...19 Hình 2.12 Sự tương tác mật thiết của hệ vi sinh vật hữu ích trong đất đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng trước các yếu tố hữu sinh và vô sinh.. Hiện tại, bởi do
TỔNG QUAN
Indol-3-acetic acid (IAA)
Trong suốt những năm cuối của thế kỷ 19, Charles Darwin và con trai ông ấy Francis đã nghiên cứu hiện tượng tăng trưởng thực vật liên quan đến quang hướng động (Hình 2.1) Một trong những điều họ quan tâm là sự bẻ cong của diệp tiêu về phía ánh sáng Darwin đã phát hiện thấy phần ngọn của diệp tiêu cảm nhận được ánh sáng, vì nếu phần ngọn được bao phủ, phần diệp tiêu sẽ không uốn cong Nhưng vùng dưới phần ngọn vài mm mới gây ra việc bẻ cong về phía ánh sáng và vùng này được gọi là vùng tăng trưởng Vì thế, họ kết luận rằng một vài tín hiệu được sản xuất trong phần ngọn đã di chuyển xuống vùng tăng trưởng là nguyên nhân làm cho bên khuất bóng phát triển nhanh hơn so với bên được chiếu sáng Kết quả thí nghiệm của họ đã được công bố vào năm 1881 [27]
Hình 2.1 Mô phỏng về tính quang hướng động ở yến mạch [27]
Yến mạch nảy mầm được 4 ngày tuổi
Hạt nảy mầm bình thường (uốn cong)
Ngọn diệp tiêu bị cắt bỏ (không có uốn cong)
Ngọn diệp tiêu bị bao phủ (không có uốn cong
Tiếp theo đó một thời gian dài thử nghiệm bởi nhiều nhà nghiên cứu về bản chất các kích thích tăng trưởng trong diệp tiêu điển hình như Boysen - Jensen (1913) và Paál (1919) (Hình 2.2)
Nghiên cứu lên đến đỉnh điểm vào năm 1926 nhờ Frits Went chứng tỏ sự hiện diện của một chất thúc đẩy tăng trưởng trong phần ngọn diệp tiêu của cây yến mạch (Avena sativa) (Hình 2.3) Vào thời đó, nhiều người biết rằng nếu phần ngọn diệp tiêu bị cắt bỏ, việc tăng trưởng của diệp tiêu là không còn Nên các công trình trước đó đã cố gắng cô lập và xác định chất hóa học thúc đẩy tăng trưởng bằng cách nghiền phần chóp diệp tiêu và thử nghiệm hoạt tính của chất đã chiết tách Tuy nhiên cách tiếp cận này đã không thành công bởi việc nghiền các mô bào thực vật vô tình tạo các phản ứng ức chế hay phân hủy chất cần chiết tách Nhưng Went đã tạo nên
Hình 2.2 Hai mô hình nghiên cứu về bản chất các kích thích tăng trưởng trong diệp tiêu của Boysen - Jensen (1913) và Paál (1919) [27].
Miếng kim loại được chèn vào bên tối (không uốn cong)
Miếng kim loại được chèn vào bên sáng (uốn cong)
Khối agar được chèn giữa phần ngọn và diệp tiêu
Quá trình uốn cong xảy ra bình thường
Phần ngọn bị cắt rời
Phần ngọn được đặt lên một bên của diệp tiêu Độ cong tăng trưởng gia tăng mà không cần ánh sánh kích thích
7 bước đột phá lớn là thay thế việc nghiền mô bào bằng cách cắt chóp diệp tiêu cho trực tiếp vào khối agar Nếu đặt đối xứng trên đầu của diệp tiêu đã bị cắt chóp ngọn, các khối agar có thể được kiểm tra về khả năng gây uốn cong khi được chiếu sáng một bên Bởi chất có thể thúc đẩy sự kéo dài của các phần diệp tiêu, nên cuối cùng đã được đặt tên là auxin từ tiếng ―auxein‖ có nguồn gốc Hy Lạp, có nghĩa là "mọc" hoặc "sinh trưởng‖ Đến giữa những năm 1930 thì auxin được xác định chính là indole-3-acetic acid (IAA) Nhiều auxin khác có trong thực vật bậc cao đã được phát hiện sau này, nhưng IAA đến nay là phổ biến nhất trong nghiên cứu khoa học và có nhiều đặc tính sinh lý liên quan Ban đầu auxin được định nghĩa là bao gồm tất cả các chất có trong
Hình 2.3 Mô hình nghiên cứu của Frits Went (1926) [27].
Diệp tiêu cong xuống hoàn toàn trong bóng tối; độ uống cong có thể được đo Những phần ngọn của diệp tiêu trên khối agar
Mỗi miếng agar được đặt lên một bên của diệp tiêu
Những phần ngọn bị loại bỏ; khối agar được cắt nhỏ
Năm 1926, F W Went đã cho thấy rằng cơ chất thúc đẩy hoạt động tăng trưởng có thể khuếch tán vào khối agar Ông ấy đã nghĩ ra một phương pháp phân tích định lượng auxin là dựa vào độ uốn cong của diệp tiêu Độ uốn cong
Số lƣợng ngọn diệp tiêu trên khối agar Độ uốn cong
Nồng độ IAA trong miếng agar (mg/L)
8 tự nhiên hay được tổng hợp hóa học mà có khả năng kích thích kéo dài mô bào có trong diệp tiêu và phần thân Tuy nhiên, auxin ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển bên cạnh kéo dài mô bào Do vậy auxin có thể được định nghĩa là các hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự như IAA, bao gồm khả năng kích thích kéo dài mô bào, quang hướng động, ưu thế ngọn, sự lão hóa hay quá trình ra hoa
Các phát hiện của Went đã mở đường cho những nghiên cứu chuyên sâu về chất sinh trưởng thực vật, đặt nền tảng cho khoa học về hormone thực vật (phytohormone) Ngày nay, thuật ngữ "chất điều hòa sinh trưởng thực vật" được sử dụng để chỉ chung cho nhóm các hợp chất này.
