Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic và thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi lợn

Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHAN THỊ THU DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GIỐNG VI SINH VẬT CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM PROBIOTIC ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI LỢN CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ HỌC VIÊN :09310564 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2011 CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày tháng năm ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phan Thị Thu Dung Giới tính : Nữ Ngày, tháng, năm sinh : 20 – 05 – 1986 Nơi sinh : Kiên Giang Chuyên ngành : Công nghệ sinh học MSHV: 09310564 Khoá (Năm trúng tuyển) : 2009 1- TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic ứng dụng chăn nuôi lợn” 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: - Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn lactic từ hệ tiêu hóa lợn - Tiến hành thí nghiệm khảo sát sàng lọc chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic - Định danh, lập sưu tập lưu trữ giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic cao - Thử nghiệm tạo chế phẩm probitic ứng dụng chăn nuôi 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 15/7/2010 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30/12/2010 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: - PGS TS Nguyễn Thúy Hương – Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức giúp em hoàn thành tốt luận văn - PGS TS Nguyễn Đức Lượng Bộ môn Công Nghệ sinh học – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM tạo điều kiện cho em trình học tập thực luận văn môn - Tất quý thầy cô Trường Đại học Bách Khoa Tp HCM giảng dạy cho em kiến thức bổ ích suốt chương trình đào tạo bậc cao học đại học - Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn - Các bạn người thân động viên suốt thời gian học tập Tp HCM, ngày 14 tháng 01 năm 2011 Học viên Phan Thị Thu Dung TÓM TẮT ĐỀ TÀI - Tên đề tài: “Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic thử nghiệm tao chế phẩm probiotic ứng dụng chăn nuôi lợn” - Học viên thực hiện: Ks Phan Thị Thu Dung - Cán hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thúy Hương - Thời gian thực hiện: từ tháng 07/2010 đến tháng 12/2010 - Đề tài thu số kết sau: Phân lập 23 chủng vi sinh vật từ hệ tiêu hóa lợn Qua bước khảo sát đặc điểm hình thái, chúng tơi lựa chọn 16 chủng vi khuẩn có đầy đủ đặc điểm tính chất nhóm vi khuẩn Lactic Các chủng ký hiệu mã hóa từ L1 – L10 K3 → K9 Qua sàng lọc hoạt tính probiotic bao gồm khả chịu đựng điều kiện cực đoan pH thấp, pepsine, muối mật khả kháng vi sinh vật, chúng tơi lựa chọn chủng có hoạt tính probiotic