Luận văn này được thực hiện nhằm mục tiêu nâng cao hàm lượng FOS trong quá trình sản xuất sử dung enzyme cô định.Nghiên cứu gồm có 5 phan: + Khảo sát điều kiện cỗ định: sử dụng quy hoạch
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
HUỲNH DUY TẤN
NGHIÊN CỨU SAN XUẤTFRUCTOOLIGOSACCHARIDE (FOS) BỞI ENZYMEPECTINEX ULTRA SP-L CO ĐỊNH TREN ALGINATE
Chuyén nganh : CONG NGHE SINH HOC
Mã số: 60 42 80
LUẬN VÁN THẠC SĨ
TP HO CHI MINH, 06/2012
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa-ÐHQG-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Huỳnh Ngọc OanhCán bộ chấm nhận xét Ï: - -i c1 1 S23 E23 898898585898 58 58585853555 E55 E55 E55 55s.Can bO cham nhéin xét 2 c
Luan van thạc sĩ được bao vệ tai Trường Dai hoc Bách Khoa, DHQG Tp HCM
Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, hoc ham, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc si)
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KTHH
Trang 3ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập — Tự do — Hạnh phúc
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: Huynh Duy Tân MSHV: 10310616Ngày, thang, năm sinh: 22/01/1986 Nơi sinh: Bình Dương
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 604280I TÊN ĐÈ TÀI:
NGHIÊN CỨU SAN XUẤT FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS) BỞI
ENZYME PECTINEX ULTRA SP-L CO ĐỊNH TREN ALGINATE
NHIỆM VU VA NỘI DUNG oooiceccccccccceseccescecescscesescescscsesscesvscevscsacsesavsceacneeceseas
IV.CÁN BO HUONG DAN : TS Huỳnh Ngọc Oanh
Tp HCM, ngay tháng năm 2012CÁN BỘ HUỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)
TS Huỳnh Ngọc Oanh PGS TS Nguyễn Đức Lượng
TRUỞNG KHOA KTHH
(Họ tên và chữ ký)
Trang 4Các Thay Cô của tôi - Phó giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Đức Lượng, Phó giáo sưTiến sĩ Nguyễn Thúy Hương, Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên, Tiến Sĩ Huỳnh NgọcOanh Thây Cô đã dạy tôi suốt thời sinh viên và cao học, luôn luôn tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi trong việc học tap, Thây Cô đã truyền đạt cho tôi nhiều kinhnghiệm làm việc, những kiến thức quý báo về chuyên môn, và quan trọng là vềkỹ năng sống.
Chị Trần Trúc Thanh — là cán bộ phòng thí nghiệm Bộ Môn Công nghệ sinhhọc — đã tạo điều kiện thuận lợi về dụng cụ, thiết bị dé tôi có thé tiến hành thí
nghiệm.
Các bạn khóa 2004 ngành Công Nghệ Sinh Học: Nguyễn Thị Huyền Trang,Đỗ Thị Hoàng Tuyến, Huỳnh Nguyễn Anh Khoa, Lý Trần Thụy Vi, Lê TuyếtMinh, đã chia sẻ cho tôi nhiều kinh nghiệm học tập
Em Nguyễn Thị Hải sinh viên khóa 2007 ngành Công nghệ sinh học đã hồtrợ tích cực cho tôi trong suốt quá trình thực nghiệm
Con xin cảm ơn Ba Mẹ, gia đình và những người thương yêu nhất đã luôn
là cho dựa vững chac, khuyên khích động viên con.
Trang 5TOM TATFructooligosaccharide (FOS) từ sucrose, chat ngọt thay thé mới với đặc tinhnăng lượng thấp, an toàn cho người bệnh tiểu đường, là một trong các prebiotic,FOS kết hop với probiotic tạo thành synbiotic Chế phẩm Pectinex Ultra SP-L,
trong đó có enzyme fructosyltransferase, xúc tác phản ứng tạo ra các
fructooligosaccharide mach ngăn Luận văn này được thực hiện nhằm mục tiêu
nâng cao hàm lượng FOS trong quá trình sản xuất sử dung enzyme cô định.Nghiên cứu gồm có 5 phan:
+ Khảo sát điều kiện cỗ định: sử dụng quy hoạch thực nghiệm —phương pháp cau trúc có tâm (CCD) xác định được điều kiện tối ưu cho quátrình cố định enzyme trên gel alginate Kết quả thu được: nồng độ alginate3,3 (%), tỉ lệ enzyme:alginate là 0,79 (g/g), nồng độ CaCl, 3,75 (%), hiệusuất có định protein đạt 73,32 (%)
+ Kết quả tối ưu cho điều kiện phản ứng: 60 (°C), vận tốc lắc 90(vòng/phút), nồng độ sucrose ban dau 50 (%), pH phản ứng 5,75
+ Khảo sát điều kiện sản xuất: ở 20 (h) cho ham lượng FOS caonhất đói với hệ thống phản ứng dạng cột Tổng hàm lượng FOS trong mẫusử dụng eznyme cô định sản xuất đạt 47,87 (%), trong đó I-kestose chiém
37,06 (9%), còn lại 10,81 (3%) là nystose va fructofuranosylnystose Khả
năng sản xuất FOS của enzyme cố định khi so với enzyme tự do là khá cao,lên đến 89,49 (%)
+ Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cô định sau quá trìnhsản xuất Kết quả đối với hệ thông phản ứng dang lắc ở lần tái sử dụng thứ4 hoạt tính còn 48,77 (%) Đối với hệ thống phản ứng dạng cột ở lần tái sử
dụng thứ 11 hoạt tính còn 49,93 (%).
+ Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quan của enzyme cố định.Kết quả sau 30 ngày bảo quản lạnh (2 °C — 6 °C) hoạt tính enzyme cô địnhcòn 84,95 (%), trong khi đó thì enzyme cố định bảo quan trong dung dich
CaCl, (2 °C — 6 °C) còn 57,19 (%).
Trang 6Fructooligosaccharides (FOS) from sucrose, new alternative sweetenerswith functional properties such as low calories, no cariogenicity, safety fordiabetics, prebiotics, combine with probiotics: synbiotics Pectinex Ultra SP—L,a commercial enzyme preparation containing fructosyltransferase activity, wasimmobilized onto alginate gel and was used for the production offructooligosaccharides Condition optimum of immobilization is 3,3 (%) alginate(w/v), rate 0,79 (g) enzyme : | (g) alginate, 3,75 (%) CaCl, The immobilizedenzyme showed in activity for 11 batch reactions Optimum conditions wereaffected by immobilization, and the optimum pH, temperature, shaking for
immobilized enzyme were 5,75, 60 (°C) and 90 (rppm), respectively.
Immobilized enzyme was more stable at high temperatures The amount offructooligosaccharides produced from 50% (w/v) sucrose solution using theimmobilized enzyme was determined to be approximately 47,87 (%) of the totalsugar in the reaction mixtures Production possibility FOS by immobilizedenzyme in comparison with free enzyme be well high, go up to 89,49 (%) andimmobilized enzyme retains its activity for 30 days.
Trang 7LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan rang, ngoại trừ các kết quả tham khảo từ các công trình khác như đã
chi rõ trong luận văn, các công việc trình bày trong luận văn này là do chính tôi
thực hiện và chưa có phan nội dung nào của luận văn nay được nộp để lay mot bangcấp ở trường nay hoặc trường khác
Tp.HCM, ngày tháng năm 2012.
