 44.000 tҩn, chiӃm 90% sҧQOѭӧng xuҩt khҭu sang thӏ WUѭӡng Hoa KǤ, còn lҥi xuҩt khҭu sang thӏ WUѭӡng Châu Âu và tiêu thө nӝL ÿӏa [1] Mұt ong là mӝt trong nhӳng sҧn phҭm tӵ nhiên có tính kháng khuҭn và có giá trӏ GLQKGѭӥng rҩt cao Các sҧn phҭm cӫDRQJÿѭӧc sӱ dөng làm nguӗn nguyên liӋu cho các ngành công nghiӋp thӵc phҭm, mӻ phҭPYjGѭӧc phҭm ChҩWOѭӧng sҧn phҭm tҥo ra tӯ ong mұW QKѭ Pұt ong, sáp ong, keo ong, phҩn hoa và sӳD RQJ FK~D ÿDQJ ÿѭӧc nâng cao vӅ mһc chҩWOѭӧng và sҧQOѭӧng, góp phҫn phát triӇn kinh tӃ NghӅ nuôi ong mұt không nhӳng mang lҥi hiӋu quҧ kinh tӃ cao, mà còn góp phҫn vào viӋc duy trì cân bҵng hӋ sinh thái, bҧo vӋ P{LWUѭӡQJÿHPOҥi lӧi ích cho cây trӗng Ngoài ra, ong mұt còn là loài thө phҩn chính và rҩt quan trӑQJÿӕi vӟi nhiӅu loҥi cây nông nghiӋp ӣ châu Âu và bҧo tӗQÿDGҥng sinh hӑc thӵc vұt trong tӵ nhiên, ѭӟc tính khoҧng 35% tәQJOѭӧng tiêu thө thӵc phҭm cӫDFRQQJѭӡi phө thuӝc trӵc tiӃp hoһc gián tiӃp vào sӵ thө phҩn trung gian nhӡ côn trùng [2] NghӅ nuôi RQJÿmFKX\Ӈn dҫn tӯ hình thӭFFKăQQX{LWӵ phát, nhӓ lҿ sang hình thӭc nuôi tұp trung vӟi quy mô lӟn Vì vұy, yêu cҫu vӅ kӻ thuұt nuôi trӗng và chҩWOѭӧng sҧn phҭm phҧLÿѭӧc nâng cao

ĈӃQQăP9LӋt Nam nҵm trong 15 quӕc gia có sҧQOѭӧng mұt ong xuҩt khҭu lӟn nhҩt trên toàn thӃ giӟi vӟi giá trӏ 57,4 triӋu USD, chiӃm 2,9% trên tәng sҧQOѭӧng mұt ong xuҩt khҭu cӫa thӃ giӟLQăPJLҧm 12,8% so vӟLQăP[3] Nguyên nhân chính dүQÿӃn sҧQOѭӧng sөc giҧPOjGRQJѭӡi nông dân sӱ dөng NKiQJVLQKWURQJÿLӅu trӏ bӋnh cho ong mұt dүQÿӃn vҩQÿӅ GѭOѭӧng kháng sinh trong sҧn phҭm ong mұt làm sҧn phҭPNK{QJÿҥt yêu cҫu khҳc khe chҩWOѭӧng và vӅ mһWDQWRjQÿӇ xuҩt khҭu sang thӏ WUѭӡng quӕc tӃ [4]

Tӯ thӵc trҥng trên, hiӋQ QD\ Kѭӟng mӟL ÿӇ ÿLӅu trӏ bӋnh cho ong là sӱ dөng chӃ phҭm probiotic thay cho kháng sinh, sӁ mang lҥi nhiӅu lӧi ích thӵc tiӉn

Trang 15

nKѭJLҧPGѭOѭӧng kháng sinh trong sҧn phҭm, hӛ trӧ WLrXKyDFKRRQJJL~SWăQJhӋ miӉn dӏch, bҧo vӋ P{LWUѭӡng, và mang lҥi nhiӅu lӧi ích kinh tӃ khác HӋ vi khuҭn probiotic tӗn tҥi trong hӋ tiêu hóa cӫa ong mұt là Fructophilic Lactic Acid (FLAB) chính là nguӗn vi sinh có lӧi rҩt phù hӧp vӟLFKtQKFѫWKӇ ong mұWÿӗng thӡi chúng có khҧ QăQJNKiQJPҥnh vӟi vi khuҭn gây bӋnh thӕi ҩu trùng ong [5] [6] HiӋn tҥi, FLAB vүQFKѭDÿѭӧc nghiên cӭu sâu vӅ ÿһFWtQKSURELRWLFÿӇ làm

tiӅQ ÿӅ xây dӵng chӃ phҭm probiotic cho ong Vì vұ\ ÿӅ tài luұQ YăQ ³GÓP

PHҪN XÂY DӴNG BӜ 6Ѭ87ҰP GIӔNG VI KHUҬN FRUCTOPHILIC LACTIC ACID (FLAB) PHÂN LҰP TӮ Hӊ TIÊU HOÁ ONG MҰT VÀ THӰ NGHIӊM TҤO CHӂ PHҬM´ÿѭӧc thӵc hiӋn vӟi mөFWLrXEѭӟFÿҫu xây

dӵng quy trình sҧn xuҩt chӃ phҭm probiotic cho ong mұt tiӃQ ÿӃn thay thӃ dҫn thuӕFNKiQJVLQKÿLӅu trӏ bӋnh trên ong

Nӝi dung nghiên cӭu:

- Phân lұp và sàng lӑc vi khuҭn FLAB trong hӋ tiêu hóa cӫa ong mұt

- Sàng lӑc các chӫng FLAB có khҧ QăQJNKiQJYLNKXҭn gây bӋnh trên ong

mұt: Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae, Paenibacillus alvei

- TuyӇn chӑn các chӫng FLAB có hoҥt tính probiotic bao gӗm khҧ QăQJFKӏu pH thҩp, khҧ QăQJWӵ bám dính, kháng kháng sinh, và khҧ QăQJFKӏu nhiӋt - Ĉӏnh danh các chӫQJÿmWX\Ӈn chӑn

- Phân tích yӃu tӕ có khҧ QăQJ NKiQJ YL NKXҭn gây bӋnh trên ong mұt cӫa các chӫng tuyӇn chӑn

- 7KăPGzWҥo chӃ phҭm probiotic cho ong mұt

Trang 16

&+ѬѪ1*7ӘNG QUAN TÀI LIӊU 1.1 Tình hình bӋQKYjÿLӅu trӏ bӋnh trên ong mұt

1.1.1 Các loҥi bӋnh phә biӃn

HiӋn nay do nhu cҫu vӅ nguyên liӋu và sҧn phҭm tӯ ong mұt ngày càng

WăQJQJRjLRQJQӝLÿӏa A cerana thì các giӕng ong mұWFKkXÆXÿѭӧc nhұp vӅ và

ÿѭӧc nuôi vӟi quy mô lӟn ViӋFWăQJTX\P{QX{LRQJPұt kéo theo tình hình dӏch bӋQKWăQJYjNKyNLӇPVRiWKѫQWKD\YuNҿ WKWUѭӟFÿk\Fӫa ong mұt là các loài sâu bӋQKÿӏch hҥLQKѭRQJEzYӁ, kiӃn, chim, sâu ăQViSWKuEk\JLӡ còn có sӵ tҩn công cӫa nhiӅu bӋQKQKѭEӋnh ҩu trùng túi, thӕi ҩu trùng châu Âu, bӋnh thӕi ҩu trùng châu Mӻ, bӋnh Ӎa chҧ\1RVHPD«+ҫu hӃt các bӋQKÿѭӧc gây ra bӣi tác nhân chính là vi sinh vұt, chúng lây lan nhanh chóng và khó kiӇm soát nӃu không phát hiӋn kӏp thӡi

