Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Cố định tế bào Bacillus Subtilis Natto bằng phức chất mang Alginate - Chitosan để lên men Nattokinase

TÊN ĐỀ TÀI: “Có định tế bào Bacillus subtilis nado bằng phức chất mang alginate — chitosan dé lên men naftokinase ” NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Tối ưu hóa quá trình cô định tế bao Bacillus s

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

KHOA KY THUAT HOA HOC

BO MON CONG NGHE SINH HOC

a

HO THI HIEN

PHUC CHAT MANG ALGINATE-CHITOSAN DE LEN MEN

NATTOKINASE

LUAN VAN THAC SI

TP HO CHI MINH, tháng 06 năm 2016

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

KHOA KY THUAT HOA HOC

BO MON CONG NGHE SINH HOC

Cán bộ hướng dan: PGS.TS Nguyễn Thúy Huong

Học viên thực hiện: Hồ Thị Hiền — MSHV: 13310298

TP HO CHI MINH, tháng 06 năm 2016

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Hồ Thị Hiền MSHV: 13310298

Ngày, tháng, năm sinh: 13/05/1987 Nơi sinh: Tỉnh Hà Tĩnh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

“Có định tế bào Bacillus subtilis nado bằng phức chất mang alginate — chitosan dé

lên men naftokinase ”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tối ưu hóa quá trình cô định tế bao Bacillus subtilis natto bang phức chat mang

alginate - chitosan.

- Khảo sát quá trình lên men nattokinase bởi tế bao cố định.- Khảo sát số lần tái sử dụng tế bào cô định

Il NGÀY GIAO NHIỆM VU: 17/08/2015

Ill NGAY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 17/03/2016

IV CAN BO HUONG DAN: PGS.TS NGUYEN THUY HUONG

Tp HCM, ngày thang nam 2015

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

TRUONG KHOA KY THUAT HOA HOC

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa hoc : PGS.TS NGUYEN THUY HƯƠNG

Tôi xin được bay t | ng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS NguyễnThúy Hương — người Thay đã tận tình hướng dan, giúp đ động viên và tạo mọi điềukiện tốt nhất đ tôi hoàn thành luận văn nay Tôi đã học được nhiều điều quý báu ở côvề kiến thức, nhiệt huyết, tình yêu thương và tinh thần trách nhiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học —Trường Đại học Bách Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi đ tôi hoàn thành luận văn tốt

nghiệp.Xin cảm ơn bạn các bạn học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 2013và các bạn sinh viên đã giúp đ và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin bay t lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình thân yêu đã luôn khích lệ và ủnghộ tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần đ tôi hoàn thành chương trình cao học

Cuối cùng, tôi xin bàyt lòng biết ơn đến bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đ va tạođiều kiện về thời gian đ tôi cóth hoàn thành luận văn nay

TÓM TẮT

Nattokinase là một enzyme thủy phân huyết khối mạnh, có tiềm năng trong việcđiều trị các bệnh về tim mạch Trong nghiên cứu nảy, chúng tôi sử dụng kết hợp phứcchất mang alginate — chitosan đ cố định tế bào Bacillus subtilis natto nhằm mục đíchlên men nattokinase Sáu thong số ảnh hưởng đến hiệu suất cô định tế bào đã đượcsàng lọc bởi ma trận Plackett-Burman bao gồm: nồng độ alginate, nông độ chitosan,pH chitosan, nồng độ CaCh, mật độ giống bồ sung, thời gian lắc khi b6 sung chitosan.Kết quả quá trình tối ưu đã xác định được hai yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cô địnhtế bào là nồng độ alginate (2,5%), mật độ giống bồ sung (khoảng 5,86 triệu tế bao/ml).Với hai yếu t6 tối ưu, các yếu tố khác được giữ ở mức giá trị trung tâm thì hiệu suất cỗđịnh tế bảo đạt 90,73% Từ kết quả tối ưu các thông số của quá trình cố định, chúng tôitiến hành ứng dụng tế bào cô định vào lên men nattokinase Sau 24 giờ lên men, hoạtđộ enzyme nattokinase đạt 71,80 + 0,19 FU/ml Tế bao Bacillus subtilis natto cỗ địnhđược tái sử dụng 6 lần và ở lần tái sử dụng thứ 6 hoạt tính enzyme nattokinase thuđược chỉ giảm 2,7% so với lần tái sử dụng thứ nhất

ABSTRACT

Nattokinase is a potent fibrinolytic enzyme with the potential for fighting cardivasculardisease In this study, Bacillus subtilis natto were immobilized in the alginate —chitosan complex for fermentation of nattokinase enzyme Six factors affecting theefficiency of immobilization cells were screened by Plackett — Burman designincluding: concentration of alginate, concentration of chitosan, pH of chitosan,concentration of CaCl, added cells density, shaking time after supplementing chitosan.Results of optimization have identified two factors affecting the efficiency of cellimmobilization They are concentration of alginate (2.5%) and added cells density(approximately 5.86 million colonies per milliliter) With these two factors optimizedand others kept at the normal level, immobilization efficiency reached 90.73% After

nattokinase enzyme activity reached 71.80 + 0.19 FU/ml Immobilized Bacillus subtilis

natto cells were reused 6 times and on the 6" time of reuse, nattokinase enzyme

activity only decreased 2.7% in compared with the 1* reuse.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các sô liệu và kêt quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng

được công bồ trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Hồ Thị Hiền

Nutrion agar (Môi trường dinh dư ng agar): NANutrion broth (Môi trường dinh dư ng [ ng): NB

Response surface methodology (Phương pháp đáp ứng bề mặt): RSM

Central Composite Designs (Thiết kế cau trúc có tâm): CC

Fibrinolytic unit (Don vi thủy phan fibrinolytic): FU

Colony-forming units per milliliter (Số đơn vị khuẩn lac trong 1 ml mẫu): CFU/ml

Standard Deviation (Độ lệch chuẩn): SDElementary mode analysis (Phương thức phân tích cơ ban): EMA

Statistical Analysis Systems (Hệ thống phân tích thống kê): SA

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Dac đi m hình thái của Bacillus subtilis naf{O 2222 cccc«- 4

