Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát tác dụng phối hợp của colistin với meropenem trên acinetobacter baumannii mang nhóm gene đề kháng carbapenem

TÊN DE TÀI: Khảo sát tac dụng phối hop của Colistin với Meropenem trên Acinetobacter baumannii mang nhóm gene đề kháng carbapenemII.NHIỆM VU VÀ NOI DUNG: ® Xác định ty lệ các gene mã hóa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHAO SÁT TÁC DỤNG PHOI HOP CUA COLISTIN VỚI

MEROPENEM TREN ACINETOBACTER BAUMANNII

MANG NHOM GENE DE KHANG CARBAPENEM

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh HọcMã so: 60420201

LUẬN VAN THAC SĨ

TP HO CHI MINH, thang | năm 2018

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa —DHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa hoc : PGS.TS Nguyễn Thúy Huong

Cán bộ cham nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ cham nhận xét 2 : TS Hoang Anh Hoang

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa,ĐHQG Tp HCM ngày 12 tháng O1 năm 2018

Thành phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi của Hội đồng cham bảo vệ luận văn thạcST)

1 PGS.TS Lê Thi Thủy Tiên - Chu tịch2 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng - Phản biện 1

3 TS Hoàng Anh Hoàng - Phản biện 24 TS Võ Đình Lệ Tâm - Uỷ viên

C1 TS Huynh Ngọc Oanh - Uy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoaquan lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA KỸ THUAT HÓA HOC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phan Thị Vân Anh MSHV: 7140281

Ngày, thang, năm sinh: 07-10-1988 Nơi sinh: Đồng ThápChuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201I TÊN DE TÀI: Khảo sát tac dụng phối hop của Colistin với Meropenem trên

Acinetobacter baumannii mang nhóm gene đề kháng carbapenemII.NHIỆM VU VÀ NOI DUNG:

® Xác định ty lệ các gene mã hóa enzyme thủy phân carbapenem nhóm B vanhóm D ở A.baumannii ;

s - Đánh giá tình hình dé kháng kháng sinh của A.baumanniie Khảo sát tác dụng của việc phối hop kháng sinh giữa Meropenem với

Colistin trên A.baumannii mang nhóm gene dé kháng carbapenem tại Bệnhviện Đa Khoa Thống Nhất, Đồng Nai

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 11/12/2016IV NGAY HOÀN THIỆN NHIỆM VU: 05/12/2017V CÁN BỘ HƯỚNG DAN: PGS.TS Nguyễn Thúy Huong

Tp HCM, ngày 12 thang 01 năm 2018

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

TRUONG KHOA KY THUAT HOA HOC

Lời cảm ơn

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến gia đình ba mẹ hai bên,gửi đến anh Vĩnh đã đồng hành, động viên và ủng hộ em, luôn tạo điều kiện thật tốtcho em học hành, luôn bên em va là chỗ dựa tinh than quí giá của em

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sac nhất đến cô PGS.TS.Nguyễn Thúy Huong, người đã tận tụy hướng dẫn khoa hoc , giúp đỡ va tạo điềukiện tốt nhất dé em có thé hoàn thành luận văn nay

Em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến

- Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học

cùng thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại học Bách KhoaTPHCM đã tạo điều kiện và hỗ trrợ em trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn

thành luận văn này.

- Ban giám đốc, Phòng Tổ chức cán bộ, Khoa Vi Sinh - Bệnh viện Da khoaThống Nhất, Đông Nai, gởi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Sĩ Tuan - cảm ơn anh đãtạo mọi điều kiện, hướng dẫn tận tình để có được kết quả thành công của luận văn

này.

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã

động viên em rât nhiêu trong quá trình học tập và nghiên cứu.

TPHCM, ngày 23 thang 11 năm 2017

Phan Thị Vân Anh

TÓM TẮT LUẬN VĂNHiện nay, nhiễm khuẩn bệnh viện là một trong những nguyên nhân gây ra tỷ lệ mắc,tử vong cao cho các bệnh nhân tại các bệnh viện do các vi khuẩn kháng đa khángsinh gây nên Trong đó Acinetobacter baumannii được xem là vi khuẩn gây bệnh cơhội chủ yếu do chúng có khả năng thích ứng với môi trường sống đa dạng Vài nămgân đây, carbapenem được chỉ định trong điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nặnggây bởi các vi khuân Gram âm làm bùng phát mạnh về khả năng gây nhiễm khuẩnbệnh viện và kháng đa kháng sinh, do A.baumamnii sử dụng nhiều cơ chế dé kháng

carbapenem, trong đó có kha năng hình thành emzyme carbapenemase thủy phân

carbapenem Enzyme carbapenemase được tổng hợp trong A.baumannii chủ yếu bởi

các gen OXA 23, OXA 51, OXA 58 thuộc nhóm D và gen NDM-I (New delhi

metallo B-lactamase 1) thuộc nhóm B Việc sử dụng colistin phối hop meropenemhay imipenem trong điều trị tại Việt Nam hiện nay được bác sĩ chỉ định khi có cácdau hiệu như nhiễm trùng nang, nhiễm trùng do tác nhân vi khuẩn kháng diện rộnghay kháng toàn bộ Vì colistin có khả năng gây rối loạn chức năng màng bào tươngvà kháng sinh nhóm j-lactama gây ức chế tong hợp vách tế bào vi khuẩn tạo điềukiện thuận lợi cho các kháng sinh khác tiếp cận đích tác dụng Từ đó nhóm chúng

tôi đưa ra mục tiêu xác định tỷ lệ các gene mã hóa enzyme thủy phan carbapenem

nhóm B và nhóm D và đánh giá tình hình dé kháng kháng sinh của A.baumannii,làm tiền dé khảo sát tác dụng của việc phối hợp kháng sinh giữa Meropenem vớiColistin trên A.baumannii mang nhóm gene dé khang carbapenem tai Bénh vién DaKhoa Thong Nhất, Đồng Nai Kết quả thu được: gene blaoxaA-2a chiếm 70,20%; geneblaoxa.s¡ chiém 95,91%; gene blaoxa-sg chiém 8,57%: gene blanpm-1 chiếm 2,45%.Với 245 chủng A.baumannii được khảo sát kháng hầu hết trên 90% kế cả IMP

(94,40%), MEM (93,20%), ngoại trừ NET (74%), Colistin là nhạy 100% Trong 15kháng sinh được sử dụng thi A baumannii kháng với 13 kháng sinh ở mức trên 90%

và tat cả các kháng sinh nhóm B-lactam được thử nghiệm đều bị kháng trên 90%

Mức độ tác động của A baumannii mang gen kháng carbapenem khi khảo sát tác

dụng phối hợp kháng sinh giữa Meropenem/Colistin thu được kết quả như sau cộnghợp (42,5%), hiệp đồng (55%) và độc lập (2,5%)

SUMMARYAt present, hospital infections are one of the causes of high morbidity and mortalityamong patients at hospitals caused by multidrug-resistant bacteria WhereasAcinetobacter baumannii are considered opportunistic pathogens due to their abilityto adapt to diverse habitats In the last few years, carbapenem has been prescribedfor the treatment of severe infections caused by Gram-negative bacteria, which haveled to widespread outbreaks of nosocomial infection and multi-antibiotic resistance,which has been widely used by A.baumannii The carbapenem-resistant mechanism,which has the potential to form carbohydrate carbapenemase-mediated carbamate.The carbapenemase enzyme synthesized in A.baumannii is mainly composed of theOXA 23, OXA 51, OXA 58 genes in group D and the NDM-1 gene (New delhimetallo B-lactamase |) in group B The use of meristem plus meropenem orimipenem in treatment in Vietnam is currently prescribed by your doctor for signssuch as severe infection, infection by a broad-spectrum antibiotic or completeresistance Because colistin is capable of causing plasma membrane dysfunction andB-lactama antibiotics to inhibit the synthesis of bacterial cell walls, it isadvantageous for other antibiotics to reach the target The team then set out todetermine the percentage of genes that encode carbapenem groups B and D, and toassess the antibiotic resistance of A.baumannii Antibiotics between Meropenemand Colistin on A.baumannii carry carbapenem resistance gene at Thong NhatGeneral Hospital, Dong Nai Results obtained: gene blaOXA-23 accounted for70,20%; gene blaOXA-51 accounts for 95,91%; gene blaOXA-58 accounts for857%; The blaNDM-1 gene accounts for 2,45% 245 strains of A.baumannii weretested for resistance of almost 90%, including IMP (94,40%), MEM (93,20%),except NET (74%), Colistin was 100% sensitive Of the 15 antibiotics used, A.baumannii was resistant to 13 antibiotics at levels above 90% and all tested J-lactam antibiotics were more than 90% resistant The effect of A baumannii on thecarbapenem resistance gene in combining the effects of Meropenem / Colistincombination (42,5%), synergistic (55%) and independence 2,5%).