Bҧng 1 Các loҥi bӋnh phә biӃn ӣ ong mұt

STT 7rQEӋQK 7iFQKkQFKtQKJk\EӋQK

1 7KӕLҩXWUQJFKkXÆX

(European foulbrood) /LrQFҫXNKXҭQMelissococcus pluton

2 7KӕLҩXWUQJFKkX0ӻ

(American foulbrood) 9LNKXҭQPaenibacillus larvae

3 7KӕLҩXWUQJW~L6DFEURRG Vi rút Morator aetatulae Holmes

4 %ӋQKӍDFKҧ\1RVHPD 1JX\rQVLQKÿӝQJYұWNosema apis

1.1.2 BӋnh thӕi ҩu trùng châu Âu (European foulbrood)

1ăPWiFJLҧ :KLWHÿmSKiWKLӋn bӋnh thӕi ҩXWUQJFKkXÆXÿҫu tiên

ӣ châu Âu do liên cҫu khuҭn Melissococcus pluton gây ra Ӣ Qѭӟc ta hiӋn nay,

bӋnh ҩu trùng châu Âu gây thiӋt hҥi rҩt lӟn cho nghӅ QX{L RQJ QăQJ VXҩt mұt

giҧm tӯ 20 ± 80% Melissococcus pluton FǊQJ ÿѭӧF [iF ÿӏnh là nguyên nhân

chính gây ra bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong mұt theo nhiӅu nghiên cӭu cӫa các tác giҧ QKѭ WiF JLҧ Bailey (1981), và Peters (2006) [7] [8] 1Jѭӡi ta còn gӑi bӋnh

Trang 17

thӕi ҩu trùng châu Âu là bӋnh thӕi ҩu trùng mӣ nҳp, thӕi ҩu trùng chua, thӕi ҩu trùng dҩm hay thӕi ҩu trung tuәi nhӓ vì bӋQKWKѭӡng gây chӃt ҩu trùng ӣ ÿӝ tuәi

tӯ 3 ± 4 ngày Paenibacillus alvei, Streptococcus apis, Enterococcus faecalis,

Achromobacter euridice là các vi khuҭn thӭ SKiW WKѭӡng xuyên xuҩt hiӋn trong

bӋnh thӕi ҩu trùng châu Âu Khi có P alvei cùng gây bӋnh, ҩu trùng chӃt ӣ tuәi

lӟQKѫQWKѭӡng là 4 ± 5 ngày tuәLÿ{LNKLFKӃt cҧ ҩu trùng bҳWÿҫu vít nҳp và có mùi thӏt thӕi [9]

Hình 1 +uQKҧQKÿҥLWKӇYjYLWKӇFӫDM pluton WUrQP{LWUѭӡQJ%DVDO[10]

BӋnh lây tӯ vùng này sang vùng khác, tӯ ÿjQRQJQj\VDQJÿjQRQJNKiFdo ong di chuyӇQRQJÿLQKҫm tә hoһFGRRQJăQFѭӟp mұt ӣ ÿjQEӋnh Vì vұy bӋnh rҩt khó kiӇm soát và lây lan nhanh

Hình 2 TriӋu chӭng bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong mұt [11]

x TriӋu chӭng ҩu trùng bӏ bӋnh:

Khi bӏ bӋnh nhҽ thҩy ҩXWUQJNK{WKD\ÿәLWѭWKӃ nҵm tӯ cong ӣ WѭWKӃ bình WKѭӡng thì ҩX WUQJ ÿRjQ Uӝng ra, mҩt màu bóng BӋnh dүQ ÿӃn sӕ Oѭӧng ong giҧm ÿLQӃu không dӑn sҥFKÿѭӧc các ҩu trùng bӋnh, sӁ dүQÿӃn bӋnh lây nhiӉm

Trang 18

nһQJ KѫQ &iF ҩu trùng mӟi chӃt có màu trҳng bӋch, sau ngҧ thành màu vàng nhҥt, vàng sүm rӗLQkXÿұm, xác chӃt thӕi rӳa tөt xuӕQJÿi\Oӛ tә YjNK{ÿLWҥo mӝt cái vҧy cӭng màu nâu Ҩu trùng mӟi chӃt không có mùi, sau có mùi chua QKѭJLҩm [9]

x TriӋu chӭng trên bánh tә:

7Uѭӡng hӧp bӏ bӋnh nhҽ, ӣ khu vӵc nhӝng vít nҳp nhiӅu, có lӛ chӛ vài lӛ tә không vít nҳp mà có ҩu trùng hoһc trӭQJ GR {QJ FK~D ÿm ÿҿ lҥi khi ong thӧ ÿmdӑn ҩu trùng bӋQKÿL.KLÿjQRQJEӏ bӋnh nһng, ít có hoһc không có nhӝng vít nҳSSKtDGѭӟi bánh tә ong thӧ FyPjXÿHQEyQg do ҩu trùng bӏ chӃt

1.1.3 BӋnh thӕi ҩu trùng châu Mӻ (American foulbrood)

BӋnh thӕi ҩu trùng châu Mӻ là mӝt bӋnh truyӅn nhiӉm hay còn gӑi là bӋnh

thӕi ҩu trùng ác tính, do vi khuҭn Paenibacillus larvae gây ra chӫ yӃu cho ҩu trùng ong mұt tӯ 5 ± 6 ngày tuәi P larvae là mӝt vi khuҭQ *UDP GѭѫQJ KuQK

que và dҥng bào tӱ Nӝi bào tӱ tӗn tҥi rҩW OkX Yj WKѭӡng nhiӉm ҩX WUQJ Fy ÿӝ tuәLGѭӟi 30 giӡ VӟLQ{QJÿӝ vi khuҭn rҩt thҩp, khoҧng 10 bào tӱ tӗn tҥi trong ÿѭӡQJWLrXKyDOjÿӫ ÿӇ lây nhiӉm và gây tӱ vong ӣ ҩu trùng ong

x TriӋu chӭng bӋnh:

Khi bӏ bӋnh, các bào tӱ P larvae nҧy mҫm, bҳWÿҫXWăQJVLQKSKiYӥ biӇu

mô và xâm nhұp vào huyӃt cҫu cӫa ҩu trùng ong Lúc này, các ҩu trùng màu sáng chuyӇQKѫLÿөc, không còn nӃSQKăQEӅ mһt da tӯ trҳng xám chuyӇn nâu xám rӗi nâu sүm, khӕi sinh chҩt trong ҩXWUQJGtQKQKѭKӗ Khi ҩu trùng chӃWWѭWKӃ nҵm dӑc theo chiӅu sâu cӫa lӛ, dùng panh gҳp ҩu trùng thì khӕi sinh chҩt kéo dài thành sӧi

Trang 19

Hình 3 Nhӝng khӓe (trái) và nhӝng bӏ bӋnh (phҧi) cùng tuәi [12]

Hình 4 Ҩu trùng và tә ong bӏ nhiӉm bӋnh thӕi ҩu trùng châu Mӻ [12] 1.1.4 ĈLӅu trӏ bӋnh trên ong mұt

HiӋn nay, tình trҥng sӱ dөng hóa chҩt, thuӕc trӯ sâu, côn trùng và mҫm bӋQKÿmOjPTXҫn thӇ ong mұt hoang dã và ong nuôi bӏ thiӋt hҥi nһng nӅ [13] Sӱ dөng hóa chҩW ÿӇ trӏ bӋnh cho ong có thӇ QJăQ FKһn mҫm bӋnh ӣ quy mô nhӓ QKѭQJÿӕi vӟi bӋnh quy mô lӟn và lây lan nhanh thì không thӇ loҥi bӓ ÿѭӧc mҫm bӋQKĈһc biӋt, bӋnh thӕi ҩu trùng do vi sinh vұWJk\UDÿmJk\FKӃt hàng loҥt ong mұt ӣ châu Âu và châu Mӻ dүQ ÿӃn tәn thҩt nghiêm trӑQJ ÿӃn nӅn kinh tӃ cӫa nhiӅX QѭӟF 7tQK ÿӃQ QăP EӋQK ÿѭӧc phát hiӋQ KѫQ QăP QKѭQJnhӳQJÿҩWQѭӟc tiên tiӃQQKѭ0ӻ YjFiFQѭӟc châu Âu chӍ sӱ dөQJNKiQJVLQKÿӇ ÿLӅu trӏ bӋnh mà không thay thӃ bҵQJFiFSKѭѫQJSKiSNKiFĈLӅu trӏ bҵng kháng sinh gây ra nhiӅu hӋ quҧ QKѭ

x 7iFÿӝng trӵc tiӃSÿӃn quҫn thӇ ong: gây chӃt vi sinh vұt có lӧi trong hӋ tiêu hóa cӫa ong làm giҧm hӋ miӉn dӏch, xuҩt hiӋn các chӫng kháng kháng sinh dүQÿӃn viӋFÿLӅu trӏ trӣ QrQNKyNKăQKѫQ

