Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sản xuất bột men đỏ (Monascus) giàu Monacolin K

Gạo nấm men đỏ hiện đang được phát triển sản xuất và sử dụng để tạo các dạng thực phẩm chức năng sử dụng dưới dạng bột gạo đỏ có nồng độ thấp Monacolin K, hoặc dạng thuốc ở nồng độ Monac

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

- Chủng nấm mốc Monascus purpureus 012 do TS Nguyễn Hữu Phúc phân lập và được cấy chuyền trên thạch nghiên PGA 7 ngày

- Vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm dùng làm chủng chỉ thị cho hoạt tính kháng khuẩn của gạo men đỏ: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli

- Gạo tài nguyên được mua ở chợ Bình Tây, kích thước 4mm

Nước cất vừa đủ 1000ml - Môi trường NB [1]

Agar 20g pH 7 0,2 Nước cất vừa đủ 1000ml

- Methanol 99,9% (J.B.T- Jacker), ethanol 96%, H 3 PO 4 99,9% (Merck), n- buthanol, Acetone 99%, NaOH, MSG

- Chất chuẩn thuộc nhóm Statin mua ở Viện kiểm nghiệm thuốc của Bộ y tế thành phố Hồ Chí Minh

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị nuôi cấy: tủ cấy, tủ ấm, nồi hấp áp suất, máy lắc ngang, tủ lạnh, lò viba, bếp điện …

- Thiết bị phân tích: kính hiển vi, cân kỹ thuật, cân phân tích, pH kế, máy ly tâm, máy đo quang phổ, máy quét UV-VIS, máy vortex, bể điều nhiệt, bồn siêu âm, máy cô quay, máy đo độ ẩm, thiết bị HPLC

- Dụng cụ thủy tinh trong phân tích: erlen, becher, đĩa petri, ống nghiệm, bình định mức, phiễu, pipetman, đầu lọc kim tiêm.

Nội dung thí nghiệm

Các bước thí nghiệm trong đề tài được thực hiện theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp sắc tố và monacolin K

- Thời gian - Độ ẩm - pH - Nguồn cacbon và nitơ - Vi lượng

Xử lý mẫu sau lên men - Sấy, nghiền

- Định lượng sắc tố - Định lượng monacolin K - Độ bền dịch chiết

Dịch mẫu thô và phân tích

Gạo trước hấp Hấp tiệt trùng 121 0 C trong 20 phút

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát quá trình lên men gạo tạo bột men đỏ

Nuôi tĩnh nhiệt độ phòng trong 20 ngày

Sấy 50 0 C, trong 48 giờ Bột gạo đỏ

Quy trình trích ly sắc tố và làm bột màu từ gạo men đò

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ chiết tách sắc tố màu từ gạo men đỏ

Trích ly 0.5g gạo men đỏ Dầu gấc 60%

Thu hồi Ethanol Nghiền mịn

Dịch màu thô Tinh bột hòa tan

Phương pháp thí nghiệm

Để quan sát dạng khuẩn lạc của nấm mốc M.purpureus 012 tiến hành cấy điểm trên đĩa petri chứa môi trường PGA, nuôi ở nhiệt độ phòng

Thời gian quan sát hàng ngày bằng mắt thường từ khi bắt đầu cấy đến 16 ngày Đo đường kính khuẩn lạc, quan sát màu sắc, đặc điểm của khuẩn lạc theo từng thời gian

2.4.1.2 Quan sát vi thể [2] Để dễ quan sát hình thái cấu trúc của sợi nấm và các cơ quan sinh sản của nấm

M purpurues 012 ở trạng thái tự nhiên phải làm tiêu bản nấm mốc rồi quan sát dưới kính hiển vi vật kính x10, sau đó vật kính x40

Đặt đĩa thạch PGA đã cấy nấm nơi nhiệt độ phòng trong 72 giờ Dùng một lam kính đã được sấy khô, sạch và trong Lấy một đoạn giấy bóng kính kích thước 1cm x 2-3cm, chạm vào khuẩn lạc nấm sao cho lấy được đầy đủ hình thái (từ tế bào chân đế đến hạt đính) Cuối cùng, trải giấy bóng kính lên lam kính để quan sát.

