TUYỂN CHỌN VÀ XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP VI KHUẨN FRUCTOPHILIC LACTIC ACID (FLAB) TỪ HỆ TIÊU HÓA ONG MẬT

TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION JOURNAL OF SCIENCE Tập 17, Số 12 (2020): 2793-2305 ISSN: 1859-3100 Vol 17, No 12 (2020): 2793-2305 Website: http://journal.hcmue.edu.vn Bài báo nghiên cứu * TUYỂN CHỌN VÀ XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP VI KHUẨN FRUCTOPHILIC LACTIC ACID (FLAB) TỪ HỆ TIÊU HÓA ONG MẬT Cao Thanh Nhẹ*, Phạm Thị Mai Hương, Nguyễn Thúy Hương Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam * Tác giả liên hệ: Cao Thanh Nhẹ – Email: 1770179@hcmut.edu.vn Ngày nhận bài: 10-9-2020; ngày nhận sửa: 02-11-2020; ngày duyệt đăng: 30-12-2020 TÓM TẮT Nghiên cứu bao gồm: phân lập, định danh tuyển chọn vi khuẩn FLAB từ hệ tiêu hóa ong mật với khả kháng vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng ong mật, định hướng sử dụng probiotic cho ong, định hướng cho giải pháp thay phối hợp với việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh ong Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn FLAB có khả kháng cao với vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng ong mật gồm Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae Paenibacillus alvei với đường kính vịng kháng khuẩn từ 8,67±0,58 mm đến 15,33±0,58 mm, có khả bám dính cao tồn điều kiện pH thấp hệ tiêu hóa ong mật Bên cạnh đó, vi khuẩn khơng nhạy cảm với loại kháng sinh thường sử dụng điều trị bệnh ong streptomycin kanamycin để phối hợp sử dụng giới hạn cho phép, mà không làm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật có lợi Các vi khuẩn khảo sát có khả tồn nhiệt độ đến 60oC định hướng cho việc tạo chế phẩm phương pháp sấy phun Kết định danh theo trình tự 16s rRNA xác định chủng Lactobacillus kunkeei với độ tương đồng 99,24%-99,44% Nổi bật chủng L kunkeei M8, chủng FLAB địa với hoạt tính probiotic cao để phát triển tạo chế phẩm probiotic cho ong mật Từ khóa: bệnh thối ấu trùng ong; vi khuẩn Fructophilic lactic acid; vi khuẩn Lactic acid; Lactobacillus kunkeei Giới thiệu Vi khuẩn Fructophilic lactic acid (FLAB) xem nhóm vi khuẩn lactic acid (LAB) “không thông thường” việc ưu tiên sử dụng fructose thay glucose làm nguồn carbon Chúng thường tìm thấy mơi trường giàu fructose hoa quả, trái lên men, ruột loại côn trùng giàu fructose ong mật, ruồi nhiệt đới (Camponotus japonicas) Cho đến nay, nhiều nghiên cứu phát nhiều vi khuẩn FLAB thuộc hai chủng: Fructobacillus (F fructosus, F durionis, F ficulneus) Lactobacillus (L kunkeei, L apinorum, L florum) (Endo & Dicks, 2014) Cite this article as: Cao Thanh Nhe, Pham Thi Mai Huong, & Nguyen Thuy Huong (2020) Creating a collection of Fructophilic lactic acid bacteria (FLAB) from the gastrointestinal tracts of honeybees Ho Chi Minh City University of Education Journal of Science, 17(12), 2793-2305 2293 Tập 17, Số 12 (2020): 2793-2305 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Nhóm nghiên cứu Endo cộng (2009-2014) báo cáo vi khuẩn FLAB tiêu biểu hệ tiêu hóa ong mật chủng vi khuẩn thuộc L kunkeei Fructobacillus có tác động tích cực đến ong mật (Endo & Dicks, 2014; Endo, 2018) Do tập tính tìm kiếm thức ăn, hệ vi sinh vật có lợi tồn bầy ong thông qua nguồn thức ăn (Vásquez & Olofsson, 2009) Nhiều nghiên cứu khả kháng vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng vi sinh vật phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật với kết bật L kunkeei thể tính ức chế cao Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae Ascophaera apis (Ugras, 2017; Arrendondo, 2018; Iorizzo, 2020) Các nghiên cứu in vivo tiến hành thu kết tích cực bổ sung lactic acid acetic acid vào chế độ ăn đàn ong giúp tăng sản lượng mật (Pătruică, 2012), hay tỉ lệ tử vong ấu trùng nhiễm P larvae giảm tới 56,67% bổ sung L kunkeei vào chế độ ăn ong (Arrendondo, 2018; AlGhamdi, 2018) Khi bổ sung vi khuẩn Lactobacillus vào thức ăn cho ong, có mặt vi khuẩn có lợi tăng, hoạt động phân giải protein ấu trùng tăng, mầm bệnh xâm nhập vào thể ong giảm (Daisley, 2020) Do đó, nghiên cứu khả kháng vi khuẩn gây bệnh FLAB giải pháp điều trị bệnh thối ấu trùng ong mật, thay việc sử dụng kháng sinh, giúp hạn chế dư lượng kháng sinh sản phẩm từ ong mật tượng kháng kháng sinh năm gần Trên giới, việc nghiên cứu bổ sung probiotic ngành nuôi ong thực nhiều nước Tuy nhiên, hướng nghiên cứu chưa nghiên cứu Việt Nam chưa có chế phẩm probiotic cho ong thị trường Vì vậy, nghiên cứu này, tiến hành phân lập chủng vi khuẩn FLAB từ hệ tiêu hóa ong mật khảo sát khả kháng khuẩn gây bệnh thối ấu trùng ong số hoạt tính probiotic khác Kết mong muốn tuyển chọn vi khuẩn FLAB có tiềm để làm tiền đề phát triển tạo chế phẩm probiotic cho nghiên cứu sau Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu hóa chất mẫu ong mật thu thập trại ong Long Kiều (Di Linh, Lâm Đồng) Các chủng vi sinh vật gây bệnh thối ấu trùng ong mật gồm Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae Paenibacillus alvei cung cấp từ Bộ môn bệnh học, Trại ong mật Khu Thực nghiệm Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Hóa chất: hóa chất nhuộm Gram, đĩa kháng sinh streptomycin 10 µg/mL kanamycin 30 µg/mL (cung cấp Cơng ty TNHH Nam Khoa), đệm Phosphate-Buffered Saline (PBS) Môi trường de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) phân lập, nhân giống, nuôi cấy giữ giống vi khuẩn; môi trường Fructose-Yeast-Peptone (FYP) lỏng sàng lọc chủng vi khuẩn FLAB; môi trường Glucose-Yeast-Peptone (GYP) lỏng nhằm sàng lọc chủng vi khuẩn FLAB có ưu thế; mơi trường Nutrient Agar (NA) Nutrient Broth (NB) để tăng sinh vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng ong khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 2294 Cao Thanh Nhẹ tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM 2.2 Phân lập sàng lọc vi khuẩn FLAB từ hệ tiêu hóa ong mật • Phân lập: Ong mật ngâm cồn 96o phút để loại bỏ vi khuẩn bên ngoài, sau rửa lại lần với nước cất vơ trùng Tiến hành giải phẫu điều kiện vô trùng, dùng kéo kẹp tách hệ tiêu hóa ong mật Mẫu thu chuyển vào ống vô trùng chứa 10 mL MRS lỏng bổ sung 2% fructose Đồng mẫu 1-2 phút thu dịch huyền phù Pha lỗng dịch huyền phù với nước muối sinh lí 0,9% Hút 200 µL dịch huyền phù với nồng độ khác cấy trang lên đĩa Petri chứa môi trường thạch MRS, ủ 37oC, 48 Quan sát chọn khuẩn lạc dựa vào màu sắc, kích thước hình dạng, chuyển vào đĩa thạch MRS ủ điều kiện nêu trên, trình cấy lặp lại nhiều lần độ vi khuẩn xác định (Salman, 2018) • Sàng lọc FLAB môi trường đặc hiệu: Nhằm sàng lọc ứng viên FLAB, vi khuẩn phân lập tăng sinh mL FYP lỏng, ủ 37oC, sau 24 đo OD 610nm để kiểm tra khả sinh trưởng Các chủng vi khuẩn phát triển