Trang 20

x 7iF ÿӝng gián tiӃS ÿӃn sӭc khӓe cӫD QJѭӡi sӱ dөng: sҧn phҭP FzQ GѭOѭӧQJNKiQJVLQKWKD\ÿәi thành phҫn trong sҧn phҭm dүQÿӃn nhӳng tác dөng không mong muӕQOrQQJѭӡi sӱ dөng

x Gây thiӋt hҥi nghiêm trӑng vӅ mһc kinh tӃ vì các sҧn phҭm WURQJQѭӟc và xuҩt khҭu yêu cҫu các tiêu chuҭQDQWRjQGѭOѭӧQJNKiQJVLQKÿmFҧn trӣ sҧn phҭPÿѭӧFOѭXWK{QJWUrQWKӏ WUѭӡQJWURQJYjQJRjLQѭӟc khi sӱ dөng kháng sinh

ĈӃn thӡL ÿLӇP Qj\ Qѭӟc ta vүQ FKѭD Fy WKXӕF ÿһc trӏ bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong Các nhà nuôi ong sӱ dөQJFiFKÿӇ phòng trӯ bӋnh thӕi ҩu trùng là cho RQJăQVLURÿѭӡng có bә sung kháng sinh hoһc phun trӵc tiӃp kháng sinh lên tә, SKXQOrQFѫWKӇ con ong cӫDÿjQEӏ bӋnh Khi sӱ dөng kháng sinh phun trӵc tiӃp lên tә ong, mӝW Oѭӧng nhӓ thҩm vào ong, tuy mang lҥi hiӋu qua nhanh chóng, QKѭQJSKҫn lӟn kháng sinh còn lҥi sӁ tӗQÿӑng trong sҧn phҭm cӫa ong gây ҧnh KѭӣQJ ÿӃn sӭc khӓe cӫD QJѭӡi sӱ dөQJ 1ăP &KkX ÆX TX\ӃW ÿӏnh cҩm nhұp khҭu mұt ong ViӋW1DPGRGѭOѭѫQJNKiQJVLQKOӟQKѫQFKRShép là 20 mg kháng sinh/tҩn mұt ong ViӋc sӱ dөQJNKiQJVLQKWURQJÿLӅu trӏ dүQÿӃn nhiӅu hӋ quҧ ҧQKKѭӣQJQJѭӡi sӱ dөng và giҧm hiӋu quҧ kinh tӃ

Tͳ nhͷng v̭Qÿ͉ QrXWUrQÿ͓QKK˱ͣng s͵ dͭng vi sinh v̵t có lͫi ph͙i hͫp kháng sinh và d̯n thay th͇ hoàn toàn NKiQJVLQKWURQJÿL͉u tr͓ b͏nh trên ong trͧ thành m͡WK˱ͣng nghiên cͱu mͣi và thi͇t th͹c ͧ nhi͉XQ˱ͣc Các vi khu̱n có lͫi ÿ˱ͫc phân tích tͳ nhi͉u nghiên cͱX WU˱ͣF QK˱ )/$% FK~QJ PDQJ QKL͉u ti͉m QăQJÿ͋ s̫n xṷt probiotic cho ong m̵WWURQJW˱˯QJODL

1.2 Các vi sinh vұt gây bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong mұt

1.2.1 Melissococcus pluton

Melissococcus pluton là mӝt liên cҫu khuҭn gây bӋnh thӕi ҩu trùng Châu

ÆXJUDPGѭѫQJKuQKFҫXFy NtFKWKѭӟc 0,7 ± 1,5µm, phát triӇn tӕt trong môi WUѭӡng có pH 6,6, yӃPNKtKDLÿҫu kéo GjLWKjQKPǊLJLiRWKѭӡQJÿӭng thành cһSÿ{LNKLÿӭng riêng lҿ Khҧ QăQJWӗn tҥi cӫa vi khuҭn này khá cao, tӗn tҥi 17 tháng ӣ nhiӋWÿӝ WKѭӡng, 12 tháng trong bánh tә YjSKѫLQҳng liên tөc trong 3 giӡ mӟi có thӇ tiêu diӋW ÿѭӧc Vi khuҭn xâm nhұp vào ong thông qua thӭF ăQ Yjchúng tӗn tҥi trong dҥ dày ong mұt [9]

Trang 21

M pluton là tác nhân chính gây bӋnh thӕi ҩu trùng châu Âu, chúng xâm

nhiӉm vào vұt chӫ thông qua hӋ tiêu hóa và mӭFÿӝ lây nhiӉm cao

Hình 5 TӃ bào vi khuҭn Melissococcus pluton [11] 1.2.2 Paenibacillus larvae

Paenibacillus larvae gây bӋnh thӕi ҩu trùng châu Mӻ, hình que có chiӅu

rӝng khoҧng 1µm, chiӅu dài khoҧng 3 - PJUDPGѭѫQJKuQKWKjQKEjRWӱ Vi khuҭn tӗn tҥLGѭӟi dҥng các tӃ EjRÿѫQKRһc cһSYjÿ{LNKLOjFKXӛi ngҳn, phҧn ӭng âm tính vӟLFDWDODVHWăQJWUѭӣng ӣ 30 ± 37°C [14] Các bào tӱ vi khuҭn nҧy mҫm và lây nhiӉm trên ҩu trùng ong non qua nguӗn thӭFăQEӏ nhiӉm vi khuҭn Các bào tӱ vi khuҭn nҧy mҫP Yj WăQJ VLQK WURQJ OzQJ Gҥ dày giӳD WUѭӟc khi chúng bҳWÿҫu xâm phҥm biӇu mô

Hình 6 TӃ bào vi khuҭn Paenibacillus larvae [15]

Khi vi sinh vұt gây bӋQK FKR FiF ÿjQ RQJ Pұt, cách tӕt nhҩW ÿӇ chӳa và phòng bӋnh là tiêu hӫ\ÿjQRQJKRһc QJѭӡi nuôi ong sӱ dөng kháng sinh vì tӕc

Trang 22

ÿӝ lây lan nhanh, khó kiӇm soát nӃu không phát hiӋn và phòng trӯ kӏp thӡi Cho nên, các bӋnh do vi sinh vұWWKѭӡng gây thiӋt hҥi rҩt lӟQÿӃn hiӋu quҧ kinh tӃ cӫa ngành nuôi ong

1.3 HӋ vi sinh vұt trong hӋ tiêu hóa ong mұt 1.3.1 HӋ tiêu hóa ong mұt

Ong mұt thuӝFQKyPF{QWUQJGLQKGѭӥQJFKX\rQKyDFѫTXDQWLrXKyDcӫa chúng bao gӗm: miӋng, hҫu, thӵc quҧn, diӅu, ruӝW WUѭӟc, ruӝt giӳa và ruӝt sau Phҫn diӅu cӫDRQJOjQѫLGӵ trӳ tҥm thӡi mұt hoa vұn chuyӇn vӅ tә và có thӇ chӭDÿѭӧc 0,7 gam mұt [9] Ruӝt giӳDOjQѫLUҩt quan trӑng, mӑi quá trình tiêu hoá và hҩp thu chҩWGLQKGѭӥQJÿӅu diӉn ra ӣ ÿk\7KӭFăQÿѭӧFÿѭDYjRFѫWKӇ qua miӋng, quá trình tiêu hoá hҩp thu xҧy ra ӣ ruӝt

Hình 7 HӋ tiêu hóa cӫa ong mұt [16]

Ĉӝ pH cӫa diӅXFyWtQKD[LWFDRQKѭQJFǊQJWKD\ÿәLWKHRÿӝ pH cӫa các thӵc phҭP Pj RQJ ăQ YjR 7LӅn dҥ dày có cҩu trúc van mӝt chiӅX Oj QѫL Yұn chuyӇn chӫ ÿӝng các hҥt phҩQKRDWURQJNKLÿyVӁ giӳ lҥi hҫu hӃt các chҩt lӓng Qѭӟc, mұt hoa và sӳDRQJFK~D Yjÿҧm bҧo rҵng diӅu không bӏ nhiӉm enzyme và vi khuҭn tӯ ruӝt giӳa [17] Enzyme tiêu hóa cӫa ruӝt giӳa hoҥWÿӝng trên mӝt phҥm vi pH và tӕLѭXӣ pH 8 Ruӝt ljQѫLWѭѫQJÿӕi giàu chҩWGLQKGѭӥng vӟi hӋ vi sinh vұWFѭWU~7KHRTX\WUuQKGLFKX\Ӈn cӫa thӭFăQVDXUXӝt giӳa, giá trӏ pH giҧP GR KjP OѭӧQJ D[LW XULF WăQJ NKL ӕng malpighian loҥi bӓ chҩt thҧL QLWѫ Wӯ máu [17]