2.4.2 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật [1] Để xác định số lượng bào tử và số tế bào vi sinh vật có trong mẫu, sử dụng phương pháp xác định gián tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc

 Thực hiện - Đổ 15ml môi trường PGA vào đĩa petri vô trùng, để thạch đông

- Pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng thích hợp

- Dựng pipetvà đầu tớp vụ trựng chuyển 100àl mẫu pha loóng lờn trờn mặt thạch và dùng que thủy tinh khử trùng trãi đều dịch giống

- Ủ đĩa ở tủ ấm 28 0 C – 30 0 C trong 2-3 ngày Sau đó đếm số khuẩn lạc

 Tính kết quả - Mật độ tế bào trong mẫu được tính như sau

Mi = A i x D i /V (CFU/ml) Trong đó: Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa

D i : Độ pha loãng V: thể tích dịch mẫu cho vào đĩa (0,1ml)

2.4.3 Phương pháp lên men bề mặt [45]

 Chuẩn bị môi trường lên men (môi trường lên men ở đây là môi trường rắn trên cơ chất là gạo)

- Gạo nguyên hạt được rửa sơ nhằm loại các chất dơ và bụi bám trên hạt gạo

- Ngâm nước khoảng 12 giờ để nước ngấm vào và làm mềm hạt gạo

- Nguyên liệu được vớt ra để ráo nước và cho vào các erlen 250ml với lượng 20gram đậy nút bông và hấp tiệt trùng 121 0 C, 20 phút

- Sau khi tiệt trùng các bình môi trường được lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng

Cấy giống từ ống thạch nghiên chứa môi trường PGA đã nuôi trước đó 7 ngày

 Chuẩn bị giống cho lên men

- Hút 10ml nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng cho vào mỗi ống giống

M.purpureus 012, dùng que cấy đánh đều bào tử trên mặt thạch hòa tan vào nước

- Dùng pipet hút 2ml nước muối có chứa (khoảng 34.10 4 ~ 4.10 6 bào tử ) cho vào môi trường lên men (ở đây 20g gạo trong erlen 250ml)

Sau khi cấy xong cho các bình môi trường nuôi ở nhiệt độ phòng Mẫu được lấy ra ở các ngày khác nhau trong thời gian lên men, sấy khô mẫu sau lên men đến trọng lượng không đổi ta được sản phẩm gạo men đỏ bảo quản ở nhiệt độ thường để xác định sắc tố và hàm lượng Monacolin K

2.4.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và

Sắc tố của gạo men đỏ không bị phân hủy khi sấy ở nhiệt độ cao Mặc dù bền ở nhiệt độ thường nhưng nếu trích ly trong dung môi không thích hợp để chiết hết sắc tố thì hiệu suất cũng không cao Do đó, dung môi trích ly cũng cần được khảo sát vì nó đóng vai trò tương đối quan trọng trong phản ứng và vì tính kinh tế

- Gạo sau khi lên men được 20 ngày sấy khô đến khối lượng không đổi ở 50 0 C trong 48h, sau đó xay và nghiền thành bột mịn

- Cân 0,5g bột mịn cho vào 10ml ethanot 70% lắc đều

- Lắc trên máy lắc ngang 120v/ph trong 2h ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm để 5000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch nổi

Hút 1ml dịch nổi bằng pipet rồi pha loãng bằng ethanol 70% Tiếp theo, đo hấp thụ dung dịch pha loãng bằng máy quang phổ ở bước sóng 410nm và 505nm, sử dụng dung môi trích ly làm mẫu chuẩn trắng.

- Tính lượng sắc tố thu nhận được công thức ở mục 2.4.5 và vẽ hình

2.4.4.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Để xác định thời gian cho lượng sắc tố và monacolin K sinh ra cao nhất trong quá trình lên men chúng tôi tiến hành như sau

- Chuẩn bị môi trường lên men giống như ở mục 2.4.3, bổ sung thêm nước để độ ẩm 45-50%

- Hút 2ml nước muối sinh lý có chứa giống M.purpureus 012 vào môi trường gạo hấp đã vô trùng và nuôi ở nhiệt độ phòng