cao Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium bifidum Lý lịch chủng xây dựng với tất đặc điểm, tính chất nguồn gốc bảo quản Bộ môn Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Tp HCM Với chế độ sấy phun: lưu lượng 2.5cm3/s, áp suất phun 2kg/cm2, nhiệt độ đầu vào 1000C nhiệt độ đầu dịng sản phẩm 400C, chúng tơi xác định hàm lượng chất bảo vệ sử dụng 20% whey protein 15% maltodextrin + 10% tinh bột Chế phẩm sau sấy đạt chất lượng: độ ẩm từ 4.5 - 4.8% mật độ tế bào đạt 8.51x108 – 9.08 x108 cfu/g sản phẩm Tỷ lệ hai chủng Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium bifidum sản phẩm 1:1 i MỤC LỤC Mục lục .i Danh mục bảng v Danh mục hình vii Danh mục chữ viết tắt viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Cơ chế hoạt động probiotic 1.1.3 Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để sản xuất probiotic 1.1.4 Khái niệm prebiotic, synbiotic 1.2 Ứng dụng probiotic lĩnh vực chăn nuôi 1.2.1 Sử dụng kháng sinh chăn nuôi nhược điểm .6 1.2.2 Probiotic thay cho kháng sinh chất kích thích sinh trưởng 1.2.3 Kiểm soát chứng nhận sản phẩm probiotic 1.2.4 Những tiêu chí lựa chọn probiotic cho động vật .9 1.2.5 Mức độ an toàn sản phẩm probiotic sử dụng chăn nuôi 10 1.2.6 Một số sản phẩm probiotic thương mại ứng dụng chăn nuôi .11 1.3 Tác dụng probiotic đến hệ tiêu hóa trình sinh trưởng lợn .15 1.3.1 Quá trình tăng trưởng lợn 15 1.3.2 Những stress lợn gặp phải giai đoạn cai sữa 16 1.3.3 Cấu trúc hình thái chức ruột non lợn giai đoạn cai sữa .17 1.3.4 Tác dụng probiotic tới hệ vi khuẩn đường ruột lợn 21 1.3.5 Probiotic kích thích tăng trưởng nâng cao hiệu chăn nuôi lợn 23 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG ii 1.4 Tổng quan kỹ thuật bao gói 25 1.4.1 Định nghĩa .25 1.4.2 Tác nhân bảo vệ 25 1.4.3 Sấy thăng hoa 26 1.4.4 Sấy phun 27 1.5 Những nghiên cứu liên quan 29 1.5.1 Nghiên cứu nước 29 1.5.2 Nghiên cứu nước 34 CHƯƠNG VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu môi trường 37 2.1.1 Giống vi sinh vật 37 2.1.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 37 2.1.3 Môi trường sử dụng 37 2.1.4 Hoá chất thuốc thử 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu .39 2.2.1 Qui trình thu nhận mẫu phân lập 41 2.2.2 Cấy chuyền làm chủng vi khuẩn phân lập 42 2.2.3 Quan sát đại thể vi thể .42 2.2.4 Khảo sát đặc tính sinh hóa chủng .43 2.2.5 Kiểm tra hoạt tính probiotic chủng vi sinh vật thu 45 2.2.6 Định danh vi sinh vật .47 2.2.7 Khảo sát yếu tố sinh trưởng .47 2.2.8 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm probotic phương pháp lên men 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết phân lập chọn giống 50 3.1.1 Khảo sát hệ vi khuẩn đường ruột lợn 50 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG iii 3.1.2 Sơ chọn giống vi khuẩn probiotic dựa đặc điểm tế bào hình thái khuẩn