Hình 1.2: Cau trúc bậc 1 của nattokinase c.cccccccccccscsccssesescssescsessesesescescseseescseseescsesecscseesees 7Hình 1.3: Cau trúc hóa học của nattokinase c.ccccccccccsssescscssescsessesesescescsescescseseescseseesescenees 8

Hình 1.4: Các hiệu ứng sinh lý cua nattokinase lên fibrin eee eceeeeesseeeeeeeeeseeenenees 8

Hình 1.5: Cau tao của alginate cccccccccscsssssssssssssssssesesecececscscscsssvsvsvsvsvscsesesecscscasasavavavens 13Hình 1.6: Quá trình tao tế bảo có định trong gel alginate calcium băng phương pháp bay0U 14

Hình 1.7: Sự hình thành gel giữa alginate và Ca”” ¿2 5+ +21 E22k 2x E2 rrg 14

Hình 1.8: Cong thức hóa học của chitosan, với n trong khoảng 700 — 4500 16

Hình 1.9: Liên kết giữa alginate va Chitosan .ccccscscsesesssssesescesetsesssscssetsesesesseteeseeen 17

Hình 1.10: Hạt gel alginate — chitosan dưới kính hi n vi điện tỬ - 555 s<s+ 17

Hình 1.11: Minh họa quá trình cố định tế bào băng phức chất mang alginate — chitosan 18Hình 3.1: Hình dạng khuân lạc của chủng giống - ¿2 +k+k+E+E+EeEsEstersrsrereree 41Hình 3.2: Hình thái của chủng giỐng - - - k1 E919 9E SE ccư cưng ng nerreg 42

Bảng 2.1: Các thiết bi dùng trong nghiên cỨU - - 6 + +E£E£EeEeEeEeEererersrreree 28Bảng 2.2: Bồ trí các biến, giá trị theo các mức khảo sát trong ma trận Plackett-Burman 33Bang 2.3: Bồ trí thí nghiệm theo ma trận Plackett — Burman - 2 2-5 +s+s+£sze£: 33Bang 2.4: Bồ trí thí nghiệm khởi dau và thí nghiệm trung tâm - 2-2-5 +s+cscee: 34Bảng 2.5: Bảng bố trí thí nghiệm CCD (central composite Design) s55: 35Bảng 3.1: Đặc đi m của chủng giống Bacillus subtilis naffO -ccccccccceree seseei 41Bảng 3.2: Hiệu suất có định trong thí nghiệm sang loc các yếu t6 ảnh hưởng đến quá trình“0n 46Bảng 3.3: Các mức của các biến trong thí nghiệm và sự ảnh hưởng của các biến lên hiệusuất CO định - -c- ctcnc 1110111118 1111 181551118155 11 1315111311111 1111111511511 111111111 151113 151113 cereg 47Bảng 3.4: Hiệu suất cô định của các thí nghiệm khởi đầu -.ccc nen chen rersrseree 48Bảng 3.5: Các mức ảnh hưởng của hai yếu tố khảo sát ¿666k +vexeEeeeesese 49Bảng 3.6: Kết quả phân tích phương sai của hai yếu tố khảo sát - 5 scs<scse 49Bang 3.7: Hiệu suất có định chủng Bacillus subtilis natto trên phức chất mang alginate-

chitosan trong ma trận thực nghiệm RSM-CCCD) << ĂGc 11111111 9913335511 xx2 50

Sơ đồ 1.1: Phân loại kỹ thuật có định té bảo «+ + St £EeEeEeEeEreeree rrsree 9Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên CỨU - - S119 9 5E E11 1101115111111 29Sơ đồ 2.2: Quá trình tạo hạt gel chứa tế bao cô định trên phức chat mang alginate —

MỤC LỤC

0007100077 1CHƯƠNG 1: TONG QUAN TAL LIPU -5 5 5-5555 << << s5 seseses2 4

1.1 Bacillus subtilis Matto HH nà 4

1.1.1 NguÖn g6C oc cccccccccccscscssssssscssscscsesesesececscscssavsvevevsvsvsesesesececscacasavavavavevsvevsvevavaeaeees 4

1.1.2 Đặc di m phân loại và hình that cece ccscccccccceeesseeessssseeeeeeeeceesesseeeeeeseaes 4

1.2 Đại cương vé naffOkiftaS€ - - - 11391965 5 E1 E11 v91 E111 1111 1313111111 51.2.1 Giới thiệu chung vỀ naftokina$e - + s33 EEEEEE5E5 5E EeErxrereri 51.2.2 Cau trúc của natfOkiinasSe ¿c6 S226 SE E915 1 1515112115111 111111111 xe 71.2.3 Tác dụng và cơ chế tác dỤng -.- «sư 111515 1111 1 1 Tri 81.3 CO dimh 0 91.3.1 Các phương pháp có định tẾ bào wocccccesssessssescsesesescecscscssessssvevsvsvststseseseeneen 91.3.2 Yêu cau va phân loại chat mang + + s xxx StSkSt SE EEEEEESESEExExrkrkrererees 111.3.3 Chat mang alginate va Chitosan c.cccccscssssssscssscsesesesessececsssssvevevsvsvstseseseseee 121.3.4 Bản chất liên kết giữa alginate va Chitosan c cccscscscsesesscesestssssssesereeeeeeseeen 171.3.5 Trang thai cua tế bào CO Minh e ccccccccccccsssesescssesescssesesesscsesesscscseseesesessesessescsesees 181.3.6 Ưu đi m và nhược đi m của tế bào cô định o.cccccccccccsscsesceseseseeseseeseseseeseseseeees 191.4 Một số công trình nghiên cứu về hướng của dé tải sex sEvxckrxexeeeed 21

1.4.1 Các công trình trong nue 0.0 cccccccessssssssssscceeeeeececeeeessesesssnaeeeaeeeeeesseeeeeees 21

1.4.2 Các công trình trên thé giới - - + + EEExSx St EEEEEEEESEeESEeEererererees 23CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU - 27

2.1 Dia đi m và thời gian thực hiỆn G5 5 E2 222222211299311 1111111111111 1111111111 332 272.2 Vat GU 272.3 NOi dung thi nghie eee 29