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn khoa học, hướng dẫn thực nghiệm của PGS.TS Nguyễn Thúy Hương vàTS Nguyễn Sĩ Tuấn

Các số liệu, hình ảnh và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thựcvà chưa từng được công bố trong bat kỳ công trình nào khác

Tác giả

Phan Thị Vân Anh

MỤC LỤC

Danh mục các bảng oooocc s9 9.9.9.9 00 08 00009099900999499996600666666688660666 i

Danh mục biểu dO cccscscscscscsssssscsssssssssssssssesssssssssscssssssssscsssssssssssesesssssssssessssssees ii

Danh mục hình ảnh oco œ5 999669889 9098999099949499696660666666688666666 iil

Danh mục Viet tat - (5£ << << E11 g1 6036005050556 ivChương 1 DAT VAN DE 5 5 5 << << 99 909 0g 2 sesee 1Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU <-5-5-5-5c5° se se se SsSseseseseses 42.1 Giới thiệu chung về Acinetobacter baudnii 5-s-5s<sesesese 42.1.1 Đặc điểm chung - -C E1 SE 3 1 1511511211 11111111111 cxrk 42.1.2 Đặc điểm sinh học của Acinetobacter baumdninii ccccccccecssa 42.1.3 Nguồn lây và đường lây của Acinetobacter baumannii - 72.2 Kháng sinh nhóm carbapenem và colistin được sử dụng trong điều tri

ACinEtObacter DAUMANNIL ú ccc G0000 9 0 9.00009009888855 8

2.2.1 Giới thiệu về nhóm carbapenem < << sec se se seseseses 82.2.1.1 Cấu tạo hóa hỌC c1 111912111 5 511151511 E121 1g gi 92.2.1.2 Cơ chế tác dụng - 5-5222 t E2 3 1 1215121212111 11 1111111 10

2.2.1.3 Các enzyme phân giải nhóm carbapenem -«««++<<s 11

2.2.1.4 Cơ chế dé kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii 132.2.2 Giới thiệu về eolistin sss<<cscseseseeseeeeeeseseseseseses 16

2.2.2.1 Cấu trúc hóa hỌC - Gv 111912191 3 5111915111 E1 ng go l62.2.2.2 PhO tác dụng - + c Le ST TT E1 1111111111111 711 te 172.2.2.3 Co chế tác MUNG voecccccccccccscsssscscscsssssescscssssssescscsssssscsescsssssssseseess 172.2.2.4 Cơ chế dé kháng - ¿2-5 52522223 E2 2E 12121211221 E re, 182.2.3 Phối hợp trong điều tri c.ccccccccccscscccssssssscscsssssssssssssssssssssessssssasecesecs 192.3 Tình hình đề kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii trên thé giới

Và ÍFODĐ HƯỚC Q.00 666666666666666600606000000606066660666066 20

Chương 3 DOI TƯỢNG, VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 263.1 Đối tượng nghiên €Ứu 5-5-<-< << << << 9S SeSESExEsEsESSeEesesessee 263.2.Địa điểm và thời gian nghiên €Ứu 5-e< 5 5< << << esesesesesese 26

3.3 Vật liệu nghiên CỨU oc << S 5 S S 6 66999 999999999999.9696996666666666888666666 263.4 Phương pháp nghiÊn CU d œ0 G SG G6 S59 99999999.9999000666066566888666666 26

3.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quấtt - 5-5252 2E+E+EEE£E+E£EEEErkrkrrrrees 263.4.2 Thuyết minh sơ đỒ ¿-¿- - + kE+E+E9 9 SE SE TT reg 28

3.4.2.1 Phân lập và định danh - - 5 5S S335 xsses 28

3.4.2.2 Định danh bằng hệ thống tự động BD Pheonix’ wo 283.4.2.3 Định danh Acinetobacter baumannii bang sinh học phân tir 29

3.4.2.4 Xác định ty lệ các gen mã hóa enzyme thủy phân carbapenem nhóm Dvà gen New-Delhi Metallo-beta lacfamase -ĂS S1 ke 32

3.4.2.5 Đánh giá tình hình dé kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii 333.4.2.6 Khảo sát tác dụng của việc phối hợp kháng sinh giữa Meropenem vàColistin đối với Acinetobacter baumannii mang gen kháng carbapenem bang

phương pháp vi pha loãng c9 kế 33

3.5 Phương pháp xử lý số liệu . -<< << =<e<ssseseseseseseeeesesessse 34Chương 4 KET QUÁ NGHIÊN CUU VA BIEN LUẬN 354.1 Kết qua phân lập, định danh các chủng Acinetobacter baumannii 354.2 Định danh 16S bang sinh học phân tử - + ¿55+ £2£s+s+escee 374.3 Đánh giá tình hình dé kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii 404.3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii trên hệ thông tự

4.3.2 Tỷ lệ các gen mã hóa enzyme thủy phân carbapenem nhóm D và gen Delhi Metallo-beta lactamase - - - - - c0 00003030 vn Y y ve 41

New-4.4 Khảo sát tác dụng của việc phối hợp kháng sinh giữa Meropenem và Colistinđối với Acinetobacter baumannii mang gen kháng carbapenem băng phương pháp

VỊ pha ÏOãNg LG 0 46

Chương 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 2-5-5<e< s5 e5 << << << cseses 505.1 Kết luận - - tT 111 12T 111111111 11101111 HT TH ng ng 505.2 Kiến nghị - 5c 1122 121 1511511 111151111 111111111111 11 01.01110111 0101 0101011 gr 50TÀI LIEU THAM KHAO) S-5 5-5-5 S9 2 S2 S2 S4 Sex ssesesesesese 52

PHU LUC 2 << S£©S#EE4ESE£9SE49EE4ES49EE4eEE99299928492242299 60

DANH MỤC CAC BANG

Bang 2.1 Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler ««- 14

Bang 3.1 Mã số truy cập các trình tự dùng thiết kế môi trong nghiên cứu 30Bang 3.2.Thành phan và thể tích phản ứng PCR cơ bản - 31

Bang 3.3 Chu trình nhiệt trong phan ứng PCR cơ ban «<<- 3l

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra các đặc tính vật lý của từng trình tự mỗi 37Bang 4.2 Kết quả khuếch đại in silico xác định vị trí bắt cặp và kích thước sảnphẩm PCR + S21 1E 123212151511 1111111511 1111115110101 011501 110111010 rk 38Bảng 4.3 Kết quả so sánh các kỹ thuật sử dụng dé phát hiện Acinetobacter

2277/127/1/171PEREEREERRSEREREEE 34 40

Bang 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của Acinetobacter baumannii 4

Bang 4.5 Tỷ lệ kháng khang sinh cua Acinetobacter baumannii theo nghiên cứu

của một SO tác Øiả - 5+ S11 1 1 121115151111 11 1111511110101 11 0101110111017 01 11111 0 43

Bảng 4.6 Tỷ lệ các gen mã hóa enzyme thủy phân carbapenem nhóm D và genNew-Delhi Metallo - beta lactamase -ĂcSS SH xà 45

Bang 4.7 Tỉ lệ tác động của meropenem và colistin đối với Acinetobacter

baumannii mang gen kháng carbapenem « «sscsn nhnn ke 47

DANH MỤC BIEU ĐỎ

Biểu đồ 4.1: Mức độ các gen mã hóa enzyme thủy phân carbapenem nhóm D va gen

New-Delhi Metallo-beta lactamase 1s s n1 S S1 11v vs 42

Biểu đồ 4.2 Biéu đồ mức độ kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii 45Biểu đồ 4.3 Mức độ tác động của meropenem và colistin đối với Acinetobacter

baumannii mang gen kháng carbapenem « «sscsn nhnn ke 47

DANH MỤC HÌNH ANH

Hình 2.1 Acinetobacter baumannii tông hop siderophore 6Hình 2.2 Acinetobacter baumannii tồn tại trong môi trường bệnh viện 7Hình 2.3 Cau tạo các loại kháng sinh nhóm «<< « << sssss 9Hình 2.4 Vách té bào vi khuẩn Gram Am - +-c+++rxcsrxeerkeerrrerkrrrk 13Hình 2.5 Bơm day kháng sinh ra khỏi mang vi khuẩn 5-5-5: 15Hình 2.6 Cau trúc hóa hoc của colistin ccceccssscsscecessssscessssecscscecescesevecececeeseees 16Hình 2.7.Co chế tác dụng của colistin với mang ngoài tế bào vi khuẩn 18Hình 4.1 Khuan lac Acinetobacter baumannii trên môi trường thạch MC 35Hình 4.2 Tiêu ban vi khuan Acinetobacter baumanni soi ở vật kính 100x 35Hình 4.3 Kết quả định danh Acinetobacter baumannii bằng hệ thông tự động

Phoenix TMIÕO . -CQ Q00 HH HH HH HH TH HH ng cu vế 36

Hình 4.4 Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của các cặp mỗi 16S, OXA 23,