tốt môi trường FYP tiếp tục tăng sinh hai môi trường FYP lỏng GYP lỏng so sánh khả sinh trưởng phương pháp đo OD 610nm sau 18, 24, 30 Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng, kích thước, màu sắc quan sát vi thể kính hiển vi quang học độ phóng đại 40x 100x Kiểm tra sinh hóa vi khuẩn FLAB thí nghiệm sinh hóa: nhuộm Gram thử nghiệm Catalase (Kandler, 1986) 2.3 Sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn FLAB có khả kháng vi khuẩn gây bệnh cho ong mật Các ứng viên FLAB tăng sinh môi trường FYP lỏng 30oC 24 Các chủng vi khuẩn gây bệnh cho ong mật gồm M pluton, P larvae P alvei, nuôi cấy mL môi trường NB nhiệt độ 37oC 24 Sau hút 200 µL dịch khuẩn thị cấy trang lên đĩa Petri chứa môi trường NA, với mật độ 108 CFU/mL, ổn định 30 phút đục giếng, giếng đối chứng âm chứa mơi trường FYP, đường kính giếng mm Hút 100 µL dịch vi khuẩn FLAB cho vào giếng, ủ điều kiện vi hiếu khí, nhiệt độ 37oC 24-48 Sau thời gian ủ, đo đường kính vịng kháng khuẩn (ĐKVKK) tính theo cơng thức (1): 𝐻𝐻 = 𝐷𝐷 − 𝑑𝑑 (1) Với H đường kính vịng kháng khuẩn (mm), D đường kính vịng vơ khuẩn (mm), d đường kính giếng (mm) Hoạt dược tính theo phương pháp Moore cộng (2013) (Moore, 2013) Thí nghiệm lặp lại ba lần 2.4 Khảo sát hoạt tính probiotic khác 2.4.1 Khảo sát khả chịu pH thấp Các chủng vi khuẩn tuyển chọn tăng sinh môi trường MRS lỏng 37oC 48 Thu lấy sinh khối vi khuẩn cách li tâm 4000 vòng/phút 10 phút 2295 Tập 17, Số 12 (2020): 2793-2305 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Rửa sinh khối thu với 1,5 mL nước cất vô trùng chuyển dịch huyền phù vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường MRS chỉnh pH pH Khả chịu pH thấp khảo sát cách xác định mật độ tế bào điều kiện pH khảo sát, kiểm tra mật độ tế bào phương pháp định lượng gián tiếp (Hoben, 1982) 2.4.2 Khảo sát khả tự bám dính Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp Kos cộng (2003) Vi khuẩn tăng sinh 30 mL môi trường MRS lỏng, li tâm 4000 vòng/phút 15 phút thu sinh khối Sinh khối tế bào vi khuẩn rửa lần đệm PBS pH 7,2 vô trùng, sau tái huyền phù mL đệm PBS (OD 600nm =1) (OD ban đầu) Để yên huyền phù 37oC Đo OD dịch bề mặt Các tế bào vi khuẩn tự kết dính lại với tạo nên hạt có kích thước lớn lắng xuống dung dịch Do theo thời gian mật độ tế bào bề mặt dịch vi khuẩn giảm Mức giảm OD phản ánh tỉ lệ vi khuẩn kết dính Khả tự kết dính phần trăm độ giảm OD 600nm dịch bề mặt mẫu để yên so với ban đầu tính cơng thức (2): 𝐴𝐴 (1 − 𝐴𝐴 𝑡𝑡 ) × 100 (2) 𝑜𝑜 Với A o OD 600nm thời điểm giờ; A t OD 600nm thời điểm đến (Kos, 2003) 2.4.3 Khảo sát độ nhạy cảm kháng sinh Độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn đánh giá phương pháp khuếch tán đĩa có hiệu chỉnh (Salman, 2018) Tiến hành trải 200 µL dịch vi khuẩn tăng sinh môi trường MRS lỏng (ủ 37oC 24 giờ) lên đĩa Petri Kháng sinh sử dụng gồm: Streptomycin nồng độ 10 µg/mL kanamycin 30 µg/mL Đĩa kháng sinh, đường kính đĩa 5mm, đặt lên mặt thạch ủ 37oC 24 Sau thời gian ủ, đo kích thước vịng vơ khuẩn so sánh với giá trị tiêu chuẩn mức độ nhạy cảm với kháng sinh Tính nhạy cảm với kháng sinh đánh giá theo hướng dẫn CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014) ĐKVKK (mm) tương ứng xác định là: kháng: R (Resistant) ≤ 14 mm, nhạy cảm vừa: 14 mm < S+ (Susceptible) ≤ 19 mm, nhạy cảm mạnh: S++ ≥ 20 mm (Sharma, 2015) 