2.1.2 Những hợp chất có hoạt tính auxin
Nhiều hợp chất được xếp trong nhóm có hoạt tính sinh học như auxin tồn tại trong tự nhiên đã được khám phá bởi các sinh trắc nghiệm [28] Trong đó IAA là một auxin nội bào được nghiên cứu rộng rãi và được xem như là chất đại diện khi nói đến auxin Nó có khả năng thể hiện hoạt tính sinh học ở nồng độ cực thấp (Hình 2.4) Một số tiền chất của IAA, chẳng hạn như indole-3-acetonitrile và indole-3- pyruvic acid, cũng có hoạt tính sinh học trong sinh trắc nghiệm có lẽ vì tham gia quá trình chuyển đổi phản ứng trong các mô để tạo IAA Tương tự như vậy, indole-3- butyric acid, giống với IAA ngoại trừ hai nhóm methylene (-CH 2 -) gắn bổ sung ở chuỗi bên, cũng tìm thấy có hiệu quả trong sinh trắc nghiệm (Hình 2.5) IBA ban đầu được phân loại như một auxin tổng hợp, nhưng về sau đã tìm thấy hợp chất này có ở trong mô thực vật IBA đã được thương mại hóa nhằm tạo hệ rễ bên (rễ con) trong những năm 1990 và ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp
Ngoài các hợp chất auxin có gốc indol, một dạng clo hoá IAA có hoạt tính auxin cao là 4-Cl-IAA và phenylacetic acid cũng đã được xác nhận có ở vài loài thực vật (Hình 2.5)
4-chloroindole-3-acetic acid (4-Cl-IAA)
Hình 2.5 Các auxin nội bào Hình 2.4 Các auxin có hoạt tính sinh học [28]
Các hợp chất auxin thúc đẩy hình thành rễ bên hơn là kéo dài rễ cái thông qua hình ảnh được thử nghiệm trên cây cải
Arabidopsis thaliana Col-0 sau 6 ngày tuổi không có bổ sung (control) (A); có bổ sung 10 nM IAA (B); 100 nM 2,4-D (C); 100 nM NAA
(D); 10mM IBA (E) Và hình ảnh so sánh các nồng độ khác nhau của auxin lên độ dài của rễ sau 8 ngày nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng vàng (F)
Hai chất chính được xếp vào nhóm tổng hợp hóa học đều gây ảnh hưởng sinh học tương tự auxin, bao gồm hạn chế việc kéo dài rễ cái nhưng lại thúc đẩy hình thành hệ rễ bên là: NAA và 2,4-D (Hình 2.4) Một đồng phân khác của 1- naphthalacetic acid là 2-NAA ít có hoạt tính trong sinh trắc nghiệm (Hình 2.6) Một dẫn xuất khác của 2,4-D với hai nhóm methylene được gắn vào chuỗi bên là 2,4-DB đã thể hiện những đáp ứng sinh học tương tự khi không có sự hiện diện của 2,4-D trong quá trình thực nghiệm (Hình 2.6) Ngoài ra một số auxin tổng hợp cũng có hoạt tính auxin như 2,4,5-T; 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba) và 4- amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram) (Hình 2.6)
Hình 2.6 Các auxin tổng hợp có hoạt tính sinh học
2.1.3 Đặc điểm sinh học của IAA trong thực vật
Mặc dù hiện nay có nhiều hợp chất tự nhiên hay tổng hợp thể hiện được hoạt tính giống auxin nhưng IAA được công nhận như một phân tử tín hiệu có trong hầu hết thực vật Hàm lượng IAA ở trong mô của cây cải (Arabidopsis thaliana) - loài cây mô hình và nhiều loài thực vật khác đóng vai trò quan trọng trong việc tạo phôi, chồi và phát sinh cơ quan rễ cũng như ưu thế chồi ngọn; phát triển các mô mạch; ảnh hưởng đến quá trình tạo nụ hoa và phát triển trái IAA cũng quyết định đến quá trình lão hóa, tương tác giữa thực vật và yếu tố gây bệnh, đáp ứng các phản ứng stress vô sinh và các phản ứng khác của thực vật đối với môi trường Quá trình sinh tổng hợp, trao đổi chất, điều hòa và vận chuyển IAA luôn được thực hiện cùng nhau đảm bảo nồng độ IAA là thích hợp để đáp ứng sự phát triển ổn định của thực vật
2.1.3.1 Sinh tổng hợp IAA ở thực vật
Quá trình sinh tổng hợp IAA trong thực vật diễn ra hết sức phức tạp vì được ví như một phức hệ trao đổi chất
Những nghiên cứu cho thấy con đường sinh tổng hợp IAA bắt nguồn từ chuỗi phản ứng sinh hóa shikimate [29] (Hình 2.7A) L-Trp được chứng minh là tiền chất quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp IAA và chính L-Trp là sản phẩm cuối của chuỗi phản ứng sinh hóa shikimate được tổng hợp trong lục lạp thông qua chất trung gian chorismate [29] Từ tiền chất L-Trp quá trình sinh tổng hợp IAA được thực hiện qua 2 con đường chính: (1) phụ thuộc vào L-Trp và (2) không phụ thuộc vào L-Trp [28]; [29]
Hình 2.7 Quá trình trao đổi IAA trong thực vật
IAA được sinh tổng hợp theo con đường độc lập không phụ thuộc vào tiền chất L-Trp đến nay vẫn chưa được hiểu rõ về những gen và enzyme sinh tổng hợp liên quan, chỉ biết rằng những tiền chất như IGP hay những hợp chất indole là có liên quan đến cơ chế hình thành IAA nội bào (Hình 2.7A) [29]
Auxin sinh học tổng hợp theo con đường phụ thuộc vào tiền chất L-Trp Con đường này có 4 chuỗi phản ứng sinh hóa khác nhau, được đặt tên theo sản phẩm đầu tiên khi phản ứng với L-Trp: indole-3-acetamide, indole-3-pyruvic acid, tryptamine và con đường indole-3-acetaldoxime.