OXA 51, OXA 58 vàNDM-[ CC SE E111 11111 v.v 332 x£2 39

Hình 4.5 Kết quả thực hiện phối hợp kháng sinh giữa Meropenem và Colistin đối

VỚI A DAUIMANNLL cccccccccecceccccocceccccuccecceccecscceccecnccsccecsecscescncscsceecnscscascessscascescscanees 46

DANH MỤC VIET TAT

Ký hiệu Viết day đủ Viết giải nghĩa tiếng việt

DNA Deoxyribonucleic Acid Phan tu axit nucleicbp Base pair Don vi đo trọng lượng cua

PCR Polymerase chain reaction Chuỗi phan ứng trùng hợpFDA Food and Drug Administration Cuc quan ly Thue pham va

Dược phẩm Hoa KỳPBP penicillin binding protein protein găn penicillin

Chương 1 ĐẶT VAN DEHiện nay, nhiễm khuẩn bệnh viện là một trong những nguyên nhân gây ra tylệ mắc, tử vong cao cho các bệnh nhân tại các bệnh viện do các vi khuẩn kháng đakháng sinh gây nên Trong đó Acinetobacter baumannii được xem là vi khuẩn gâybệnh cơ hội chủ yếu do chúng có khả năng thích ứng với môi trường sống da dang,ton tại lâu trong môi trường bệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế [66] Nhờkhả năng tạo mang sinh hoc (biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩn A.baumanniicó thé gan chat vao bé mat dụng cu, môi trường, nhân viên chăm sóc sức khỏe, taođiều kiện cho vi khuẩn dé dang lây lan và tôn tại lâu dai, thu nhận, tích lũy nhiềugene kháng khang sinh và từ đó có thé trở thành tác nhân da kháng, gây khó khăntrong điều trị và kiễm soát nhiễm khuan[31, 39, 41].

Carbapenem là nhóm kháng sinh thuộc họ B-lactam, có phổ kháng khuẩnrộng nhất nên được chỉ định trong điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nặng gâybởi các vi khuẩn Gram âm có khả năng sản sinh enzyme phân hủy kháng sinh phốrộng Nhưng hiện nay không còn hiệu quả bởi sự trỗi dậy của các chủng đa kháng

(multidrug resistance — MDR) hay đa kháng mở rộng (extensive drug resistance XDR) Cac chung A.baumannii khang carbapenem thường có kha nang khang lại

-hau hết các nhóm khang sinh, vì chúng có nhiều co chế dé kháng khác n-hau trongđó cơ chế tiết enzyme -lactamse có hoạt tính thủy phân carbapenem hiện đang phổbiến nhất ở các chủng A.baumannii khang carbapenem [2, 8, 11,53, 54]

Vào năm 1983, các nghiên cứu chứng tỏ rang Acinetobacter mang genekháng kháng sinh năm trên plasmid [29] Đến năm 2006, A.baumannii mang các

gen mã hóa enzyme kháng kháng sinh nhóm carbapenem như OXA-51, OXA-23 và

OXA-58 được phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó gen OXA-51 là genkháng thuốc nội tại nam trong nhiễm sắc thé của A.baumannii [60] Gen OXA-23và gen OXA-58 là các gen kháng kháng sinh mạnh được mã hóa cả trên nhiễm sắcthể và trên plasmid do đó khiến khả năng lây truyền và phát tán gen kháng khángsinh của A.baumannii trở nên nguy hiểm hơn Năm 2009, việc công bố phát hiện

một gen mới có khả năng kháng carbapenem là gen New Delhi metallo-beta

lactamase - 1(NDM-1) đã làm gia tăng sự chú y của các nhà khoa học vì vi khuẩn

mang gen NDM-I có khả năng kháng lại rất nhiều loại kháng sinh và có khả nănglây lan cao dẫn đến việc điều trị trở nên rất khó khăn [21] Điều nay cho thấy sựbiến đối không ngừng dé kháng lại kháng sinh của vi khuẩn, đặt ra van dé lớn chocác nhà khoa học trên toàn thế giới nhăm tìm ra cách thức dé điều trị các vi khuẩn

có khả năng kháng kháng sinh.

Ở Việt Nam, Acinetobacter được xem là vi khuẩn hàng đầu gây viêm phốibệnh viện tại những bệnh viện lớn và kháng với hầu hết kháng sinh kế cả nhữngkháng sinh phố rộng mạnh nhất hiện nay [9, 12] Tại bệnh viện Nguyễn Tri Phươngđã tiến hành nghiên cứu hiệu quả phối hop kháng sinh colistin với meropenem vàimipenem trên A.baumannii đa kháng trên 100 chủng vi khuẩn phân lập, kết quacho thấy colistin có khả năng làm tăng hiệu quả hợp đồng của meropenem vàimipenem trên A.baumannii khi sử dụng kháng sinh phối hợp Vì colistin có khanăng gây rối loạn chức năng màng bào tương và kháng sinh nhóm B-lactama gây ứcchế tong hop vach tế bào vi khuẩn tao điều kiện thuận lợi cho các kháng sinh kháctiếp cận đích tác dụng Do đó việc phối hợp colistin với nhóm B-lactama được ápdụng cho cả trường hợp kháng sinh đã bị vi khuẩn dé kháng (do không thắm đượcqua màng hoặc do bơm tống thuốc) [2, 11]

Sự phối hợp kháng sinh trong điều trị phải nhằm đạt 3 mục đích: mở rộngphô kháng khuẩn, loại trừ nguy cơ xuất hiện chủng dé kháng và dat được tác dụngdiệt khuẩn Việc sử dung kháng sinh phối hop trong điều trị tại Việt Nam hiện nayđược bác sĩ chỉ định khi có các dấu hiệu như nhiễm trùng nặng, nhiễm trùn ø do tácnhân vi khuẩn kháng diện rộng hay kháng toàn bộ Ngoài ra phối hợp kháng sinh sẽlàm số kháng sinh phải dùng nhiều hơn, dẫn đến chi phí diéu trị tăng cao nên sựphối hợp đòi hỏi thận trọng và cân nhắc tối đa

Việc nắm rõ khả năng phối hợp của colistin với nhóm carbapenem trênA.baumannii mang các gene mã hoá nhóm carbapenem cùng với việc kết hợp thựctiễn lâm sàng sẽ giúp cho việc điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn thành công hơn.Với tính cấp thiết và ý nghĩa đã nêu.từ đó nhóm chúng tôi tiễn hành nghiên cứu“Khảo sát tác dụng phối hợp của Colistin với Meropenem trên Acinetobacter

baumannii mang nhóm gene đề kháng carbapenem”

Với mục tiêu của đề tài là xác định tác dụng của việc phối hợp kháng sinh giữaMeropenem với Colistin trên A.baumannii mang nhóm gene dé kháng carbapenemtại Bệnh viện Đa Khoa Thống Nhất, Đồng Nai

Đề thực hiện được mục tiêu nêu trên của đề tải, nhóm chúng tôi tiến hành thực

hiện với các nội dung sau:- - xác định ty lệ các gene mã hóa enzyme thủy phan carbapenem nhóm B va

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU2.1 Giới thiệu chung về Acinetobacter baumannii

2.1.1 Đặc điểm chung

A.baumannii được phát hiện vào năm 1911 khi Beijerinck, một nha vi sinh

học người Hà Lan mô tả như một Microccus calcoaeficus aceticu, sau đó vì khuẩnnày đã được đặt với nhiều tên khác nhau [22] Năm 1986 Buovet cùng cộng sự đãnghiên cứu và phát hiện ra chi Acinetobacter, sau nay với việc sử dụng nhiều kỹthuật sinh học phân tử đã giúp phân loại các loài trong chi Acinetobacter [68] Hầuhết các loài Acinetobacter được tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm nhưng khôngphải tất cả đều có ý nghĩa lâm sảng, các nhà khoa học đã tìm ra 34 loài

Acinetobacter khác nhau, trong đó 25 loài đã được đặt tên và 9 loài chưa được đặttên [34].

A.baumannii có thé được tim thay ở người bình thường như trên da, nách,hang, đầu ngón tay, ngón chan , chúng cũng thường trú trên da của nhân viên y tế,tỷ lệ lên đến 30% Ngày nay, người ta đã phát hiện chúng như là một tác nhân

thường trú trong bệnh viện và có khả năng phát tán và lây lan thành các vụ dịch, đặc

biệt ở là ở khoa Hồi Sức Tích Cực, trên những bệnh nhân nặng, nam điều trị kéodài, có thực hiện các thủ thuật xâm lẫn giup chân đoán và điều trị bệnh và việc sửdụng nhiều loại kháng sinh kéo dải trong điều trị Đặc biệt chúng tổn tại tới 45%

trong vung mở khí quan [20,22.55.,63|.