2.3.1 Sơ đỗ nghiên €ỨU - - - E919 5E Sư v31 E111 31111111111 rreg 292.3.2 Bồ trí thí nghiệm - - - x99 5E xxx E1 1111513111111 rreg 30

2.4.2.Các phương pháp khác - - - << << c5 11 113311111111999933311 1111111111 1111 000235561 xke 38

CHƯƠNG 3 KET QUÁ - THẢO LLUẬNN 2 5-5-5555 << xxx s99 xe 413.1 Khảo sát một số đặc đi m của chủng giống - «+ +k+k+E#EeEeEsrsrerererees 41

3.1.1 Đặc đi m đạith, vith , sinh ly và sinh hóa - 55555 ++++++++++<ssssss2 41

3.1.2 Biến động sinh trưởng va khả năng trao đối chat của chủng giống 423.2 Tối ưu quy trình có định tế bao Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate

mài 5a e 44

3.2.1 Sang lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định 5-5 eee 443.2.2 Tối ưu hóa quá trình cỗ định chủng giống Bacillus subtilis natto bang phức chat

mang alginate - CHItOSAN 00000787877 48

3.3 Ứng dụng chế phẩm Bacillus subtilis natto cỗ định trên phức chất mang alginate —

chitosan đ lên men natfOkifniaS€ - - - - G1 1 ngư 53

3.3.1 Biến động của quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase theo thời gian 533.3.2 So sánh quá trình lên men nattokinase bởi tế bào tự do và tế bào cố định 5S3.3.3 Khao sát số lần tái sử dụng chế phẩm tế bào cố định - 5 +cscsesesese 57KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ], 2-5-9999 9E cv 61TAI LIEU THAM KHAO

PHU LUC

MỞ ĐẦU1 Đặt vẫn đề

Nattokinase [EC 3.4.21] là một serin protease ngoại bào có khả năng làm tan huyếtkhối mạnh, được xem là một tác nhân có tiềm năng trong việc điều trị hiệu quả bệnh tắcnghẽn mạch máu [1,2] Enzyme này đã được phát hiện từ các nguồn thực phẩm khác nhaunhư: Natto của Nhật [1], Doen-jang của Hàn Quốc hay từ Dauchi của Trung Quốc [3] vàcác loài vi sinh vật khác nhau mà quan trọng nhất đó là các chủng vi khuẩn Bacillussubtilis trong các thực phẩm lên men truyền thống từ đậu nành [4] Trong đó, chủngBacillus subtilis natto là chủng vi khuẩn có kha năng sinh tong hợp nattokinase cao nhất[1] Nattokinase có khả năng tiêu hủy fibrin bang con đường trực tiếp hoặc gián tiếpthông qua quá trình hoạt hóa các yếu tô sinh plasminogen [5] So với các loại protein kháccó khả năng làm tan huyết khối như streptokinase, lumbrokinase thì nattokinase được xemlà yếu tô có nhiều ưu việt hon vì khả năng phân hủy fibrin cao hơn, thời gian tác dụng dai

hơn và gia thành rẻ hơn [6].

Kỹ thuật cô định enzyme và tế bao băng phương pháp bẫy nhốt trong gel đangđược ứng dụng rộng rãi và đạt hiệu quả cao trong ngành công nghiệp thực phẩm, dượcphẩm và xử lý môi trường [7] Trong số các chất mang sử dung trong quá trình cô định tếbào thi alginate va chitosan được sử dụng nhiều do các chất mang này đều có ưu đi mnhẹ, dễ thực hiện va an toàn đối với người sử dung [8] Tuy nhiên, cố định tế bao trongalginate có sự bất lợi đó là khi tế bào trong hạt gel cô định phát tri n mạnh thì dé dan đếnhiện tượng hạt gel bị v , tế bào cố định sẽ thoát ra kh i mạng gel, lẫn vào môi trường lênmen và số lần tái sử dụng hạn chế Bên cạnh đó, quá trình cố định tế bào băng phươngpháp bẫy nhốt trong mạng lưới gel chitosan có một số nhược đi m là do kích thước lỗ gelnh nên làm hạn chế sự khuếch tán chất dinh dư ng và sản phẩm trao đối chất qua lạigiữa môi trường lên men và tế bào cô định trong hat gel Đối với hạt gel alginate thườngcó độ ôn định không cao trong môi trường có chứa citrate va phosphate mà các chất nay

chitosan Sự kết hợp giữa nhóm amino của chitosan và nhóm cacbonat của alginate sẽ tạonên độ bền cho mạng lưới gel, điều này sẽ giúp hạn chế sự thất thoát tế bảo và tăng số lầntái sử dụng của hạt gel chứa tế bào cỗ định [9.10] Ngoài ra, với ưu đi m về khả năngkháng khuẩn của chitosan trong môi trường lên men và ôn định ở nhiệt độ cao sẽ tạo điềukiện thuận lợi cho tế bào Bacillus subtilis natto phát tri n mạnh [11] Do vậy, chúng tôi déxuất thực hiện dé tài “Có định té bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mangalginate - chitosan dé lên men nattokinase”’.

2 Mục tiêu nghiên cứu

> Mục tiêu tông quát: Thu nhận nattokinase.> Mục tiêu cụ th :

- Tối ưu hóa quá trình có định tế bào Bacillus subtilis natto bang phức chất mang

alginate — chitosan.

- Khảo sát quá trình lên men nattokinase bởi tế bao Bacillus subtilis natto cô định.3 Đối tượng nghiên cứu

Đôi tượng nghiên cứu tập trung vào:

- C6 định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate - chitosan - Tiến hành lên men chế phẩm cố định đ xác định hoạt độ enzyme nattokinase tao

thanh.4 Nội dung nghiên cứu

> Sang lọc các yêu tô ảnh hưởng đên quá trình cô định tê bào Bacillus subtilis natto.

> Tối ưu hóa quá trình có định tế bao Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang

alginate — chitosan.