- Phân tích mẫu theo từng thời gian, bắt đầu từ lúc môi trường chuyển sang màu đỏ (ngày thứ 5), sau đó lấy mẫu vào các ngày 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21

- Phân tích mẫu đo sắc tố ở bước sóng 410nm và 505nm và xác định hàm lượng monacolin K

Với thời gian đã chọn, xác định độ ẩm cần thiết cho môi trường lên men của chủng M.purpureus 012 Chuẩn bị môi trường lên men giống như ở mục 2.4.3

Thử nghiệm bổ sung nước cho gạo ở các thể tích 5, 15, 30, 50ml; chuẩn bị môi trường tiệt trùng và lên men theo phương pháp đã mô tả, trích mẫu vào các ngày 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, phân tích đo sắc tố ở bước sóng 410nm và 505nm để xác định hàm lượng monacolin K.

Với thông số thời gian và độ ẩm đã chọn, ngâm gạo trong nước có pH thay đổi từ 4; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 điều chỉnh bằng acid H 3 PO 4 và NaOH

Môi trường gạo có bổ sung nước theo pH trên và chuẩn bị môi trường tiệt trùng và lên men như mục 2.4.3 Trích mẫu vào các ngày 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 phân tích đo sắc tố ở bước sóng 410nm và 505nm

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp sắc tố và monacolin K của M purpureus 012, chuẩn bị môi trường lên men như mục 2.4.3

- Vào ngày lên men thứ 5 bổ sung thành phần glucose: 0.8g, 1,6g, 2,4g tương với các nồng độ 4%, 8%, 12% Độ ẩm môi trường 50-55%, pH 6 và lên men trong 17 ngày

- Đo sắc tố ở bước sóng 410nm và 505nm và quét UV-VIS

2.4.4.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp sắc tố và monacolin K của M purpureus 012, môi trường lên men bổ sung các thành phần pepton, cao nấm men, MSG Chuẩn bị môi trường lên men như mục 2.4.3, hấp tiệt trùng và cấy 2% giống vào

- Vào ngày lên men thứ 5 bổ sung pepton, MSG và cao nấm men 0,2g và 1g tương ứng nồng độ 1%, 5% Độ ẩm môi trường 50-55%, pH 6 và lên men trong 18 ngày

- Đo sắc tố ở bước sóng 410nm và 505nm và quét UV-VIS

2.4.4.6 Ảnh hưởng các vi lượng

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn vi lượng đến sinh tổng hợp sắc tố của M purpureus 012, môi trường lên men bổ sung các thành phần vi lượng như sau:

Zn 0,16mg/ 1kg gạo Cu 0,016mg/ 1kg gạo Fe 0,016mg/ 1kg gạo

Mg 0,16mg/ 1kg gạo Thêm nước vào bình môi trường để độ ẩm khoảng 50%-55%, lên men như mục 2.4.3 hấp tiệt trùng và cấy 2% giống M purpureus 012 từ ống thạch nghiên vào lên men ở 30 -32 0 C, thêm nước để độ ẩm môi trường 50-55% trong 17 ngày

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn vi lượng đến sinh tổng hợp monacolin K của M purpureus 012, tiến hành bổ sung vào môi trường lên men dung dịch vi lượng vào bình môi trường chứa 20g gạo theo nghiệm thức sau:

Bảng 2.1 Thành phần các nguyên tố trong dung dịch vi lượng bổ sung vào môi trường lên men

Thêm nước vào để độ ẩm khoảng 50%-55%, hấp tiệt trùng, để nguội và cấy 2% giống M purpureus 012 từ ống thạch nghiên vào lên men ở nhiệt độ phòng

Trích mẫu vào các ngày 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 phân tích đo sắc tố ở bước sóng 410nm và 505nm và xác định hàm lượng monacolin K

2.4.5 Phương pháp trích ly sắc tố

- Gạo sau khi lên men được sấy khô 50 0 C trong 48 giờ, nghiền mịn

- Cân 0,5g bột mịn cho vào 10ml ethanol 70%, lắc 120v/ph trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 5000v/ph trong 10 phút để loại chất rắn lơ lửng Dung dịch nổi được phân tích bằng máy đo quang phổ với mẫu đối chứng ethanol 70%