lạc môi trường MRS .52 3.1.2.1 Hình thái khuẩn lạc 52 3.1.2.2 Đặc điểm tế bào qua kỹ thuật nhuộm Gram .55 3.1.2.3 Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào 57 3.1.3 Kết khảo sát đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng .59 3.1.3.1 Đặc điểm sinh lý 59 3.1.3.2 Phản ứng catalase khả sinh acid .60 3.1.3.3 Khả lên men loại đường 61 3.2 Kết sàng lọc chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic cao 61 3.2.1 Khả chống chịu chủng điều kiện cực đoan .64 3.2.1.1 Khả sống sót chủng sau lý pH thấp 64 3.2.1.2 Khả sống sót mơi trường có chứa pepsin 5g/lít 69 3.2.1.3 Khả sống sót mơi trường có chứa 0.3 % muối mật 71 3.2.1.4 Tổng hợp thí nghiệm sàng lọc lựa chọn 72 3.2.2 Khả kháng vi sinh vật gây bệnh 73 3.3 Kết định danh kit API 50CHL 74 3.4 Kết khảo sát điều kiện lên men .78 3.4.1 Ảnh hưởng pH đến khả tạo sinh khối tế bào 78 3.4.2 Kết khảo sát đường cong sinh trưởng .79 3.4.2.1 Đường cong sinh trưởng Lactobacillus acidophilus .79 3.4.2.2 Đường cong sinh trưởng Bifidobacterium bifidum 80 3.5 Khảo sát trình tạo sản phẩm probiotic 81 3.5.1 Chất lượng sản phẩm dùng whey protein làm chất bảo vệ 81 3.5.1 Chất lượng sản phẩm dùng maltodextrin làm chất bảo vệ 83 3.5.2 Khảo sát tỷ lệ hai chủng Bifidobacterium bifidum Lactobacillus acidophilus chế phẩm sau sấy phun 87 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG iv CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 88 4.2 Kiến nghị 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các giống vi khuẩn lactic khác sử dụng sản xuất probiotic Bảng 1.2: Các sản phẩm probiotic thương mại dùng chăn nuôi Anh 12 Bảng 1.3: Một số sản phẩm probiotic thương mại chứng nhận tổ chức The Scientific Committee for Animal Nutrition (EU) 13 Bảng 1.4: Tóm tắt tác dụng chủng probiotic đến hệ tiêu hoá lợn .21 Bảng 1.5: Tác dụng sản phẩm probiotic đến tốc độ tăng trưởng lợn 23 Bảng 1.6: Nguồn gốc tổ hợp vi sinh vật tác giả phân lập 30 Bảng 1.7: Các tiêu chuẩn có Viện Kiểm nghiệm Tp Hồ Chí Minh 33 Bảng 1.8: Các chủng probiotic tác giả phân lập 34 Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS dịch thể 38 Bảng 3.1: Sự phân bố hệ vi sinh vật đường ruột lợn 50 Bảng 3.2: Mật độ tế bào vi khuẩn Lactic hệ tiêu hóa lợn sử dụng mơi trường MRS (mơi trường đặc hiệu vi khuẩn Lactic) 51 Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái chủng phương pháp quan sát đại thể vi thể 58 Bảng 3.4: Kết khảo sát nhu cầu oxy chủng khảo sát 59 Bảng 3.5: Kết thử nghiệm catalase khả sinh acid 60 Bảng 3.6: Khả lên men loại đường 61 Bảng 3.7: Mật độ tế bào theo thời gian sau xử lý điều kiện pH thấp 64 Bảng 3.8: Tỉ lệ sống sót chủng mơi trường chứa pepsin 5g/lít 69 Bảng 3.9: Tỉ lệ sống sót chủng môi trường chứa muối mật .71 Bảng 3.10: Tổng hợp khả chịu đựng môi trường cực đoan chủng 72 Bảng 3.11: Kết định danh kit API50 CHL .74 Bảng 3.12: Thông tin chung chủng K6 76 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG vi Bảng 3.13: Thông tin chung chủng K7 77 Bảng 3.14: Mật độ tế bào sản phẩm sau sấy phun sử dung chất bảo vệ maltodextrin nghiệm thức khác .81 Bảng 3.15: Mật độ tế bào sản phẩm sau sấy phun sử dung chất bảo vệ maltodextrin nghiệm thức khác .84 Bảng 3.16: Tỷ lệ hai chủng Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium bifidum sản phẩm sau sấy phun .87 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG 94 Ignacio Badiola b, Marga Martı´n a, Josep Gasa a Quantification of total bacteria, enterobacteria and lactobacilli populations in pig digesta by real-time PCR Veterinary Microbiology 114 (2006) 165–170 [35] Muirhead, M R and Alexander, T.J.L 1997 Managing pig health and treatment of disease 5M enterprises Ltd, London Pp 126-127 [36] Mul, A.J and F.G Perry 1994 The role of fructo-oligosaccharides in animal nutrition In: recent Advances in Animal Nutrition Editors: Garnsworthy, P.C and D.J.A Cole Nottingham University Press p57-79 [36a] Nelson P´erez Guerra a, Paula Fajardo Bern´ardez a, Jes´us M´endez b, Pilar Cachaldora b, Lorenzo Pastrana Castro a., 2007 Production of four potentially probiotic lactic acid bacteria and their evaluation as feed additives for weaned piglets Animal Feed Science and Technology, 134, 89–107 [37] Pal, P.U.C., 1999 Probiotics benefits Poultry International October pp 4044 [38] Qingqiang Yin and Qiuhong Zheng, 2005 Isolation and identification of the dominant Lactobacillus in gut and faeces of pigs using carbohydrate fermentation and 16S rDNA analysis Journal of Bioscience and Bioengineering, vol 99, 68-71 p [39] Selvarani Elahi, Peter F., Kevin J Thurlow, Claudio Scotti, Alan H Varnam, 2008 Referee analysis of probiotic food supplements Food control [40] Shim, S.B., 2005 Effects of prebiotics, probiotics and synbiotics in the diet of young pigs Wageningen University and Research Centre, vol 127 [41] Surawicz CM, 2008 Role of probiotics in antibiotic- associated diarrhoea, Clostridium difficile associated diarrhea, and recurrent Clostridium difficileassociated diarrhoea J Clin Gastroenterol 42(Suppl 2): S64–S70 [42] Timmerman HM, Koning CJ, Mulder L, Rombouts FM, Beynen AC, 2004 Monostrain, multistrain and multispecies probiotics– A comparison of functionality and efficacy Int J Food Microbiol 96:219–233 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN TH THU DUNG 95 [43] TanjaLaăhteinen*, ErjaMalinen, JoannaM.K.Koort, UllaMertaniemi- Hannus, TanjaHankimo, Ninja Karikoski, SoilePakkanen, HannaLaine, HannaSillanpaăaă, HennaSoăderholm,AiriPalva, 2009 Probiotic propertiesof Lactobacillus isolates originating from porcine intestine and feces Anaerobes 16, 293-300 [44] Yuji