> So sánh quá trình lên men nattokinase bởi tế bào cố định và tế bao tự do.> Khảo sát số lần tái sử dụng của tế bào có định

5 Y nghĩa khoa học và thực tiễn

Hiện nay trên thê giới cũng như ở Việt Nam, tỷ lệ mac các bệnh vê tim mạch liên

quan đến huyết khói là rất cao Do đó, nhu cầu sử dụng các loại thuốc làm tan huyết khối

là rất lớn Nattokinase là một trong những loại enzyme được xem là ưu việt nhất trongviệc sử dụng điều trị và ngăn ngừa tinh trạng tắc nghẽn mạch máu Tuy nhiên, việc sảnxuất nattokinase chỉ mới dựa trên việc tối ưu hóa môi trường, điều kiện lên men và sảnxuất nattokinase tái tổ hợp Việc kết hợp những ưu đi m của tế bảo cô định với cácphương pháp tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men sẽ nâng cao được hiệu suất thuhồi enzyme sau quá trình lên men đồng thời sẽ tiết kiệm được chi phí sử dụng chủnggiỗng Bacillus subtilis natto sử dụng trong lên men sản xuất nattokinase.

1.1 Bacillus subtilis natto

1.1.1 Nguôn gốc

Bacilus subfilis natto được giáo sư Swamura phân lập và định danh lần đầu tiênvào năm 1905 Bacillus subtilis natto có nhiều trongc khô, đậu nành Ngoài ra, vi khuẩnnày cũng phát tri n trong các loại đậu, các thực phẩm CÓ nguồn gốc từ động vật, thực vật

khác nhau như tao bi n, cá, tôm, cua [12,13] Bacillus subtilis natto không được thừanhận như một loài độc lập tuy nhiên khi sử dụng các chung Bacillus subtilis khác đ lên

men môi trường đậu nành chín thì cũng không tạo thành natto giống như Bacillus subtilis

natto [14].

1.1.2 Đặc điểm phân loại và hình thái

Hình 1.1: Đặc đi m hình thai cua Bacillus subtilis natto [15]

Bacillus subtilis natto là trực khuẩn Gr(+), hiểu khí, nội bao tử hình que, có kíchthước dưới lum, các tế bao vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi Khuanlạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định, bề mặt hơi nhăn lan rộngtrên bề mặt thạch nên trong quá trình nuôi cấy có mép nhăn bám chặt vào môi trường

thạch [13].

Bacillus subtilis natto là vi khuan hiểu khí nên trong quá trình nuôi cay cần phảicung cấp oxy, nó cóth phát tri n trong môi trường có nồng độ oxy >3% Nhiệt độ tối ưulà 39°C - 43°C, ở 55°C tế bào ngừng sinh trưởng, nhiệt độ tối ưu cho bảo tử nảy mam là40°C Bacillus subtilis natto phát trí n ở pH trung tính, sự nảy mam va phát tri n bị ức chế

khi pH < 4,5 [13].

Bacillus subtilis là sinh vat dị dư ng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydratcacbon: glucose, fructose, saccarose trong đó saccarose là cần thiết cho vi khuẩn pháttri n va tạo ra chất nhớt cho sản phẩm Bacillus subtilis natto cũng cần có biotin, trongmôi trường nuôi cay không có biotin thì các tế bào sinh dư ng không phát tri n được vàbào tử cũng không nảy mầm được Môi trường nuôi cây chứa vitamin B thích hợp cho sự

phát tri n của bào tử [15,16].

1.2 Đại cương về nattokinase

1.2.1 Giới thiệu chung về Nattokinase

Nattokinase được bác sĩ Hyroyuki Sumi phát hiện vào năm 1980 khi ông tiếnhành nghiên cứu khả năng làm tan cục máu đông của các loại thực phẩm Ông đã sử dungkhoảng 173 mẫu thực phẩm cho nghiên cứu của mình va phát hiện ra dịch chiết từ mộtloại sản phẩm truyền thống của Nhật Bản lên men từ đậu nành là loại thực phẩm có khảnăng làm tan cục máu đông nhanh và mạnh nhất Khi lay dịch chiết xuất từ natto nh lêntrên cục huyết khối nhân tạo (sợi huyết) trong một đĩa Petri và giữ ở 37°C, cục huyết khốixung quanh natto hoa tan dan dan và hoan toàn tan trong 18 giờ Bác sĩ Hyroyuki Sumi

đặt tên la enzyme "nattokinase" có nghĩa "enzyme trong natto" Nattokinase la enzyme có

khả năng chống đông máu mạnh hơn cả các urokinase Enzyme này đã được chứng minh

là an toàn và được sử dụng ở Nhat Bản trong hơn 20 năm qua, có khả năng tăng cường va

kéo dải tác dụng trong huyết tương khi sử dụng enzyme nảy thông qua đường miệng [17]

Tên gen Tên: aprNSinh vật Bacillus subtilis subsp.nattoNhan dang phan loai 86028 [NCBI]

Dong phan loai Bacteria> Firmicutes>Bacillales> Bacillaceae> BacillusThuộc tính cua protein

Chiéu dai chudi 275 AA

Trạng thái chuỗi Hoàn chỉnh

Xử lý chuỗi Trinh tự hi n thị tiếp tục được xây dựng tới lúc trưởng thành

Sự tôn tại của protein Băng chứng ở mức độ protein

Chú thích chung

Chức năng Subtilisin là một protease ngoại bào, xúc tác thủy phân

protein và các peptide amides Subtilisin NAT cũng có tácdụng thủy phan fibrinolytic.

Hoạt động xúc tác Thủy phân protein với độ đặc hiệu rộng rãi cho các liên kết

peptide.

Câu trúc ti u đơn vi Monomer

Vị trí dưới té bao Chưa khám phá raChuỗi tương tự Thuộc về họ peptide S8Đặc tính hóa sinh Tham số động học:

Km=0.48mM cho Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA

1.2.2 Cau trúc của nattokinase

Nattokinase (subtlisin NAT, NK) là một loại enzyme có kha năng phân hủy sợihuyết, được phân lập từ một loại thực phẩm truyền thống của Nhật Ban có tên là “Natto”’.Nattokinase là một serine protease gồm 275 acid amin, có khối lượng phân tử là 27,7 kDa

[12].