- Đơn vị sắc tố vàng là một lượng sắc tố được trích ly ra bằng ethanol 70% và đo ở bước sóng 410nm trong cuvette 1 cm

- Đơn vị sắc tố đỏ là một lượng sắc tố được trích ly ra bằng ethanol 70% và đo ở bước sóng 505nm trong cuvette 1 cm

Mẫu được pha loãng đến mức đo cần thiết, kết quả tính bằng đơn vị hấp thu (AU) trên gram sản phẩm khô

- Tổng lượng sắc tố hấp thu (AU/g) = Abs x (10/0,5) x df Abs: độ hấp thu mẫu df: hệ số pha loãng

2.4.6.1 Phân tích Monacolin K từ gạo men đỏ

Cân 0,5g mẫu bột gạo sau lên men, cho vào bình định mức 25ml ethanol 70% và lắc 120v/ph trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó ly tâm 5000v/ph, thời gian 10 phút ở nhiệt độ phòng Thu dịch nổi, pha loãng dịch mẫu nếu cần thiết rồi lọc qua màng lọc kim tiờm 0,45àm và đo bởi hệ thống HPLC

- Dựa vào đường chuẩn xác định lượng monacolin K tạo thành trong mẫu đo

Tổng lượng Monacolin K tạo thành (àg/g) = C x (25/0,5) x df

C: nồng độ monacolin K có trong mẫu đo df: hệ số pha loãng

2.4.6.2 Xây dựng đường chuẩn Monacolin K

Chất chuẩn monacolin K được pha ở các nồng độ khác nhau 1, 5, 10, 20, 50, 75ppm bằng ethanol 70%, đánh sóng siêu âm 30 phút cho mẫu hòa tan hoàn toàn

Dung dịch này lọc qua màng lọc kim tiờm 0,45àm và đo bởi hệ thống HPLC Dựng phương pháp bình phương cực tiểu ta xây dựng nồng độ đường chuẩn theo diện tích peak

2.4.6.3 Điều kiện phân tích HPLC

Sử dụng thiết bị HPLC 1200 hãng Agilent Technologies Cột: Eclipse XDB-C18, 5 μm, 4.6 x 150 mm, Agilent Đầu dò DAD, bước sóng = 238nm Tốc độ dòng 1ml/ph

Tỉ lệ pha động methanol: nước: 0.1% H 3 PO 4 (80:20:0.1) Lượng mẫu tiờm vào 20àl

2.4.7 Phương pháp làm bột màu

Gạo sau khi lên men được 20 ngày, sấy khô, nghiền mịn, thanh trùng 121 o C/30 phút Trích ly thu dịch màu trộn với tinh bột hòa tan ta được bột màu

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Đặc điểm chủng M purpureus

Hình dạng khuẩn lạc

Khi theo dõi sự phát triển đường kính khuẩn lạc của chủng M purpureus 012 trên môi trường PGA ta có kết qua như sau:

Trong giai đoạn đầu phát triển của khuẩn lạc trên môi trường PGA (3 ngày sau khi cấy), bề mặt khuẩn lạc M purpureus 012 có dạng phẳng mỏng, với các sợi nấm màu trắng mịn, ngắn phủ trên sát bề mặt thạch.

Sau 120 tiếng đường kính khuẩn lạc tăng từ 3mm lên 32mm và đạt 84mm vào ngày quan sát cuối cùng (ngày thứ 16) Khi đó khuẩn lạc có dạng hình tỏa tròn, màu đỏ, viền khuẩn lạc có tơ mọc ra lan tỏa lên màu đỏ, các tơ mỏng mọc cao lên khỏi mặt thạch bào tử tỏa ra xung quanh ngoài môi trường Mặt sau khuẩn lạc giống như có hai vòng đồng tâm: vòng ngoài màu đỏ tươi, vòng trong đỏ đậm hơn Đồng thời, môi trường có sự thay đổi màu từ không màu chuyển sang màu đỏ thẩm là do quá trình phát triển của các sợi nấm đã acid hóa môi trường làm môi trường có màu đỏ

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Đường kính khuẩn lạc, mm

Hình 3.2 Sự phát triển của khuẩn lạc M.purpureus 012 trên môi trường PGA 16 ngày

Cấu trúc tế bào

Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40x ta thấy cấu trúc tế bào

M.purpureus 012 nuôi trên môi trường PGA có các đặc điểm sau:

- Sợi khuẩn ty dài, phân nhánh, không có vách ngăn Hệ sợi dài và mảnh khi còn non có màu trắng ngà, khi già đủ ngày nuôi cấy có màu đỏ Nang bào tử sinh ra từ một cuống nhỏ bên cạnh sợi khuẩn ty

- Các nang bào tử hình cầu, các nang đính trên cuống tạo thành theo dạng chuỗi và số nang trong một chuỗi thường không quá 7 Khi các nang chín, các bào tử bên trong sẽ được phóng thích

Hình 3.3 Tế bào M purpureus 012 quan sát dưới kính hiển vi

(dạng còn non – không nhuộm màu)

purpureus 012

Đậu hũ Đậu hũ Anka*

Anka Anka Mốc cám Cây Mốc cám Mốc cám Anka Cây Anka

Mốc cám Đậu hũ Đậu hũ

M purpureus M purpureus M purpureus M purpureus M purpureus M ruber M purpureus M purpureus M ruber M ruber M pilosus M pilosus M purpureus M ruber M purpureus M pilosus M pilosus M ruber

* Mốc gạo đỏ; ** Rượu gạo [3]

- Hình dạng khuẩn lạc + Đường kính khuẩn lạc: 40mm (sau một tuần nuôi trên môi trường PGA)

+ Hình thái: phẳng, bẹt, tỏa tròn

+ Bề mặt: có tơ mỏng, hệ sợi ngắn

+ Màu sắc: còn non có màu trắng khi già chuyển sang màu đỏ, màu đỏ của hệ sợi đậm dần với độ già của hệ sợi

+ Mặt sau: màu đỏ tía

- Quan sát dưới kính hiển vi + Đặc tính nổi bật: những nang nấm có vách mỏng tồn tại nhiều, dạng tròn, có nhiều chùm bào tử đỉnh Chất màu được tạo thành tạo hệ sợi dưới dạng tinh thể hình chữ nhật, có kích thước tương đối đều nhau

+ Các nang nấm vách mỏng được sản sinh trên những sợi nấm ngắn giống cuống; các nang nấm trưởng thành chứa đầy các bào tử nang rời rạc, không gắn chặt; nhưng các nang nấm vẫn có thể được nhìn thấy rõ ràng khi còn non

- Bào tử: bào tử nang hỡnh cầu (kớch thước 5 – 6 àm x 3.5 – 4 àm), phẳng, không màu

Red yeast rice, scientifically known as Monascus purpureus Went, is a widely recognized substance with numerous aliases worldwide Commonly referred to as Red Rice, Red Leaven, or Red Mould in the United States, it holds the name Beni-koji in Japan, Hung-chu and Hong qu in China, and Angkak or Zhitai in Chinese tradition.

- M purpureus tương tự Monascus ruber van Tieghen, là loài mốc hoại sinh phát triển trên tinh bột, thức ăn bị lên men và trong các sản phẩm sữa Chúng lên men được maltose, fructose và glucose nhưng không lên men đường saccharose Ying et al (1987)

- M purpureuse được phân biệt nhờ vào những bào tử nang của nó Các nang này thường cú hỡnh cầu (đường kớnh 5 àm) hoặc hỡnh trứng (đường kớnh 6 x 5 àm)

- Ở giai đoạn ban đầu, những sợi nấm còn non có màu trắng Tuy nhiên, chúng nhanh chóng chuyển sang màu hồng đậm và cuối cùng là màu vàng cam

Trong quá trình phát triển, Monascus làm tăng độ acid của môi trường (acid hóa môi trường) và tạo ra màu đỏ thẫm ở lớp dưới cơ chất khi nuôi cấy Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Monascus là t op = 30 0 C – 37 0 C, nhiệt độ tối đa t max = 45 0 C, nhiệt độ tháp nhất t min = 15 0 C – 18 0 C

Những loài trong giống Monascus tạo ra hàng loạt sản phẩm trao đổi thứ cấp, bao gồm những sắc tố có cấu trúc azaphilone giống như cấu trúc polyketide Những sắc tố này là hỗn hợp của màu đỏ, cam và vàng, cho dù sản phẩm có giá trị thương mại chính là hỗn hợp đỏ nhưng chúng vẫn được dùng mà không cần tách riêng từng loại ra

Màu Monascus được tạo ra thông qua quá trình lên men gạo với nấm Monascus, sau đó được tách chiết bằng ethanol Quá trình tinh sạch được thực hiện để loại bỏ các tạp chất không mong muốn Màu Monascus tinh khiết được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm (làm chất tạo màu cho thịt, đồ uống, ), dược phẩm và mỹ phẩm.

