Góp phần xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn fructophilic lactic acid (flab) phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật và thử nghiệm tạo chế phẩm

I H C QU C GIA TP HCM I H C BÁCH KHOA CAO THANH NH GÓP PH N XÂY D NG B P GI NG VI KHU N FRUCTOPHILIC LACTIC ACID (FLAB) PHÂN L P T H TIÊU HOÁ ONG M T VÀ TH NGHI M T O CH PH M ISOLATION OF FRUCTOPHILIC LACTIC ACID BACTERIA (FLAB) FROM THE HONEY BEE DIGESTIVE SYSTEM CREATES A COLLECTION OF FLAB AND EXPERIMENTS TO MAKE PRODUCTS Chuyên ngành: Công Ngh Sinh H c Mã s : 60420201 LU TP H CHÍ MINH, Tháng 09 21 C HOÀN THÀNH T I: I H C BÁCH KHOA -HCM Cán b ng d n khoa h c: PGS TS Nguy Cán b ch m nh n xét 1: PGS.TS Phan Th ng Trang Cán b ch m nh n xét 2: TS Nguy Lu c b o v t i Tr ng i h c Bách Khoa, HQG Tp (tr c n) Thành ph n H i n v n th PGS.TS Nguy n Ti n Th ng m: Ch t ch PGS.TS Lê Th Thu Tiên PGS.TS Phan Th ng Trang TS Nguy Ph n bi n PGS.TS Nguy y viên Xác nh n c a Ch t ch H i chuyên ngành sau lu n v n ã CH T CH H Ph n bi n NG ng Khoa qu n lý c s a ch a (n u có) NG KHOA K THU T HÓA H C - - NHI M V LU H tên h c viên: Cao Thanh Nh MSHV: 1770179 -09-1994 Chuyên ngành: Công ngh sinh h c I Mã s : 60420201 TÀI: Góp ph n xây d ng b p gi ng vi khu n Fructophilic Lactic Acid (FLAB) phân l p t h tiêu hóa ong m t th nghi m t o ch ph m II NHI M V VÀ N I DUNG: - Phân l p vi sinh v t FLAB t h tiêu hóa ong m t - Kh o sát m t s ho t tính probiotic c a vi sinh v t phân l p - o ch ph m probiotic t vi khu n n ch n III NGÀY GIAO NHI M V : 21/09/2020 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 19/04/2021 V CÁN B NG D N: PGS TS Nguy N i dung yêu c u lu c thông qua b môn Tp HCM, ngày tháng NG KHOA K THU T HÓA H C (H tên ch ký) L IC c hoàn thi n l cc ab n c nhi u s t y cô, b n bè, nh ng v t d ng xung quanh u tiên, vơ bi ch c nh v m t a v ng c qua nh ng th thách, nh s ng Con xin c c n th gi i kh e m nh bên Em xin c h ng h ng h c t p hoàn thành t t lu Em xin g i l i c c nh n Cô PGS TS Nguy n Thúy truy n d y ki n th c, ni ng c m v i em t nh u, mà c ch p ch ng n ngày cu có l cs L ic v i nh u ng phí nh ng ki n th c, tr i nghi m c a nh ng ngày tháng h c t p làm vi c, s d ng nh u ngh l giúp ích cho xã h i tr thành m t cơng dân có trí tu , c Em xin chân thành c n Quý Th y Cô khoa Công ngh Hóa h c, Th y Cơ B mơn Cơng ngh Sinh h c, th y Thi h ct tr em trình ng hành anh th c hi tài này, b n nh ng h Nh su t trình h c Th anh ch , b n làm vi c phịng thí nghi m c a B mơn Q trình th c hi n lu ki n th c, lu góp ý c a Th t nghi p v i s h n ch v th i gian i nh ng sai sót Em mong nh em có th hồn thi n lu b i cs n th c c a TÓM T T LU n xây d ng b p gi ng vi khu n Fructophilic Lactic Acid (FLAB) phân l p t h tiêu hoá ong m t th nghi m t o ch ph c th c hi n v i m p gi ng FLAB xây d ng quy trình s n xu t ch ph m probiotic cho ong m t ti d n thay th thu u tr b nh cho ong m u n vi c d n t k t qu sau: tài phân l c 14 ch ng LAB sàng l c ng viên FLAB M4, M5, M6, M8 v i ch c cung c p b i b môn nghi m C ch ng FLAB có kh b nh th i u trùng ong m t v n gây ng kính vịng kháng khu n t 8,67 ± n 15,33 ± 0,58 mm m sau: có kh u pH th p, ch u nhi t, kh t không nh y c m v i streptomycin kanamycin B n ch ng FLAB M4, M5, M6 M8 có kh acid acetic v i n ng h p acid lactic, t 2011 ng M8 có kh ng h p c lo i acid cao nh K