Nattokinase là một protease serin, trung tâm hoạt động là bộ 3 xúc tác gồm nhómhydroxyl của Ser-221, imidazol của His 64 và nhóm cacboxyl của Asp 32 Cơ chất đặchiệu của nattokinase là cơ chất đặc hiệu chung của subtilisin: Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA.Nattokinase 6n định trong khoảng pH từ 6 - 10 và nhiệt độ 30 - 60°C, mất hoạt tính ởnhiệt độ trên 70°C Enzyme nay có đi m đăng điện là pI = 8 [12]

l AOSVPYGISO IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHPDLNVRGGASF VPSETNPYQD

6l GSSHGTHVAG TIAAILNNSIG VIGVAPSASI YAVKVLDSTG

SGOYSWIING IEWAISNNMG121 VINMSLGGPS GSTALKIVVD KAVSSGIVVA AAAGNEGSSG

SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV181 NSSNOQRASFS SAGSELDVMA PGVSIOSTLP GGTYGAYNGT

SMATPHVAGA AALILSKHIPT241 WITNAOVRDRL ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAO

Hình 1.2: Cau trúc bậc 1 của nattokinase [12]

Nattokinase có đặc đi m sinh học giống như plasmin, phân hủy fibrin trực tiếp hoặc giántiếp thông qua 3 con đường (hình 1.4).

- Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp (A)

- Nattokinase tăng cường plasmin thông qua hoạt hóa prourokinase (nội sinh) thànhurokinase (B).

- Nattokinase làm tăng nồng độ t-PA (tissue plasminogen activators- yếu tố hoạt hóa

plasminoge) (C) [5,18].

1.3 Có định tế bao

Cố định tế bào là sự giới hạn về vật lý hoặc định vi của các tế bào nguyên vẹn ởmột khu vực không gian nhất định nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác của chúng và cóth sử dụng nhiều lần Carel và cộng sự (1985) đã phân loại các phương pháp cố định tế

bào thành 4 nhóm chính [20,21].

Các phương pháp cô định

tê bào sông

Có định tế bao Cé định tế bao Cé định tế bao Nhốt bằng phương

trên bê mặt chât trong lòng không cân chât pháp cơ học saumang chât mang mang màng chăn

Sơ đồ 1.1: Phân loại kỹ thuật cố định tế bao [20]

1.3.1 Các phương pháp cô định tế bào

1.3.1.1 Có định tế bào trên bề mặt chất mangĐây là phương pháp cô định dựa vào tương tác bề mặt giữa tế bào và chất mang nhờcác lực liên kết như lực liên kết tĩnh điện, liên kết cộng hóa tri, tương tác ki nước Các lực

này rất yêu nhưng khi các liên kết được hình thành với số lượng lớn là cơ sở đ gắn kết vi

sinh vật vào chât mang.

Ưu đi m: đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, tế bao cố định sẽ phục hồi trở lại tếbao tự do và tế bao ít hoặc không bị anh hưởng bởi kỹ thuật cô định

Nhược đi m: tế bào dễ bị tách kh ¡ chất mang, làm tăng hàm lượng tế bào tự dotrong môi trường lên men Do đó, kỹ thuật nay làm hạn chế số lần tái sử dụng so với cáckỹ thuật cố định khác

Các loại chất mang sử dụng cho kỹ thuật nay là: cellulose, gỗ, m n cưa [20]

1.3.1.2 Cố định tế bao trong lòng chất mangKỹ thuật cố định tế bào trong khung mạng xốp là kỹ thuật cố định mà tế bào đượcđưa vào trong mạng xốp (tạo gel) đ giảm sự khuếch tán của tế bào vào môi trường xungquanh, nhưng vẫn cho phép sự trao đối các chất dinh dư ng cùng các sản phẩm trao đổichất giữa môi trường và tế bào có định

Bay trong cau trúc sợi và vi gói là hai phương pháp cu th của kỹ thuật này Hai

phương pháp này có đặc đi m như sau:

Bay là phương pháp mà đối tượng cố định được bay trong màng hoặc bên trong cautrúc sợi nên đối tượng được giữ chặt và hạn ché được sự di chuy n tự do trong màng hoặctrong cau trúc sợi

Ưu đi m: đối tượng được cố định cóth sẽ tránh kh i các tác động từ điều kiện bên

ngoài.

Nhược đi m: do đối tượng được giữ chặt trong chất mang nên khi cố định có thlam cho đối tượng bi bất hoạt, dẫn đến khả năng chuy n hóa cơ chất chậm va chi phí cố

định cao.

Các chất mang thích hợp thường được d ng cho phương pháp này là: alginate,

carrageenan, chitosan, collagen, gelatin, polyvinyl alcohol

Khác với phương pháp bay, vi gói là phương pháp mà đối tượng được cố định tronglòng chất mang nhưng đối tượng vẫn cóth di chuy n tự do trong không gian này

Ưu đi m: đối tượng được bảo vệ tránh kh i những ảnh hưởng của các nhân tố bênngoài, kỹ thuật này giúp tăng kha năng chuy n hóa cơ chất và có th tránh làm cho đốitượng có định bi bất hoạt

Nhược đi m: khi sinh khối tạo ra nhiều, độ bền của màng sẽ giảm làm cho tế bào cóth thoátra kh i mạng gel và phát tri n như tế bao tự do

Các chất mang được d ng đ vi gói: chitosan, gelatin, k-carrageenan [20]

1.3.1.3 Có định tế bào không sử dụng chất mangĐây là kỹ thuật có sự hiện diện của một số hóa chất, các tác động về mặt vật lý hoặchóa học nhờ hình thành liên kết cộng hóa trỊ giữa tế bào dẫn đến sự tự gan kết của nhiềutế bào lại với nhau tạo nên một cụm tế bào lớn có cấu trúc phức tạp hơn

Ưu đi m: dé tạo lại tế bao tự do.Nhược đi m: đối tượng cô định cóth bị bất hoạt, biến tính, do có sự hiện hiện củamột số hóa chất nên sản phẩm tạo ra có th không đảm bảo an toàn va tính ôn định khôngcao Do đó phương pháp tự kết tụ ít được sử dụng trong kỹ thuật cô định [20]

1.3.1.4 Nhốt bằng phương pháp cơ học sau mảng chắn.Phương pháp này có th được thực hiện băng hai cách, sử dụng màng vi xốp và sử

chất mang phải có tính ôn định cơ học, hóa học, nhiệt, sinh học và không dễ dàng bị giảmgiá trị bởi enzyme, dung môi, sự thay đổi áp suất Song song đó, kỹ thuật cố định trênchất mang phải dễ thực hiện và có hiệu quả về kinh tế Những chất được sử dụng làm chấtmang đ cố định thường không có phản ứng với môi trường dinh dư ng, vi sinh vật vàsản phẩm tạo thành và đặc biệt là đảm bảo an toàn cho người sử dụng Chất mang khôngảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm do dư lượng còn lại.