Theo nhiều tác giả, có hơn mười sắc tố tạo ra từ Monascus, nhưng chỉ có khoảng sáu sắc tố được làm rõ theo nghiên cứu của Shin et al (1998) [40].

Trong số các sắc tố của Monascus thì sắc tố đỏ là quan trọng nhất do nó được sử dụng như là chất tạo màu thực phẩm và là chất thay thế nitrate trong bảo quản

Sắc tố của Monascus có độ ổn định pH trong khoảng rộng, từ pH = 2 – 10, bền với nhiệt độ sấy nên được thêm vào trong xúc xích, bánh nướng được giữ ổn định 92 – 98% trong suốt 3 tháng với nhiệt độ (4 0 C), Fabre (1993) [14]

Màu Monascus là một phức màu trong đó có 6 thành phần chính chia làm 3 nhóm màu gồm hai màu đỏ, hai màu vàng và hai màu cam Một màu có hai cấu trúc phân tử khác nhau bởi chiều dài mạch của hợp chất béo [6]

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của các sắc tố Monascus Blanc (1994)[6]

Sắc tố Monascus kém hòa tan trong nước nhưng tan tốt trong các dung môi khác nhau như dầu ăn, ethanol, methanol, benzen, chloroform…ở các mức độ khác nhau Chúng dễ bị ảnh hưởng bởi acid, nhiệt độ, ánh sáng, oxy, độ ẩm và thời gian và có phổ hấp thu ánh sáng ở các bước sóng 505nm, 470nm, 420nm, 400nm, 370nm, 330nm Chính vì vậy các nhà khoa học đã tập trung vào việc nghiên cứu khả năng ổn định hòa tan sắc tố cũng như tìm phương pháp hiệu quả nhằm tách chiết và thu hồi sắc tố này [4]

Sắc tố cam là monascorubrin và rubropunctatin, được tổng hợp trong cytosol từ acetyl Coenzyme A nhờ vào các phức hợp các enzyme tổng hợp polyktide

Những sắc tố này thì không tan trong nước nhưng có ái lực cao với các phức có mang nhóm amino Các phản ứng với amino acid dẫn đến việc hình thành khả năng tan trong nước và sắc tố cam chuyển thành sắc tố đỏ là monascorubramine và rubropunctamine Quá trình chuyển hóa của sắc tố vàng vẫn chưa được hiểu rõ ràng Do ái lực với nhóm amino, sắc tố Monascus thường đi kèm với protein hoặc với thành tế bào, hình thành nên các phức mà có thể gây nhiều khó khăn trong việc tách chiết Vì thế, việc tách chiết sắc tố đòi hỏi có sự phá vỡ tế bào và hòa tan trong các dung môi hữu cơ Cũng nhờ vào ái lực với nhóm amin, nên có thể chuyển đổi sắc tố cam thành sắc tố đỏ bằng phản ứng với các amino acid và các phức tương tự

Khi đó, nitơ từ nhóm amin của amino acid hoặc các phức tương tự, gắn vào vị trí oxygen của vòng trên rubropunctatin hoặc monascorubrin, hình thành nên rubropunctamine và monascorubramine (Haws , 1959)

Hình 1.2 Sinh tổng hợp sắc tố đỏ do phản ứng Schiff base [33]

Các giải pháp được sử dụng nhằm sản xuất sắc tố Monascus hòa tan trong nước chủ yếu dựa trên nguyên tắc thay thế ôxy trong monascorubrin hoặc rubropunctatin bằng nitơ tại nhóm amin của các hợp chất khác như axit amin, peptit hoặc protein Quá trình này chuyển đổi màu sắc tố từ cam sang màu đỏ tía.