Trang 23

1.3.2 HӋ vi sinh vұt trong hӋ tiêu hóa ong mұt

HӋ vi sinh vұt trong hӋ tiêu hóa ong mұt rҩWÿDGҥng và phө thuӝFYjRÿӝ tuәi, nguӗn thӭFăQYjQѫLVӕng NhiӅu nghiên cӭu sӵ ÿDGҥng vi khuҭQÿѭӡng ruӝt cӫa ong cho thҩy các chӫng chӫ yӃu là vi khuҭn sӕng tӕW WURQJ ÿLӅu kiӋn hiӃu khí hoһc nӗQJÿӝ CO2 tӯ 5 ± 10%, vi khuҭn kӷ khí rҩt hiӃm xuҩt hiӋn Các nhóm vi khuҭn sӕng trong hӋ tiêu hóa cӫa ong bao gӗm các chӫng thuӝc nhóm

enterobacteriaceae, bacillus spp, lactobacillus, vi khuҭn gram bҩW ÿӏnh, nҩm

men và nҩm mӕc [5] [18] Không phҧi tҩt cҧ FiFFRQRQJÿӅu chӭa hӋ vi sinh vұt giӕng nhau, và sӕ Oѭӧng cӫa chúng trong hӋ tiêu hóa cӫDRQJWKD\ÿәi tӯ ÿjQQj\VDQJÿjQNKiFKRһc tӯ mùa này sang mùa khác

HӋ vi khuҭn lactic (LAB): NhiӅu nghiên cӭu cho thҩy, nhóm vi khuҭn

này bao gӗm các vi khuҭn kӷ khí và vi khuҭQѭDQѭӟc, liên kӃt chһt chӁ vӟi các tӃ bào biӇu mô ruӝt và tham gia vào mӝt sӕ chӭF QăQJ Fӫa vұt chӫ, có vai trò WK~Fÿҭy các thành phҫn cӫa cӝnJÿӗng vi khuҭQÿѭӡng ruӝWWUѭӣng thành Khi tác giҧ Mardan (2010) tiӃn hành phân lұp các vi khuҭn lactic trong hӋ tiêu hóa

ong mұt, chӫng Lactobacillus chiӃP KѫQ WURQJ Wәng sӕ vi khuҭn phân lұp ÿѭӧc Các chӫng phә biӃn cӫa LAB là Lactobacillus mellis, Lactobacillus

mellifer, Lactobacillus helsingborgensis, Lactobacillus kullabergensis, Lactobacillus melliventris và Lactobacillus kimbladii Chúng có khҧ QăQJNKiQJ

khuҭn bҵng cách tәng hӧp các hӧp chҩt có hoҥt tính kháng khuҭQ QKѭbacteriocin, acid lactic, acid béo mҥch ngҳn [13] Trong nhóm LAB, nәi bұt là chӫng vi khuҭn FLAB vӟLÿһFÿLӇm kháng khuҭQYjÿһc biӋt thích nghi vӟi môi WUѭӡQJJLjXIUXFWRVHQKѭWURQJKӋ tiêu hóa cӫa ong mұt

Nhóm vi khuҭn hӑ Enterobacteriaceae: Vi khuҭQJUDPkPWKѭӡng thҩy

ӣ ong mұt bao gӗm Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, và Klebsiella

pneumoniae Enterobacteriaceae WKѭӡQJ ÿѭӧc phân lұp nhiӅu nhҩt trong ruӝt

cӫa ong thӧ ít nhҩt 14 ngày tuәi hoһc trong ruӝt cӫa ong chúa

HӋ vi khuҭn gram bҩWÿӏnh: Là nhóm vi khuҭn có biӇu hiӋn khác nhau

khi nhuӝm gram, dҥng que hoһc hình cҫu, xuҩt hiӋn phә biӃn nhҩt ӣ ong thӧ WUѭӣQJ WKjQK Yj RQJ FK~D &iF FKL ÿѭӧF [iF ÿӏQK WURQJ QKyP Qj\ QKѭ

Lactobacillus, Corynebacterium và BifidobacteriumFK~QJÿmÿѭӧc phân lұp tӯ

Trang 24

nhiӅu nguӗQ NKiF QKDX QKѭ ҩu trùng ong mұt, phân ong, bánh ong hoһc phҩn hoa

Nҩm mӕc: Các loҥi nҩm mӕF ÿѭӧc tìm thҩy nhiӅu nhҩt trong ong mұt

thuӝc các chi Penicillium và Aspergillus Các loài nҩm mӕF ÿѭӧF [iF ÿӏnh WKѭӡng là P frequentans, P cyclopium, A flavus, A niger hoһc Các loҥi nҩm mӕF ÿѭӧc phân lұp tӯ ruӝt cӫa ong thӧ QKѭ Cladosporium cladosporioides và

Alternaria tenuissima Nҩm mӕc xuҩt hiӋn phә biӃQ KѫQ ӣ ong thӧ vào nhӳng

WKiQJPDWKXYjPDÿ{QJ7X\QKLrQSKkQFӫa 50% ҩu trùng thӧ có chӭa nҩm mӕFYjRWKiQJQKѭQJFKӍ 25% có nҩm mӕc vào tháng 9 (n = 20) [12] Hҫu hӃt

các loҥi nҩm mӕc tӯ phân ҩu trùng ong là Penicillia YjFǊQJÿѭӧc tìm thҩy ӣ ong

thӧ

Nҩm men: NҩPÿѭӡng ruӝWWKѭӡng gһp nhҩt ӣ ong thӧ tӯ FiFÿjQEӏ nhӕt

trong chuӗng, bӏ bӋQK FKR ăQ WKLӃu chҩW FKR ăQ NKiQJ VLQK KRһc tiӃp xúc vӟi thuӕc trӯ sâu [18] 'R ÿy FK~QJ GѭӡQJ QKѭ Oj Gҩu hiӋu cӫa tình trҥQJ FăQJthҷng ӣ ong mұt ӣ $UL]RQD&K~QJFǊQJSKә biӃQKѫQӣ ong vào mùa xuân Các

loài ÿѭӧc phân lұS WKѭӡng xuyên nhҩt là Torulopsis magnoliae, Torulopsis

glabrata, Candida parapsilosis, và Hansenula anomola Nҩm men rҩt hiӃm ӣ

ÿjQEӕ mҽ khӓe mҥnh, và chӍ mӝt trong sӕ 110 con ong chúa có chӭa mӝt loҥi nҩm men [9]

Vi khuҭQÿѭӡng ruӝt kích thích khҧ QăQJPLӉn dӏch cӫa ҩu trùng ong mұt JLDLÿRҥn dӉ bӏ nhiӉm bӋnh nhҩWWURQJYzQJÿӡi cӫa ong mұt YjWK~Fÿҭy các phҧn ӭng miӉn dӏch chӕng mҫm bӋQK WURQJ FѫWKӇ ong nhӡ vào khҧ QăQJNtFKWKtFKSKLrQ Pm FiFJHQOLrQTXDQÿӃn phҧn ӭng miӉn dӏch HӋ vi khuҭn lactic ÿѭӡng ruӝt sҧn xuҩt acid hӳX Fѫ Kӧp chҩt kháng khuҭn, hydrogen peroxide, diacetyl, benzoate, bacteriocin và protein có chӭFQăQJNKiQJNKXҭn [19]

1.4 Vi khuҭn Fructophilic Lactic Acid (FLAB) 1.4.1 ĈһFÿLӇm chung

Vi khuҭn Fructophilic Lactic Acid (FLAB) là mӝt nhóm thuӝc hӑ vi khuҭn lactic dӏ GѭӥQJ ÿѭӧc xem là vi khuҭQ /$% ³NK{QJ WK{QJ WKѭӡQJ´ GRFK~QJѭXWLrQVӱ dөQJIUXFWRVHWKD\YuJOXFRVH'Rÿy)/$%WăQJWUѭӣng mҥnh WURQJ P{L WUѭӡQJ JLjX IUXFWRVH Yj WăQJ WUѭӣng kém trên môL WUѭӡng glucose

Trang 25

không giӕQJQKѭFiF/$%NKiFĈһFÿLӇPWăQJWUѭӣng cӫa FLAB khác biӋt so vӟi LAB là do có chӭD ÿRҥn gen không hoàn chӍQK Pm KyD Uѭӧu acetaldehyde dehydrogenase (adhE) dүQÿӃn mҩt cân bҵng NAD/NADH và cҫn bә sung chҩt nhұQÿLӋn tӱ QKѭS\UXYate, oxy, hoһFIUXFWRVHÿӇ chuyӇn hóa glucose FLAB có ít gen chuyӇQ KyD FDUERK\GUDWH KѫQ ÿiQJ NӇ so vӟL FiF /$% NKiF ÿһc biӋt là thiӃu hӋ thӕng vұn chuyӇn hòa chӍnh phosphatransferase (PTS) [20]