1.3.2.2 Phân loại chất mangChat mang hữu co: polymer tổng hợp như là polyvinylalcohol, polyacrylamide,polyacrylic, được d ng đ cố định enzyme và tế bao bang phương pháp nhốt trong longchất mang

Polymer sinh hoc: gelatin, keratin, albumin dùng trong cố định tế bao băng phươngpháp vi gói trong gel Ngoài ra, còn có nhiều vật liệu khác như tỉnh bột, chitin, chitosan,alginate, carrageenan cũng được d ng đ cố định tế bào

Chất mang vô cơ: oxit kim loại (nhôm oxit, mangan oxit, magie oxit, ), gốm, chấtmang nay có đặc đi m là có cau trúc lỗ xốp, kích thước các 16 cóth điều chỉnh được, khảnăng cô định tốt với tế bào va enzyme [22,23]

1.3.3 Chất mang alginate và chitosan1.3.3.1 Chất mang alginate và phương pháp cô định bẫy nhốt

Alginate là một copolyme loại block cấu tạo từ các gốc B-D-manuronat và guluronat bằng liên kết (1-4) glucosit, được tìm thay trong loài rong nâu Phân tử alginateđược tạo thành bởi liên kết của 3 loại block khác nhau là block polyguluronat, blockpolymannuronat và bloek xen kẽ có độ dải ngăn khác nhau và trình tự sắp xếp khác nhau.Chính điều đó tạo nên tính chat đặc th của alginate và được ứng dụng trong rất nhiềulĩnh vực khác nhau từ thực phẩm, mỹ phẩm, in vải, giấy cho đến dược phẩm và cácnghiên cứu nuôi cây mô động vật có vú [24,25,26]

M-~G-M-M-M-M-M-M-G-M-G -_

~G@-M-M-G-G-G-G~G-G-G-M-rrr)

~M-G-M-M-M-G-M-G-M-G-M-G-M-M

MO - bleak

Hình 1.5: Câu tao của alginate [21]

Trong những năm gan đây, việc cố định tế bào trong gel alginate calcium bangphương pháp bay (entrapment) đã trở thành kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi Phạm vi sửdụng ngày cảng rộng, từ các vi khuẩn cho tới tế bao của động vật có vú Việc ứng dụngrất đa dạng, kỹ thuật chuẩn bị đơn giản Quy trình chung là trộn lẫn dung dịch alginatenatri và dịch huyền ph chứa tế bào cần cô định Dịch huyền ph thu được sẽ được cho

nh giọt vào dung dịch tao gel như CaCl, các hạt gel alginate calcium sẽ hình thành và có

dạng hình cầu Trong mỗi hạt gel, tạo thành một mạng lưới (matrix) bao quanh các tế bảo,cầu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các 16 xốp, thuận tiện cho việc khuếch tán cơ chấtvào và khuếch tán sản phẩm ra kh i hạt gel Bang cách này người ta cóth dễ dang khôngchế các phan ứng, tách sản phẩm ra kh i bình phản ứng va sản xuất liên tục [2]

Hình 1.7: Sự hình thành gel giữa alginate và Ca?* [20]

Trong hai thập niên qua, khoa học đã có những thành tựu đáng k trong đó có lĩnh

vực có liên quan đến alginate là công nghệ sinh học Với kỹ thuật có định tế bào trên gelalginate, công nghệ sinh học đã công nghiệp hóa được một số công nghệ cao như sản xuất

liên tục các loại rượu bang việc cỗ định các tế bào nam men, sản xuất acid hữu co, cácchất kháng sinh và các hocmôn bang việc có định các vi khuẩn đồng thời nuôi cay mô tếbào của động thực vật, các kháng nguyên d ng vô tính đơn, Ngoài tác dụng cỗ định,alginate cũng được dùng trong một số thực phâm hạn chế tăng trọng, acid alginic và muốicủa nó có th làm chất 6n định trong kem ly, làm cho kem min và có m 1 thơm, chịu nóngtốt, thời gian khuấy trộn ngắn Gel alginate natri 0,1% cho vào sữa b chống được hiệntượng các chất không h a tan kết tủa, nồng độ 0,1% d ng đ làm trong rượu vang.Alginate cũng được ứng dụng trong sản xuất bơ, fomat, nước giải khát cũng như các mặt

hàng đông lạnh.

Các ứng dụng của kỹ thuật cố định tế bào đã phát tri n mạnh mẽ và được côngnghiệp hóa ở các nước phát tri n với nhiều thành tựu đáng k Tuy nhiên, ở nước ta vớinguôn rong nâu phong phú cho alginate có tính chất tạo gel và có định tế bào tốt nhưngcác ứng dụng c n rất ít Việc ứng dụng alginate làm chất mang đ sản xuất ethanol theo

phương pháp lên men liên tục là ứng dụng có th nghiên cứu tri n khai trong công nghiệptại nước ta [25.26].

1.3.3.2 Chất mang Chitosan

a) Giới thiệu về chitosanChitosan là một polysaccharide gồm các phân tử B-(1,4)-D-glucosamine Chitosan làthành phần quan trọng trong v của động vật giáp xác, bộ xương ngoài của côn tr ng va

thành tê bào của nam, có tác động tạo khung vững chac và ôn định.