t qu u ki n thí nghi m nh danh theo trình t nh c ch ng phân l p m i u Lactobacillus kunkeei v ng l t 99,24%, 99,43%, 99,44% 99,43% Trong ch ng vi khu n kh o sát, ch ng L kunkeei M8 mang nhi th nghi m t o ch ph m probiotic v i thông s phù h p trình s y bao g m: t l b u vào 1000 chu n probiotic v u nành ph i tr n 15%, nhi ng d ch phun 1,5 cm3/s Ch ph m nh khơng khí t tiêu vi khu n s ng cao 9,63 log CFU/g ii SUMMARY The topic "Isolation of Fructophilic Lactic Acid Bacteria (FLAB) from the honey bee digestive system creates a collection of FLAB and experiments to make products" was carried out with the aim of contributing to the collection of FLAB varieties and started creating a process to produce probiotic products for honey bees, gradually replacing antibiotics to treat diseases for honey bees The topic achieved the following results: Isolated 14 LAB strains and screened four FLAB candidates, namely M4, M5, M6, M8 along with one FLAB strain F4 provided by the department to be tested All five strains of FLAB were resistant to bacteria causing foulbrood disease on honey bees with antibacterial circle diameters from 8,67 ± 0,58 mm to 15,33 ± 0,58 mm Five FLAB strains M4, M5, M6, M8, and F4 have the following characteristics: low pH tolerance, heat resistance, good adhesion ability, and insensitive to streptomycin and kanamycin Four FLAB strains, M4, M5, M6, and M8, have the ability to synthesize lactic acid, acetic acid with concentrations from 2011 to 2463 mg/kg, in which strain M8 has the highest ability to synthesize both acids in the same condition The results of 16S rRNA sequencing identified all four new isolates M4, M5, M6, and M8 as Lactobacillus kunkeei with similarity of 99,24%, 99,43%, 99,44%, and 99,43% respectively Among the surveyed bacteria strains, strain L kunkeei M8 has more advantages for testing to create probiotic products with suitable parameters during the drying process including percentage of mixed soybean meal 15%, the inlet air temperature is 1000C and the spray fluid flow is 1,5 cm3/s The product obtained met probiotic standards with moisture content less than 5% and a high density of live bacteria 9,63 log CFU/g iii L Góp ph n xây d ng b p gi ng vi khu n Fructophilic Lactic Acid (FLAB) phân l p t h tiêu hóa ong m t th nghi m t o ch ph m u c a T t c s li u s d ng lu n t qu nghiên c u t th c hi n, t tìm hi u tài li u có ngu n g c, trích d n rõ ràng hồn tồn trung th c Tơi xin ch u hoàn toàn trách nhi cb ng v s Tp H Tác gi tài Cao Thanh Nh iv M CL C DANH M C B NG viii DANH M C HÌNH ix DANH M C CH L IM VI T T T x U NG QUAN TÀI LI U 1.1 Tình hình b u tr b nh ong m t 1.1.1 Các lo i b nh ph bi n 1.1.2 B nh th i u trùng châu Âu (European foulbrood) 1.1.3 B nh th i u trùng châu M (American foulbrood) 1.1.4 u tr b nh ong m t 1.2 Các vi sinh v t gây b nh th i u trùng ong m t 1.2.1 Melissococcus pluton 1.2.2 Paenibacillus larvae 1.3 H vi sinh v t h tiêu hóa ong m t 1.3.1 H tiêu hóa ong m t 1.3.2 H vi sinh v t h tiêu hóa ong m t 10 1.4 Vi khu n Fructophilic Lactic Acid (FLAB) 11 1.4.1 1.4.2 m chung 11 Các y u t ns ng phát tri n c a FLAB 14 1.4.3 c tính probiotic c t o ch ph m probiotic cho ong m t 15 1.5 Các nghiên c u v tài 16 U 19 2.1 Th 2.2 V t li m nghiên c u 19 ng, hóa ch t thi t b 19 2.2.1 V t li u 19 2.2.2 ng hóa