)/$% ÿѭӧc phân lұp tӯ FiF P{LWUѭӡQJJLjXIUXFWRVH QKѭ KRD TXҧ, trái cây lên men và ruӝWF{QWUQJăQWKӵc vұt giàu fructose Các FLAB phân lұp tӯ F{QWUQJFyWiFÿӝQJÿӃn sӭc khӓe vұt chӫ Yjÿѭӧc coi là vector thích hӧp cho vi sinh vұt ký sinh trên ong mұt Nhóm FLAB bҳt buӝc phát triӇn tӕt trên IUXFWRVHQKѭQJNpPWUrQJOXFRVe Tuy nhiên, sӵ phát triӇQWUrQJOXFRVHÿѭӧc kích WKtFKNKLP{LWUѭӡQJÿѭӧc bә sung pyruvate hoһc fructose hoһc khi ӫ WURQJÿLӅu kiӋn hiӃu khí Các chӫng trong nhóm này tҥo khuҭn lҥFFyÿѭӡQJNtQKÿӃn 0,2 mm sau hai ngày ӫ WURQJP{LWUѭӡng có glucose là nguӗn cacbon duy nhҩt và ÿѭӧc ӫ WURQJÿLӅu kiӋn kӷ NKt.tFKWKѭӟc khuҭn lҥFWăQJOrQWӯ ÿӃn 2 mm khi ÿѭӧc ӫ WURQJP{LWUѭӡng có glucose vӟLÿLӅu kiӋn hiӃu khí [20]

FLAB là nhóm vi khuҭn kӷ NKtW\ê*UDPGѭѫQJNK{QJVLQKEjRWӱ và tӃ bào có dҥng hình que hoһc hình cҫu, tӗn tҥLÿѫQOҿ hoһc thành cһp Mӝt sӕ loài

)/$%ÿһc biӋt là L kunkeei và L fructosus là thành phҫn vi sinh vұt trong hӋ

tiêu hóa cӫa ong mұt và chiӃm tӍ lӋ chính trong hӋ vi sinh vұt tiêu hóa FLAB tҥo ra khí CO2 tӯ quá trình lên men glucos cùng vӟi mӝW Oѭӧng lӟn acid lactic và DFLGDFHWLFYjOѭӧng nhӓ ethanol [21] DӵDWUrQÿһFÿLӇPWăQJWUѭӣng cӫa chúng, )/$% ÿѭӧc chia thành 2 nhóm: nhóm vi khuҭn tiêu thө fructose bҳt buӝc và nhóm vi khuҭn tiêu thө fructose tùy ý Các loài thuӝF FKL )UXFWREDFLOOXV FǊQJ

QKѭLactobacillus kunkeei ÿѭӧc coi là nhóm vi khuҭn fructose bҳt bӝc

FLAB có vai trò tích cӵF ÿӕi vӟi sӭc khӓe cӫa ong mұt, là mӝt trong nhӳng FѫFKӃ bҧo vӋ chính cӫa ong mұt chóng lҥi mҫm bӋnh Các tác dөng cө thӇ cӫa FLAB vӟi ong mұt do có liên kӃt chһt chӁ vӟi khoang GIT

Trang 26

Bҧng 2 ĈһFÿLӇm hình thái cӫa mӝt sӕ vi khuҭn FLAB [20]

&KӫQJ 0{LWUѭӡQJQKұQELӃW

Hình thái NKXҭQOҥF

Kích tKѭӟFNKXҭQOҥF

(mm)

7UҥQJWKiL WӃEjR

L kunkeei MRS

0ӡYjPһWO}P0ӝWVӕFKӫQJWӯUѭӧXFyPjXWUҳQJYjEӅPһWQKҹQ

~ 1 ± 2 FһSKRһFWKjQKFKXӛL

L florum FYG %ӅPһWQKүQPjX

xám tro ~ 1 ± 2

ĈѫQOҿWKjQKFһSKRһFFKXӛL

L apinorum MRS

Tròn, màu WUҳQJEӅPһWQKҹQKRһFcó gân

~ 3 ± 4 ĈѫQOҿKRһFWKjQKFһS

F fructosus MRS, FYG 7UzQPjXWUҳQJ[iPEӅPһWQKүQ

~ 0,1 ± 0,2 trên môi WUѭӡQJ\ӃPkhí

~ 1 ± 2 trên P{LWUѭӡQJKLӃXNKt

ĈѫQOҿKRһFWKjQKFһS

F ficulnes MRS, FYG /ӗLPjXWUҳQJ

[iPEӅPһWQKүQ < 1

ĈѫQOҿKRһFWKjQKFһS

F durionis APT, FYG 7UzQEӅPһWQKҹQ

PjXWUҳQJ < 1 ± 2

F pseudoficul

neus

MRS, FYG 7UzQEӅPһWQKүQYjOӗL

ĈѫQOҿthành FһSKRһFFKXӛL

Trang 27

F tropaeoli GYP 0jXWUҳQJEӅPһWQKҹQ

1.4.2 Các yӃu tӕ ҧQKKѭӣQJÿӃn sӵ VLQKWUѭӣng và phát triӇn cӫa FLAB NguӗQGLQKGѭӥng: Nguӗn Carbohydrat có vai trò cung cҩp carbon cung

cҩSQăQJOѭӧQJFKR)/$%WăQJWUѭӣng và phát triӇn phân chia tӃ bào, tҥo các hӧp chҩt hӛ trӧ phân chia tӃ bào hoһc tәng hӧp sҧn phҭm tәng hӧp hay sҧn phҭm bұc KDLWtFKOǊ\WURQJP{LWUѭӡng FLAB sӱ dөng nguӗn carbon chӫ yӃu tӯ fructose Fructobacillus sӱ dөng glucose khi có sӵ hiӋn diӋn cӫa các chҩt nhұQÿLӋn tӱ bên QJRjLQKѭVӵ hiӋn diӋn cӫDS\UXYDWHWURQJÿLӅu kiӋn hiӃu khí, sӱ dөng oxi QKѭPӝt chҩt nhұQÿLӋn tӱ [22] Ngoài nguӗn carbon, FLAB còn cҫn các yӃu tӕ GLQK GѭӥQJ NKiF QKѭ QLWR SKRVSKR Yj FiF NKRiQJ FKҩt khác (magie, natri,

mangan)

NhiӋWÿӝ: Ĉk\Oj\Ӄu tӕ WiFÿӝng trӵc tiӃp vào khҧ QăQJFKX\Ӈn hóa cӫa vi

sinh vұt Mӛi vi sinh vұt có khoҧng nhiӋWÿӝ WăQJWUѭӣng tӕLѭXQKҩWÿӏnh FLAB có thӇ VLQKWUѭӣng trong khoҧng nhiӋWÿӝ tӯ 15 ± 350C Tuy nhiên, mӝt sӕ FLAB

có thӇ VLQKWUѭӣng ӣ QKLrWÿӝ FDRKѫQQKѭL apinorum phát triӇn ӣ nhiӋWÿӝ lên

ÿӃn 500C [23]

pH: Tҩt cҧ các FLAB có thӇ VLQKWUѭӣng ӣ P{LWUѭӡng pH tӯ ÿӃn 7,0

Yjÿһc biӋt mӝt sӕ loài có khҧ QăQJSKiWWULӇQWURQJFiFP{LWUѭӡng có tính acid

QKѭL kunkeei phát triӇn ӣ pH 3,0, L florum pH 4,0 [20] [23]

Oxi: 7URQJ ÿLӅu kiӋn yӃm khí, tҩt cҧ các FLAB phát triӇn tӕt trên môi

WUѭӡQJFy IUXFWRVH KѫQVRYӟL P{L WUѭӡng chӭD JOXFRVH 1Jѭӧc lҥLWURQJÿLӅu

Trang 28

kiӋn hiӃX NKt Fy R[L GѭӡQJ QKѭ )/$% SKiW WULӇn tӕW KѫQ WUrQ P{L WUѭӡng có glucose [23] Khi ӫ WURQJ ÿLӅu kiӋn kӷ khí, các chӫng trong nhóm FLAB tҥo khuҭn lҥF Fy ÿѭӡQJ NtQK ÿӃQ PP VDX KDL QJj\ WUrQ P{L WUѭӡng có glucose là nguӗn cacbon duy nhҩt Tuy nhiên, khi ӫ WURQJÿLӅu kiӋn có oxi, kích WKѭӟc khuҭn lҥFWăQJOrQYjFyÿѭӡng kính tӯ ÿӃn 2 mm