Huỳnh Duy Tân
Trang 8MỤC LỤCLOL CAM ON 0 iTOM TAT oescscccsssssssessesescescscsscsessesessesessesessesessssesesueseesssssessesessesesueseseessaneseseeueseeseaes ii
00v ili
DANH MỤC CHU VIET TẮTT ¿2-5522 2E 2ESEEtexerxererxrrrrrrrerrrre viiiM 9081109.) 1005757 ixDANH MỤC BẢNG 2t 22122 21211211212111111121111211211112111111121111 0111 He ixDANH MỤC HINH ceccscssssessssessesessesesescssseseesesessesesueseseeseacessseeueseseseateseseeneeeens xiDANH MỤC SƠ ĐÔ 52 1 2121 2121121121211111112111211211111111111111111 1x xiiCHƯƠNG 1: MO ĐẦU 5:22 1221 12212122121111112111111121111111111111111 c2 |LV Dat nan |1.2 Luận điểm mới của để tài 5: 2x22 2x2 EE212121121211111111111111 11c 2
1.3 Mục tiêu nghiÊn CỨU C2 11 0100021211111 11111111111 3 11111 v3 x4 2IẾ TW (00000152020 7 2
CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIEU G56 <3 EE+E£eEsEekgeeseei 42.1 Tổng quan về FOS c-skkvSvS1 S111 5 1101 1H TT HT TH TT TT ngưng 4
2.1.1 9 i0 0 n090^ 6 4 4
2.1.2 Nguồn gốc va cấu tạo FOS, - St 1n HH TH ng ng ng 52.1.3 Tính chất của FOS cececcecccessessssessestesessesesseesesessesesecusseesceesesneaneneeneaeens 72.1.4 Ảnh hưởng của FOS với sức khỏe con Ngudi cccccccessceseescteeeseeeeees 8
2.1.5 Tinh an toàn và ứng dụng của FOS ccceceeeseecceececeeeeeceeeeseeeenens 13
2.1.6 Tiém nang cho san xuất FOS tại Việt Namt ccccccccccccscescsscescescesceseeseeees 142.1.7 Một số nghiên cứu sản xuất FOS trên thế giới c sex 152.2 Tổng quan về enzyme frucfosyÌtranfEraSe c- scs kề vs ceveerkeo 202.2.1 Khái niệm chung vỀ enZyIme - :- - sk St xE về vs cv ro 20
2.2.2 Enyme frucfOsyÏfranSÍ€TaSe - c0 111.111 Y Y1 và 21
2.3 Enzyme cố địnhh -ck + tt S1 1191111 11T HE HT TT ng TH ng ro 222.3.1 Sơ lược về enzyme cố 1511 | cac cn tang S3 13 1311311311513 1 1s se cseg 222.3.2 Phương pháp cô định enZyIme -:-s- ksxkESxSxE về vs cv ro 232.3.2.1 Phương pháp nhốt enzyme ¿- s skcxESESxSE#E vs evvskekeeesed 232.3.2.2 Phương pháp liên kết enzyme với chat mang - - s2 +: 232.4 Vật liệu cô định 57A0 ỐA 252.4.1 Phân loại chất mang c- «SE E11 S1 nề HH ru 25
Trang 92.4.2 Khái quát về alginaf€ is xxx 1T TH TT ng TH ru 262.4.2.1 Cau trúc hạt gel khi cỗ định enzyme ¿- < + sec sxsEseseesesed 292.4.2.2 Ứng dụng của alginafe -c- «tk Hy ng ngư 30CHUONG 3: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 323.1 Vật liệu và thiẾt bị -c: ct +2 2 2 2t212212121211.11111111.re 32
3.2.2 Phuong pháp tính toáắn ccc c2 1911110102 1111111111111 3 11 tru 34
3.2.3 Phương pháp tiến hành nghiên cứu - - - = + +x+sE+x£k£EsEcvsEseeecse 36
3.2.3.1 Quy hoạch thực nghiỆm - + + + << << < + S333 115532 36
3.2.3.2 Quá trình có định chế phẩm Pectinex Ultra SP-L trên chất mang
ÏØ1TIAf€ - -ccc c0 00011010010 02 1111111010030 111111111110 111v 0n xu 41
3.2.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nông độ cơ chất sucrose
ban đầu, vận tốc lắc đến hoạt tính của CNZYME - - 433.2.3.4 Sản xuất FOS từ chế phẩm enzyme cố định s55 ss se: 453.2.3.5 Tái sử dụng chế phẩm enzyme cố định ¿- sex ssses£sxsxe 453.2.3.6 Khảo sát thời gian bảo quản của chế phẩm enzyme cô định 45CHƯƠNG 4: KET QUA VA BAN LUẬN - G cà ch nềnnxnnsckekekre 464.1 Đường chuẩn - k1 1111 H11 H1 TT HT TT TH ng 464.1.1 Đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử glucose - 464.1.2 Đường chuẩn xác định hàm lượng profein ¿- s6 se se sex 474.2 Tối ưu hóa quá trình cô định chế phẩm Pectinex Ultra SP—L trên chất mang
213i 0 - An 48
4.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase của chếphẩm enzyme tu dO - -¿-c-< 6s 11111 E91 1 5 111 1 11111111 ng ngư 564.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzyme tự đo -s 564.3.2 Ảnh hưởng của pH đến chế phẩm enzyme tự do ¿s55 +sssxe: 57
Trang 104.3.3 Ảnh hưởng của nơng độ cơ chất sucrose ban đầu đến chế phẩm enzyme4.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase của chếphẩm enzyme cố định .- - k1 EE S5 11 1E 11115111 1 E1 ri 594.4.1 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính fructosyltransferase của chế
phẩm enzyme cố định - + ssxSxE1 về 1 E1 ng re reg 594.4.1.1 Bước đầu sử dụng quy hoạch thực nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng
phẩm enzyme cố định - + ssxSxE1 về 1 E1 ng re reg 674.5 Sản xuất FOS c1 TT HT TH TT HT TH TT TT ng ng ru 684.5.1 Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme tự đO - <5 ssssse: 684.5.2 Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme cơ định trong hệ thống phản
ứng dạng lẮC 6 cv 111v TS TT TT HT HH ng rceg 7]4.5.3 San xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme cơ định trong hệ thống phản
ứng dạng CỘY - 0000101101010 1111111111003 1111111110 111111 xe 73
4.5.4 So sánh hiệu quả sản xuất FOS giữa hệ thống phản ứng dạng lắc và hệ
thống phản ứng dang cỘT - - c1 S31 E về vn ng re reg 754.6 Kết quả phân tích Sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 56s xe cevseeees 774.7 Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme cố định 854.8 Khao sát điều kiện bảo quan của chế phẩm enzyme cơ định - 87CHƯƠNG 5: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ G2 S6 xxx re 90
5.2 Kiến nghị - G111 TH HT TH HT TH TT HT ceg 91TÀI LIEU THAM KHẢO SG 1x3 11x 191 1E vn nề HT ng ru 92
I3;i08MNla:aaaaa3ậắẳẮúẲẲ 97
Trang 11DANH MỤC CHỮ VIET TATANOVA: Analysis of Variance — Giải tích phương sai
bd: ban dauCCD : Central Composite Design — Thiết kế đáp ứng tamcd, cd: cô định
Ecd, Ecd: enzyme cô định
Etd: enzyme tu doF: fructose
FOS: FructooligosaccharideE/Alg, Enzyme/Alginate: ti lệ enzyme trên alginateG: glucose, GF : Sucrose, GF, : I-kestose hoặc kestose, GF3 : nytoseGF, :1F—fructofuranosylnytose hoặc fructofuranosylnyfose
h: thời gian (gid)
HPLC: sắc kí lỏng cao ápHS cd enzyme : hiệu suất về hoạt tinh của enzyme cố địnhHS cđ protein : hiệu suất cỗ định protein
HS HT : hiệu suất hoạt tính
HT: hoạt tính
HT enzyme cd : hoạt tinh enzyme cô định
HT enzyme td : hoat tinh enzyme tu do
RSM: Response Surface Mothodology — Phương pháp đáp ứng bề mặtSTT: số thứ tự
td: tự doUI: đơn vi hoạt tính
Trang 12DANH MỤC ANH
Ảnh 4.1: Kết quả phân tích tính toán ANOVA băng phần mềm Design — Expert 7.0
(Tối ưu điều kiện cố định) - + kx St SxSxE SE gxgv ng rvceret 51Ảnh 4.2: Kết qua phân tích tính toán phương trình hồi quy bang phần mềm Design
— Expert 7.0 (Tối ưu điều kiện cố định) 2s + x+E+s+e sex 52Ảnh 4.3: Mặt đáp ứng bậc 2 thé hiện sự tô hợp 2 yếu tố:
DANH MỤC BANG
Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả - - se x2 xe £sEsveereed 5Bảng 2.2: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác - 7Bang 2.3: Tình hình sản xuất mía đường của Việt Nam năm 2010-—2011 15
Bang 2.4: Luong FOS hình thành theo thời gian phản ứng - 19
Bảng 2.5: Một số ứng dụng của algintaf€ -:- xxx về vn ng 31Bang 3.1: Thi nghiệm tối ưu điều kiện cố định theo mô hình hóa tối ưu hóa 3 yếu tố