2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Chủng vi khuẩn khảo sát nuôi môi trường MRS lỏng 37oC 24 100 µL dịch tăng sinh cấp vào ống nghiệm chứa mL môi trường MRS lỏng Ủ ống nghiệm nhiệt độ 40oC, 45oC, 50oC, 55oC 60oC Sau 24 nuôi cấy, đo mật độ quang học dịch nuôi vi khuẩn OD 610nm để kiểm tra khả chịu nhiệt chủng vi khuẩn khảo sát 2296 Cao Thanh Nhẹ tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM • Định danh vi khuẩn Chọn vi khuẩn có hoạt tính probiotic cao định danh phương pháp giải trình tự gen 16sRNA Cơng ty Nam Khoa • Xử lí thống kê Độ lặp lại thí nghiệm thử hoạt tính xử lí phần mềm Excel SPSS version 22.0 Kết thảo luận 3.1 Phân lập sàng lọc vi khuẩn FLAB từ hệ tiêu hóa ong mật Từ mẫu ong mật ban đầu, sau trình phân lập môi trường MRS sàng lọc môi trường FYP thu chủng FLAB kí hiệu từ M1 đến M9 Tiếp tục sàng lọc chọn chủng FLAB ưu môi trường đặc hiệu FYP GYP, kết thu chủng M4, M5, M6 M8 với đặc điểm hình thái thể Bảng Bảng Đặc điểm hình thái vi khuẩn FLAB phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật Hình thái khuẩn lạc Kích thước Màu sắc (mm) STT Kí hiệu Hình dạng M4 Trịn Trắng đục 1-2 M5 Tròn Trắng đục 0,5-1,5 M6 Tròn Trắng sữa 1-3 M8 Tròn Trắng đục 0,5-1,5 Hình dạng tế bào Bề mặt Phẳng, khơng nhân Phẳng, khơng nhân Bóng, lồi, khơng nhân Bóng, lồi, khơng nhân Que ngắn, đơn đôi Que ngắn, chùm Que dài, đơn Que dài, đơn, đơi, chuỗi dài Hình Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn FLAB tuyển chọn mơi trường MRS Hình Hình ảnh vi thể vi khuẩn FLAB tuyển chọn 2297 Tập 17, Số 12 (2020): 2793-2305 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM 3.2 Sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn FLAB có khả kháng vi khuẩn gây bệnh cho ong mật Tiến hành kiểm tra khả kháng vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng chủng FLAB M4, M5, M6 M8 Sau 24 ủ, kết thu chủng vi khuẩn FLAB có khả kháng chủng gây bệnh thối ấu trùng ong Trong đó, chủng M4, M5 M8 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh (9 mm ≤ ĐKVKK ≤ 20 mm) với chủng vi khuẩn gây bệnh (Bảng 2) Kết đề tài tương tự kết Forrgren (2010) chứng minh nhóm vi khuẩn LAB, gồm vi khuẩn L kunkeei phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật có khả kháng khuẩn mạnh với P larvae (Forsgren, 2010) Nghiên cứu D Arredondo (2017), 57/65 chủng phân lập có khả kháng với P larvae, có chủng FLAB với L kunkeei có ĐKVKK từ 8±1 đến 20±8mm (Arrendondo, 2018) Thí nghiệm Ugras (2017), phân lập chủng L kunkeei HD1 có khả kháng mạnh với M pluton với ĐKVKK 17 mm (Ugras, 2017) Các chủng đề tài phân lập có khả kháng mạnh chủng nghiên cứu phân lập trước Bảng Đường kính vùng kháng khuẩn vi khuẩn phân lập đối kháng với vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng ong mật Đường kính vùng kháng khuẩn H=D-d (mm) Chủng vi khuẩn M pluton P larvae P alvei M4 14,33 ± 0,58 9,33 ± 0,58 9,33 ± 0,58 M5 14,33 ± 0,58 9,67 ± 0,58 9,33 ± 0,58 8,67 ± 0,58 M6 14,00 ± 1,00 9,00 ± 1,00 M8 15,33 ± 0,58 9,33 ± 0,58 10,00 ± 1,00 Ghi chú: Kết giá trị trung bình lần lặp lại STT Hình Kết đối kháng chủng M8 với M pluton (Hình a), P larvae (Hình b) P alvei (Hình c) 3.3 Khảo sát hoạt tính probiotic khác Khả tồn bám dính vào biểu mơ FLAB hệ tiêu hóa ong mật điều kiện quan trọng để chủng tăng sinh đường tiêu hóa, chống lại loại bỏ tác động nhu động ruột cạnh tranh vị trí bám, nguồn thức ăn