Chitosan là dẫn xuất quan trọng cua chitin, được thu nhận bang cách khử acetyl cua

chitin khi xử ly với dung dich KOH hay NaOH đậm đặc Vi vay, chitosan là một polymer

đồng tr ng hop của N-acetyl-D-glucosamine va D-glucosamine, chứa một lượng tối da

30% các nhóm acetyl [28,29,30].

Hình 1.8: Công thức hóa hoc cua chitosan, với n trong khoảng 700 — 4500 [27]

Có 2 chỉ số quan trọng của chitosan là mức độ deacetyl hóa va trọng lượng phan tử trung

bình, độ deacetyl hóa là độ chuy n hóa chitin thành chitosan Thông thường các chitosan

có độ deacetyl hóa 85 — 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có độ deacetyl hóa khoảng 45 —55% tan tốt trong nước nên gọi là chitin tan Trọng lượng phân tử trung bình của chitosanlà một đại lượng có ý nghĩa thống kê, được xác định thông qua độ nhớt dung dịchchitosan, có gia tri biến đồi từ 10.000 — 50.000 tùy theo mỗi loại chitosan khác nhau Haichỉ số này ảnh hưởng trực tiếp đến các tinh chất hóa lý, hoạt tính sinh học va ứng dung

cua chitosan [27].

b) Tính chất của chitosan- Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây bệnh nhưE.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tac dụng diệt nam nhất lànam Candida albicans

- Chitosan có khả năng hấp phụ lớn

- Chitosan không tan trong nước, nhưng nhờ sự có mat của những nhóm amino làm

cho nó cóth tan trong dung dịch acid loãng có pH thấp khoảng 6,5

- Chita các nhóm amino va hydroxyl hoạt động [28,29].

1.3.4 Ban chất liên kết giữa alginate và chitosan

Các polysaccharit sinh học như la alginate và chitosan hiện nay đang được chú

trọng nghiên cứu vì chúng có nhiều khả năng ứng dụng trong lĩnh vực vi gói tế bào, vậnchuy n thuốc va kỹ thuật mô Một yếu tố có th phát tri n vật liệu sinh hoc sử dụngalginate va chitosan là khả năng liên kết giữa nhóm cacboxyl của alginate và nhóm aminocủa chitosan thông qua liên kết ion giữa hai nhóm này tạo nên một cấu trúc 3 chiều Hìnhdạng của liên kết này không phụ thuộc vào tỉ lệ giữa khối G/M trong cấu trúc của alginate.Khả năng điều chỉnh đặc tính hóa lý của sự liên kết giữa alginate và chitosan được thựchiện thông qua điều chỉnh các nhóm chức Alginate có đặc tính bị co rút lại trong môitrường có pH thấp và h a tan trong môi trường pH cao Ngược lai, chitosan hòa tan trongmôi trường pH thấp và không tan trong môi trường pH lớn hơn 7 Trong phương pháp cốđịnh tế bào băng cách vi gói trong phức hợp alginate — chitosan, kích thước thực tế củahat phần lớn phụ thuộc vào tỷ lệ giữa alginate và chitosan, khối lượng phân tử của các

polymer này và pH của dung dich [30].

1.3.5 Trạng thải cua té bào cô định

1.3.5.1 Sự phát tri n của tế bào trong hạt gelViệc có định tế bào vi sinh vật trong chất mang alginate sẽ được bao quanh bởi mộtmạng lưới lưới gel làm hạn chế sự di chuy n của tế bào vi sinh vật trong hạt gel Vớinông độ alginate khoảng 2% thì kích thước lỗ trên hạt gel khoảng từ 5nm đến 200nm,kích thước này nh hơn kích thước của hầu hết các loại vi sinh vật nên tế bào vi sinh vậtsẽ được nhốt bên trong hat gel Một số tác giả đã nghiên cứu sự phát tri n của vi sinh vật

bên trong mạng lưới hạt gel Di n hình là Willaert và Baron (1993) đã nghiên cứu sự phát

tri n của tế bào nam men khi cố định trong chất mang alginate có nồng độ 2% bang cáchquan sát dưới kính hi n vị trực tuyến Ban dau, tế bào nam men được phân bố đồng đềubên trong hạt gel Khi tế bào bắt đầu phân chia, số lượng tế bào trong hạt gel tăng lên tạonên một lực đây cơ học đây mạng lưới gel ra xa và một mật độ tế bao dày đặc đã đượchình thành trong gel Khi mật độ tế bào trong hat gel càng lớn, tế bào sẽ bao quanh bề mặthạt gel tạo nên lực đây cơ học cóth phav mạng lưới hat gel và tế bào thất thoát ra môitrường Sự thất thoát này sẽ tạo nên những lỗ hồng trên hạt gel và có th làm thất thoátmột phân hoặc toan bộ tế bao trong hạt gel ra ngoải môi trường [9,10,21]

1.3.5.2 Sự vận chuy n cơ chất và sản phẩm qua mạng lưới hạt gelTrong quá trình lên men bằng tế bào có định, một số tác giả đã chứng minh rang kíchthước hạt gel ảnh hưởng đến động học của quá trình lên men tế bào cô định Cahon vàcông sự (1995) đã chỉ ra rằng, sự giảm bớt kích thước hạt gel từ 1,3mm đến 0,75mm lànguyên nhân dẫn đến sự tăng lên của khả năng tạo thành sản phẩm Đồng thời sinh khói tếbao trong hạt gel cỗ định cũng tăng gấp đôi và hiệu suất cô định tăng 50% Tương tự, mộtsố tác giả khác cũng đã ghi nhận răng, kích thước của hạt gel chứa tế bào cố định có ảnhhưởng tới sự phân phối không đồng nhất của sinh khói tế bào trong hạt gel trong suốt quátrình lên men Các nghiên cứu cũng chỉ ra rang, 95% sinh khối tập trung phía ngoài cùngcủa hạt gel và chiếm diện tích khoảng 300um so với diện tích của hạt gel Rõ ràng hiệntượng xuất hiện một chuỗi không đồng dạng vẻ điều kiện tăng trưởng của tế bao trong hạtgel Nguyên nhân chính của điều kiện phat tri n không đồng dạng trong hat gel da do sựgiới hạn về khả năng vận chuy n của cơ chất và các sản phẩm thải ra từ quá trình trao đôichất qua màng của hạt gel Sự vận chuy n này xuất hiện chủ yếu thông qua quá trìnhkhuếch tán [21.32]