Ohashia,b, Yoshinori Umesakib, Kazunari Ushidaa, 2004 Transition of the probiotic bacteria, Lactobacillus casei strain Shirota, in the gastrointestinal tract of a pig International Journal of Food Microbiology 96, 61– 66 [45] Xuan, Z N., J D Kim, K N Heo, H J Jung, J H Lee, Y K Han, Y Y Kim and In K Han 2001 Study on the development of a probiotics complex for weaned pigs Asian-Aust J Anim Sci 14:1425-1428 [46] Zhou X., Pan Y., Wang Y., and Li W., 2007 In vitro assessment of gastrointestinal viability of two photosynthetic bacteria, Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides J Zhejiang Univ Sci B, 8(9), 686-692 LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG PHỤ LỤC Phụ lục A: Phân lập khảo sát hệ vi sinh vật đường tiêu hóa lợn Phụ lục A1: MẪU A (5g ruột non/50 ml nước muối sinh khí vơ trùng) phân lập mơi trường NA Điều kiện ni cấy Hiếu khí Kỵ khí Tổng Mật độ tế Mật độ tế bào/1g Phân bào/1ml dịch loại ruột non Đặc đểm đại thể Tỉ lệ Kích thước % (mm) Đặc điểm vi thể Màu sắc Hình dạng Bề mặt 3-4 mm Trắng đục Trịn Trơn bóng,chỏm cầu 2-2.5 mm Trắng vàng Trịn Trơn bóng, nhơ A1 1.09x108 1.09x109 A2 1.30x107 1.30x108 A3 1.40x107 1.40x108 mm Vàng nhạt Trịn Bóng, chóp nhọn A4 8.00x106 8.00x107 mm Trắng đục Trịn bóng,chỏm cầu A5 2.14x106 2.14x107 1-1.5 mm Trắng đục Trịn Trơn bóng,nhơ A6 6.60x106 6.60x107 A7 1.58x107 1.58x108 A8 3.16x107 A9 1.84x107 62% Tròn Trơn bóng,nhơ 2-3 mm Trong, vàng Vàng nhạt Trịn Bóng, chỏm cầu 3.16x108 0.5 mm Trắng đục Tròn Trơn 1.84x108 2.19x108 < 0.5 mm Trắng đục Tròn Trơn 37.8% mm Que, kết chuỗi ngắn, đơi Hình que ngắn, chuỗi ngắn, kết đôi Que, kết chuỗi ngắn, đôi Cầu, kết đơi, chuỗi ngắn Hình que, kết chùm Que, chùm Cầu, kết đôi, chuỗi ngắn Cầu, kết chùm Mật độ tế bào/1g mẫu = [Mật độ tế bào/1ml dịch] x 50 ml/khối lượng mẫu Phụ lục A 2: MẪU A (5g ruột non/50 ml nước muối sinh khí vơ trùng) phân lập môi trường MRS Điều kiện nuôi cấy Phân loại Hiếu khí Mật độ tế Mật độ tế bào/1g bào/1ml dịch mẫu huyền phù 2.66x108 M1 6.50x106 6.50x107 M2 1.23x107 1.23x108 M3 7.80x106 7.80x107 3.72x108 Kị khí Tổng M4 1.06x107 1.06x108 M5 4.80x106 4.80x107 M6 2.18x107 2.18x108 6.38x108 Hình dạng khuẩn lạc Nhuộm Gram 0.5-1mm, trắng đục, tròn đều, bóng lống 0.1-0.5mm, trắng trong, trịn đều, bóng lống 3-4 mm, trắng đục, trịn đều, bóng lống Hình cầu, gram (+), kết chùm Hình que, chữ Y, Gram (+), kết chuỗi Hình que, Gram (+), rời rạc 2mm, trắng đục, trịn, bóng lống, nhơ 0.1-0.5 mm, trắng đục, trịn 3-4 mm, trắng đục, trịn, khơng trơn rằn Phụ lục A3: Phân lập mẫu B (5g ruột già/50 ml nước muối sinh khí vơ trùng) mơi trường NA Điều kiện Phân nuôi loại cấy Mật độ tế Mật độ tế bào/1ml bào/1g ruột dịch Hiếu Đặc điểm Đặc đểm đại thể % 4.89x109 0.7579 khí Kích thước (mm) Màu sắc Hình dạng vi thể Bề mặt B1 6.50x107 6.50x108 3-4 mm Trắng