2.1.2 Đặc điểm sinh học của Acinetobacter baumanniiA.baumannii là một cầu trực khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, không sinhhơi, không di động Phát triển được trên các môi trường thông thường ở 20-30°C,tối ưu là 35°C, có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn là 41-42°C A baumannii là loài vikhuẩn dễ dàng mọc trên môi trường thạch máu thỏ, cừu và không gây tan máu trênmôi trường thạch máu Khuâẩn lạc nhẫn, màu xám trắng đôi khi hơi nhầy đườngkính khoảng từ 1,5 - 3 mm Các tính chất sinh hóa dùng để xác định là: có khả năng

tạo catalase, không có kha năng tao oxidase, indole va nitrate [13, 24, 26]

A.baumannii có khả năng tồn tại lâu và kháng được hau hết với các loạikháng sinh là nhờ vào các đặc tính sinh học như khả năng tạo màng sinh học, cầutạo mang ngoài lipopolysaccharide, sự tong hop siderophore

a) Kha năng tạo mang sinh hoc (biofilm)

A.baumannii có kha năng hình thành mot lớp biofilm bám dính lên bề mặtcác dụng cu y tế bang nhựa và thủy tinh, tạo điều kiện giúp chúng tôn tại và phát tantrong môi trường bệnh viện Biofilm có ban chất là một chất sinh học, có khả năngtạo thành các màng bám dính trên những vật dụng được đặt trong cơ thể, mạch máucủa bệnh nhân, những bề mặt cứng cũng như âm ướt của môi trường, biofilm này cókha năng bao bọc các vi khuẩn lai, làm cho chúng tránh khỏi sự tiêu diệt của các đạithực bào, kháng sinh, chất sát khuẩn Vì vậy chúng sẽ trở thành nguồn lây nhiễmtiềm ân ở các bệnh viện [37, 41]

b) Cầu tạo màng ngoài lipopolysaccharide

Lipopolyssccharide (LPS) hay còn gọi là kháng nguyên O là thành phan cấutạo mang ngoai của các vi khuan Gram âm Với đặc tinh polysaccharide của vỏ vikhuẩn được cấu tạo bởi L-rhamnose, D-Glucuronic, Dmannose giúp cho màng tếbào của A.baumannii ưa nước, từ đó A.baumannii dé dàng bám vào tế bao biểu mô

ở các cơ quan người thông qua vỏ va receptor của chúng [38].

Ngoài ra lipopolysaccharide của A.baumannii còn giúp tế bào nhân thật giảiphóng các chất trung gian như cytokine gây ra rất nhiều các biến đổi trong cơ chếsinh bệnh gây nhiễm khuẩn huyết của A baumannii [39]

c) Sự tổng hop siderophore

Acinetobacter co khả nang tong hop siderophore, một phân tử có trong lượngthấp, có kha năng chuyén đổi trùng hop từ oxy-hydroxit sắt thành sắt hòa tan giúpcho vi khuẩn phát triển trong điều kiện thiếu sắt Khả năng gây bệnh trong điều kiệnthiếu sắt được tìm thấy trong tất cả các chủng A.baumannii phân lập tại bệnh viện

[17].

Sat ngoai bao

Hinh 2.1 Acinetobacter baumannii tong hop siderophore [17]

d) Các porin trên bê mặt và ty thể tế bao

Porin là một protein được tìm thấy trên bề mặt thành tế bao va ty thé củaA.baumannii Các porin đóng vai trò quan trọng giúp bảo vệ cau trúc tế bào của vikhuẩn toản vẹn và có khả năng liên hợp với vi khuẩn, gắn kết với kháng sinh, và sựhình thành các lỗ (kênh porin) trên màng tế bào vi khuẩn cho phép sự xâm nhập của

các phân tử nhỏ như đường, axit amin, ion và kháng sinh đi qua Porin còn giúp vi

khuẩn thiết lập sự bám dính, đây kháng sinh ra khỏi vi khuẩn và tiết ra những chấtđộc thấm sâu vào trong mô gây hủy hoại tế bào và cơ thé ký chủ và từ đó gây nhiễmkhuẩn toàn thân nặng và đó cũng chính là cơ chế gây kháng thuốc nội tại [69]

d) Cơ quan cam ứng

A.baumannii có kha năng cảm nhận các tín hiệu cua vi khuẩn kế bên nhờ vàocơ quan cảm ứng, các tín hiệu này có thể kích hoạt các gen kháng kháng sinh củacác vi khuẩn Day là một trong những cơ chế dé kháng được phố biến rộng rãi ở các

vi khuan Gram âm, được tim thay trên A baumannii

2.1.3 Nguôn lây và đường lây của Acinetobacter baumanniia) Nguôn lay nhiễm Acinetobacter baumannii

Khi van đề nhiễm khuẩn bệnh viện được chú ý thì A.baumannii là một trongnhững vi khuẩn thường trú trong môi trường bệnh viện và xâm nhập vào cơ thểngười bệnh hoặc nhân viên y tế, chúng kháng với hầu hết với các loại kháng sinhđiều tri như cephalosporin, carbapenem, ciprofloxacin, amikacin, colistin [34] Sựda kháng thuốc này có được là nhờ vào co chế dé kháng khang sinh rất phong phú,đặc biệt với khả năng tổn tại lâu trong môi trường bệnh viện và trên nhân viên y tế,người lành mang vi khuẩn từ đó chúng có thể tích lũy sự kháng thuốc và phát tántính kháng kháng sinh cho trong cùng một loài hoặc khác loài qua nhiều con đườngkhác nhau, nguy hiểm nhất là qua plasmid làm khó khăn cho van dé kiểm soát vàphòng ngừa lây nhiễm chúng trong cộng đồng và bệnh viện [9, 37, 48, 53, 60]

Trang thiệt bị nhiềm ban

Môi trường ô nhiém

b) Các con đường gây nhiễm của Acinetobacter baumannii

Cũng như tất cả các vi khuẩn gây nhiễm khuân bệnh viện khác, A.baumanniithường lây nhiễm qua hai con đường chính là lây qua đường tiếp xúc và lây quađường giọt băn [34]

- Lây qua đường tiếp xúc: đây là con đường lây nhiễm chính, bệnh nhân cóthể tiếp xúc trực tiếp với các nguồn nhiễm như với bệnh nhân, nhân viên y tế bịnhiễm hoặc gián tiếp qua những dụng cụ chăm sóc, các bề mặt môi trường bị nhiễmvi khuẩn này và từ đó đi vào trong máu như các catheter mạch máu, ống nội khíquan, dây máy thở, ống thông tiểu, các dụng cụ nhân tạo torng phẫu thuật cấy

ghép, [14, 20].

- Lay qua đường giọt băn: trước đây các nhà khoa học không cho rangA.baumanniii có thé lây qua đường giọt bắn hoặc không khí, nhưng hiện nay nhiềutác giả nghiên cứu về vi khuẩn này đã cho răng vi khuẩn này có thể lây qua conđường giọt ban, điều này giúp lý giải cho khả năng lan tràn của vi khuẩn nay trong

môi trường bệnh viện [14]

A.baumannii hay gây bệnh trên bệnh nhân có bệnh mãn tính, suy giảm miễndịch HIV/AIDS, việc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, thuốc chống thải ghép Những người trên 60 tuổi, trẻ sơ sinh là đối tượng mà hàng rào miễn dịch tự nhiêngiảm hay trạng thái đa bệnh lý cùng lúc làm giảm sức đề kháng tạo điều kiện thuậnlợi cho nhiễm khuẩn [22, 34, 55]

2.2 Kháng sinh nhóm carbapenem và colistin được sử dụng trong điều tri

Acinetobacter baumannii

2.2.1 Giới thiệu về nhóm carbapenem

Carbapenem là một nhóm kháng sinh thuộc ho B-lactam, có pho kháng khuẩnrộng nhất so với các phân lớp khác của B-lactam, có kha năng tiêu diệt các vi khuânGram âm va Pseudomonas aeruginosa Nhóm kháng sinh nay gồm có: imipenem,meropenem, ertapenem và doripenem, còn 2 hoạt chất đang được nghiên cứu là

panipenem và faropenem [11].

Carbapenem có thé bền vững được với các thế hệ enzyme B-lactamase do vikhuẩn tiết ra, kế cả B-lactamase phô rộng Carbapenem có phổ kháng khuẩn baotrùm cả vi khuẩn Gram (+) lẫn Gram (-) nên có thé xem là kháng sinh phổ rộngnhất, được chỉ định trong điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nặng.

2.2.1.1 Cau tạo hóa học

Cấu tạo hóa học của bốn loại kháng sinh trong nhóm carbapenem được dùng

phô biên ở các bệnh viện được biêu hiện ở hình 2.3

\ 9,0 NeN Oo US ị

ức chế dehydropeptidase Imipenem/cilastatin có liên quan đến độc tính trên hệ thầnkinh trung ương như sự thay đổi trạng thái tinh than, rung giật cơ đặc biệt là co giật.Không sử dung imipenem dé điều trị viêm màng não [8,11].