Con đường indole-3-pyruvic acid (L-Trp IPyA ( IAAld) IAA)
Trong con đường này, gen TAA1 (TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE of
ARABIDOPSIS 1) và những gen tương đồng TARs (TRYPTOPHAN
AMINOTRANSFERASE RELATED1 - 4) cùng tham gia mã hóa enzyme aminotransferase xúc tác chuyển L-Trp thành IPyA; sau đó hệ enzyme flavin monooxygenase do gen YUCCA (YUC) mã hóa chuyển hóa IPyA thành IAA (Hình
2.7B) Hiện nay vẫn còn đang nghi ngờ vai trò IAAld như là một chất trung gian trong con đường này hay không [29]
Con đường indole-3-acetamide (L-Trp IAM IAA)
Mối tương tác giữa thực vật và vi sinh vật
Tương tác giữa thực vật và vi sinh vật thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học, và các giả thuyết khoa học ngày càng được xác thực để áp dụng thực tiễn trong sản xuất nông nghiệp Thực vật tiết ra nhiều hợp chất hữu cơ như đường, axit hữu cơ và vitamin, đóng vai trò chất dinh dưỡng hoặc tín hiệu cho quần thể vi sinh vật đất Ngược lại, vi sinh vật giải phóng hoocmon thực vật, phân tử có trọng lượng phân tử thấp hoặc hợp chất dễ bay hơi có tác dụng kích hoạt miễn dịch, điều hòa tăng trưởng hoặc hình thái thực vật.
2.2.1 Thực vật - phần đóng góp cho hệ vi sinh vật đất
Sự đa dạng các hợp chất hữu cơ được tiết ra bởi các phần khác nhau của hệ thống rễ đã tạo ra một môi trường sống khác thường so với vùng đất xung quanh
Diện tích đất nhỏ hẹp giàu hợp chất sinh học được biết đến với tên gọi là vùng rễ (rhizosphere) Các hợp chất hữu cơ được gọi chung là dịch tiết rễ và được phân thành 3 nhóm chính: (1) hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, (2) hợp chất có trọng lượng phân tử cao và (3) chất hữu cơ dễ bay hơi [32] Trong đó, phần lớn dịch tiết ra từ rễ là các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp bao gồm các loại đường, acid amin, acid hữu cơ, phenol, vitamin và các hợp chất trao đổi thứ cấp
Các hợp chất cao phân tử bao gồm chất nhầy (polysaccharides) và protein, trong khi khí carbon dioxide, chất chuyển hóa thứ cấp, rượu và aldehyde thuộc nhóm chất hữu cơ dễ bay hơi Có từ 20 đến 40% những hợp chất hữu cơ được cây trồng quang tổng hợp là được vận chuyển xuống vùng rễ [32]
Hệ vi sinh vật điển hình trong vùng rễ cây bao gồm vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn và cả tảo [32] Mật độ vi sinh vật có sự tương tác với các chất dịch tiết ra từ rễ cây, và số lượng của chúng có thể thay đổi trong khoảng 10 - 100 lần trong vùng rễ so với vùng đất ngầm không có rễ của thực vật (Hình 2.11) [32] Do vậy, vùng rễ không những đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì khả năng sinh trưởng và phát triển tự nhiên cho cây trồng; nó còn là một hệ thống chức năng trong việc tương tác và giao tiếp giữa rễ và vi sinh vật
Một vài nghiên cứu cho thấy dịch tiết ra từ hệ thống rễ cây là acid malic đóng vai trò như một phân tử tín hiệu thu hút vi khuẩn có lợi trong đất như Bacillus subtilis đến để bảo vệ cây trồng chống lại yếu tố gây hại trên lá là Pseudomonas syringaei [32] Các phân tử tín hiệu phòng vệ ngoại bào như acid salicylic, methyl jasmonate và nitric oxide đã kích ứng sự hình thành một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm glucosinolate indole, phytoalexin và alkamides có thể đóng một vai trò trong việc giao tiếp với quần thể vi khuẩn [32] Có kết quả chứng minh rằng chính hệ rễ đã có những lựa chọn để tiết ra các hợp chất hữu cơ nhằm tạo các tín hiệu có hiệu quả cao đối với các vi khuẩn và nấm có lợi hơn là các loài vi sinh gây hại [32]
Hình 2.11 Sự thay đổi hình thái cây trồng nhờ tăng mật độ vi sinh có lợi ở vùng rễ
A Vùng rễ không ủ thêm vi sinh có lợi B Vùng rễ có sử dụng thêm vi sinh có lợi
Dựa vào một vài ý nghĩa như đã trình bày, việc kiểm soát được vùng rễ là có khả năng quản lý được một khu vực sinh học quan trọng với mục tiêu thúc đẩy hiệu suất sản xuất của cây trồng chỉ với một lượng nhỏ là nước, phân bón và những hóa chất dùng trong nông nghiệp Hơn nữa, vấn đề này có thể đạt được bằng cách bón bổ sung các vi sinh vật hữu ích vào vùng đất hoặc bằng kỹ thuật gen ở thực vật nhằm thay đổi đặc tính gen để ảnh hưởng đến nồng độ và loại các chất hữu cơ là dịch tiết từ rễ nhằm kích ứng hệ sinh thái vùng rễ [33]
2.2.2 Hệ vi sinh vật đất - phần đóng góp quan trọng cho đất và thực vật
Các hợp chất giàu carbon được tiết ra từ hệ rễ cây trồng vào vùng rễ làm tăng sinh khối và hoạt tính hệ vi sinh vật tại vùng rễ Cũng chính nhờ hệ vi sinh vật hữu ích tại vùng rễ có thể giúp ngăn chặn những yếu tố gây bệnh - là các sinh vật gây hại lan truyền qua đất, và giúp điều hòa tăng trưởng thực vật bởi các cơ chế trực tiếp hoặc gián tiếp khác nhau [33] Chẳng hạn như sản xuất hormone thực vật; kí sinh trên nấm gây hại; phân hủy và khoáng hóa chất hữu cơ; tạo các hợp chất mùn cho đất; làm tăng hoạt tính sinh học của các dinh dưỡng khoáng như phốtpho và sắt
Ngoài ra, các vi sinh vật có lợi đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch của cây trồng bằng cách sản xuất các phân tử kích thích miễn dịch; giúp cây trồng chống chịu với các điều kiện thời tiết khắc nghiệt như hạn hán, độ mặn (Hình 2.12) [33].