đục Trịn Bóng láng Gram (+), kết chùm B2 3.10x108 3.10x109 1-2 mm Trắng đục Tròn Bóng láng Gram (+), kết chùm B3 4.90x107 4.90x108 2- mm Vàng đục Trịn Bóng láng Gram (+), kết chùm B4 6.50x107 6.50x108 0.5-1.5 mm Hơi vàng Tròn Bóng láng Gram (+), kết chùm 1.56x109 0.2421 Kỵ khí TỔNG non Tỉ lệ B6 3.56x107 3.56x108 2.5 mm Trắng đục Tròn Nhẵn B7 3.86x107 3.86x108 0.5 mm Trắng đục Tròn Nhẵn B8 3.00x106 3.00x107 0.5 mm Trắng Tròn Nhẵn B9 7.90x107 7.90x108 0.5 mm Trắng Tròn Nhẵn 6.45x109 Hình cầu, Gram (+), kết đơi, kết chuỗi ngắn Phụ lục A4: Phân lập mẫu B (5g ruột già/50 ml nước muối sinh khí vơ trùng) mơi trường MRS Điều kiện nuôi cấy Mật độ tế Phân loại bào/1ml dịch huyền phù bào/1g mẫu Hình dạng khuẩn lạc Nhuộm Gram 5.82x108 Hiếu khí M1 2.20x107 2.20x108 M2 1.73x107 1.73x108 M3 1.89x107 1.89x108 1-2.5mm, trắng đục, tròn đều, bóng lống, nhơ 0.5-1 mm, trắng đục, trịn đều, bóng lống, nhơ 0.5-1 mm, trắng trong, trịn đều, bóng lống Hình que, Gram (+), chuỗi Hình cầu, Gram (+), chùm Hình que, hình cầu, Gram (+) 3.42x108 Kị khí Tổng Mật độ tế M4 8.00x105 8.00x106 2mm, dẹp tròn, nhân trắng Cầu, Gram (+), chùm nhỏ M5 6.20x106 6.20x107 1mm, trắng đục, trịn, bóng Cầu, Gram (+), chùm M6 2.72x107 2.72x108 0.5- 1mm, trắng đục, trịn, bóng Cầu, Gram (+), chùm 9.24x108 Phụ lục A5: Phân lập mẫu C (4.64g dày/50 ml nước muối sinh khí vơ trùng) môi trường NA Điều kiện Phân nuôi cấy loại Mật độ tế bào/1ml dịch bào/1g ruột non 9.18x107 Hiếu khí Tỉ lệ % Đặc đểm đại thể 10.4% C1 1.40x106 1.40x107 2,5-3 mm Trắng đục, vàng C2 1.84x106 1.84x107 2-2.5 mm Trắng đục C3 2.28x106 2.28x107 1- 1.5 mm Vàng đục C4 3.66x106 3.66x107 0.5 mm Trắng 7.93x108 Kỵ khí Tổng Mật độ tế 89.6% C5 2.40x106 2.59x107 5-6mm, vàng, dẹt, loãng C6 2.36x107 2.54x108 1-2mm, trắng đục, trịn, bóng C7 2.10x107 2.26x108 1-2mm, vàng, trịn, bóng C8 2.54x107 2.74x108 0.5 mm, trắng đục, trịn, bóng C9 1.20x106 1.29x107 1-mm, trắng trong, rìa loang, trịn 8.85x108 Phụ lục A6: Phân lập mẫu C (4.64g dày/50 ml nước muối sinh khí vơ trùng) mơi trường MRS Điều kiện Phân nuôi cấy loại Mật độ tế bào/1ml dịch huyền phù Mật độ tế bào/1g mẫu Hình dạng khuẩn lạc Nhuộm Gram 1-2 mm, trắng đục, tròn đều, Hình que ngắn, Gram (+), bóng lống chuỗi 2-5 7.74x107 Hiếu khí M1 5.00x105 5.39x106 M2 2.83x105 3.05x106 M3 6.40x106 6.90x107 0.1-0.5 mm, trắng trong, trịn, bóng 0.5 mm, trắng đục, trịn, bóng Hình que, Gram (+) Hình que ngắn, Gram (+), chuỗi 2-3 1.71x107 Kị khí M4 1.10x105 1.19x106 M5 1.48x106 1.59x107 mm, trịn, trơn bóng, trắng 0.1mm, trịn, trơn bóng, trắng Cầu, Gram (+), đơn lẻ Cầu, Gram (+), đơn lẻ Phụ lục B: Khảo sát khả khăng chịu đựng pH thấp chủng phân lập Mật độ tế bào đếm (100µl) theo thời gian mức độ pha loãng Chủng pH L1 pH=1.5 pH=2 pH=3 L2 pH=1.5 pH=2 pH=3 L3 pH=1.5 pH=2 pH=3 L4 pH=1.5 pH=2 pH=3 L5 pH=1.5 pH=2 