1.4.3 Ĉһc tính probiotic cӫD)/$%ÿӇ tҥo chӃ phҭm probiotic cho ong mұt

Khҧ QăQJNKiQJYLVLQKYұt gây bӋnh thӕi ҩu trùng ӣ ong mұt, cө thӇ là ba

chӫng gây bӋnh Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae và Paenibacillus

alvei bҵQJ Fѫ FKӃ tәng hӧp các hoҥt chҩt kháng khuҭQ QKѭ DFLG KӳX Fѫ

bacteriocin, hydro peroxide

Ĉӗng thӡi, khҧ QăQJWӗn tҥi trong pH thҩp 3 ± 3,5 và bám dính vào biӇu mô cӫa hӋ tiêu hóa ong mұWOjÿLӅu kiӋn tiên quyӃt quan trӑng ÿӇ các chӫng vi khuҭn có lӧLWăQJVLQKWURQJÿѭӡng tiêu hóa, chӕng lҥi sӵ loҥi bӓ ngay lұp tӭc do WiFÿӝng cӫDQKXÿӝng ruӝt và mang lҥi lӧi thӃ cҥnh tranh vӏ trí bám, nguӗn thӭc ăQWURQJKӋ sinh thái vi sinh vұWÿѭӡng ruӝt vӟi các vi sinh vұt có hҥi, kích thích hӋ miӉn dӏch, kháng khuҭn chӕng lҥi vi khuҭn gây bӋnh [24]

Vi khuҭn có khҧ QăQJEiPGtQKYjRFiFWӃ bào biӇu mô ruӝWOLrQTXDQÿӃn các hoҥt tính bӅ mһt bao gӗm khҧ QăQJWӵ bám dính và tính kӷ Qѭӟc cӫa tӃ bào vi khuҭn Tính chҩt bám dính có thӇ là do sӵ WѭѫQJWiFYұt lý giӳa các tӃ bào tích ÿLӋQGѭѫQJYjÿLӋn tích âm giӳa các thành phҫn kӷ QѭӟFYjѭDQѭӟc cӫa tӃ bào vi khuҭQ ĈӇ kiӇm tra tính kӷ Qѭӟc cӫa bӅ mһt tӃ bào vi khuҭn, các tác giҧ ,RUL]]R .RV ÿmVӱ dөQJSKѭѫQJSKiS%$7+%DFWHULDODELOLW\WR$GKHUHWR+\GURFDUERQV ÿӇ ÿiQKJLiNKҧ QăQJNӷ Qѭӟc cӫa bӅ mһt tӃ bào bҵng cách sӱ dөng hai hydrocacbon khác nhau là xylen và touen làm dung môi Tính kӷ Qѭӟc cӫa vi khuҭn càng cao khi liên kӃt càng nhiӅu vӟi xylen và toluen HӋ tiêu hóa cӫD ÿӝng vұW ÿѭӧc bao phӫ mӝt lӟp chҩt nhҫy có thành phҫn chính là PXFLQ ÿѭӧc sҧn xuҩW OѭX WUӳ và giҧi phóng bӣi các tӃ bào Goblet Mucin là nhӳng glycoprotein lӟQ WURQJ ÿy JO\FDQV FKLӃP KѫQ NKӕL Oѭӧng phân tӱ

Các vi khuҭn Lactobacillus bám dính lên các niêm mҥc ruӝc nhӡ các protein

nhҫ\EiPGtQKWK{QJ TXDFiF Wѭѫng tác kӷ QѭӟFNK{QJÿһc hiӋu vӟi các thành phҫn chҩt nhҫy (yӃu tӕ kӃt hӧp AggL, protease PrtP) hoһc liên kӃt cө thӇ cӫa các

Trang 29

ÿRҥn Mub trong protein vӟi glycans mucin Liên kӃt bám dính vӟi niêm mҥc ruӝt là các liên kӃt cӝng hóa trӏ giӳa nhóm carboxyl cӫa serine hoһc threonine vӟi nhóm amino cӫa màng tӃ bào vi khuҭn [25]

1.5 Các nghiên cӭu vӅ KѭӟQJÿӅ tài

7URQJ QѭӟF ÿӃn hiӋn tҥi, vүQ FKѭD Fy QJKLrQ Fӭu vӅ viӋc bә sung SURELRWLF FKR RQJ FǊQJ QKѭ QJKLrQ Fӭu bә sung vi khuҭQ )/$% Fy ÿһc tính probiotic vào thӭFăQÿӇ trӏ bӋQKFKRRQJ'Rÿyÿk\Yүn là mӝWKѭӟng nghiên cӭu mӟi ӣ ViӋt Nam

Mӝt nghiên cӭu cӫa Lê Minh Hoàng (2012) khi dùng sӳDFKXDÿӇ trӏ bӋnh thӕi ҩu trùng cho ong, vӟi mөFÿtFKKҥn chӃ sӱ dөng kháng sinh và hiӋQWѭӧng GѭOѭӧng kháng sinh trong các sҧn phҭm tӯ ong mұWYjÿmÿѭӧc áp dөng thӵc tӃ ӣ tӍQK%uQK3KѭӟF3KѭѫQJSKiSGӵDWUrQFѫVӣ sӱ dөng nhӳng vi sinh vұt có lӧi sҹn có trong sӳa chuDÿӇ làm thӭFăQFKRRQJÿӇ khӕng chӃ các loҥi vi sinh vұt gây hҥLÿӗng thӡi acid latic trong sӳDFKXDFzQWăQJVӭFÿӅ kháng cho ong.Tác giҧ ÿm Vӱ dөng nguӗn nguyên liӋu tӯ sӳD Ez WѭѫL ÿѭӧF ÿXQ V{L WUӝn thêm sӳa chua ӫ ӣ nhiӋWÿӝ 30 ± 330C trong 2 ± 3 ngày rӗi phun trӵc tiӃSOrQÿjQRQJ+LӋu quҧ thӵc nghiӋP Oj ÿjQ RQJ ÿѭӧF ÿLӅu trӏ bҵng sӳa chua có sӭF ÿӅ kháng cao KѫQJLҧm thiӇu sӕ Oѭӧng ong chӃt do bӋQKQăQJVXҩt và chҩWOѭӧng mұWFǊQJWăQJÿiQJNӇ Tuy nhiên, nghiên cӭu chӍ sӱ dөng các vi sinh vұt có sҹn trong sӳa chua /$% FKѭD Pӣ rӝQJ ÿӇ nghiên cӭu vӅ các vi khuҭn probiotic có tiӅm QăQJQKѭ)/$%YjÿӏQKKѭӟng tҥo chӃ phҭm sinh hӑFÿӇ thay thӃ kháng sinh hiӋn tҥi [26]

7URQJNKLÿyYLӋc nghiên cӭu bә VXQJSURELRWLFWURQJQJjQKQX{LRQJÿmÿѭӧc thӵc hiӋn trên nhiӅXQѭӟF7URQJÿyQәi bұt là probiotic tӯ nhóm vi khuҭn FLAB Các nghiên cӭX Qѭӟc ngoài vӅ vi khuҭQ )/$% ÿm ÿѭӧc tác giҧ Martha Gilliam thӵc hiӋn tӯ QăPQKyPQJKLrQFӭu cӫDÿmSKkQOұSYj[iFÿӏnh hӋ

vi sinh vұt trong hӋ tiêu hóa ong mұt Apis mellifera gӗm các chӫng thuӝc nhóm

Enterobacteriaceae, Bacillus spp, Lactobacillus, vi khuҭn gram bҩW ÿӏnh, nҩm

men và nҩm mӕc HҫXQKѭWҩt cҧ các loài vi sinh vұWOLrQTXDQÿӃQRQJÿӅu phát triӇn tӕWWURQJÿLӅu kiӋn hiӃu khí hoһc có cӗQJÿӝ CO2 WURQJP{LWUѭӡng tӯ 5% ÿӃn 10% Vi khuҭn kӷ khí bҳt buӝc rҩt hiӃm HӋ vi sinh vұt có khҧ QăQJNKiQJ

Trang 30

nҩm bӋQK ÿyQJ JyS YӅ mһW VLQK KyD QKѭ WLӃt enzyme, chҩt chӕng vi trùng, hӛ trӧ bҧo quҧn phҩn hoa

1ăP 6YMHWODQD 9RMYRGLF ÿm FKӭng minh khҧ QăQJ NKiQJ NKXҭn

bӋnh cӫa các chӫng Lactobacillus kunkeei, Fructobacillus fructosus và sӵ ÿD

dҥng cӫa hӋ vi sinh vұt trong hӋ tiêu hóa cӫa ong phө thuӝc vào loài ong và môi WUѭӡng sӕng