hệ vi 2298 Cao Thanh Nhẹ tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM sinh đường ruột với vi sinh vật có hại, kích thích hệ miễn dịch kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gây bệnh (Kos, 2003) 3.3.1 Khảo sát khả chịu pH thấp Cả chủng FLAB M4, M5, M6, M8 theo dõi khả chịu pH từ đến Kết trình bày Hình cho thấy chủng có khả tồn sinh trưởng môi trường pH Đặc biệt, chủng M5 M8 có khả sinh trưởng tốt pH (tăng 1,09 1,13 log CFU/mL sau khảo sát) pH 4, chủng M6 M8 có sinh trưởng đáng kể (tăng 2,98 2,17 logCFU/mL sau khảo sát) chủng lại Các chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật có khả tồn sinh trưởng điều kiện pH 4, kết phù hợp với nghiên cứu Serp Ugras (2017), chủng L kunkeei HD1 phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật có khả phát triển tốt môi trường pH (Ugras, 2017), hay nghiên cứu D Arredondo (2017), tất chủng phân lập từ hệ tiêu hóa ong mật cho thấy khả tồn pH 7, 27/65 chủng tồn môi trường pH với khả mật độ tế bào lại sau ủ từ 23-100% so với mật độ ban đầu (Arrendondo, 2018) Kết khảo sát cho thấy chủng có xu hướng phát triển mơi trường pH thấp diều ong mật Đặc biệt chủng M5, M8 có khả tồn phát triển tốt chủng lại pH 10 10 log CFU/mL log CFU/ mL pH M4 M5 M6 Chủng vi khuẩn giờ M8 M4 M5 M6 Chủng vi khuẩn giờ M8 Hình Đồ thị biểu diễn thay đổi mật độ vi khuẩn điều kiện pH pH 3.3.2 Khảo sát khả tự bám dính Khả tự bám dính tiêu chí để đánh giá tiềm probiotic liên quan đến khả bám dính vào biểu mơ hệ tiêu hóa, thể khả sống sót, hoạt động ổn định, khả cạnh tranh khả đối kháng với vi sinh vật khác đường ruột Các vi khuẩn dịng liên kết với nhau, giúp tăng cường sức sống phát triển theo kiểu mối quan hệ hỗ trợ loài tạo hàng rào sinh học bảo vệ hệ tiêu hóa (Kos, 2003) Các nghiên cứu trước báo cáo protein, glycoprotein, trachoic lipoteichoic acid bề mặt tế bào vi khuẩn Lactobacillus có vai trò quan trọng chất kỵ nước bề mặt khả tự bám dính chủng vi khuẩn (Tou, 2013) Kết cho thấy khả 2299 Tập 17, Số 12 (2020): 2793-2305 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM tự kết dính chủng khảo sát cao Đặc biệt chủng M8 M4 đạt 48,99% 59,71% (Bảng 3) Kết tương tự với kết số nghiên cứu khả tự bám dính chủng Lactobacillus công bố Lactobacillus acidophilus M92 lên đến 70% nhiệt độ phòng theo nghiên cứu Kos cộng (năm 2003) (Kos, 2003) Khả tự bám dính 20 chủng vi khuẩn thuộc loài L plantarum, L casei, L rhamnosus nghiên cứu Yanfeng Tou (năm 2013) đạt từ 24,16-41,39% sau ủ 37oC (Tou, 2013) Bảng Khả bám dính vi khuẩn tuyển chọn STT Chủng vi khuẩn Khả bám dính (%) M4 59,71 M5 29,05 M6 35,63 M8 48,99 Từ công bố tương tự vi khuẩn Lactobacillus, kết khả tự bám dính chủng vi khuẩn khảo sát đề tài tương đối cao đặc biệt chủng M4 M8 3.3.3 Khảo sát độ nhạy cảm kháng sinh Nhiều vi khuẩn Lactobacillus có khả kháng kháng sinh với chế kháng nội kiểu hình phổ biến kháng trimethoprim, vancomycin kanamycin Cơ chế nội hữu ích để phục hồi hệ vi sinh vật đường ruột sau điều trị kháng sinh Tuy nhiên, chế kháng nội thường không phổ biến, đề kháng thu nhận yếu tố di truyền di động phổ biến Khi kháng kháng sinh gene kháng nằm yếu tố di truyền di động (như plasmid transposon) đặc tính mang nguy hiểm truyền cho chủng vi khuẩn gây bệnh Các nghiên cứu trước khẳng định khả chất kháng kháng sinh chủng vi khuẩn probiotic khác nhau, lồi cần có nghiên cứu