Hình 2.12 Sự tương tác mật thiết của hệ vi sinh vật hữu ích trong đất đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng trước các yếu tố hữu sinh và vô sinh
Cây chủ Cây bị mặn
Sự tương tác giữa thực vật và sinh vật
Hỗ trợ cây chủ Hỗ trợ cây trước yếu tố gây hại
Cộng sinh với cây chủ Hình thành hỗ sinh do môi trường Mục đích cải thiện chức năng thực vật trước yếu tố gây hại
2.2.3 Ứng dụng chế phẩm vi sinh vật cho cây trồng
Dựa trên phản ứng tương hỗ có lợi giữa thực vật và vi sinh vật, các chế phẩm vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp Tùy theo hoạt động, chế phẩm vi sinh có thể đóng vai trò phân sinh học, thuốc trừ sâu hay thuốc trừ cỏ sinh học Việc sử dụng chế phẩm sinh học tăng mạnh trên toàn thế giới, đạt tốc độ tăng trưởng thị trường khoảng 10% Chiến lược khai thác vi sinh vật hữu ích và tương tác thực vật - vi sinh vật tạo ra hướng đi tiềm năng, thân thiện với môi trường cho cả nông nghiệp truyền thống và hữu cơ.
Nhưng thật đáng tiếc là sự tương tác hữu ích giữa thực vật - vi sinh vật thường bị bỏ qua trong các phương thức trồng trọt mặc dù hệ vi sinh vật liên quan đến thực vật đảm nhận chức năng quan trọng tới hệ sinh thái cây trồng và đất [6]
Những tương tác có lợi bao gồm nhiều tác động của vi sinh vật đến sức khỏe và sự tăng trưởng của cây trồng; chúng giúp khả năng chống chịu các stress hữu sinh hay vô sinh; tăng cường khả năng kháng bệnh cho cây; giúp khoáng hóa các chất dinh dưỡng cho cây trồng hấp thụ và thúc đẩy đa dạng sinh học Hơn nữa, những quần thể vi sinh vật liên quan đến thực vật có ảnh hưởng tới sự trao đổi chất thứ cấp đặc thù và hình thái học cho từng loài cây Kiến thức này vẫn chưa được khai thác áp dụng triệt để trong công nghệ sinh học nông nghiệp [33]
Tuy nhiên, trong suốt hơn 150 năm qua, các nghiên cứu đã chứng minh rằng vi khuẩn và nấm có một sự tương tác mật thiết với cây chủ của chúng và có thể thúc đẩy sự tăng trưởng cây trồng cũng như khả năng ngăn chặn các yếu tố gây bệnh [6]
Tất cả môi trường sống vi mô liên quan đến vùng đất của cây trồng, đặc biệt là vùng rễ được xem là thuộc địa của vi sinh vật với mật độ và sự đa dạng chủng loài cực lớn Diễn giải một cách ngắn gọn, có 2 khả năng ảnh hưởng đến việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật hay giúp cây trồng đối kháng trước các yếu tố vô sinh hay hữu sinh bao gồm: (1) quản lý hệ vi sinh vật bản địa bằng cách bổ sung các hợp chất hữu cơ;
(2) bổ sung thêm hệ vi sinh vật hữu ích có khả năng kiểm soát sinh học hoặc thúc
Nấm Aureobasidium pullulans
Loài nấm Aureobasidium pullulans đã được biết đến vào cuối thế kỷ thứ 19 với nhiều tên gọi khác nhau [35] Năm 1884, danh pháp sơ khai của loài nấm A pullulans đã được de Barry mô tả với cái tên là nấm Dematium pullulans Năm 1891,
Các nhà khoa học Viala và Boyer đã phát hiện ra loài nấm Aureobasidium vitisi sinh sống trên bề mặt lá cây nho (Vitis vinifera) Sau đó, vào năm 1918, A pullulans (de Bary) Arnold được công nhận là tên khoa học chính thức của loài nấm này.