Meropenem có phố kháng khuẩn tương tự như imipenem, được FDA chấpthuận năm 1996 Tuy nhiên meropenem 6n định hon với men dehydropeptidase ởthận, vì vậy có thể tác dụng mà không cần kết hợp với cilastatin Meropenem ít có

nguy co gây động kinh hơn imipenem-cilastatin Meropenem là carbapenem duy

nhất được chấp thuận dé diéu trị viêm màng não Imipenem và meropenem đượcdùng để điều trị nhiễm trùng bệnh viện nặng và đa nhiễm trùng gây ra bởi nhiềuchủng vi khuẩn dé kháng [8,11]

Ertapenem là một carbapenem thế hệ mới với phố kháng khuẩn hẹp hơn sovới imipenem, meropenem, được FDA chấp thuận năm 2001 Ertapenem tác độngtrên Enterobacteriaceae và vi khuân yém khí, nhưng kém hon các carbapenem kháctrên P.aeruginosa, Acinetobacter và các vì khuẩn Gram dương đặc biệt là vi khuẩnđường ruột và phế cầu kháng penicillin Ertapenem có thời gian bán hủy kéo dài vàđược dùng một lần mỗi ngày Ertapenem được chỉ định trong điều trị nhiễm trùng 6bụng, nhiễm trùng phụ khoa và viêm phối mắc phải trong cộng dong [8, 11]

Doripenem được FDA chấp thuận năm 2007 để điều trị nhiễm trùng đườngtiêu và nhiễm trùng 6 bụng Phố kháng khuẩn tương tự như meropenem, mặc dù khảnăng kháng P.aeruginosa in vitro mạnh hơn meropenem Can có thêm các thửnghiệm lâm sàng để xác nhận tính hiệu quả và an toàn của doripenem trong cáctrường hợp viêm phối, nhiễm khuẩn huyết và các nhiễm trùng nặng khác [ 8, 11].2.2.1.2 Cơ chế tác dụng

Carbapenem là nhóm kháng sinh thuộc họ B-lactam nên có cơ chế tac dụngchung của kháng sinh họ B-lactam, kháng sinh có tác dung ức chế quá trình sinhtong hợp thành tế bào vi khuẩn dẫn đến sự dung giải tế bào Dé có được tác dụngnày, chúng phải xâm nhập vào vách tế bảo vi khuẩn qua các kênh porin và gắn vớiPBP Những protein nay thực tế là các enzyme (transpeptidases) tham gia vào quátrình tạo liên kết chéo peptidoglycan — thành phần chính của vách tế bao vi khuẩn

[2 10, 11].

2.2.1.3 Các enzyme phân giải nhóm carbapenema) Kháng carbapenem do enzyme nhóm A

Enzyme nhóm A bao gồm NmcA/IMI (Not metallo enzyme carbapenemase/

imipenem-hydrolyzing B-lactamase), SME (Serratia marcescens enzyme), GES(Guiana extended spectrum) va KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) có

khả năng phân giải kháng sinh nhóm ÿ-lactam gồm: penicillin, cephalosporin,

carbapenem va aztreonam [19].

Enzyme IMI va NmcA được mã hóa bởi các gen năm trên nhiễm sắc thé của

chung Enterobacter spp phan lập tại Anh, Pháp và Agrentina, [MI-2 được mã hóa

bởi gen IMI-2 năm trên các plasmid của các chủng Enterobacter asburiae phan lậpđược từ nước sông tại Mỹ Enzym SME được mã hóa bởi các gen nằm trên nhiễmsắc thé của các chủng Serratia marcescens phân lập tại Mỹ và được chia thành 3

loại (SME-1, SME-2 và SME-3) [61].

Enzyme nhóm GES phát hiện lần đầu năm 2000 được mã hóa bởi các gennăm trên plasmid và có khả năng ly giải các kháng sinh phố rộng cephalosporin, tuy

nhiên một vài enzym thuộc nhóm này (GES-4,-5 và -6) có khả năng ly giải cáckháng sinh nhóm carbapenem [42].

KPC là enzyme có tác động mạnh nhất trên lâm sàng trong số các enzymethuộc nhóm A do KPC gây ra tình trạng kháng đa kháng sinh KPC lần đầu tiênđược phát hiện trên chủng K pneumoniae phân lập ở miền nam nước Mỹ năm1996, sau đó các trường hợp nhiễm khuẩn bởi các chủng K pneumoniae khángcarbapenem được phân lập rải rác tại Mỹ trong thập ký 1990 Cho đến những năm2000, tỷ lệ phân lập các chủng K.pneumoniae kháng carbapenem trên bệnh phẩm

lâm sàng tại Mỹ gia tăng một cách nhanh chóng, nghiên cứu tại Brooklyn-New

York cho thay khoảng 1/3 số chủng K pneumoniae phân lập năm 2004 mang gen

KPC mã hóa enzym KPC ly giải carbapenem [73].b) Kháng carbapenem do enzyme nhóm B ( metallo-beta-lactamase)

Nhóm B, metalo-bela-lactmmase (MBL) có kha nàng iy giả hầu hết cáckháng sinh phô rộng bao gồm: penicillin, cephalosporin và carbapenem, được phát

hiện lẫn đầu tiền trên c¿reus và Stenatrophomonas maltophilia, các gen ma hoa

MBL phan lớn nam trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn Sau đó nhiều nghiên cứu đãphát hiện sự lây lan nhanh chóng của các gen mã hóa MBL nam trên plasmid sangnhiều loại vi khuẩn đường ruột nhân lập từ các bệnh phẩm lâm sang ở nhiều quốcgia trên thé giới Cac enzym thường gặp nhất được phát hiện trên các chủng vikhuẩn đường ruot bao gồm các enzym IMP {active on imipenem), ViM (Verona

integron-encoded metallo-B-lactamase) va NDM-1 (New delhi metallo betalactamase-l) [53].

IMP được phát hiện đầu tiên trên các chúng Pseudomonas va Acinetobactervà vi khuẩn đường ruột, Hiện nay có khoảng 33 loại enzym thuộc nhom IMP đượcxác định có khá năng ly giải carbapenem được phát hiện tại nhiều quốc gia nhưNhật Ban, Bai Loan, Trung Quốc và Hy Lạp Chúng chủ yếu được phát hiện trêncác chúng P.aeruginosa và thột số it các vi khuẩn đường ruột tuy nhiên chỉ cóVIM-2 là enzym được phát hiện nhiều nhất trên thé giới [76]

Enzym NÖM-I kháng carbapenem được mã hóa boi gen NDM-1 năm trêncác plasmid được công bố vào năm 2009 tại Thụy Điển trên ching K.pneumoniae phân lập được từ bệnh nhân người An quốc tịch Thụy Điện có tiên sửchữa bệnh tại New Delhi, An Độ đã làm gia tăng sự chú ý của các nhà khoa học vìvi khuẩn mang gen NDM-1 có kha năng kháng lại rất nhiều loại kháng sinh và cókhả năng lây lan cao dẫn đến việc điều trị trở nên rất khó khăn [21]

c) Kháng carbapenem có enzyme nhóm D ( oxacilinase)

Một số OXA (oxacillin-hydrolyzing) quan trọng có khả năng ly giảicarbapenem như OXA-23 được phát hiện trên các chủng A.baumannii tại nhiềuquốc gia trên thế giới, OXA-51 nam trên nhiễm sắc thé của A.baumannii phân bỗtrên toàn cầu và OXA-51, hay OXA-58 kháng carbapenem cũng được phát hiện trêncác chủng Acinetobacter ở nhiều nơi trên thé giới Bên cạnh đó OXA-48 và OXA-181 cũng được tìm thấy ở một số nước tuy nhiên với số thượng thấp và khả năng ly

giải carbapenem kém [51, 53, 77].

2.2.1.4 Cơ chế đề kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii

Có bốn cơ chế thường gặp gây hiện tượng đa kháng thuốc ở A baumanniiđược nói đến nhiều nhất là: thay đổi vị trí đích tác động, đột biến mất kênh porinkhông cho kháng sinh qua màng tế bào vào bên trong vi khuẩn, bất hoạt kháng sinhqua các bơm day kháng sinh ra ngoài, tiết enzyme để phân giải kháng sinh 0-lactamase làm bat hoạt kháng sinh [2]

- Biến đổi vi tri gan kết ở ribosom: biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu

đơn vi ribosom dich làm giảm hoạt tính của kháng sinh macrolides, clindamycine,

nhóm aminosides hoặc chloramphenicol Sự biến đổi này làm cho kháng sinh khôngđủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của vi khuẩn dokhông thể găn kết vào vị trí tác dụng ở ribosom

- Biến đối ADN-gyrase va topoisomerase: ADN-gyrase là enzyme cân thiếtcho hoạt tính của các quinolone Sự đột biến nhất thời ở độc nhất một acid aminecủa ADN-gyrase gây ra dé kháng Tương tự như thé đối với các đột biến ở

topoisomerase.