ẮẲỎỎ 42
Bảng 3.2: Thí nghiệm tối ưu điều kiện phản ứng theo mô hình hóa tối ưu hóa 2 yếu
ID ÔỎ 44Bảng 4.1: Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu glucose chuẩn 46Bảng 4.2: Hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP—L tự do 47Bảng 4.3: Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu protein chuẩn 47Bảng 4.4: Hàm lượng protein trong mẫu chế phẩm Pectinex Ultra Sp—L tự do 48
Trang 13Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm khảo sát điều kiện cố định theo mô hình hóa tối ưu
hóa 3 yếu tỐ - k1 1S 1 1T HT TT TT TT ng TH ryg 49Bảng 4.6: Các phương án tối ưu chương trình dự đoán và kết quả khảo sát thực
0140190022277 d 4 56
Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm khảo sát điều kiện phản ứng của chế phẩm enzyme cô
định theo mô hình hóa tối ưu hóa 2 yếu tỐ ¿-s- xxx £+x+e+s£sesecse 60
Bảng 4.8: So sánh sự thủy phan sucrose khi chỉnh pH acid và không chỉnh pH 62
Bảng 4.9: Kết quả tối ưu khảo sát nhiệt độ phản ứng của chế phẩm enzyme cô định
ẮẲỎỎ 64
Bang 4.10: Kết quả tối ưu khảo sát vận tốc lắc của chế phẩm enzyme cố định 67Bang 4.11: Kết quả tối ưu khảo sát nồng độ cơ chất sucrose ban đầu của chế phẩm
enzyme cố định xxx E39 98v 11 1E 11115111 1 111g ng ru 67Bảng 4.12: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng của chế phẩm enzyme tự do 69Bảng 4.13: Kết quả khảo sát thời gian phan ứng của chế phẩm enzyme cố định
trong hệ thông phản ứng dang lắc ¿- 5 + Sex 72Bảng 4.14: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng của chế phẩm enzyme cố định
trong hệ thông phản ứng dạng cỘP - c6 SE sE SE cvvserees 74Bảng 4.15: So sánh hiệu quả sản xuất FOS giữa hệ thống phản ứng dạng lắc và hệ
thống phản ứng dang cỘT - - c1 S31 E về vn ng re reg 76Bảng 4.16: Kết quả tính toán phân tích HPLC của mẫu chuẩn - 5: 83Bang 4.17: Kết qua tính toán phân tích HPLC của mau FOS sử dung chế phẩm
enzyme tự do sản XUẤT ¿- c1 1 3E E12 5111 1 111v ngu 83Bang 4.18: Kết quả tính toán phân tích HPLC của mau FOS sử dung chế phẩm
enzyme cố định sản XUẤT - - G9 S32 SE E11 1 E11 cv rerrkg 84Bang 4.19: Kết quả khảo sát khả năng tái sử dung của chế phẩm enzyme cố định
Bảng 4.21: Kết quả khảo sát quá trình bảo quản chế phẩm enzyme cố định ở dạng
ướt trong dung dich CaCl, 3,75 (⁄%) Ss S1 S A1 1 xa 88
Trang 14DANH MỤC HINH
Hình 2.1: Công thức cau tạo của EOS s5 St 11232311 1 1111111115151 11 1E re 6Hình 2.2: Sự thay đôi nồng độ insulin trong máu sex vsEeveereed 9Hình 2.3: Sự thay đôi nồng độ glucose trong mắu ket vsEskeereed 9Hình 2.4: Sự thay đôi nồng độ fructose trong máu ¿ - xxx cevseeees 10Hình 2.5: Sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tinh enzyme - 2-2-2 2 +s+s+s£s£+z+x2 16Hình 2.6: Sự ảnh hưởng cua nhiệt độ đến hoạt tính €ñZVI€ - << << -+<+s52 16Hình 2.7: Hàm lượng sucrose trong quá trình sản xuất fructooligosaccharide 17Hình 2.8: Thời gian phản ứng tao sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L
ang tl 177 số —ốốằ.ne 18
Hình 2.9: Thời gian phản ứng tao sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L
dạng cô định trên chất mang Sepadbead EC—EP5 5s +s=s se 18Hình 2.10: Cơ chế hoạt động của enzyme ccecceccscessesesessecescsssceecevscessecseessenen 20Hình 2.11: Cơ chế chuyển hóa tao FOS từ sucrose của fructosyltransferase 22
Hình 2.12: Enzyme trong hỆ øe€lÌ - - << << 2c 0031110101101 1111111111013 11111111111 32 24Hình 2.13: Enzyme trong hỆ SỢI - 2c 0001110101101 3111111111131 11111111 s2 24
Hình 2.14: Cau tạo hóa hoc của aÌginnaf -:- sskx x1 E cv ng ng ro 26Hình 2.15: Cấu trúc phân tử của alginafe - ¿+ x+s+e+sE+E+k+E£EeEeErkeererererred 27Hình 2.16: Liên kết tạo gel khi alginate tiếp xúc với Ca”” -¿-ccs sex ceesesed 29Hình 2.17: Cau trúc không gian mạng lưới gel alginafe -s-s s +scs£sxsxe 30Hình 4.1: Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng ølueose 2s <5: 46Hình 4.2: Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng profein 2s sssse: 47Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm
IYA4001 5810 00 da 111B1BãBầă na 57
Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm
IYA4001 5810 00 da 111B1BãBầă na 58
Hình 4.5: Đồ thi biểu diễn sự anh hưởng của nông độ cơ chất sucrose ban đầu đến
hoạt tính của chế phẩm enzyme tự dO -c- 5 + SE se evseeees 59Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm
enzyme cố định -:- - x61 SE 111 1 119121 511 5 111g ng cư ret 64Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của vận tốc lắc đến khả năng hoạt động
của chế phẩm enzyme C6 định: - + - 6E SE SvESEEkEEsEceekseceree 66
Trang 15Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nông độ cơ chất sucrose ban đầu đến
khả năng hoạt động xúc tác của chế phẩm enzyme cố định 68Hình 4.9: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử sinh ra theo thời gian phản ứng
đối với chế phẩm enzyme tự đO - c E+x+xEE+E SE EEskeeeeseceree 70Hình 4.10: Đồ thị biểu diễn ham lượng đường khử sinh ra theo thời gian trong hệ
thống phản ứng dang lắC - + s3 x E1 SE cv ng ng 71Hình 4.11: Đồ thị biểu diễn ham lượng đường khử sinh ra theo thời gian trong hệ
thống phản ứng dang cỘT - - + E311 1v ng ng kg 75Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử sinh ra theo thời gian trong hệ
thống phản ứng dạng cột và hệ thống phan ứng dạng lắc 76Hình 4.13: Phổ sắc kí lỏng cao áp của mau FOS sử dụng chế phẩm enzyme tự do
sản xuất — chạy lần Ì c-c- EkSskk St 191 1S 1n HT ng ru 79Hình 4.14: Phổ sắc kí lỏng cao áp của mau FOS sử dụng chế phẩm enzyme tự do
sản xuất — chạy lần 2 c1 t1 111 S111 11T ng ng ru 80Hình 4.15: Phổ sac kí long cao áp của mau FOS sử dung chế phẩm enzyme cô định
sản xuất — chạy lần Ì c-c- EkSskk St 191 1S 1n HT ng ru 81Hình 4.16: Phổ sac kí long cao áp của mau FOS sử dung chế phẩm enzyme cô định
sản xuất — chạy lần 2 c1 t1 111 S111 11T ng ng ru 82Hình 4.17: Đồ thi so sánh tỉ lệ (%) các loại đường trong mẫu FOS 84Hình 4.18: Đồ thị biểu diễn khả năng tái sử dung của chế phẩm enzyme cố định 87Hình 4.19: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của chế phẩm enzyme có định theo
thời gian trong 2 điều kiện bảo quản - ¿xxx eevserees 89
DANH MỤC SƠ DO
Sơ đồ 3.1: Các bước xác định hoạt tinh enzyme fruetosyltransferase - 33Sơ đồ 3.2: Các bước cô định enzyme fructosyltransferase trên chất mang alginate
Trang 16CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Dat van đề
Đường chức năng là một trong nhóm thực phẩm chức năng được tập trungnghiên cứu nhiều trong những năm gân đây và có tiềm năng trở thành loại chấtngọt mới thay thé cho sucrose va loại đường truyền thống Trong đófructooligosaccharide (FOS) là chat tạo ngọt năng lượng thấp, có đặc tínhprebiotic FOS đang dan thay thé vi trí các loại đường truyền thống như đườngkính và syrup giàu fructose, FOS được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm chứcnăng, sữa, công nghệ sản xuất bánh kẹo