pH=3 L6 pH=1.5 pH=2 pH=3 L7 pH=1.5 pH=2 pH=3 L8 pH=1.5 pH=2 pH=3 Đĩa Đĩa Đĩa 264x103 122x104 79x103 410x103 K K 220x103 K K 95x105 12x106 13x106 85x103 97x103 K 158x103 102x103 K 58x103 K K 69x105 71x105 92x105 Đĩa 1.11x106 3.03x106 K 1.66x105 K K 0 6.70x106 7.50x106 7.00x106 3.90x104 4.90x104 5.00x103 0 6.40x104 4.90x104 0 2.08x106 Đĩa 1.01x106 9.80x106 7.60x106 2.18x105 1.66x105 2.36x105 0 6.90x106 6.90x106 1.00x107 8.70x104 6.50x104 K 0 4.20x104 5.50x104 0 3.40x106 Đĩa 1.60x106 8.50x106 6.20x106 K 2.18x105 3.20x105 0 6.00x106 7.20x106 K K K K 0 K K 0 3.10x107 Đĩa 2.02x106 2.56x106 0 0 0 2.62x106 5.10x106 0 0 0 39x103 3.80x104 0 90 Đĩa Đĩa Đĩa 0 5.80x106 7.30x106 3.12x106 7.20x106 5.90x106 K 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4.60x107 4.40x107 4.90x106 4.70x106 K 6.20x106 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25x103 29x103 195x102 4.60x104 K 38x103 0 0 0 0 180 Đĩa Đĩa 4.10x106 3.70x106 3.20x106 4.10x106 0 0 0 0 0 0 0 6.50x106 K 6.30x106 5.90x106 0 0 0 0 0 0 0 215x102 28x103 31x103 36x103 0 0 0 L9 pH=1.5 pH=2 pH=3 L10 pH=1.5 pH=2 pH=3 K3 pH=1.5 pH=2 pH=3 K4 pH=1.5 pH=2 pH=3 K5 pH=1.5 pH=2 pH=3 K6 pH=1.5 pH=2 pH=3 K7 pH=1.5 pH=2 pH=3 K8 pH=1.5 pH=2 pH=3 K9 pH=1.5 pH=2 pH=3 19x10 123x104 6x103 39x104 174x105 177x105 168x105 12x102 35x105 23x10 K 1.50x104 148x104 152x104 8.40x104 3 25x10 14x10 2.00x103 1.35x105 45x104 43x104 3.20x105 4.20x105 2.30x106 5 149x10 151x10 1.29x107 18x106 21x106 1.38x107 1.09x107 1.70x105 25x10 259x10 1.52x107 1.43x107 8x10 K 0 49x105 51x105 1.80x106 5.10x106 0 0 9.00x103 K 0 0 5.70x104 1.05x105 0 0 K K 1.05x105 1.20x105 2.60x105 K 3.40x10 K 2.70x106 K 0 1.21x107 K 0 1.52x107 K 1.23x107 K 1.90x105 K 1.76x107 2.06x107 1.87x107 K 0 0 0 0 1.20x106 K 5.30x106 K 0 0 0 0 0 1.20x105 0 4.10x106 7.00x106 9.40x106 1.28x107 1.39x107 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 K K 0 0 3.80x106 3.90x106 0 1.08x107 K 1.30x107 K 0 1.52x107 1.55x107 1.45x107 K 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.80x103 0 3.50x106 5.80x106 8.90x106 1.06x107 1.11x107 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2.20x10 K 0 0 4.80x106 3.80x106 0 6.60x106 1.05x107 0 K 1.09x107 1.35x107 K 0 0 0 0 0 0 Phụ lục C: Mật độ tế bào sau môi trường chứa pepsin % Chủng L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 Lần 264x103 410x103 220x103 95x105 85x103 158x103 69x105 58x103 19x103 123x104 6x103 39x104 174x105 12x102 35x105 177x105 168x105 Số khuẩn đếm /1µl đĩa petri Trước xử lý Sau xử lý Lần Lần Lần Lần 122x10 79x10 L1 60x105 K K L2 K K L3 6 12x10 13x10 L4 125x104 97x10 K L5 13x102 102x103 K L6 39x102 71x105 92x105 L7 47x103 K K L8 110x104 23x10 K L9 4 148x10 152x10 L10 76x104 25x103 14x103 K3 51x102 45x104 43x104 K4 35x104 149x105 151x105 K5 109x105 8x10 K K6 156x105 49x105 51x105 K7 