Bary) được Arnaud đề xuất Nhưng vào năm 1923, Berkhout đã mô tả lại loài nấm A pullulans bằng cái tên khác là nấm Pullularia pullulans (de Bary) Năm 1956, Ciferri cùng cộng sự đã sử dụng lại tên A pullulans (de Bary) Arnaud Loài nấm A pullulans còn được biết với cái tên chung là nấm men đen (Black yeast-like) vì liên quan đến khả năng tạo sắc tố melanin Đã có ý kiến cho rằng lý do loài nấm Aureobasidium pullulans có nhiều cái tên khác nhau được cho là có sự nhầm lẫn khi dựa vào những khuẩn lạc nuôi cấy ở các điều kiện môi trường khác nhau Bởi hình thái khuẩn lạc và tế bào nấm
Aureobasidium pullulans cho thấy phụ thuộc vào (i) loại nguồn carbon (đường hay đường có gốc rượu) sử dụng trong môi trường nuôi cấy; (ii) thời gian nuôi cấy; (iii) nhiệt độ nuôi cấy; (iv) chu trình ánh sáng và (v) loại cơ chất
2.3.2 Hệ thống phân loại và đặc điểm hình thái
Nấm Aureobasidium pullulans có 4 thứ dưới loài khác nhau đó là: (1) Aureobasidium pullulans var pullulans, (2) var melanogenum, (3) var subglaciale và (4) var namibiae [36]
2.3.2.1 A pullulans (de Bary) G Arnaud var pullulans (1918) (MB 101771) Đây chính là loài nấm do de Bary phát hiện lần đầu vào năm 1884 với tên gọi là Dematium pullulans (MB 219317) Gần đây, Zalar cùng cộng sự (2008) đã xác nhận rằng A pullulans var pullulans là Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud var aubasidani Yurlova (MB 442903) do Yurlova và de Hoog mô tả vào năm 1997.Hầu hết những mẫu phân lập phát hiện A pullulans var pullulans bắt nguồn từ những môi trường sống liên tục bị biến động như nước mặn trong các ruộng muối, tồn tại trong nhựa cây, bề mặt trái và cả lá cây Đường kính khuẩn lạc A pullulans var pullulans vào khoảng 3 cm sau khi ủ ở 25°C trong 7 ngày trên môi trường PDA (Hình 2.13A) Khuẩn lạc lúc này bằng phẳng, mịn, ẩm ướt, giống khuẩn lạc nấm men, đặc biệt là nhầy nhớt đến nhão do quá trình hình thành bào tử Bề mặt khuẩn lạc có màu trắng, hồng nhạt đến vàng nhạt Sau 14 ngày xuất hiện những vùng có màu đen do sợi nấm chuyển sang màu tối hoặc do bào tử phát triển Rìa mép khuẩn lạc luôn xuất hiện hệ sợi nấm như lông tơ Không tìm thấy sợi nấm khí sinh ở A pullulans var pullulans
Hình 2.13 Hình ảnh đại thể và vi thể A pullulans var pullulans
Hệ sợi nấm sinh dưỡng màu trắng trong, mịn, có vách mỏng rộng khoảng 4–
12 àm, cú vỏch ngăn ngang, trong mụi trường cũ đụi lỳc xuất hiện những sợi nấm cú màu nâu đen ở vài vị trí Những tế bào tạo bào tử vô định hình nằm xen ở giữa và cả đoạn cuối sợi nấm sinh dưỡng Một lượng lớn các bào tử được sản xuất cùng lúc từ đầu đến cuối trên những cấu trúc bên hình giống những răng nhỏ Bào tử có màu trắng trong đến nâu đen Bào tử trắng trong là loại đơn bào, trơn, hình trái xoan, có nhiều hỡnh dạng và kớch thước khỏc nhau 7,5 – 16 ì 3,5 – 7 àm với một cỏi mấu (rốn) không rõ ràng (Hình 2.13B) Bào tử màu nâu đen thường có dạng 1 - 2 tế bào, loại 1 tế bào cú kớch thước 10 – 17 ì 5 – 7 àm; loại 2 tế bào teo thon ở vỏch ngăn cú kớch thước 14 – 25 ì 5 – 11 àm Quỏ trỡnh nảy chồi của sợi nấm và cả bào tử thường được quan sát thấy khá rõ với sự xuất hiện của bào tử thứ cấp luôn nhỏ hơn bào tử sơ cấp Bào tử trong môi trường lâu ngày thường chuyển thành hình cầu, nâu nhạt có kớch thước đường kớnh vào khoảng 10 - 15 àm
A pullulans var pullulans có khả năng chịu được nồng độ muối NaCl 15% và khoảng nhiệt độ từ 4 - 30°C, thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển là 25°C
2.3.2.2 A pullulans (de Bary) Arn var melanogenum Hermanides-Nijhof (1977) (MB 352628)
Nguồn phân lập của chủng A pullulans var melanogenum được cho là ở những nơi có nguồn dinh dưỡng thấp, những môi trường có độ bền thấp như bề mặt ẩm ướt của kim loại hay thủy tinh, vòi sen, vòi phun nước cũng như là nước biển
Duy nhất có một chủng trong dòng này được phân lập từ bệnh nhân, nhưng nó cũng được cho rằng đây là một nguyên nhân gây bệnh cơ hội, vì nó được báo cáo có mặt trong không khí, đặc biệt là ở vùng khí hậu ấm áp Đường kính khuẩn lạc A pullulans var melanogenum vào khoảng 2,5 cm sau khi ủ ở 25°C trong 7 ngày trên môi trường PDA (Hình 2.14A) Khuẩn lạc lúc này bằng phẳng, mịn, nhầy nhớt liên quan đến sự hình thành lượng lớn bào tử và polysaccharide ngoại bào Bề mặt khuẩn lạc có màu xám ôliu ở phần trung tâm, phần gần rìa mép khuẩn lạc màu vàng xám, nhưng phần rìa mép lại có màu trắng hơi vàng nhạt Rìa mép khuẩn lạc luôn xuất hiện hệ sợi nấm như lông tơ hay những sợi nấm
27 dày, gợn sóng phát triển vào bề mặt thạch đôi lúc chỉ thấy ở vài vị trí Sau 14 ngày toàn bộ những khuẩn lạc có màu xanh đến đen Tìm thấy hệ sợi nấm khí sinh phát triển ở vài nơi trên khuẩn lạc A pullulans var melanogenum
Tổ chức sợi nấm dinh dưỡng ở phần trung tâm khuẩn lạc có màu nâu đen, mịn đến hơi nhỏm và có cuống dày, rộng khoảng 6–12 µm, cuống ngang, co thắt ở đoạn gần vách ngăn, được bao bọc bởi polysaccharide ngoại bào, bào tử túi có màu nâu đen, loại 1 tế bào có kích thước 13–16 µm x 8–12 µm và loại 2 tế bào là 17–24 µm x 10–12 µm Tổ chức sợi nấm dinh dưỡng ở phần rìa có màu trắng trong, mịn, cuống mỏng và rộng khoảng 2–10 µm, cuống ngang Khi được chiếu sáng hệ sợi nấm dinh dưỡng này trở nên dày hơn và có màu tối sẫm Tổ chức sợi nấm dinh dưỡng ăn sâu vào bề mặt thạch xuất hiện những mấu bên giúp bám chặt.