- Biển đổi các enzyme đích: sự biến đổi của dihydropteroate synthetasekháng lại sự gắn kết với sulfamide và của dihydropteroate reductase làm mat nhạycảm với trimetoprime gây ra kháng thuốc Sự đề kháng của các vi khuẩn Gram âmđối với các sulfamide là do plasmide tạo các enzyme đề kháng

b) Tạo ra enzyme phân giải kháng sinh làm bất hoạt kháng sinh

Các Jj-lactamase là enzyme do vi khuẩn sinh ra va lây truyền theo đườngnhiễm sắc thé hoặc plasmid Chúng làm bat hoạt các kháng sinh nhóm j-lactambăng cách phá hủy câu nỗi amide của vòng j-lactam làm tách vòng lactam củakháng sinh Trong số các vi khuân Gram dương, S.aureus và cầu khuẩn Gramdương đường ruột là tác nhân gây bệnh thường sinh J-lactamase lây truyền quaplasmid nhật Ngoài ra, các trực khuẩn Gram âm đường ruột cũng sản xuất nhiêuloại B-lactamase được phân thành nhiều nhóm nhỏ

Dựa vào cau trúc phan tử và trung tâm hoạt động cua enzyme, Ambler

(1980) chia B-lactamases thành 4 lớp A, C, D và B như bang 2.1

Bảng 2.1 Phân loại enzyme beta-lactamase theo AmblerLớp ESBLs Carbapenemase

TEM, SHV, CTX-M, VER,Lớp A KPC, IMI, NMC, SME

PER, TLA, FSO

Lớp B NDM, IMP, VIM, SPM, GIMLop C | AmpC (CMY, FOX, )

LớpD |OXA OXA

e) Giảm tính thâm thấu của màng nguyên sinh chất

Sự giảm tính thấm của tế bào làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trongđến dich tac dụng, nguyên nhân là do biến đổi tính thắm lớp màng bên trong hoặcbên ngoài vi khuẩn Sự biến đối các lỗ trên thành tế bào vi khuân Gram âm có thélàm giảm hoặc ngăn cản sự khuyếch tán của kháng sinh vào đúng vị trí tác dụng.Dạng dé kháng này xảy ra đối với nhiều kháng sinh của nhiều nhóm khác nhau docó khi các kháng sinh khác nhau nhưng có thé dùng chung một loại lỗ

Mặt khác, sự đề kháng này là đặc hiệu khi một kháng sinh chỉ dùng riêngmột loại lỗ Ví dụ như sự đề kháng cua Pseudomonas aeruginosa với imipenem làsự dé kháng đặc hiệu gây ra do mat đi các lỗ riêng dành cho các carbapeneme

d) Bơm day kháng sinh ra ngoài

Một trong các cơ chế kháng thuốc khác của A baumannii là bơm day khángsinh ra khỏi mang vi khuẩn Cơ chế này giúp A baumannii loại bỏ kháng sinh ngaykhi mới tiếp xúc với mảng ngoài tế bào của vi khuẩn, ngăn ngừa sự tiếp xúc và xâmnhập của kháng sinh vào trong vi khuẩn, làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bàovi khuan Các chất vận chuyên day kháng sinh ra là các thành phan bình thường củatế bào vi khuẩn và góp phần cho tính đề kháng nội sinh của vi khuẩn chống lạinhiều thuốc kháng sinh

as z“ ft C=) A baumanniila _ ¬ s >? ` RAK Od

Sf NN : 5= “& > sẽ TY = @ khang sinhpao ree ` xã r= x

7 6 Scalise Strong tac _ ' ~ ~

J *~——~” _ymôi recng 4 ngoai bap= Sw

— ' | 2.Co-efflux ! 1< mdi trường ngoại bao =

mang ngoai

TL ; ~khodng gian bao

Sự kết hợp cơ chế bơm đây kháng sinh ra ngoài với cơ chế kháng qua độtbiến mất kênh porin làm cho khả năng kháng thuốc của A.baumannii trở nên mạnhmẽ Nếu đặt tất cả cơ chế đề kháng chung với nhau trên A.baumannii, cộng với hiệntượng đột biến điểm của hai gen gyrA va parC (gen kháng với KS nhómFluoquinolon) thì A.baumannii trở thành một vi khuẩn có khả năng kháng với tat cảcác loại kháng sinh để điều trị nó và khi ay nó thực sự là một con ác mộng, mộtthách thức đối với nhà lâm sàng [71, 75].

2.2.2 Giới thiệu về colistin2.2.2.1 Cau trúc hóa hoc

Colistin (còn gọi là polymyxin E) là một kháng sinh thuộc nhóm polymycin

Được phân lập lần đầu tiên tại Nhật Bản từ Bacillus polymyxa var colistinus vàonăm 1949 và sử dụng lâm sàng từ năm 1959 [15, 64] Câu trúc hóa học của colistinlà một hỗn hợp các polypeptid mạch vòng gồm colistin A và colistin B

colistin tiêm tĩnh mạch trong nhiễm khuẩn bệnh viện, khi mà vi khuẩn đã kháng cáckháng sinh khác, đặc biệt là trên bệnh nhân nhiễm Pseudomonas và Acinetobacter

spp [43, 47].

Colistin sẵn có trên thị trường gồm: colistin sulfat và colistin methansulfonat

(CMS) Dang CMS có hoạt lực kém hơn và ít độc tính hon so với dạng colistinsulfat.

trùng [1, 25, 30].

2.2.2.3 Cơ chế tác dụng

Dich tác dụng của colistin là mang ngoài tế bào vi khuẩn Colistin tác động

thông qua tương tác tĩnh điện giữa các phospholipid mang điện tích dương và các

phân tử lipopolysaccharid (LPS) mang điện tích âm tại màng ngoài tế bao vi khuânGram âm, gây xáo trộn màng tế bào Tiếp đó, colistin thế chỗ các cation hóa trị II(Mg2+ và Caa: ), đây vốn là các cation đóng vai trò 6n định thành phan LPS củamảng, kết quả là làm tăng tính thắm của màng tế bào, gây vỡ mang tế bào vi khuẩn,giải phóng các chất nội bảo và làm chết vi khuẩn [25, 65]

= gan két VỚI

oO A i —<— a 3 -bu ị Khu LPS và lam thay cõi

mans ngoai té bao

a) Điều trị nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, và phối hợp với các thuốc khác dé khửnhiễm chọn lọc ở đường tiêu hóa cho người bệnh chăm sóc tăng cường (dùngtheo đường uống)

b) Điều trị nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm: nhiễm khuẩn huyết, viêmmàng não, nhiễm khuẩn thận, nhiễm khuẩn đường niệu - sinh dục do các vikhuẩn nhạy cảm (dùng theo đường tiêm)

c) Điều trị nhiễm khuân đường hô hap (dang hit), đặc biệt ở người bệnh bị xơ

thấp và không phụ thuộc vao thời gian sử dụng colistin, trái ngược với dé kháng

thích nghi [25].

2.2.3 Phối hợp trong điều tri

Trong thực tế để nâng cao hiệu quả diéu trị, một số trường hop cân thiếtchúng ta phải phối hợp kháng sinh Mục đích phôi hợp kháng sinh là làm giảm khảnăng xuất hiện chủng dé kháng với những dé kháng do đột biến thì phối hop khángsinh sẽ làm giảm xác suất xuất hiện một đột biên kép; điều trị nhiễm khuẩn do nhiềuloại vi khuân gây ra, như vậy mỗi kháng sinh diệt một loại vi khuẩn, phối hopkháng sinh sẽ diệt nhiều loại vi khuẩn hon; làm tăng khả năng diệt khuẩn [2]

Phối hợp kháng sinh có thé dẫn đến tác dụng cộng (addition) hoặc hiệp đồng(synergism) hoặc đối kháng (antagonism) hay không thay đổi (indifference) so vớimột thuốc đơn lẻ [46, 1, 2, 10]:

+ Hiệp đồng là sự phối hop hai hay nhiêu thuốc mà tác dung thu được lớnhơn tông tác dụng của các thành phân: [A + B] > [A] + [B] Thường dùng trong délam tang tac dung diéu tri va lam giam tac dung phu, tac dung doc hai Hai thuốc cótác dụng hiệp đồng có thé qua tương tác dược động học (tăng hap thu, giảm thải trừ)hoặc tương tác dược lực học (trực tiếp hoặc gián tiếp qua receptor) Ví dụ phối hợpmột B-lactam với một aminoglycosid cho kết quả hiệp đồng do j-lactam làm mấtvách tạo điều kiện cho aminoglycosid dé dàng xâm nhập vào tế bào và phát huy tácdụng (phối hợp piperacilin với aminoglycosid điều trị nhiễm khuẩn nặng do trựckhuẩn mủ xanh; penicilin với gentamycin nhăm diệt liên câu) Phối hợp hai khángsinh cùng ức chế sinh tổng hợp vách vi khuẩn, nếu mỗi kháng sinh tác động vàomột protein gắn penicilin (PBP) - enzym trong quá trình tông hợp vách thì sẽ có tácdụng hiệp đông (phối hợp ampicilin (gắn PBP1) với mecilinam (gin PBP2) hay

ampicilin với ticarcilin).