để đảm bảo chủng kháng kháng sinh an toàn sử dụng (Jaimee, 2015) Cả chủng vi khuẩn M4, M5, M6, M8 không nhạy cảm với loại kháng sinh sử dụng phổ biến điều trị bệnh ong mật Kết phù hợp với nghiên cứu G Jaimee cộng (2015) việc lồi Lactobacillus có chất đề kháng với aminoglycoside (gentamycin, kanamycin, streptomycin neomycin) chất vận chuyển bị suy giảm bất hoạt loại enzyme biến đổi aminoglycoside (AMEs) gồm N-acetyltransferases (AACs), Ophosphotransferases (APHs), O-nucleotidyltransferases (ANTs) làm cho kháng sinh không gắn vào tiểu phân 30S ribosome (Jaimee, 2015) 2300 Cao Thanh Nhẹ tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Bảng Kết độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn STT Chủng vi khuẩn M4 M5 M6 M8 Streptomycin (10 µg/mL) R R R R Kanamycin (30 µg/mL) R R R R Ghi chú: R: kháng; S: nhạy cảm Hình Thí nghiệm kháng kháng sinh chủng M4 với loại kháng sinh streptomycin (Hình a) kanamycin (Hình b) Như vậy, trình điều trị bệnh cho ong mật, giải pháp trước mắt đặt phối hợp sử dụng chủng vi khuẩn chất kháng sinh với liều lượng tiêu chuẩn cho phép, kháng sinh khơng có khả tiêu diệt làm hoạt tính chủng vi sinh vật hữu ích tuyển chọn bên thể ong mật 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Với định hướng làm tiền đề tạo chế phẩm trình sấy phun, vi khuẩn probiotic sử dụng phải chịu nhiệt độ q trình sản xuất Thơng thường, nhiệt độ đầu trình sấy phun vi khuẩn Lactobacillus nghiên cứu công bố từ 45oC trở lên (Huang, 2017) Đề tài tiến hành khảo sát phát triển vi khuẩn tuyển chọn nhiệt độ khác từ 40oC đến 60oC 2301 Tập 17, Số 12 (2020): 2793-2305 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Khả chịu nhiệt độ OD 610nm 0.8 0.6 0.4 0.2 M4 Nhiệt độ (oC) M5 M6 Chủng vi khuẩn 40 45 50 55 M8 60 Hình Đồ thị biểu diễn giá trị OD 610nm chủng vi khuẩn tăng sinh nhiệt độ khảo sát (môi trường MRS lỏng, sau 24 giờ) Mật độ tế bào chủng khảo sát có xu hướng giảm nhiệt độ tăng dần Các chủng vi khuẩn phát triển nhiệt độ 40oC 45oC, nhiệt độ cao hơn, mật độ vi khuẩn bắt đầu giảm Các chủng M5, M6 M8 phát triển khoảng nhiệt độ từ 40oC đến 60oC Trong chủng M4 khơng có dấu hiệu phát triển ủ nhiệt độ 60oC Kết thu đề tài phù hợp với công bố khả chịu nhiệt độ loài FLAB Ở loài FLAB, khoảng nhiệt độ trung bình từ 20-40oC, tối đa 50oC, số phát triển 55oC (Endo & Dicks, 2014) Như vậy, chủng M5, M6, M8 có khả chịu nhiệt độ đến 60oC định hướng tạo chế phẩm probiotic phương pháp sấy phun 3.3.5 Định danh vi khuẩn Từ kết thí nghiệm trên, chủng M4, M5, M6 M8 mang nhiều tiềm để tạo chế phẩm probiotic điều trị bệnh thối ấu trùng cho ong thay phối hợp sử dụng kháng sinh Vì vậy, đề tài tiến hành định danh chủng vi khuẩn kĩ thuật giải trình tự 16S rRNA Kết giải trình tự gene 16S rRNA chủng tuyển chọn giải trình tự trực tiếp so sánh trình tự với ngân hàng liệu NCBI Kết cho thấy chủng M4, M5, M6 M8 có độ tương đồng khác 99,24%, 99,43%, 99,44% 99,43% với chủng Lactobacillus kunkeei Vì chủng phân lập từ mẫu ong khác độ tương đồng trình tự 16S rRNA có khác nên nói L kunkeei chủng lợi khuẩn chiếm ưu hệ tiêu hóa ong mật Kết tương đồng với nghiên cứu trước chủng vi khuẩn chiếm ưu hệ vi sinh đường ruột mang đặc tính để trở thành probiotic tiềm cho ong mật nghiên cứu Endo cộng (2009-2014) với kết hệ tiêu hóa ong mật đa số dịng vi khuẩn thuộc chủng Lactobacillus kunkeei chủng