FOS mang lại những lợi ích cho sức khỏe người sử dụng như: kích thích
tiêu hóa, giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride, chống béo phi, an toàn chongười bị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa sâu răng Đặc biệt, FOS còn giúp tăngkhả năng hấp thu Ca, Mg, Fe, , ngăn ngừa bệnh thiếu máu, thiếu sắt, cân bangion Mg””, Ca“” trong co thé, chống loãng xương
Hiện nay, tại Việt Nam bệnh béo phì, tiểu đường ngày càng có tầm ảnhhưởng đến cuộc sống Do đó việc tìm nguồn chất ngọt mang ít giá trị năng lượngvà không lam thay đổi nồng độ glucose trong máu dé thay thé cho các chất ngọttruyền thống là một yêu cầu cấp thiết Bên cạnh đó công nghiệp thực phẩm chứcnăng đang ngày càng phát triển mạnh và mang lại giá trị kinh tế cao Việt Namcó nhiều tiềm năng phát triển công nghiệp sản xuất FOS với nguồn mía đườngcung cấp nguyên liệu đầu vào cho sản xuất
Từ thực trạng trên, sản xuất FOS công nghiệp là vẫn đề hết sức cân thiếthiện nay, mang lại lợi ích về sức khỏe con người cũng như nguồn lợi về kinh tế.Và để sản xuất FOS thì không thể không nhắc đến enzyme với hoạt tínhfructosyltransferase là một trong những thành phan rất quan trọng trong quá trìnhsản xuất
Việc nghiên cứu và sản xuất enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷXX đến nay và đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế lớn Tuy nhiên việc sử dụng
enzyme sao cho đem lại hiệu quả cao nhat và lợi ích vé kinh tê là van dé được
Trang 17quan tâm hang đầu trong quá trình sản xuất công nghiệp Từ những nhu cau cấpthiết đó, enzyme cô định đã được nghiên cứu trên nhiều nước và thu được nhữngkết quả khả quan Trong khi các loại enzyme hòa tan không có khả năng tái sửdụng, lẫn enzyme ở sản phẩm cuối làm cho sản phẩm kém tỉnh sạch và có thể bịbiến tính dưới tác dung của điều kiện môi trường thì enzyme cố định có thé khắcphục được những van dé trên Chính những ưu điểm enzyme cô định mà các nhàkhoa hoc đã nghiên cứu cỗ định các loại enzyme khác nhau trên những chấtmang khác nhau nhằm tạo ra enzyme cố định mang lại hiệu quả sử dung enzymecao nhất.
1.2 Luận điểm mới của đề tài
Hầu hết các nghiên cứu ở nước ngoài chỉ tập trung vào nghiên cứu enzymetự do sản xuất FOS và dạng có định trên chất mang Eupergit C, Sepadbead EC—
EPS.
Dé tài này nghiên cứu sản xuất FOS bằng chế phẩm Pectinex Ultra Sp—L côđịnh trên chất mang alginate là một hướng mới, chưa có nghiên cứu nào trong vàngoài nước nghiên cứu theo hướng này, đồng thời alginate là một chất mangtương đối pho bién va giá thành rẻ, có thé ung dung trong thuc tế sản xuất được.Ngoài ra dé tài còn ứng dụng quy hoạch thực nghiệm để tính toán tối ưu cho các
quá trình thực nghiệm.1.3 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu này thực hiện với mục đích dùng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm xác định điều kiện tối ưu khi cô định chế phẩm Pectinex Ultra SPL trêngel alginate trong quá trình sản xuất FOS
1.4 Noi dung nghiền cứu
Gồm 5 nội dung:
+ Nghiên cứu sự phụ thuộc của quá trình cố định chế phẩmPectinex Ultra SP—L trên gel alginate bởi các yếu tố: nông độalginate sử dụng, ty lệ enzyme và alginate, nồng độ CaCl, băng
phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Trang 18+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ cơchất sucrose ban đầu và vận tốc lắc đến hoạt tính của enzyme cố
định
+ Sản xuất FOS+ Tái sử dung enzyme cố định
+ Khảo sát điêu kiện và thời gian bảo quản enzyme cô định
Trang 19CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIEU
2.1 Tong quan về FOS
2.1.1 Khai niém FOS
Gan đây trong dinh dưỡng, người ta chú ý đến carbohydrate trong khẩuphân ăn, mà trước tiên là chất xơ Tuy cơ thể không lên men tiêu hóa được,nhưng chất xơ đóng vai trò quan trọng trong cuộc chiến chống lại những bệnh tậtvề tim mach va một số trường hop ung thư đường ruột [1,13]
Nhiều loại carbohydrate được nghiên cứu đóng vai trò như một prebiotic,
với các đặc tính như:
+ Không bị hấp thu ở tuyến tiêu hóa trên
+ Lên men bởi vi sinh vật trong ruột.
+ Kích thích chọn lọc sự phát triển và hoạt tính của một số vi khuẩn
có khả năng cải thiện sức khỏe.
Đường chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chứcnăng được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây và có tiềm năngtrở thành loại chất ngọt mới thay thế cho sucrose, loại đường truyền thống
Có nhiều loại đường chức năng: palatinose, maltitol, sorbitol, lactitol,
fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS), trong đó, đường
FOS nổi bật từ những năm 1980 và được nghiên cứu nhiều hơn cả, không chỉ vìcông nghệ sản xuất đơn giản, mà nó còn có nhiều đặc tính sinh học có lợi cho sức
khỏe con người: kích thích tiêu hóa, giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride,
chống béo phì, an toàn cho người bị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa sâu răng Đặcbiệt, FOS còn giúp tăng kha năng hấp thu Ca, Mg, Fe, , ngăn ngừa bệnh thiếumáu, thiếu sat, cân bằng ion Mg””, Ca” trong cơ thể, chống loãng xương [19]
FOS là chất tạo ngọt năng lượng thấp, không được hấp thu ở tuyến tiêu hóa
trên, tuy nhiên được sử dụng chọn lọc bởi hệ vi khuẩn đường ruột Bifidobacteria,
nên có đặc tính prebiotic FOS dang dan thay thế các loại đường truyền thốngnhư đường kính va syrup giàu fructose, được sử dụng rộng rãi trong thực phẩmchức năng, công nghệ sản xuất bánh kẹo [37]
Trang 20Việc sử dụng FOS hằng ngày đem lại những lợi ích cho sức khỏe, mỗi ngàysử dụng 4+15 (g) FOS giúp cơ thé khỏe mạnh, giảm bệnh táo bón.
2.1.2 Nguồn gốc và cau tạo FOSFOS có nhiều trong tự nhiên, ton tại trong các loại rau quả như chuối, man,
đào, quýt, atiso, cà chua, hành, tỏi, lúa mì, măng tây và mat ong [11,13] Hàm
lượng FOS ở một số loại rau quả có thể tham khảo ở bảng 2.1 [9].Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) [9]Loại cây, | I-Kestose | Nystose | Fruetofuranosylnystose | Tổng FOS
quả, rau (GEF;) (GE:) (GF,) (GF,)
Chuối 5,9 0,1 0,0 6,0
Quyt 1,7 0,0 1,11 2,8
Dao 3,5 0,0 0,0 3,5Lé 0,8 0,0 0,0 0,8Man 1,8 0,2 0,0 2.0
Dưa hau 2,8 0,0 0,1 3,0
Măng 0.3 0,0 0,0 0,3
Rau dén dé 0,1 0,0 0,0 0,1Rau can tay 0,2 0,0 0,4 0,6
FOS là những oligosaccharide mà trong phân tử của chúng gồm một phântử đường sucrose liên kết với 1, 2 hay 3 gốc fructose thông qua mối liên kếtB-2.1-glueoside Công thức tổng quát của đường FOS là GF,, trong đó n là sốnhóm n =2, 3, 4 (G là gốc đường glucose, F là gốc đường fructose), tương ứng là
Trang 21các đường l-kestose (GF2), nystose (GF3) và fructofuranosylnystose (GF4) với
công thức cầu tạo như hình 2.1 [36, 37, 39] Tuy nhiên, nhiéu nha nghiên cứu
khác cũng gdp cả các loại đường khác như fructan, glucofructosan và inulin vàonhóm đường FOS [39].