ch t 19 2.2.3 Trang thi t b 20 v 2.3 nghiên c u t ng quát thuy t minh quy trình 21 2.3.1 Phân l p sàng l p ch ng FLAB 22 2.3.2 Sàng l c ch ng FLAB có kh n gây b nh Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae Paenibacillus alvei 22 2.3.3 Tuy n ch n ch ng FLAB có ho t tính probiotic ho t tính k thu t 23 2.3.4 Phân tích y u t kháng vi khu n gây b nh ong m t c a ch ng n ch n 24 2.3.5 nh danh 25 2.3.6 B o qu n b gi ng 25 2.3.7 m dò kh o ch ph m probiotic cho ong m t 25 2.4 27 2.4.1 m khu n l c 27 2.4.2 ch 27 2.4.3 t bào b 28 2.4.4 m Gram 28 2.4.5 Th nghi m catalase 28 2.4.6 X lý s li u 29 T QU VÀ BI N LU N 30 3.1 Phân l p sàng l c vi khu n FLAB 30 3.1.1 Phân l p sàng l c FLAB 30 3.1.2 Sàng l c vi khu 3.2 30 Sàng l c ch ng vi khu n FLAB có kh n gây b nh cho ong m t 33 3.3 Tuy n ch n ch ng FLAB sàng l c có ho t tính probiotic 34 3.3.1 Kh 3.3.2 Kh o sát kh ng có pH th p 35 bám dính 36 3.3.3 3.3.4 3.4 37 Kh o sát kh u nhi t 39 nh danh 40 vi 3.5 Phân tích y u t có kh n gây b nh ong m t c a ch ng n ch n 41 3.6 3.6.1 o ch ph m probiotic cho ong m t 42 Kh o sát ng c a t l b n ch ng ch ph m 43 3.6.2 Kh o sát n ch 3.6.3 Kh o sát ng c a nhi u vào s y phun ng ch ph m 44 ng nh p li u s n ch ng ch ph m 44 T LU N VÀ KI N NGH 46 4.1 K t lu n 46 4.2 Ki n ngh 46 TÀI LI U THAM KH O 47 PH L C vii K t qu nh danh ch ng M5 K t qu nh danh ch ng M6 K t qu nh danh ch ng M8 10 11 Ph l c 6: K t qu phân tích y u t kháng khu n Ki m tra y u t kháng khu n c a ch ng M4 12 Ki m tra y u t kháng khu n c a ch ng M5 13 Ki m tra y u t kháng khu n c a ch ng M6 14 Ki m tra y u t kháng khu n c a ch ng M8 15 Ph l c 7: ng t l b n ch ph m m s ng c a L kunkeei tính: ch ph m (%) 10% 15% 20% 25% 9,86 4,56 4,48 3,75 9,82 4,60 4,50 3,72 9,80 4,62 4,54 3,70 tính: M 10% s ng c a L kunkeei (log CFU/g) 15% 20% 25% 9,62 9,35 9,35 9,60 9,30 9,35 9,65 9,38 9,31 16 Ph l c 8: ng c a nhi s n ch ph m m s ng c a L kunkeei tính: ch ph m (%) C) 900C 1000C 1100C 1200C 6,85 4,56 4,50 3,85 6,92 4,60 4,52 3,80 6,88 4,62 4,50 3,89 tính: m s ng c a L.kunkeei (log CFU/g) 900C C) 1000C 1100C 1200C 9,62 7,45 3,84 9,60 7,40 3,82 9,65 7,41 3,88 17 Ph l c 9: ng c ng d n ch ph m m s ng c a L Kunkeei tính: ch ph m (%) /s) 1.5 2.5 4,60 4,56 8,85 9,67 4,62 4,60 8,85 9,65 4,55 4,62 8,82 9,60 tính: M s ng c a L.kunkeei (log CFU/g) 1.5 9,65 9,61 9,70 9,63 9,60 9,64 /s) 2,5 18 PH N LÝ L CH TRÍCH NGANG H tên: Cao Thanh Nh 01 09 1994 a ch liên l c: 20/130/2A B Bao Tân Th , Qu n Tân Phú, Tp HCM O T ngày 25/08/2012 15/07/2016: Sinh viên n p Th c ph m Thành ph H Chí Minh T ngày 06/02/2017 Nay: H c viên cao h c Thành ph H Chí Minh Q TRÌNH CƠNG TÁC T ngày 01/07/2017 27/02/2018: Cơng ty TNHH Khoa h c K thu t T ngày 19/06/2018 Nay: Cơng ty CP Hóa c ph m Mekophar 19 ... TÀI: Góp ph n xây d ng b p gi ng vi khu n Fructophilic Lactic Acid (FLAB) phân l p t h tiêu hóa ong m t th nghi m t o ch ph m II NHI M V VÀ N I DUNG: - Phân l p vi sinh v t FLAB t h tiêu hóa ong. .. sâu v ti xây d ng ch ph m probiotic cho ong Vì v PH N XÂY D NG B tài lu GÓP P GI NG VI KHU N FRUCTOPHILIC LACTIC ACID (FLAB) PHÂN L P T TH làm NGHI M T O CH PH M H TIÊU HOÁ ONG M T VÀ c th c... sinh v t h tiêu hóa ong m t 1.3.1 H tiêu hóa ong m t 1.3.2 H vi sinh v t h tiêu hóa ong m t 10 1.4 Vi khu n Fructophilic Lactic Acid (FLAB) 11 1.4.1 1.4.2 m chung