201x105 18x106 21x106 K8 2x102 25x106 259x105 K9 Lần 43x 105 0 142x104 11x102 41x102 39x103 98x104 9x105 43x102 41x104 96x105 158x105 209x105 k PHỤ LỤC D: Mật độ tế bào mơi trường có bổ sung muối mật 0.3% Số khuẩn đếm /1µl đĩa petri Chủng L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 Lần 264x103 410x103 220x103 95x105 85x103 158x103 69x105 58x103 19x103 123x104 6x103 39x104 174x105 12x102 35x105 177x105 168x105 Trước xử lý Lần 122x104 K K 12x106 97x103 102x103 71x105 K 23x103 148x104 25x103 45x104 149x105 8x102 49x105 18x106 25x106 Lần 79x103 K K 13x106 K K 92x105 K K 152x104 14x103 43x104 151x105 K 51x105 21x106 259x105 Lần 67x104 179x103 19x103 109x105 6x103 67x103 50x102 124x103 109x103 302x104 60x103 197x105 164x105 0 Sau xử lý Lần 59x104 181x103 23x103 121x103 k 62x103 3x103 119x103 11x104 34x105 4x103 18x106 17x106 0 Lần 63x104 21x104 k 118x103 k 57x103 k 117x103 9x104 k 16x106 k 0 PHỤ LỤC E: Khảo sát khả kháng vi sinh vật gây bệnh chủng probiotic 5.34x105 Tỉ lệ E.Coli giảm 0% 13% 83% 79% Mật độ tế bào ban đầu 5.34x105 cfu/ml Chủng probiotic Mật độ tế bào E.Coli sau xử lý L1 4.34x106 K4 4.64x105 K6 9.2x104 K7 1.10x105 PHỤ LỤC F: Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả tạm sinh khối tế bào Khảo sát chủng K6 pH 5.5 6.5 cfu/ml 2.14x109 4.90x109 7.94x109 8.32x109 4.07x109 log(cfu/ml) 9.33 9.69 9.9 9.92 9.61 5.5 7.41x108 8.87 2.19x109 9.34 Khảo sát chủng K7 pH cfu/ml lg(cfu/ml) 3.89x108 8.59 6.5 2.75x109 9.44 3.63x108 8.56 PHỤ LỤC G: Đường cong sinh trưởng Đường cong sinh trưởng Lactobacillus acidophilus K6 Thời gian (giờ) 10 12 14 16 18 20 22 24 cfu/ml 6.43x107 6.52x107 9.57x107 1.69x108 2.09x108 3.36x108 4.38x108 6.07x108 5.84x108 6.15x108 6.07x108 5.49x108 4.27x108 Log cfu/ml 7.8079 7.8139 7.9809 8.229 8.3197 8.5266 8.6416 8.7832 8.7662 8.7892 8.7832 8.7396 8.6307 Đường cong sinh trưởng Bifidobacterium bifidum K7 Thời gian (giờ) cfu/ml Log cfu/ml Thời gian (giờ) cfu/ml Log cfu/ml 6.48x107 7.81152 6.91 x107 7.83935 7.32 x107 7.86476 x108 8.00028 1.51 x108 8.17815 10 2.01 x108 8.30278 12 2.69 x108 8.42983 14 16 18 20 22 24 3.42 x108 4.27 x108 4.42 x108 4.47 x108 4.12 x108 3.35 x108 8.53389 8.63069 8.64521 8.65005 8.61496 8.52542 ... ? ?Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic ứng dụng chăn nuôi lợn? ?? Trong nghiên cứu tiếp tục phân lập tuyển chọn probiotic đường tiêu hóa lợn. .. lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic ứng dụng chăn nuôi lợn? ?? 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: - Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn lactic từ hệ tiêu hóa lợn - Tiến... Dung TÓM TẮT ĐỀ TÀI - Tên đề tài: ? ?Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic thử nghiệm tao chế phẩm probiotic ứng dụng chăn nuôi lợn? ?? - Học vi? ?n thực hiện: Ks Phan Thị Thu Dung