Hình 2.14 Hình ảnh đại thể và vi thể A pullulans var melanogenum
28 loại 1 tế bào cú kớch thước 7 ì 6 àm; loại 2 tế bào hơi teo thon ở vỏch ngăn cú kớch thước 12–20 ì 4–12 àm Quỏ trỡnh nảy chồi của sợi nấm hay ở bào tử (đụi khi chỉ xảy ra một trong 2) thường được quan sát thấy khá rõ với sự xuất hiện của bào tử thứ cấp luôn nhỏ hơn bào tử sơ cấp
A pullulans var melanogenum có khả năng chịu được nồng độ muối NaCl
10% và khoảng nhiệt độ từ 10 - 35°C, thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển là 30°C
2.3.2.3 Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn var subglaciale Zalar, de Hoog
Đường kính khuẩn lạc của A pullulans var subglaciale khoảng 2 cm sau 7 ngày ủ ở 25°C trên môi trường PDA Khuẩn lạc phẳng, mịn, màu cam nhạt và nhầy do hình thành nhiều bào tử Sau 14 ngày, trung tâm khuẩn lạc chuyển sang hồng nhạt, gần viền có màu nâu đậm Viền khuẩn lạc xuất hiện hệ sợi nấm dày gợn sóng, đâm sâu vào thạch Không có hệ sợi nấm khí sinh.
Hình 2.15 Hình ảnh đại thể và vi thể A pullulans var subglaciale
Hệ sợi nấm sinh dưỡng màu trắng trong, mịn, có vách mỏng rộng khoảng 2–
10 àm, cú vỏch ngăn ngang, trong mụi trường lõu ngày đụi lỳc xuất hiện những sợi nấm cú màu nõu đen, vỏch dày và cú đường kớnh khoảng 5 - 9 àm Những tế bào tạo bào tử vô định hình nằm xen ở giữa và cả đoạn cuối sợi nấm sinh dưỡng, đôi lúc phát triển thành một cụm giống cấu trúc cuống bào tử Một lượng lớn các bào tử được sản xuất cùng lúc từ đầu đến cuối trên những cấu trúc bên hình giống những răng nhỏ
Bào tử có màu trắng trong đến nâu đen Bào tử trắng trong là loại đơn bào, trơn, hình trỏi xoan, cú nhiều hỡnh dạng và kớch thước khỏc nhau 5,5–28 ì 2–6,5 àm với một cái mấu (rốn) không rõ ràng (Hình 2.15B) Bào tử màu nâu đen thường có dạng 1 - 2 tế bào, loại 1 tế bào cú kớch thước 8–16 ì 5–9 àm; loại 2 tế bào là 9–25 ì 5,5–7,5 àm Quỏ trỡnh nảy chồi thường được quan sỏt thấy khỏ rừ với sự xuất hiện của bào tử thứ cấp luôn nhỏ hơn bào tử sơ cấp
A pullulans var subglaciale có khả năng chịu được nồng độ muối NaCl 10% và khoảng nhiệt độ từ 4 - 25°C, thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển cũng là 25°C Tất cả các chủng A pullulans var subglaciale được phân lập từ vùng Bắc cực, trong vùng băng tuyết và trong những vùng lân cận của các sông băng như trong nước biển Do vậy thứ dưới loài này có thể phát triển ở nhiệt độ thấp hơn so với các thứ khác của loài A pullulans
2.3.2.4 Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn var namibiae Zalar, de Hoog
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Sử dụng 143 chủng nấm được phân lập từ tế bào lá cây bắp ở phòng thí nghiệm nấm men thuộc khoa vi sinh vật học, trường Đại Học Kasetsart, Thái Lan
Công việc định danh 143 chủng nấm được tiến hành song song cùng với 1 nhóm khác thuộc phòng thí nghiệm nấm men, khoa vi sinh vật học.