+ Cộng hợp là khi phôi hop hai hay nhiều thuốc, tác dung thu được bangtong tác dụng của các thành phân: [A + B] = [A] + [B] Không ảnh hưởng tác độnglan nhau, nhưng có cùng hướng tác dụng Cộng hợp thường không được dùng ở lâmsả ng vì nếu cân thì tăng liều thuốc chứ không phối hợp thuốc

+ Độc lập là khi phối hợp hai hay nhiều thuốc, tác dụng thu được có kết quả

không khác biệt so với dùng một kháng sinh.

+ Đối kháng là khi phối hợp hai hay nhiều thuốc, tác dụng thu được thấp hơntong tac dụng của các thành phân: [A + BỊ < [A] + [B] Sự phối hợp này đưa đếnkết quả làm giảm hoặc tiêu hủy đi tác động của một hay nhiều thành phan khi phốihợp Đối kháng có thé chỉ một phan (partial antagonism), nhưng cũng có thé đốikháng hoàn toàn khi A làm mat hoàn toàn tác dụng của B Thường ứng dụng dé giảiđộc Ví dụ phối hợp tetracyclin cùng penicilin có thể dẫn đến tác dụng đối kháng, vìpenicilin có tác dụng tốt trên những tế bào đang nhân lên, trong khi tetracyclin lạiức chế sự phát triển của những tế bảo nảy

Phối hợp kháng sinh áp dụng cho những trường hợp bệnh nặng mà không cóchan đoán vi sinh hoặc không chờ được kết quả xét nghiệm, ở người suy giảm sứcdé kháng hay nhiễm khuẩn do nhiều loại vi khuẩn khác nhau Khi phối hợp, cầndùng đủ liều và nên lựa chọn những kháng sinh có tính chất dược động học gầnnhau hoặc có tác dụng hiệp đồng

2.3 Tình hình đề kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii trên thé giới

va trong nước

Sự kháng kháng sinh nhóm carbapenem của A.baumannii là do vi khuẩn này

có chứa gen mã hóa enzyme -lactamase có khả năng ly giải các kháng sinh nhómcarbapenem như IMP, VIM, SIM và NDM-I thuộc lớp B (Metallo-beta-lactamase)và Oxacilinase thuộc lớp D Mặc dù vậy, sự khang kháng sinh của A.baumannii chu

yếu vẫn do các gen có chứa gen mã hóa enzyme thuộc lớp D của vi khuẩn có khảnăng thủy phân và ly giải các kháng sinh nhóm B lactam, điển hình là nhóm

carbapenem.

Tại Anh, sự nhiễm khuẩn bệnh viện do Acinetobacter kháng carbapenems đã

xảy ra từ năm 2000 Giữa năm 2004 và 2008 tỷ lệ không nhạy cảm với meropenemđã tăng từ 13 - 29% Trong năm 2008 sự không nhạy cua Acinetobacter với các lớpkhác của kháng sinh được báo cáo: aminoglycosides khoảng 20%; ciprofloxacin30%; ceftazidime 70%; cefotaxime 89%; piperacillin/ tazobactam 50%.

Ở Mỹ, nhiễm khuẩn bệnh viện xác định 65-75% bởi Acinetobacter da khángthuốc và không nhạy với carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995 lên 57% trong

năm 2006 Cac vụ dịch gây ra bởi A.baumannii kháng carbapenem được báo cáo

ngay càng gia tăng tại nhiều khu vực trên thế giới bao gồm cả các quốc gia đangphát triển nhu Morocco, Thái Lan, An Độ va Indonesia Ngoài ra, các vu dich gây

ra bởi các chung Acinetobacter ma không xác định rõ là do A.baumannii khang

carbapenem đã được báo cáo tại các nước châu Phi (Lagos, Ngeria) và châu Á trong

đó có Nepal.

Một báo cáo về tình hình đề kháng carbapenem của Acinetobacter tại khuvực châu Á - Thái Bình Dương được thực hiện bởi chương trình giám sát SENTRY

2006-2007: (SENTRY Surveillance ProGram) thực hiện trên 544 Acinetobacter

được phân lập tai 41 trung tâm thuộc 10 nước cho biết: 42.3% không nhạy cảm với

carbapenem, 70.4% -lactamase mang nhóm D (OXA) hoặc nhóm B (MBL).

Nhóm nghiên cứu ASIAN HAP Working Group đã thực hiện nghiên cứu tại

các bệnh viện thuộc 10 quốc gia châu Á (2008) Kết quả cho thay Acinetobacterspp., P.aeruginosa, S aureus va K pneumoniaeare là các chung vi khuẩn đượcphân lập nhiều nhất từ người lớn mang bệnh viêm phổi bệnh viện (HAP) hay viêmphối liên quan đến thở máy (VAP)

Từ tháng 4/2007- 4/2008, Federico Perez và cộng sự với đề tài:

*Acinetobacter baumannii va Klebsiella pneumonia khang carbapenem qua một hệ

thong bénh vién: chiu tac dong pho bién ở các co sở chăm sóc đặc biệt” với sự lanrộng vi khuẩn này tại 6 bệnh viện bang Ohio (Mỹ), kết quả: trong 39 chủngA.baumannii phân lập được, có hai kiểu gene chiếm ưu thế liên quan đến dòngEuropean clone II được tìm thấy 18 chủng sau khi phân tích chứa blaOXA-23 và 4chủng có blaOXA-24/40 Những bệnh nhân nhiễm A baumannii và K pneumoniaekháng carbapenem thì lớn tuổi, mang đồng thời nhiều bệnh, thường ra vào các cơ sởchăm sóc đặc biệt và năm bệnh viện thời gian đài (trên 25 ngày) với tỷ lệ tử vong

cao (trên 35%) [27]

Từ 7/2007-6/2009, Paviz Vahdani va cộng sự tại bệnh viện Loghman Hakim,

với dé tài: “Sự nhiễm Acinetobacter baumannii đa kháng kháng sinh trong một

bệnh viện 400 giường tại Tehran, Iran”, kết qua: Acinetobacter được phân lập phốbiến từ các mẫu bệnh phẩm thuộc cơ quan hô hấp Vi khuẩn này kháng với

ceftazidime (96%), ceftizoxime (95%), ceftriaxone (93%), amikacin (58%),gentamicin (68%), Co-terimoxazole (85%) va _ ciprofloxacin (85%) Ty lệ

Acinetobacter kháng Imipenem thấp nhất (9%) [56]

Năm 2011, Pfeifer Y cùng cộng sự với đề tài: “Đặc tính phân tử củablaNDM-I trong 1 chủng A.baumannii phân lập ở Đức năm 2007”, kết qua:

A.baumannii da khang phan lập được mang gene ÿ-lactamase blaNDM-I và

blaOXA-64, nhưng không có trình tự đoạn ISAbal năm ở vị trí đầu tiên Đồng hóatoàn bộ DNA genome và phân tích trình tự cho thay blaNDM-1 năm giữa 2 yếu tô

xen của ISAbal25 [72].

Năm 2012, Pawel Nowak, Paulina Paluchowska, Alicja Budak, với dé tai:“Sur phân bố của các gene blaOXA giữa các chủng A.baumannii kháng Carbapenemở bệnh viện Phần Lan”, kết quả: Nghiên cứu bao gom 104 chung A.baumanniikháng Carbapenem đã phan lập, gồm những bệnh nhân trong ICU va BTU thuộckhu đặc biệt trong bệnh viện ở Krakow Multiplex PCR được dùng để tìm ra genemã hóa cho enzyme Carbapenemase OXA được chon Phân tích PCR thể hiện sựhiện diện của nhóm gene blaOXA-51va ISAbal trong tất cả các chủng phân lập 46

chủng mang nhóm gene blaOXA-5 [và blaOXA-23 trong khi 48 chủng mang nhómgene blaOXA-51 và blaOXA-40 3 chung phan lập mang nhóm gene blaOXA-51,blaOXA-23 va blaOXA-40 7 chung mang gene blaOXA-51 nhưng không có

enzyme thuộc vào các họ khác sau khi được kiểm tra So sánh các chủng phân lập ởICU và BTU biểu hiện sự trội hơn của nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-40 ở

ICU trong khi nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-23 ở BTU [57].