Tӯ QăP ÿӃQ QăP &iF QJKLrQ Fӭu cӫa nhóm tác giҧ Akihito (QGRÿmSKkQOұp FLAB tӯ các nguӗQJLjXIUXFWRVHQKѭPұt hoa, mұWRQJUѭӧu nho, ruӝt cӫDÿӝng vұWăQWKӭFăQJLjXIUXFWRVH)/$%SKiWWULӇn tӕt trong môi WUѭӡQJJLjXIUXFWRVHÿѭӧc phân biӋWWUrQP{LWUѭӡQJ)<3VLQKWUѭӣng tӕt trong hӋ tiêu hóa cӫa ong mұt và có khҧ QăQJ Wҥo ra các hӧp chҩt kháng khuҭn giúp ong mұt chӕng lҥi mӝt sӕ bӋnh do vi khuҭn gây ra

1ăP QKyP QJKLrQ Fӭu cӫD 3DVTXDOH )LODQQLQR ÿm SKkQ OұS ÿѭӧc

các chӫng FLAB tӯ hӋ tiêu hóa ong mұt là Lactobacillus kunkeei, Fructobacillus

fructosus, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus fermentum có khҧ QăQJ

kháng khuҭn khi tҥo acid phenolic Các chӫng FLAB phát triӇn tӕt trên môi WUѭӡQJ)<3Yj*<3WURQJÿLӅu kiӋn khҳc nghiӋt buӝc các chúng phҧi phát triӇn FiFÿһc tính sinh lý và sinh hóa cө thӇ ÿӇ tӗn tҥLYjVLQKWUѭӣQJWURQJÿLӅu kiӋn khҳc nghiӋW WѭѫQJ Wӵ quá trình tiêu hóa cӫa ong mұW QKѭ WLrX WKө liên tөc mұt hoa, các chҩt chuyӇn hóa thӭ cҩp tӯ thӵc vұt, áp suҩt thҭm thҩu cao và sӵ tác ÿӝng cӫDHQ]\PHQJăQFҧn sӵ hình thành màng sinh hӑc và sӵ tӗn tҥi cӫa vi sinh vұt Vì vұy, các chӫng FLAB có thӇ tӗn tҥLYjFyWiFÿӝng tích cӵFÿӃn sӭc khӓe cӫa ong mұt

1ăPQKyPQJKLrQFӭX$UWXU3DFKODÿmQJKLrQFӭXVkXKѫQYӅ cҩu trúc phân tӱ và kiӇu hình cӫa vi khuҭQ)/$%ÿѭӧc phân lұp tӯ ong mұt, chúng

là nhóm vi khuҭQODFWLFÿһc biӋt và có khҧ QăQJNKiQJPҥnh vi khuҭn P larvae

LMG 9820, tác nhân gây bӋQKWKӕLҩu trùng ong ӣ Mӻ nhӡ vào các hӧp chҩt có khҧ QăQJ NKiQJ NKXҭQ ÿѭӧc tәng hӧp tӯ TXi WUuQK VLQK WUѭӣQJ QKѭ DFLG ODFWLFacid axetic và acid phenolic [6]

1ăP6DOPDQÿmSKkQOұp vi khuҭn FLAB tӯ dҥ dày cӫa ong mұWÿӇ thӱ nghiӋm vӅ hoҥt tính kháng khuҭn cӫD FK~QJ WUrQ Fѫ WKӇ cӫa thӓ khi bӏ vӃt

Trang 31

WKѭѫQJEӏ nhiӉm trùng do Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus

Fructobacillus fructosus FH1, Fructobacillus fructosus FH8 và Lactobacillus kunkeei SHGH- ÿѭӧc sӱ dөQJ ÿӇ chӕng nhiӉm trùng vӃW WKѭѫQJ GR YL NKXҭn

gây ra KӃt quҧ cho thҩy thӡi gian xӱ lý vӃWWKѭѫQJQJҳQKѫQNKLÿѭӧFÿLӅu trӏ FLAB so vӟi các vӃW WKѭѫQJ NK{QJ ÿѭӧF ÿLӅu trӏ, lӟp da không còn biӇu hiӋn bӋnh lý, xuҩt hiӋn mҥch máu tҥLFiFP{ÿѭӧc tái tҥRĈk\OjQJKLrQFӭXÿҫu tiên vӅ viӋc sӱ dөng vi sinh vұW)/$%WURQJÿLӅu trӏ vӃWWKѭѫQJEӏ nhiӉm trùng Tác

giҧ 6DNDQGDU ÿm SKkQ Oұp chӫng L.kunkeei tӯ trái cây và hoa Trung Quӕc thӱ

nghiӋPÿһc tính sinh hӑc và in vitro cho thҩy tiӅPQăQJVLQKKӑFÿiQJNӇ vӅ hoҥt ÿӝng chӕng mҫm bӋnh cӫDFK~QJYj[XKѭӟng sӕQJVyWWURQJÿLӅu kiӋQÿѭӡng

ruӝt mô phӓng [27] L kunkeei cho thҩy khҧ QăQJFKӏXÿӵng ӣ pH thҩp và nӗng

ÿӝ axit mұt khác nhau, cùng vӟL FiF WiF ÿӝng tӕL ÿD Wӯ TXi WUuQK ÿӗng hóa cholesterol và hoҥWÿӝng chӕng nhiӉm trùng

Tͳ các nghiên cͱu v͉ vi khu̱n FLA%WURQJQ˱ͣc và các nghiên cͱu ngoài Q˱ͣc cho th̭y t͝ng quát nh̭t v͉ quá trình nghiên cͱu v͉ K˱ͣQJÿ͉ WjLÿ͋ t̩o ch͇ pẖm probiotic là m͡WFKL͇QO˱ͫc quang tr͕QJÿ͋ gi̫m s͹ thi͏t h̩i cͯDTX̯QWK͋ ong m̵t b̹ng vi khu̱n FLAB có lͫLÿ˱ͫc s͵ dͭng d̯n d̯n tha\WK͇FKRNKiQJVLQKÿ͋ÿL͉XWU͓ YjQJăQQJͳa b͏nh do vi khu̱n gây ra trên ong m̵t

Trang 32

&+ѬѪ1*3+ѬѪ1*3+È31*+,Ç1&ӬU 2.1 ThӡLJLDQYjÿӏDÿLӇm nghiên cӭu

Thӡi gian: Ngày 21/09/2020 ± Ngày 19/04/2021

ĈӏDÿLӇm: Phòng thí nghiӋm Bӝ môn Công nghӋ Sinh hӑc, Khoa Kӻ thuұt Hóa hӑF7UѭӡQJĈҥi hӑc Bách Khoa Tp HCM

2.2 Vұt liӋXP{LWUѭӡng, hóa chҩt và thiӃt bӏ 2.2.1 Vұt liӋu

Mүu phân lұp: 6 mүu ong mұt thu thұp tҥi trҥi ong Long KiӅu (Di Linh,

/kPĈӗng)

Ba chӫng vi sinh vұt gây bӋnh thӕi ҩu trùng trên ong mұWÿѭӧc cung cҩp tӯ Bӝ môn bӋnh hӑc, trҥi ong mұt trong khu thӵc nghiӋP Ĉҥi hӑc Nông Lâm Tp

HCM bao gӗm: Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae và Paenibacillus

alvei ÿmÿѭӧFWiLÿӏnh danh bҵng bӝ kit API

Bӝ VѭX Wұp FLAB tӯ bӝ môn Công nghӋ Sinh hӑF WUѭӡQJ Ĉҥi hӑc Bách Khoa Tp HCM gӗm 5 chӫQJÿѭӧc ký hiӋu là F1, F2, F3, F4, F5

2.2.2 0{LWUѭӡng và hóa chҩt

Bҧng 3 0{LWUѭӡQJÿѭӧc sӱ dөQJWURQJÿӅ tài

0{LWUѭӡQJ 0өFÿtFKVӱGөQJ

056OӓQJ 3KkQOұSWăQJVLQKYLNKXҭQODFWLFWӯKӋWLrXKyDRQJPұW MRS agar 3KkQOұSNKҧRViWJLӳJLӕQJYLNKXҭQ)/$%