Phương pháp thực hiện
3.2.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của 143 chủng nấm
Mục tiêu của thí nghiệm này là khảo sát toàn bộ 143 chủng nấm nội cộng sinh được phân lập từ lá cây bắp trước đó cho khả năng sinh tổng hợp IAA; nhằm chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất trong môi trường YPD (Hình 3.1)
Hình 3.1 Lược đồ tóm tắt khảo sát 143 chủng nấm cho khả năng sinh tổng hợp IAA
Phần dịch nổi Phần sinh khối nấm
Thuốc thử Salkowski Sấy khô ở 100 0 C Đo quang phổ (530 nm)
Sinh khối tế bào (g/L) Chủng nấm sinh tổng hợp IAA cao nhất Ly tâm 8,000 vòng trong 5 phút
YPD + L-Trp Lắc ở 340 vòng/phút Nhiệt độ phòng
Mẫu chủng nấm đã nuôi cấy 24h trên môi trường thạch YMPD được chuyển vào trong ống nghiệm có chứa 5 mL môi trường YPD có bổ sung thêm 1 g/L L-Trp (Sigma) [37] Nghiệm thức đối chứng tiến hành không bổ sung thêm L-Trp và tất cả các ống nghiệm được nuôi cấy lắc 340 vòng/phút trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng
Hàm lượng IAA có trong canh trường lên men được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 530 nm sau khi ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 5 phút Phương pháp này dựa trên phản ứng của IAA với thuốc thử Salkowski, bao gồm FeCl3 và H2SO4 Phần dịch nổi 1 mL sẽ được phản ứng với 1 mL thuốc thử Salkowski Hàm lượng IAA được xác định dựa trên cường độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 530 nm.
H 2 SO 4 ) trong 30 phút Hàm lượng IAA có trong mẫu được tính toán thông qua phương trình hàm lượng IAA chuẩn
Tăng trưởng của 143 chủng nấm được xác định bằng trọng lượng khô tế bào Tế bào nấm được thu gom bằng cách ly tâm, rửa sạch bằng nước cất và sấy khô ở 100 độ C đến khối lượng không đổi Quá trình rửa sạch giúp loại bỏ các thành phần môi trường lên men, đảm bảo độ chính xác trong phép đo trọng lượng khô.
Từ 143 chủng nấm (kí hiệu từ CE01 đến CE143) đã lựa chọn được 5 chủng nấm đó là CE63, CE88, CE104, CE132 và CE135 có khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất Tiếp tục tiến hành khảo sát 5 chủng nấm này để lựa ra chủng sinh tổng hợp IAA cao nhất ở điều kiện 30 0 C và lắc ở 200 vòng/phút Có sự thay đổi trong phần khảo sát 5 chủng nấm này là chuyển 0,5 mL mẫu đã tăng sinh 18-20h trong môi trường YMPD vào erlen 250 mL có chứa 50 mL môi trường YPD có bổ sung thêm 1 g/L L-Trp (Sigma) Hàm lượng IAA có trong canh trường và sinh khối của 5 chủng nấm vẫn được xác định như trên nhưng sau các mốc thời gian là 1; 2; 3; 4 và 5 ngày lên men
3.2.2 Khảo sát thành phần môi trường tạo IAA cao nhất
Sau quá trình khảo sát 143 chủng nấm, đã lựa chọn được chủng nấm
Aureobasidium pullulans (kí hiệu DMKU-CE104) có khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất trong môi trường YPD có bổ sung L-Trp ở nhiệt độ 30 0 C và lắc 200 vòng/phút Công việc tối ưu hóa các thành phần môi trường được thực hiên như mô tả trong hình 3.2
3.2.2.1 Khảo sát thành phần L-Trp
Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ L-Trp ở chủng nấm A pullulans cho khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất Erlen 250 mL chứa 50 mL môi trường YPD có sự thay đổi nồng độ L-Trp là 0; 0,5; 1; 1,5; 2 và 2,5 g/L Mỗi erlen được ủ với 0,5 mL canh trường A pullulans đã tăng sinh 18-20h nuôi cấy trong môi trường YMPD Tất cả các erlen được nuôi cây lắc 200 vòng/phút, ở 30 0 C trong điều kiện tối với 4 lần lặp lại (4 erlen cho một nghiệm thức L-Trp) và chỉ thực hiện 1 lần
Hình 3.2 Lược đồ tóm tắt tối ưu hóa môi trường chủng nấm A pullulans
Ly tâm 8,000 vòng trong 5 phút
Sau mỗi 6 giờ lấy mẫu canh trường
- Nồng độ L-Trp - Nguồn và nồng độ N - Nguồn và nồng độ C - pH môi trường - Nhiệt độ tối ưu
Sinh khối tế bào (g/L) Thuốc thử Salkowski Đo quang phổ (530 nm)
Hàm lượng IAA (mg/L) Xác định đƣợc điều kiện tối ƣu
Phần dịch nổi Phần sinh khối nấm
Sau mỗi 1; 3; 5; 7; 9; và 11 ngày 3 mL mẫu canh trường được lấy ra để kiểm tra hàm lượng IAA và mật độ tế bào
3.2.2.2 Khảo sát nguồn và nồng độ nitơ
Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của 2 nguồn nitơ (hữu cơ và vô cơ) đến quá trình sinh tổng hợp IAA ở chủng nấm A pullulans (Hình 3.3)
Erlen 250 mL chứa 50 mL môi trường YPD gồm 2 thành phần cố định là glucose 2% (w/v) và L-Trp 1,5 g/L, trong khi thay đổi nguồn nitơ là cao nấm men (1%); pepton (1%); cao nấm men 1% và pepton 2% trong môi trường YPD ( mẫu đối chứng); NH 4 Cl (1%); (NH 4 ) 2 SO 4 (1%); NH 4 NO 3 (1%); KNO 3 (1%) và NaNO 3 (1%)
Hình 3.3 Sơ đồ bố trí nghiệm thức khảo sát nguồn nitơ
So sánh và lựa chọn giữa 2 nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ Glucose (2%)
NH 4 Cl (1%) (NH 4 ) 2 SO 4 (1%) NaNO 3 (1%) KNO 3 (1%) NH 4 NO 3 (1%) Ure (1%)
Các erlen được ủ với 0,5 mL canh trường mẫu A pullulans đã tăng sinh 18-20h nuôi cấy trong YMPD
Tất cả các erlen được nuôi cây lắc 200 vòng/phút, ở 30 0 C trong điều kiện tối với 4 lần lặp lại và chỉ thực hiện 1 lần Để kiểm tra nồng độ IAA cứ sau mỗi 12h (trong 84h) lấy 3 mL mẫu canh trường để kiểm tra, riêng nồng độ tế bào là 6h lấy mẫu kiểm tra 1 lần
Để xác định nguồn và nồng độ cacbon tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp IAA ở nấm A pullulans, nghiên cứu đã tối ưu hóa nguồn và nồng độ cacbon trước khi tiến hành tối ưu hóa nồng độ nitơ bằng nguồn nitơ tốt nhất là cao nấm men (1%) Trong quá trình này, các nồng độ cao nấm men được tối ưu hóa lần lượt là 5; 10; 15 và 20 (g/L), tương tự như khi tối ưu nồng độ L-Trp.