Fructooligosaccharide chứa 3 loại đường chính: I-kestose (2—1)2—o0-D-glucopyranoside, OGEF;), nystose (Ệ-D-fru-(2—>l)3-œ-D—glucopyranoside, GF3) và _ fructofuranosylnystose (—D-fru-(2—>l)4-œ-D—
(f—D-fru-glucopyranoside, GF,), liên kết với các gốc fructosyl (F) tại các liên kết B(21)
của sucrose(2—4) [17].
HOH°CH,OH
Hình 2.1: Công thức cấu tạo của FOS [39]Fructooligosaccharide (FOS) từ đường sucrose, chất ngọt có tiềm năngthay thế với những tính chất đặc trưng, cũng được gọi là chất xơ, có một số đặcđiểm như năng lượng thấp, an toàn cho người bệnh tiểu đường FOS cũng đượcbiết đến như prebiotic, có kha năng kích thích hoạt động của các vi sinh vật
Trang 22probiotic Việc sản xuất FOS hiện năng dang phát triển mạnh trong suốt nhiều
năm qua [41].
Trong tự nhiên, FOS được hình thành dưới tác dụng của enzyme chuyển
hóa fructose Quá trình trích ly FOS từ những loại thực vật này ở quy m6 công
nghiệp không có tính kinh tế do nông độ rất thấp, lượng enzyme lại bị giới hạn
bởi điều kiện thời tiết, vì vậy FOS thương mại được sản xuất bằng phương pháptong hợp hoặc thủy phân [39]
FOS có thé được sản xuất ở quy mô công nghiệp từ nguồn nguyên liệusucrose, với xúc tác là enzyme B—fructofuranosidase thu nhận từ các loại nammốc như Aureobasidiums sp và Aspergillus niger [39]
2.1.3 Tính chất của FOS
Bang 2.2: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác [9]
Độ on định
Độ ngọt :Đường Nhiệt độ T Độ nhót | Tính hút am
(Sucrose = 1) ; pH
CC)
Sorbitol 0,7 <160 |2+10 Thap CaoXylitol 0,9 <160 |2+10 | Rat thap CaoMannitol 0,5 <160 |2+10 Thap ThapErythritol 0,65 <160 |2+10 | Rất thập Thap
Maltitol 0,75 < 160 2+ 10 Cao Trung binh
Isomalt 0,60 <160 |2+10 Cao ThapLactitol 0,40 <160 |2+10 | Ratthap | Trung bình
Maltidex 0,75 < 160 2~10 Cao Trung bìnhFOS 0.30 <160 |2+10 | Caohơn | Trung bình
Theo Gross, I-kestose là loại đường kết tinh mau trắng có góc quay cực[œ|pf” là +28,5° và nhiệt độ nóng chảy là 199 + 200 (°C) Độ ngọt của I—kestose,nystose và fructofuranosylnystose so với sucrose lần lượt là 31 (%), 32 (%) và 16
Trang 23(%) Độ ngọt tổng của ba loại đường này (FOS) chỉ bằng 30 (%) độ ngọt của
đường sucrose [39].
Vi ngọt cua FOS khoảng 0,3+0,6 độ ngọt cua sucrose tùy thuộc theo cầutrúc và độ trùng hợp của các oligosaccharide Đường FOS hút âm, nên khó bảoquản trong thời gian dài Ở cùng nông độ FOS có độ nhớt cao hơn so với sucrosedo các phân tử có trọng lượng lớn Độ nhớt cao làm chậm tốc độ đường tiêu hóagiúp quá trình tiêu hóa và hap thu chất dinh dưỡng tốt hơn sucrose Độ bền nhiệtồn định lên đến 140 (°C), pH hoạt động từ 4,0+7,0 [13, 12]
Ở dạng long, FOS mạch ngắn là chất lỏng trong, không màu hoặc màu vàngnhư syrup, có mùi trái cây và vị ngọt Ở dạng bột, FOS có màu trắng đến vàng
nhạt, mùi trái cây và vi ngọt FOS hòa tan trong nước [18, 20, 21, 22].
Một số tác giả nghiên cứu về tính chất hóa lý của FOS đều đưa ra một kếtluận chung là tính chất của FOS tương tự sucrose như độ hòa tan, độ đông đặc,nhiệt độ sôi va các thông số về quá trình kết tinh Khác với sucrose FOS mang lạinhiều giá trị sinh học và được các nhà nghiên cứu khai thác, ứng dụng trong thựcphẩm, y học [36, 37, 39]
2.1.4 Ảnh hưởng của FOS với sức khỏe con người2.1.4.1 Anh hướng của FOS đến sự chuyển hóa carbohydrate
FOS không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột, nên khiđược bổ sung vào hệ tiêu hóa lượng đường trong máu không có sự biến độngnhiều Những kết quả về sự thay đôi ham lượng đường va insulin trong máu theothời gian sau khi sử dụng FOS ở hình 2.2, 2.3 và 2.4 [9] Kết quả cho thấy trái
ngược với sucrose khi sử dụng FOS trong cùng một khoảng thời gian sử dụng
lượng đường trong máu không hề có sự biến đồi.Liễu lượng FOS can cho người trưởng thành là 8 (g/ngày) [35] Từ kết quacủa một số nghiên cứu khác cho thấy, đối với những người bị mắc bệnh tiểuđường nếu mỗi ngày ăn 8 (g) FOS, lượng đường trong máu sẽ giảm nhanh trong
vòng 14 (ngày).
Những biến đổi có tính tích cực phát sinh khi chuyến hoá glucose và chất
béo trong quá trình trao đôi chât với sự hiện diện của FOS Nguyên nhân của các
Trang 24hiệu ứng này là do FOS không bị tiêu hoá ở ruột non bởi tác dụng của hệ enzyme
đường ruột, mà bị lên men trong ruột già dưới tác dụng của vi khuẩnBifidobacterium (là một chi trong họ Lactobacteraceae, té bào hình que, phânnhánh, thăng hoặc cong, bất động, gram (+), sống ky khí, ưa 4m, không sinh baotử, thường gặp trong ruột giả) Kết quả của quá trình là sinh ra các acid béo đoảnmạch như acid acetic, acid propionic và acid butyric Các chất này sau đó đượcthấm vào thành ruột già hoặc chuyền lên gan, ức chế sự gia tăng của glucose vachất béo trong máu [42]
—— Ding sucrose —®— Dung FOS
Hình 2.2: Sự thay đổi nông độ insulin trong máu [9]
Thoi gian (phút)—e— Dung sucrose —m— Dung FOS
Hình 2.3: Sự thay đổi nông độ glucose trong máu [9]
Trang 25dùng sucrose nhưng sẽ được bình thường hoá bởi sự cung ứng FOS Như vậy
FOS có vai trò khá tích cực trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét ở gócđộ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu Vì thế FOS hiệnnay được dùng nhiều như là một chất ngọt thấp năng lượng đặc biệt dành cho cácđối tượng mắc bệnh tiêu đường [13]
2.1.4.2 Anh hướng của FOS đến hệ vi sinh vật đường ruộtNhiều carbohydrate được cho là prebiotic, trong đó bao gồm cả
fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS) Các prebiotic đã
được định nghĩa là một thành phan không tiêu hóa va anh hưởng có lợi trên
chủng chủ băng cách chon lọc kích thích sự tăng trưởng hoạt độ của vi khuẩn
trong ruột kết FOS trở thành nguồn năng lượng cung cấp cho sự phát triển của visinh vat Lam tăng hiệu quả tác động lên các sản phẩm probitic, thay đổi sự cânbăng của hệ vi sinh vật Bifidobacteria trong ruột làm tăng đáng kể, ngay cả trong
Trang 26trường hợp không có probiotic có lợi trong chế độ ăn uống [26, 28, 34, 24, 38,
45].