*<3OӓQJ

6jQJOӑFYLNKXҭQ)/$% )<3OӓQJ

NA +RҥWKyDYjQX{LFҩ\YLNKXҭQJk\EӋQKWKӕLҩXWUQJWUrQRQJPұW

NB

Trang 33

Bҧng 4 Hóa chҩWÿѭӧc sӱ dөQJWURQJÿӅ tài

7rQKyDFKҩW 7KjQKSKҫQ %ӝKyDFKҩWQKXӝP*UDP

Crystal violet, Lugol, Ethanol 96%, Fushin, H2O2 GҫXVRLNtQKQѭӟFPXӕLY{WUQJ

ĈƭDNKiQJVLQK

Streptomycin 10 µg/mL và Kanamycin 30 JP/FXQJFҩSEӣL&{QJW\71++Nam Khoa)

ĈӋP3KRVSKDWH- Buffered Saline (PBS)

8g NaCl; 0,2g KCl; 1,44g Na2HPO4; 0,24g KH2PO4OtWQѭӟFFҩW

2.2.3 Trang thiӃt bӏ

ThiӃt bӏ phòng thí nghiӋm: tӫ cҩy vô trùng, nӗi hҩp tiӋt trùng, tӫ sҩy dөng

cө, tӫ ҩPPi\ÿRquang phә, máy lҳc và máy ly tâm

Các dөng cө Fѫ Eҧn phòng thí nghiӋm: Ӕng nghiӋP ÿƭD 3HWUL TXH Fҩy,

ÿqQFӗn và các dөng cө FѫEҧn khác

Trang 34

2.3 6ѫÿӗ nghiên cӭu tәng quát và thuyӃt minh quy trình

Ong mұt

Phân lұp và sàng lӑc FLAB

Sàng lӑc FLAB kháng khuҭn gây bӋnh trên ong

Ĉӏnh danh

Giӳ giӕng

ChӃ phҭm Bӝ giӕng

TuyӇn chӑn các chӫng có hoҥt tính probiotic

Phân tích yӃu tӕ kháng vi khuҭn gây bӋnh trên ong

- Chӏu pH thҩp - Bám dính

- Kháng kháng sinh - Chӏu nhiӋt - M pluton

Trang 35

2.3.1 Phân lұp và sàng lұp chӫng FLAB Phân lұp chӫng FLAB

Xӱ lý mүu: Vi khuҭn FLAB phân lұp tӯ hӋ tiêu hóa cӫa các ong thӧ tӯ nhiӅu mүu khác nhau, khӓe mҥnh và không nhiӉm bӋnh Ong mұW ÿѭӧc ngâm trong cӗn 96o WURQJSK~WÿӇ loҥi bӓ các vi khuҭQErQQJRjLVDXÿyUӱa lҥi 3 lҫn vӟLQѭӟc cҩt vô trùng TiӃn hành giҧi phүu troQJÿLӅu kiӋn vô trùng, dùng kéo và kҽp tách hӋ tiêu hóa ong mұt MүX WKX ÿѭӧc chuyӇn vào ӕng vô trùng chӭa 10 mL MRS lӓQJÿѭӧc bә VXQJIUXFWRVHĈӗng nhҩt mүu trong 1 ± 2 phút và thu dӏch huyӅn phù Pha loãng dӏch huyӅn phù vӟLQѭӟc muӕi sinh lí 0,9% Hút 200 µL dӏch huyӅn phù vӟi các nӗQJÿӝ NKiFQKDXÿѭӧc cҩ\WUDQJOrQ FiFÿƭD3HWULchӭD P{L WUѭӡng thҥch MRS, ӫ ӣ 370C, 48 giӡ Sau 48 giӡ nuôi cҩy, chӑn các khuҭn lҥF ÿһF WUѭQJ Gӵa vào màu sҳF NtFK WKѭӟc và hình dҥng, tӃ bào gram GѭѫQJYjSKҧn ӭng catalase âm tính, chuyӇQYjRÿƭDWKҥch MRS mӟi và ӫ ӣ ÿLӅu kiӋQ ÿm QrX WUrQ TXi WUuQK Fҩ\ ÿѭӧc lһp lҥi nhiӅu lҫQ FKR ÿӃQ NKL ÿӝ thuҫn vi khuҭQÿѭӧF[iFÿӏnh [28]

Sàng lӑc chӫng FLAB

Chӫng thuҫQÿѭӧFWăQJVLQKWUrQP{LWUѭӡng lӓng FYP và mүXÿѭӧc nuôi trên máy lҳc 120 vòng/phút, nhiӋWÿӝ ӫ 370C, thӡi gian ӫ 24 ± 48 giӡ Cҩy mүu ÿmWăQJVLQKOrQP{LWUѭӡng thҥch FYP Chӑn các khuҭn lҥc phát triӇQÿѭӧc trên P{LWUѭӡng thҥFK)<3ÿӇ WăQJVLQKWUrQP{LWUѭӡng lӓng FYP khҧo sát mұWÿӝ tӃ bào sau 24 giӡ bҵQJSKѭѫQJSKiSÿRTXDQJӣ EѭӟFVyQJQPÿӇ chӑn ra các chӫng có mұWÿӝ tӃ bjRWăQJYѭӧt trӝL6DXÿyFҩy chӫQJWUrQYjRP{LWUѭӡng chӑn lӑF)<3YjP{LWUѭӡQJ*<3ÿӇ chӑn lӑc chӫQJ)/$%ĈR2'610nm sau 18, 24, 30 giӡ ÿӇ so sánh sӵ WăQJWUѭӣng Chӫng nào phát triӇn trên FYP mҥQKKѫQtrên GYP là chӫng FLAB [21]

2.3.2 Sàng lӑc các chӫng FLAB có khҧ QăQJNKiQJYLNKXҭn gây bӋnh

Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae và Paenibacillus alvei

Nuôi Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae và Paenibacillus alvei

(chӫng chӍ thӏ WURQJP{LWUѭӡng NB trên máy lҳc 120 vòng/ phút, 30°C trong 48 giӡ Các chӫQJ)/$%ÿmÿѭӧFQX{LWURQJP{LWUѭӡng lӓQJ)<3FQJÿLӅu kiӋn Hút 200 µL hӛn dӏch chӫng chӍ thӏ cҩ\WUDQJWUrQP{LWUѭӡQJ1$ÿmÿѭӧc chuҭn

Trang 36

bӏ Yjÿөc 5 lӛ WUrQP{LWUѭӡng thҥFKEҵQJFiFKVӱ dөng dөng cөEҩPOӛ 5 mm %ѫP/)/$%YjRFiFJLӃQJYj/P{LWUѭӡng FYP không có chӫng vào giӃQJ ÿӕi chӭng âm Sau khi ӫ ӣ 37°C trong 48 giӡ ÿR ÿѭӡng kính vòng kháng khuҭn Thí nghiӋPÿѭӧc lұp lҥi ba lҫQÿӝc lұp

2.3.3 TuyӇn chӑn các chӫng FLAB có hoҥt tính probiotic và hoҥt tính kӻ thuұt

2.3.3.1 Khҧ QăQJSKiWWULӇQWURQJP{LWUѭӡng có pH thҩp

7ăQJVLQKYLNKXҭQWURQJP{LWUѭӡng FYP (pH 6,8) trong 48 giӡ Cҩy 0,1 ml dӏch khuҭQWăQJVLQKYjRPOP{LWUѭӡng 056ÿѭӧFÿLӅXFKӍnh pH 3 và pH 4 và ӫ ӣ 37°C TiӃn hành pha loãng dӏch khuҭQÿӇ kiӇPWUDKjPOѭӧng tҥi thӡi ÿLӇm 0 giӡ và 3 giӡ

tӃ bào biӇu mô ruӝt (tӃ bào Caco-2 và HT-29) cӫa các chӫng Lactobacillus ÿm

ÿѭӧc sӱ dөQJQKѭPӝWSKѭѫQJSKiSLQYLWURÿӇ sàng lӑc các chӫng lӧi khuҭn tiӅPQăQJ[30][24] Khҧ QăQJWӵ ÿ{QJWө cӫa vi khuҭn là tiӅQÿӅ ÿӇ thӵc hiӋn các thí nghiӋm tiӃSWKHRWURQJTX\WUuQKÿiQKJLiNKҧ QăQJWӗn tҥi cӫa vi khuҭn trong hӋ tiêu hóa ong mұt trên thӵc tӃ

ĈӇ ÿiQKJLiNKҧ QăQJWӵ ÿ{QJWө, các chӫng vi khuҭQÿѭӧc nuôi cҩy trong P{L WUѭӡng lӓng MRS trong 24 giӡ ӣ 370C Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 15 phút ӣ 40&ÿӇ thu nhұn sinh khӕi Sinh khӕLÿѭӧc rӱa 2 lҫn bҵQJÿӋm phosphat 3%6