Fructobacillus (Endo & Dicks, 2014); nghiên cứu D Arredondo cộng (2017) tiến hành phân lập vi khuẩn từ hệ tiêu hóa ong mật mơi trường MRS, phân tích hóa 2302 Cao Thanh Nhẹ tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM lí định danh, thu thuộc chủng L kunkeei, với đặc tính probiotic bổ sung nhau, với hoạt tính probiotic cao (Arrendondo, 2018) Bảng Kết định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn kĩ thuật giải trình tự 16S rRNA STT Chủng vi khuẩn Mức tương đồng với Lactobacillus kunkeei (%) M4 99,24 M5 99,43 M6 99,44 M8 99,43 Như vậy, đề tài tuyển chọn chủng FLAB L kunkeei mang hoạt tính probiotic tiềm tạo chế phẩm probiotic cho ong mật từ kết thí nghiệm kiểm tra hoạt tính probiotic cho thấy chủng L kunkeei M8 chủng có ưu chủng lại Kết luận kiến nghị Nghiên cứu tuyển chọn chủng thuộc loài L kunkeei, góp phần xây dựng sưu tập FLAB, chủng vi khuẩn ưu hệ vi sinh vật đường ruột ong mật Với đặc điểm probiotic ưu khả kháng mạnh vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng ong chủng, đặc biệt chủng L kunkeei M8, làm định hướng cho nghiên cứu mở rộng in vivo làm tiền đề tạo chế phẩm điều trị bệnh thối ấu trùng ong mật, hướng tới thay phối hợp sử dụng kháng sinh tương lai Nghiên cứu kiến nghị thực kiểm tra gene kháng kháng sinh chủng L kunkeei M8 nhằm đảm bảo tính an toàn chủng giống trước sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho ong mật  Tuyên bố quyền lợi: Các tác giả xác nhận hồn tồn khơng có xung đột quyền lợi TÀI LIỆU THAM KHẢO Al-Ghamdi, A (2018) Effect of gut bacterial isolates from Apis mellifera jemenitica on Paenibacillus larvae infected bee larvae Saudi Journal of Biological Sciences, 25(2), 383-387 Arrendondo, D (2018) Lactobacillus kunkeei strains decreased the infection by honey bee pathogens Paenibacillus larvae and Nosema ceranae Beneficial Microbes, 9(2), 279-290 Daisley, A B (2020) Novel probiotic approach to counter Paenibacillus larvae infection in honey The ISME Journal, 14, 476-491 Endo, A (2018) Fructophilic Lactic Acid Bacteria, a Unique Group of Fructose-Fermenting Microbes Appl Environ Microbiol, 84(19), e01290-18 2303 Tập 17, Số 12 (2020): 2793-2305 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Endo, A., & Dicks, L M (2014) The genus Fructobacillus In W H Holzapfel, & B J Wood (Eds.), Lactic Acid Bacteria: Biodiversity and Taxonomy (pp 381-398) Turku, Finland: John Wiley & Sons Forsgren, E (2010) European foulbrood in honey bees Journal of Invertebrate Pathology, 103, S5S9 Hoben, H J (1982) Comparison of the pour, spread and drop plate methods for enumeration of Rhizobium spp in inculants made from presterilized peat Applied and Enviromental Microbiology, 44(5), 246-1247 Huang (2017) Spray drying of probiotics and other food-grade bacteria: A review Trends in Food Science & Technology Iorizzo, M., Lombardi, S J., Ganassi, S., Testa, B., Ianiro, M., Letizia, F., & Sorrentino, E (2020) Antagonistic Activity against Ascosphaera apis and Functional Properties of Lactobacillus kunkeei Strains Antibiotics, 9(262) Jaimee, G (2015) Emerging resistance to aminoglycosides in lactic acid bacteria of food origin— an impending menace Appl Microbiol Biotechnol, 100(3), 1137-1151 Kandler, O (1986) Genus Lactobacillus Beijerinck 1901, 212AL Bergeys Manual of system Bacteriology, 2(1), 1209-1234 Kos (2003) Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92 Journal of Applied Microbiology, 94, 981-987 Moore, T., Globa, L., Barbaree, J., Vodyanoy, V., & Sorokulova, I (2013) Antagonistic activity of Bacillus bacteria against food-borne pathogens Probiotics and healthy, 1(3) Olofsson, A V (2015) The lactic acid bacteria involved in the production of bee pollen and bee bread Journal of Apicultural Research, 48(3) Pătruică, S D (2012) The Effect of Prebiotic and Probiotic Feed Supplementation on the Wax Glands of Worker Bees (Apis Mellifera) Scientific Papers: Animal Sciences and Biotechnologies, 45(2), 268-271 Salman, S M (2018) Fructophilic lactic acid bacteria symbionts in honeybees - a key role to antimicrobial activities IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 13(1), 58-62 Sharma (2015) Antibiotic Resistance of Lactobacillus ssp Isolated from Commercial Probiotic Preparations Journal of Food Safety, 36(1), 38-51 Tou, Y (2013) Aggregation and adhesion properties of 22 Lactobacillus strains Journal of Dairy Science, 96(7), 4252-4257 Ugras, S (2017) Isolation, identification and characterization of probiotic properties of bacterium from the honey stomachs of Yigilca honeybees in Turkey Turkish journal of entomology, 41, 253-261 Vásquez, A., & Olofsson, T (2009) The lactic acid bacteria involved in the production of bee pollen and bee bread Journal of Apicultural Research, 48(3) 2304 Cao Thanh Nhẹ tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM CREATING A COLLECTION OF FRUCTOPHILIC LACTIC ACID BACTERIA (FLAB) FROM THE GASTROINTESTINAL TRACTS OF HONEYBEES Cao Thanh Nhe*, Pham Thi Mai Huong, Nguyen Thuy Huong Ho Chi Minh City University of Technology Vietnam National University Ho Chi Minh City, Vietnam * Corresponding author: Cao Thanh Nhe – Email: 1770179@hcmut.edu.vn Received: September 10, 2020; Revised: November 02, 2020; Accepted: December 30, 2020 ABSTRACT This study aims to isolate, name, and choose Fructophilic lactic acid bacteria (FLAB) from the gastrointestinal tracts of honeybees and also to determine their antibacterial activity against foulbrood disease bacteria in honey bees The FLABs are oriented to create probiotic products that are alternated or coordinated with the current antibiotic treatment in bees Four strains were selected with high antibacterial activity against Melissococcus pluton, Paenibacillus larvae, and Paenibacillus alvei with inhibitory zones of 8,67±0,58 mm to 15,33±0,58 mm All the four strains had potential probiotic properties as auto-aggregation and acid intolerance Besides, all strains showed resistance to streptomycin and kanamycin in the treatment of bee diseases so that they can be alternated or coordinated with antibiotic within the permitted limits, without affecting the beneficial microbiota The bacteria were able to survive at 60oC involving several stresses of spraydrying conditions All strains were identified as Lactobacillus kunkeei by sequencing of the 16S rRNA gene with from 99.24% to 99.44% identity score The L kunkeei M8 strain possesses the best probiotic potential amongst the four strains Therefore, it may be used as a candidate in the applications of probiotic additives for honey bees Keywords: Foulbrood disease; Fructophilic lactic acid bacteria; Lactic acid bacteria; Lactobacillus kunkee 2305