Thong thuong hé vi sinh duong rudt ton tai trong co thé có một tác động tolớn đối với quá trình tiêu hóa và hấp thu chất dinh dưỡng Số lượng tế bảo vi sinhvật lên đến 10!' và có đến 400 loài khác nhau, mỗi loài đều mang những đặcđiểm và tầm quan trọng khác nhau [13] Tác động của FOS đến hệ vi sinh vậtđường ruột đã có nhiều nghiên cứu cho thay Bifidobacterium spp và Bacteroidespp có thể phát triển mạnh trong môi trường dinh dưỡng có chứa FOS, ngược lại
Escherichia coli và Clostridium perfringen lại bi tiêu diệt trong mdi trường này.Hiện nay Bifidobacterium được đặc biệt quan tâm trong lĩnh vực sinh học
bởi nó mang nhiều lợi ích cho cơ thé sống Vi khuẩn Bifidobacterium tồn tại vàphát huy tác dụng ngay trong co thé chủ, điều này rất có ý nghĩa vì nó có théphòng chống các bệnh tật về đường ruột, do Bifidobacterium có kha năng sảnsinh các acid mạch ngắn như acid acetic, acid lactic trong quá trình lên men
đường [32, 33] Sự gia tăng hàm lượng acid sẽ có tác dụng giảm pH trong đường
ruột, giữ gìn hoạt động trao đôi chất của các vi sinh vật đường ruột khác ôn định,đúng quy luật, hạn chế hoặc ngăn ngừa sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnhvà các vi sinh vật gây thối rữa
Ở mức độ cao hơn nghiên cứu còn chỉ ra rang quá trình giảm pH trongđường ruột có tác dụng trực tiếp phòng và trị bệnh ung thư ruột già thông quaviệc ngăn trừ sự phát triển của bacterium hoại sinh và ức chế hoạt lực của các
enzyme như nifroreductase, glucoronidase va decarboxylase Day là những
enzyme tham gia quá trình chuyén hoá nito tạo các sản phẩm trung gian có khảnăng gây ung thư (những dẫn xuất phenol của tyrosin và tryprophan) Sự hiệndiện của các vi khuẩn có lợi và pH môi trường thấp hạn chế sự phát triển của cácvi khuẩn có hại, làm giảm quá trình tạo ra các hợp chất gây ưng thư, quá trình lênmen FOS ở ruột đóng vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu khả năng gây ungthư, ngăn chặn sự hình thành khối u ở ruột kết Ngoài ra vi khuẩn
Bifidobacterium còn có kha năng tạo vitamin, nhat là vitamin nhóm B, giảm
Trang 27cholesterol trong máu và tái sinh hệ vi sinh vật đường ruột cho các bệnh nhân sau
khi dùng nhiều kháng sinh điều trị bệnh [9].2.1.4.3 Ánh hướng của FOS đến bệnh sâu răng
Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn Streptococcus mutan và các liên cầukhuẩn gây nên Các vi sinh vật trên có rất nhiều trong khoang miệng của ngườivà động vật Khi thức ăn đưa vào, chúng sẽ lựa chọn các thành phan đinh dưỡngphù hợp dé lên men, phát triển và gây bệnh Streptococcus mutan sử dung nguôn
đường tạo thành các acid và B-glucan không tan là nguyên nhân chính gây sâu
răng Vì vậy nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa hoặc chứa ít chấtthích hợp cho quá trình sống và phát triển của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn
ngừa được bệnh.
Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môitrường FOS đã chứng tỏ cơ chế về khả năng phòng bệnh sâu răng của nó Đó là
do FOS không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây bệnh trên
phát triển Ngoài ra FOS không những chỉ có khả năng phòng mà còn có khảnăng chữa bệnh bệnh sâu răng Vì thế ngày nay nhiều nơi trên thế giới người tađã dùng FOS thay thế cho đường kính trong thành phần ăn hoặc trong chế biếnbánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng [9, 34]
2.1.4.4 Vai trò thúc day quá trình hap thụ khoáng của FOSSử dụng FOS có thể tăng cường sự hấp thụ khoáng: magie, canxi, sắt vàkẽm Trong đó đặc biệt là vai trò hấp thụ canxi Nhờ đặc tính này, FOS có thégiúp cho con người phòng và chống các bệnh vẻ chuyển hoá và bệnh loãngxương [10,17,13] Quá trình thúc đây hap thụ canxi của FOS xảy ra trong ruộtgià Cơ chế thúc đây trên chưa được xác định một cách rõ ràng nhưng có một kếtluận chung là do ba yếu tố sau:
+ Đường FOS trong ruột già bị các vi sinh vật sinh acid lên men,
làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hoà tan của cácmuối canxi
+ Trong ruột già vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi
trường có chứa FOS sinh ra các acid mạch ngăn, các acid này
Trang 28khuếch tán vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc day sự hấp
thụ canxi.
+ Sự dịch chuyển FOS trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyểncủa hợp chất canxi-protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiềuhơn với các tế bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thụvào máu Ngoài canxi, FOS đồng thời còn thúc đây sự hấp thụ cảmagiê Điều này thúc đây quá trình phát triển xương, tăng cường
hàm lượng canxi trong xương [11, 13].2.1.5 Tinh an toàn va ứng dụng của FOS
FOS thương phẩm chủ yếu có hai loại là FOS pho thông (độ tinh khiết từ45% đến 60 %) và FOS cao độ (độ tinh khiết cao hơn 75 %) Đường FOS phốthông thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩm hoặc như một chấtngọt b6 sung trong chế biến các loại thực phẩm khác Còn FOS cao độ thường déchuyên dùng cho các đối tượng mac bệnh, ăn kiêng Ngoài ra còn có loại tinhkhiết 100 (%) dùng cho công việc phân tích hoá học Loại có độ tinh khiết thấpcó thể dùng làm chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Bifidobacterium.
Cơ thé người một ngày chỉ có thé hấp thu 4+15 (g) FOS, nên việc dùngFOS bố sung vào thực phẩm khác như một chất phụ gia để tăng cường hoạt tínhsinh học của thực phẩm là ứng dụng dau tiên va quan trọng của FOS trong lĩnh
vực chế biễn thực phẩm Do FOS có đặc tính là có vi ngọt, năng lượng thấp va có
hoạt tính sinh học nên thường được bé sung vào các loại bánh, kẹo, bánh quy vacác sản phẩm của sữa hoặc kết hợp trộn lẫn vào trong các chất ngọt khác
Ở Nhật Bản FOS được dùng để bổ sung vào hơn 500 loại thực phẩm Năm
1984 ở nước này đã có một thị trường rộng lớn cho FOS Đến năm 1990 lượngFOS tiêu thụ trong cả nước lên đến 4.000.000 (kg) Đường FOS bán trên thịtrường Nhật Bản rất đa dạng, từ loại có hàm lượng rat thap đến loại có độ tinhkhiết cao đến 98 (%), phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, loại hàm lượngthấp dùng làm chất kích thích trong môi trường lên men cho vi khuẩnBifidobacterium, chất có ham lượng trung bình dùng cho người ăn trực tiếp hoặc
Trang 29bố sung vao thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phân tích [30, 31,
36].
Ở Mỹ và Nhật Bản người ta còn sử dụng FOS dé làm chất bổ sung trongthức ăn cho gia súc [38, 39] Nhờ đặc tính cua FOS là có thé tăng cường hoạtđộng của hệ tiêu hoá nên giúp cho gia súc ăn nhiều, tăng cân nhanh
Ở Mỹ và Châu Âu, nhiều công ty đã và đang xin chứng chỉ GRAS(Generally Recognized As Safe) cho việc sử dung sản phẩm FOS của minh, FOS
đã được công nhận chính thức bang van bản về độ an toàn thực phẩm Nhờ đó số
lượng người tiêu dung FOS ngày càng tang cao [9].