Một nghiên cứu của Lihua Qi cùng cộng sự về “Mỗi quan hệ giữa sự dékháng kháng sinh, sự hình thành màng sinh hoc và sự kháng thuốc đặc hiệu đối vớimàng sinh học trong A.baumannii từ năm 2010 — 2013 từ một số bệnh viện ở TrungQuốc, kết quả trong 272 mẫu phân lập được có 31 loài đa kháng thuốc (MDR), và166 đã được kháng thuốc rộng rãi (XDR) Ngoài ra, trong 249 mẫu phân lập được

thé hiện sự hình thành màng sinh học, trong số đó có 63 loài có chất tao màng sinh

học mạnh hơn chủng loại ATCC19606 [45].

Trong báo cáo của Holly Hoffman-Roberts về “ Tỷ lệ nhiễm A baumannii đakháng thuốc ở cá khu vực ngoại tru và chăm sóc đặc biệt, bao gồm nhiễmAcinetobacter kháng carbapenem, ở Mỹ năm 2015” thì CDC xếp loại A.baumanniiđa kháng thuốc là mối đe dọa nghiêm trọng Kết quả trong số 5582 chủng được thửnghiệm, có 2124 chủng là MDR A.baumannii Tỷ lệ MDR A.baumanmi cao nhấttrong giai đoạn khởi phát của bệnh viện, tiếp theo là nhập viện và lưu động với S0%

chủng MDR A.baumannii có khả năng kháng carbapenem [32].

Một nghiên cứu của Philip năm 2015 chỉ ra colistin phối hợp với meropenemcho tác dụng hiệp đồng tại thời điểm 24h trên 49/52 (94.2%) chủng phân lậpA.baumannii, trong khi đó colistin va doripenem cho tác dụng hiệp đồng 25/25(100%) chủng phân lập Ngoài ra, khi nghiên cứu tác dụng hiệp đồng của

colistin/vancomycin va colistin/teicoplanin trên 5 chủng A.baumannii phan lập đa

kháng nhạy cam với colistin cho thay tac dung uc ché mạnh mẽ sự tái sinh trên 4/5chủng (vancomycin) hay 5/5 chủng (teicoplanin) với tac dụng diệt khuẩn gấp 5 đến8 lần của logo CFU/ml tại thời điểm 24h so với phác đồ colistin đơn độc Người tacho rằng hoạt tính trên vi khuẩn Gram âm của những kháng sinh thông thườngkhông có hoạt tính này (vi dụ glycopeptid, rifampicin, macrolid ) là do sự thay đổibản chất của màng ngoài tế bào vi khuẩn trong quá trình kháng lại colistin, làm thayđôi tính thắm của mang [18]

Ngày nay, nhiều nhà nghiên cứu đã phát hiện 4 gen OXA chính, trong đó có3 gen thường phân lập được là từ những nhiễm khuẩn mắc phải trong bệnh viện nhưOXA23, OXA24, OXA58, được mã hóa trên nhiễm sắc thé và plasmid, riêngOXA5T (là gen kháng thuốc tự nhiên được mã hóa trên nhiễm sắc thể) và còn cóđến 15 loại gen OXA kháng kháng sinh khác nhau trong các nhóm OXA có tínhchất tương tự cũng đã được tìm thấy

Ở Việt Nam, hiện nay Acinetobacter được xem là vi khuẩn hàng đầu gâyviêm phối bệnh viện tại những bệnh viện lớn trong nước và kháng với hầu hếtkháng sinh kế cả những kháng sinh phố rộng mạnh nhất hiện nay Trong tong kết

của Bộ Y tế năm 2004, phan lớn những kháng sinh sử dụng thường xuyên hiện nay

đã bị kháng như ceftriaxone 70%, ceftazidime 64%, ciprofloxacine 55% và

Acinetobacter trở thành tac nhân hang đầu kháng toàn bộ kháng sinh cùng vớiP.aeruginosa gây rất nhiều khó khăn cho công tác điều trị

Một khảo sát tại Bệnh viện Chợ Ray, A.baumannii cùng với E.coli,

P.aeruginosa, Klebsiella spp., S aureus là 5 tac nhan gây bệnh thường gặp trong

nhiém trùng bệnh viện Cũng tại bệnh viện Chợ Ray, nghiên cứu cua Cao XuânMinh và cộng sự (2010) về mối liên quan giữa kiểu gen và tính kháng thuốc củaA.baumannii cho thay mức độ đa kháng thuốc của A.baumannii chiếm tỷ lệ cao(83%) gan như là kháng hoàn toàn (> 80%) với các kháng sinh thuộc nhómcephalosorine III và ciproloxacine; mức độ kháng thuốc cao (>50%) và gia tăng qua

các năm với các kháng sinh nhóm levofloxacine và carbapenem [6].

Trong 6 tháng đầu năm 2011, tại bệnh viện Đại Học Y Dược TP HCMnhóm nghiên cứu của Cao Minh Nga về sự kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnhthường gặp cho thấy Acinetobacter gây bệnh những người bị suy giảm sức dékháng và những bệnh nhân lớn tuổi Acinetobacter đề kháng cao (>40%) với nhiềukháng sinh thông thường, kế cả Imipenem (66,67%) và Meropenem (45,95%), Cáckháng sinh có mức đề kháng thấp hơn cả là: Levofloxacine (28,95%), Ciprofloxacin

(32,56%) Tetracycline (32,21%) và Colistin (39,02%) [4].

Mới đây, nhóm nghiên cứu của Ngô Thị Hồng Phương và cộng sự (2013) đã

khảo sát tỷ lệ khang kháng sinh và sàng lọc nhanh các chung có kha năng tạoenzyme metallo-B-lactamase (MBL) từ 30 chung A.baumannii phan lập được trên

195 mẫu bệnh phẩm tại viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Và kết quả thu được chothay tỷ lệ kháng các loại kháng sinh được dùng hầu như trên 90%, nhạy hoàn toànvới colistin và 50% số chủng sản xuất men MBL [7]

Tại bệnh viện Đa Khoa Thống Nhất Đồng Nai, nơi nhóm đang tiến hànhnghiên cứu, cũng đã có một số nghiên cứu về tình trạng NKBV do tác nhânA.bamannii và sự đề kháng kháng sinh của chúng đã chỉ ra các kết quả như sau: đốivới NKBV do tác nhân A baumannii chiém tỷ lệ cao nhất với 36,2% và tỷ lệ dé

kháng với kháng sinh nhóm carbapenem lần lượt là kháng imipenem là 90,2% va

meropenem là 92,7% |9, 12].

Hiện tại các nghiên cứu ở nước ta hầu hết đều ở việc khảo sát mức độ nhiễmkhuẩn bệnh viện và xác định ty lệ kháng kháng sinh bởi tác nhân A.baumannii.Chưa có nhiều những nghiên cứu đi sâu vào các cơ chế dé kháng kháng sinh, khảosát tác dụng của việc phối hợp kháng sinh cũng như sự tương tác thuốc giữa việc sửdụng các loại kháng sinh và những loại thuốc đặc trị cho từng bệnh, vì vậy việc điềutrị cho các bệnh nhân còn gặp nhiều khó khăn và chưa mang lại hiệu quả cao Việcnăm rõ tỷ lệ các gene mã hóa enzyme thủy phân carbapenem ở A.baumannii cùngvới những kiến thức lâm sang, đồng thời sử dụng kháng sinh phối hợp dé điều trị sẽmở ra cơ hội thành công trong việc điều trị đối với các bệnh nhân nhiễm khuẩn bởitác nhân A.baumannii Ngoài ra, việc nam rõ tỷ lệ các gene mã hóa enzyme thủyphân carbapenem ở A.baumannii giúp bệnh viện có thêm nguồn thông tin chính xácvề tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện, qua đó bệnh viện có kế hoạch kiểm tra, giámsát về thực hiện vệ sinh tay của nhân viên y tế, vệ sinh môi trường bệnh viện, giámsát việc xử lý dụng cụ nội soi mềm và dụng cụ ndi soi phẫu thuật, cũng như theo doiviệc đặt thông tiểu tốt hơn nhằm hạn chế và ngăn ngừa khả năng lây nhiễm, lưu trútrên bề mặt trang thiết bị y tế bởi tác nhân A.baumannii

Chương 3 DOI TƯỢNG, VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Ching vi khuẩn Acinetobacter baumannii thu từ 5 loại mẫu bệnh phẩm(phân, nước tiểu, dam, dịch màng phổi, máu) của những bệnh nhân đến khámđiều trị tại bệnh viện Da khoa Thống Nhất, Đồng Nai

3.2.Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tai thực hiện tại khoa Vi Sinh - Bệnh viện Da khoa Thống Nhất, Dong

Nai

Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2016 đến tháng 11/2017

3.3 Vật liệu nghiên cứu

Hóa chất định danh: BA, MC, MHA, các loại kháng sinh, BHI, glycerol Hóa chất phân tích: gel Agarose 2%, bộ tách chiết DNA, mix dùng để

PCR 3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tong quát