200 vòng/phút, ở 30 0 C trong điều kiện tối với 4 lần lặp lại và chỉ thực hiện 1 lần Để kiểm tra nồng độ IAA cứ sau mỗi 12h (trong 84h) lấy 3 mL mẫu canh trường để kiểm tra, riêng nồng độ tế bào là 6h lấy mẫu kiểm tra 1 lần
3.2.2.3 Khảo sát nguồn và nồng độ carbon
Sử dụng 8 nguồn carbon khác nhau (glucose, sucrose, glycerol, manitol, sorbitol, xylytol, xylose và citrate sodium) để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến quá trình tổng hợp IAA ở chủng nấm A pullulans Nấm được nuôi trong môi trường YMPD với sự thay thế các nguồn carbon 2%, ủ với canh trường mẫu A pullulans đã tăng sinh 18-20 giờ nuôi cấy ở 30 độ C, lắc 200 vòng/phút trong điều kiện tối Nồng độ IAA được kiểm tra sau mỗi 12 giờ (trong 84 giờ), trong khi nồng độ tế bào được kiểm tra sau mỗi 6 giờ.
Sau khi có được nguồn carbon tối thích sẽ tiến hành tối ưu nồng độ carbon và nguồn carbon tối thích được tìm thấy là glycerol (2%) Tương tự vẫn sử dụng erlen
(250 mL) có chứa 50 mL môi trường cao nấm men (1%) và L-Trp 1,5 g/L với sự thay đổi nồng độ glycerol lần lượt là 5; 10; 15; 20; 25; 30 và 35 (g/L)
Các erlen được ủ với 0,5 mL canh trường mẫu Aureobasidium pullulans đã tăng sinh 18-20h nuôi cấy trong YMPD Tất cả các erlen được nuôi cây lắc 200 vòng/phút, ở 30 0 C trong điều kiện tối với 4 lần lặp lại (4 erlen cho 1 nghiệm thức nồng độ glycerol) và chỉ thực hiện 1 lần Để kiểm tra nồng độ IAA cứ sau mỗi 12h (trong 84h) lấy 3 mL mẫu canh trường để kiểm tra, riêng nồng độ tế bào là 6h lấy mẫu kiểm tra 1 lần
3.2.2.4 Khảo sát pH tối ƣu cho quá trình sinh tổng hợp IAA
Khi đã có được các thành phần môi trường tối ưu tiến hành kiểm tra điều kiện pH tối thích cho quá trình sinh tổng hợp IAA ở chủng nấm A pullulans Sử dụng erlen (250 mL) có chứa 50 mL môi trường cao nấm men (5 g/L), L-Trp 1,5 g/L và glycerol (5 g/L) Các mức pH khác nhau là 3; 5; 7 và 9 được điều chỉnh bằng NaOH 0,1N và HCl 0,1N Các erlen được ủ với 0,5 mL canh trường mẫu A pullulans đã tăng sinh 18-20h nuôi cấy trong YMPD Tất cả các erlen được nuôi cây lắc 200 vòng/phút, ở 30 0 C trong điều kiện tối với 4 lần lặp lại (4 erlen cho 1 nghiệm thức nguồn carbon) và chỉ thực hiện 1 lần Để kiểm tra nồng độ IAA cứ sau mỗi 12h (trong 84h) lấy 3 mL mẫu canh trường để kiểm tra, riêng nồng độ tế bào là 6h lấy mẫu kiểm tra 1 lần
3.2.2.5 Khảo sát nhiệt độ tối ƣu cho quá trình sinh tổng hợp IAA
Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp IAA ở chủng nấm
Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các nghiệm thức đều được thực hiện với số lần lặp lại theo từng nghiệm thức đã trình bày trong những phần trên, tuy nhiêu số mẫu thấp nhất là 3 và nhiều nhất là 4 lần lặp lại
Để tối ưu hóa môi trường sản xuất IAA, các nghiên cứu viên tiến hành phân tích đơn yếu tố ANOVA (Analysis of variance) nhằm xác định các yếu tố có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Phần mềm Statgraphics và Microsoft Excel được sử dụng cho tất cả các nghiệm thức trong nghiên cứu.