2.1.6 Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt NamViệt Nam là một nước có ngành công nghiệp mía đường phát triển từ rấtsớm Thực hiện chủ trương và chính sách của chính phủ, đến năm 2000 đã có 47nhà máy trrên toàn quốc đi vào hoạt động và sản lượng đường đạt tới một triệutan Cây mía có thé trồng ở tất cả các địa danh toàn quốc Các vùng tập trungtrồng mía nhiều là các tỉnh thuộc Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Đông Nam Bộvà Đồng Băng Sông Cửu Long Sản lượng mía và đường mía hàng năm không
ngừng được nâng cao.
Việt Nam có sản lượng đường mía tương đối cao, đó là nguồn nguyên liệudồi dao cho ngành sản xuất FOS, một mặt hàng chưa được phát triển trong thị
trường nội địa [9].
Cùng với nguồn nguyên liệu déi dào, Việt Nam còn có nguồn nhân lực lớn,có trình độ khoa học dé làm chủ công nghệ nói chung và chế bién thực phẩm nóiriêng Vì vậy việc mở ra một ngành sản xuất mới sử dụng công nghệ hiện đại đểtạo nên sản phẩm FOS với nhiều đặc tính ưu việt, có giá tri cao hơn đường kínhvề đặc tính chức năng, cung cấp cho thị trường trong nước va xuất khẩu làmnguyên liệu cho các sản phẩm chức năng như bánh kẹo, thực phẩm cho ngườimặc bệnh tiểu đường, sữa va bột dinh dưỡng cho trẻ em là cần thiết và hoàn
toàn khả thi.
Trang 30Bang 2.3: Tình hình sản xuất mía đường của Việt Nam năm 2010-2011 [53]
Diện tích271,000 (ha)Diện tích tăng so với năm trước6,300 (ha)
Năng suất bình quân 60,5 (tân/ha)
Năng suât vụ trước 51,7 (tân/ha)
Chữ đường bình quân9,8 (CCS)San luong mia ép 12,5 triệu tan (tăng 30,2 %)
San xuat duong 1,15 triệu tân (tăng 29 %)Công suất nhà máy 74.8% (vụ trước 61,8%)Giá đường 16.500 (đồng/kg) — 19.500 (đông/kg)
Tiêu thụ 98.000 (tan đường/tháng)
Gia mua mia (10 CCS) 850.000 (đông/tân) — 1.200.000 (déng/tan)
Gia mia tang 250.000 (déng/tan) — 400.000 (déng/tan)2.1.7 Một số nghiên cứu san xuất FOS trên thé giới
Hiện nay các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập tuyển chongiống dé sinh tong hợp enzyme, ứng dụng enzyme trong sản xuất FOS va nghiêncứu tinh chế FOS Thông thường FOS phổ thông được sản xuất theo phươngthức liên tục và không liên tục Trong phương thức sản xuất liên tục công nghệcố định enzyme hoặc cố định tế bào được sử dụng, còn đối với phương thức sảnxuất không liên tục thì sử dụng enzyme đã chiết tách Giải pháp cỗ định enzymevà cô định tế bảo trong sản xuất FOS cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất được liêntục, tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ nhưng tính ôn định kém và cần máymóc thiết bị hiện đại, nhà xưởng tiêu chuẩn Mặc dù vậy, đây lại là phương phápcó khả năng công nghiệp hoá cao và được tập trung nghiên cứu nhiều ở các nướccó nên công nghiệp phát triển như Nhật Ban, Trung Quốc, Han Quốc
Trang 312.1.7.1 San xuất fructooligosaccharide từ Pectinex Ultra SP—L cố định
[13]Anh hưởng của pH đến hoạt tinh:
Quá trình cố định không làm thay đổi pH tối ưu của enzyme, trong khoảngpH từ 4,5 đến 8 thì enzyme cố định hoạt động ôn định hơn han so với enzyme tựdo, enzyme tự do ôn định trong khoảng pH từ 5,5 đến 6,5
Trang 32Sản xuất fructooligosaccharide:Hỗn hợp sản phẩm sau quá trình sản xuất bao gồm: sucrose (11,9 %),
fructose (2,1 %), glucose (28,8 %), 1—kestose (23,5 %), nystose (27,2 %) va
fructofuranosyl nystose (6,5 %) Tổng ham lượng fructooligosaccharide là 57
định 6n định hon enzyme tự do Quá trình sản xuất fructooligosaccharide từ
sucrose 60 (%) (w/v) thu được 57 (%) fructooligosaccharide.
2.1.7.2 Tong hop FOS từ nguồn nguyên liệu syrup đường và mật ri
đường sw dụng Pectinex Ultra SP—L [17]
Tác động của pH và nhiệt độ: pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất
FOS từ sucrose sử dung FOS được xác định là 5,5 và 60 (C) Phản ứng được
thực hiện trong 24 (h) sau đó phân tích lượng FOS tạo thành bằng HPLC.Phản ứng sản xuất FOS: trong trường hợp syrup, hàm lượng FOS đạt đến
388 (mg/ml) sau 30 (h) (228 mg/ml I-kestose, 149 mg/ml nytose và 9 mg/ml
1F—fructofuranosylnytose) Tại thời điểm phan ứng FOS chiếm 56 (%) dựa trêntong carbonhydrate trong hỗn hợp Đối với mật ri đường hàm lượng FOS tối da
Trang 33là 235 (mg/ml) (49,2 % FOS) sau 65 (h) (62 mg/ml 1—kestose, 143 mg/ml nytose
và 30 mg/ml 1F—fructofuranosylnytose) Sau 140 (h) phan ứng tiến dan tới cânbang với hàm lượng FOS dao động từ 49 (%) va 42 (%) ở syrup đường va mật ri
01a0 20 40 60 80 100 120 140
Thời gian (h)Hình 2.6: Thời gian phản ứng tạo san phẩm của chê pham Pectinex
Trang 34Cố định fructosyltransferase trên Sepabead EC-EDP5: hoạt tínhfructosyltransferase trong chế phẩm Pectinex Ultra SPL được cố định trên
sepabead EC—EP5, hàm lượng protein trong enzyme là 17,8 (mg/ml) Hoạt tính
chuyển hóa sucrose là 321 (U/ml) hàm lượng protein cố định trên chất mang là36 (mg/g) và hoạt tinh là 21 (U/g) Hình 2.8 và 2.9 thé hiện hàm lượng FOS sovới tong hàm lượng carbonhydrate trong mẫu Phan tram FOS cao nhất được xácđịnh là 61 (%) Phần trăm FOS xác định trên mẫu syrup đường va mật ri đườnglà 53 (%) và 37,5 (%) Điều nay chỉ ra rằng trong trường hop FOS sản xuất từ
syrup đường lượng FOS 440 (mg/ml) so với 385 (mg/ml) và 215 (mg/ml) trên
sucrose tinh khiết và mật ri đường.2.1.7.3 Cố định Pectinex Ultra SP-L và ứng dụng trong sản xuất
fructooligosaccharide [40]
Diéu kién hoat dong cua enzyme có định:Trước khi áp dụng enzyme cố định trong chuyển đổi sinh học, xác định
hoạt tính cao nhất trên thông số chuẩn, nhiệt độ và pH được khảo sát Kết quả
cho thay 53 (°C) và 5,6 là nhiệt độ, pH tối ưu nhất Giá trị pH gần với giá trị hoạt
động của enzyme hòa tan, trong khi đó nhiệt độ thì cao hơn.
Sản xuất FOS:
Bang 2.4: Lượng FOS hình thành theo thời gian phan ứng [40]
Thời gian phan ứng (h) | Hàm lượng FOS (g/)
1839,637,357,771,479,678
Or NY] ay ®ị Gl bà | =
Trang 35Thí nghiệm có lắc với enzyme cố định được thi nghiệm để sản xuất FOStheo mô hình lab-scale Lượng Pectinex Ultra SP-L sử dụng 0,5 (g), thé tích cơchat là 50 (cem”) Điều kiện hoạt động là pH 5,6 và 53 (°C) Thời gian phản ứng làyếu t6 được khảo sát.
2.2 Tổng quan về enzyme fructosyltransferase2.2.1 Khai niệm chung về enzyme [5]
Enzyme là một loại protein được sinh vật tổng hợp và tham gia vào cácphản ứng sinh học Enzyme không chỉ xúc tác cho các phản ứng nhất định trongcơ thể mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào Điểm rất khác biệt làenzyme hoạt động trong nhiệt độ ôn định của cơ thé sinh vật
Cấu trúc enzyme gồm hai phan: trung tâm hoạt động của enzyme va phan
không tham gia vào hoạt động xúc tác.Cơ chê xúc tác tông quát của enzyme được trình bày như sau :
E+S <Ầ—Y ES > ETP
(E: enzyme, S: co chat, P: san pham)
Cơ chat San pham
Trang 362.2.2 Enyme fructosyltransferaseFructosyltransferase là tên gọi chung cho các enzyme có hoạt tính xúc tác
quá trình chuyển dịch gốc fructose [11] Quá trình trên có thé xảy ra theo haicách là cat không gan và cat rồi gan Kha năng xúc tác cắt không gắn của enzymelà hoạt tính thuỷ phân (viết tat là Uy), con khả năng cắt rồi gan là hoạt tínhchuyền hoá (viết tắt là U+)
Nhiều nhà nghiên cứu vẫn gọi tên các loại enzyme dùng sản xuất FOS là —
D-fructofuranosidase, một loại enzyme thuộc nhóm thủy phân kí hiệu
EC.3.3.1.26 Nguyên nhân có thé là do hoạt tính chuyên gốc fructosyl ban đầuduoc phát hiện trên enzyme invertase khi tiễn hành thí nghiệm với mẫu có nồngđộ sucrose cao Trong khi đó số khác gọi là enzyme fructosyltransferase, kí hiệuEC.2.4.1.9, nhằm phân biệt với nhóm enzyme thủy phân khác [16,11,39]
Phụ thuộc vào vi tri gan các gốc fructose lên chất nhận, enzyme nay đượcphân ra nhiều loại với các tên gọi khác nhau như: 6°-fructosyltransferase (6°—FT), 6'—fructosyltransferase (6 '-FT) và 1'—fructosyltransferase (IÏ-FT) Các
enzyme trên xúc tác lên phân tử sucrose tạo ra các loại FOS có phân tử lượng
như nhau nhưng không giống nhau vé cau trúc phân tử Ba enzyme 6°-FT, 6 ï—FT và IÏ-FT xúc tác gắn vào phân tử đường ở các vi trí khác nhau tạo ra các
đường tương ứng.
Các fructosyltransferase có nguồn gốc từ thực vật chỉ có hoạt tính U},nhưng mang tính đặc hiệu cơ chất tương đối (gắn gốc fructose vào phân tử đườngsucrose khác ở nhiều vị trí khác nhau) Khác với enzyme tổng hợp từ vi sinh vật,
fructosyltransferase trong thực vật có phân tử lượng nhỏ hơn và trong phan tửkhông chứa nhóm glucoside Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chúng là 30(°C) + 45 CC) [9].
Trong khi đó fructosyltransferase có nguôn gốc từ vi sinh vật lại có cả hailoại hoạt tính U va Uy nhưng hoạt tính gan lại có tính đặc hiệu cơ chất gan nhutuyệt đối Enzyme fructosyltransferase có nguồn gốc khác nhau cũng khác nhauvề cầu tạo hoá học Fructosyltransferase tong hợp từ vi sinh vật là những enzymeđa cau tử, có phân tử lượng cao (>10,000 Da), trong phân tử có chứa các nhóm
Trang 37glucoside Nhiệt độ hoạt động thích hợp của enzyme này là 50 (°C) + 60 (°C)
[40] rộng hơn so với enzyme từ thực vật, pH thích hợp là 5 + 6,5 [40] và nồng
độ sucrose từ 500-850 (g/1) [39].
Một số chất ức chế và xúc tác hoạt động chuyến hóa củafructosyltransferase cũng được nghiên cứu Ở loài cây Agave americana,fructosyltransferase được xúc tác khi có mặt các ion Ca”, Mg”, Co và Li’ và bịức chế khi có mặt Ag, Pb, Hg, AI” va Sn Trong khi đó, enzyme sản xuất từ loàinắm sợi Aureobasidium sp bi ức chế khi có mặt Hg, Cu va Pb [39]
Fructosyltransferase là loại enzyme đặc hiệu, nó chỉ có thể tác dụng xúc tácphân cat và gan kết gốc fructose trong phân tử sucrose hoặc các dẫn xuất củasucrose dé tạo thành FOS [11] Còn ở trong dung dich chỉ có fructose va glucose
thì enzyme này không có khả năng xúc tác tạo FOS.Một don vi hoạt tính của fructosyltransferase được tinh là lượng enzyme
chuyển hóa 1 (umol) sucrose trong 1 (phút) [17] Cơ chế chung cho phản ứngchuyền hóa gốc fructose như sau:
GF + fructosyltransferase —> F — fructosyltransferase + GF-fructosyltransferase + GF —> GF, + fructosyltransferase
8 GF —=—
or
N= > GFv
2 GEaKar,GF,
Hình 2.11: Cơ chế chuyển hóa tao FOS từ sucrose của fructosyltransferase [39]2.3 Enzyme cỗ định
2.3.1 Sơ lược về enzyme cố định [5]
Dinh nghĩa:
Theo Trevan, thuật ngữ enzyme cố định (immobilized enzyme, insolubleenzyme) được hiểu là đưa enzyme vào những pha riêng rẽ Pha này được tách
Trang 38riêng với pha dung dịch tự do Pha enzyme thường không tan trong nước và được
gan với những polymer ưa nước có trọng lượng phan tử lớn.Đặc điểm của enzyme có định:
Khi gan enzyme hòa tan vào một số chất mang, enzyme nay có những đặcđiểm khác han enzyme hòa tan:
+ Hoạt tính của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của
enzyme hòa tan cùng loại.
+ Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis — Menten.+ Enzyme cô định có tính chất bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng
Phương pháp này dựa trên cơ sở tạo ra một màng bọc hay một polymer.
Các chất tham gia phản ứng va sản phẩm của cả phản ứng có thé thâm thấu vào
trong hoặc ra ngoài thông qua màng bọc này và enzyme sẽ được giữ nguyêntrong gel đó.
Nguyên liệu tạo gel để nhốt enzyme đã được nghiên cứu kỹ và đã được ápdụng thành công ở nhiều nước như polyacrylamide, alginate, carrageeman,
gelatin
Trang 39môi hữu cơ hòa tan.
Nguyên liệu chủ yếu được sử dụng như là cellulose, cellulose acetate,polyvinyl alcohol trong đó cellulose acetate được sử dụng nhiều hon cả
2.3.2.2 Phương pháp liên kết enzyme với chat mangTùy theo tinh chất của chất mang, người ta thực hiện gắn enzyme vào chấtmang theo những cơ chế sau:
+ Phương pháp hấp phụ
+ Phương pháp tạo liên kết ion
Trang 40+ Phương pháp liên kết với kim loại+ Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị2.4 Vật liệu cố định enzyme [5]
Những yêu cau của một chất mang lý tưởng:
+ Đầu tiên là cần phải rẻ Điều này có liên quan đến hiệu quả kinhtế của quy trình công nghệ
+ Chat mang phải có tính chất cơ lý bền vững, 6n định Nhờ đó machất mang mới chịu được các điều kiện của môi trường
+ Vẻ mặt hóa hoc, chất mang phải bền vững, không tan trong môitrường phải ứng Chất mang không được làm mất hoạt tínhenzyme Chất mang không gây ra những phản ứng hấp phụ
không đặc hiệu.
+ Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn
công của vi sinh vật.
+ Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn
+ Chất mang có thé có cau trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt,
dạng màng, dạng phim mỏng.
2.4.1 Phân loại chất mangTất cả các chất mang dùng trong có định enzyme được chia làm hai nhóm:chất mang polymer hữu cơ và chất mang vô cơ
Vật liệu vô cơ
Đặc điểm: chất mang vô cơ bên với các tác động bên ngoài, không bị visinh vật ăn mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzyme thường khó khăn hơn
Một số chất mang vô cơ thông dụng như: thủy tỉnh xốp, các oxit kim loại
như oxit nhôm, oxit magie, silicagel Vật liệu hữu cơ
Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: —NH;, -COOH, —OH, —SH, nên dé kết gan với enzyme nhưng độ bền với cáctác động của môi trường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dé bị vi
sinh vật xâm nhập và tân công.