Trong quá trình lên men tế bào cô định, cơ chất được tiêu thụ và tao ra các sảnphẩm thải bên trong mạng lưới hạt gel Các chất dinh dư ngh a tan trong môi trường lênmen sẽ di chuy n từ bên ngoài vào bên trong hạt gel theo cơ chế khuếch tán từ nơi cónông độ cao sang nơi có nông độ thấp Nếu khả năng tiêu thu của vi sinh vật hoặc sự tạothành các sản phẩm h a tan tăng lên tới một mức độ nhất định thì quá trình vận chuy nnày sẽ bị giới hạn Quá trình vận chuy n này xuất hiện thông qua hoạt động của 3 giaiđoạn: Sự phân phối, sự phân tán và sự khuếch tán Hai giai đoạn đầu là sự chuy n độngbên trong chất | ng [20]

1.3.6 Ưu điểm và nhược điểm của tế bào cô định

1.3.6.1 Ưu đi m

Chất mang d ngđ cố định tế bao cóth đóng vaitr như một chất bảo vệ chống lại

ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ, pH, dung môi, hoặc thậm chí là kim loại nặng Bên trong

chất mang mật độ tế bào trên một don vị th tích cao hơn nên thời gian phản ứng ngănhơn và loạib sự tăng trưởng của những tế bào vi sinh vật không có lợi Khi tế bào đượccô định trong chất mang thì khả năng hấp thu cơ chất tăng, năng suất được cải thiện vàquá trình này cóth tiến hành liên tục Do chất mang có kha năng chịu được nồng độ cơchất cao, nên giảm được sự ức chế của sản phẩm cuối Sản phẩm tao ra dé dàng hon, giảmđược các công đoạn tách, chiết và lọc, kéo theo giảm giá thành, giảm chi phí vốn và cũnggiảm nguy cơ bị nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao, nhờ đó mà thời giansản xuất ra sản phẩm ngăn hơn Thêm vao đó, ta thay tế bảo cô định có th tái sử dụngđược nhiều lần Do đó, phương pháp này giúp giảm chỉ phí ở giai đoạn chuẩn bị giống,năng suất tăng và quá trình bảo quản cũng như lưu thông được thuận lợi, dé dàng hon [22,

33].

1.3.6.2 Nhược đi m

Khi sử dụng tế bào cô định, trong môi trường sản xuất, có xảy ra hiện tượng rửa trôitế bào ra kh i chất mang Một di m nữa là tế bào cố định đ ih ¡ cung cấp nhiều nguồn

đinh dư ng, năng lượng đ đảm bảo sự sinh trưởng, phat tri n bình thường.

Khi lên men băng tế bào cố định có th xảy ra hiện tượng phân hủy sản phẩm đcung cấp chất dinh dư ng và năng lượng cần cho tế bao Vi vậy, hiệu suất sử dụng tế bảocô định cóth thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bảo tự do

Do được bao bọc bởi chất mang thành tế bào, màng tế bào chất, quá trình cố địnhcóth sẽ gây cản trở việc thâm thấu cơ chất, sản phẩm từ môi trường ra vào tế bào, nghĩalà tế bào cô định có khả năng trao đối chất kém hơn tế bào tự do

Đối với những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không có điều kiện tiếp xúc vớitế bao vi sinh vật cỗ định Vì thế, hoạt lực của những tế bào cô định cóth sẽ thấp SO VỚInhững tế bao tự do Bai toán tối ưu hóa kỹ thuật có định sẽ giải những nhược đi m nay

Từ những vấn đề trên ta thấy có các chỉ tiêu sau đ đánh giá hiệu quả của tế bảo cố

định.

- Khả năng sống của tế bào trong chất mang, lượng tế bảo còn sống sót và hoạt động saumột thời gian nhất định, khả năng chuy n hóa cơ chất và thành phần dinh dư ng đi vào,sản phẩm trao đối chat đi ra

- Độ bên cơ học của chất mang, sức chịu đựng của chất mang ở pH, nhiệt do, lực tác độngcủa môi trường và của lực khuấy, lực thôi của không khí đưa vào môi trường nuôi cấy vi

sinh vật [21,22,23].

1.4 Một số công trình nghiên cứu về hướng của đề tài

1.4.1 Các công trình trong nước

Ở Việt Nam hiện nay cũng đã có một số công trình nghiên cứu của trường đại họcDược Hà Nội, trường đại học Khoa học tự nhiên đại học quốc gia Thành phố Hồ ChíMinh và trường đại học Bách khoa Thanh phố Hồ Chí Minh về van dé phân lập các chủngBacillus subtilis có khả năng lên men thu nattokinase hàm lượng cao, tối ưu hóa thànhphan môi trường lên men chủng Bacillus subtilis đ thu nattokinase tái tổ hop bangphương pháp đáp ứng bề mặt và nghiên cứu tối ưu môi trường lên men đ thu enzymenattokinase Chưa có hướng nghiên cứu về van đề cô định tế bao Bacillus subtilis natto

nhăm mục đích lên men nattokinase.

> Tran Quốc Tuan và cộng sự (2014) đã tiễn hành tối ưu hóa thành phan môi trườnglên men ching Bacillus subtilis thu nhận nattokinase tái tổ hop bằng phương pháp đápứng bề mặt Từ 6 yếu tố ban đầu, chọn ra 3 yếu tố ảnh hưởng 1a peptone đậu nành,MgSO¿ và NaCl băng thiết kế ma trận Plackett-Burman Sử dụng phương pháp đáp ứngbề mặt Box-Behnken đã tối ưu thành phần môi trường cho hoạt tính nattokinase cao nhấtvới 10g/1 peptone từ đậu nành, 0,88g/1 MgSO¿ và 5g/1 NaCl Hoạt tính tối đa đạt được là152FU/ml sau 16 giờ nuôi cây chủng Bacillus subtilis DB 104 tái tổ hợp Kết quả làm tiềndé cho nghiên cứu thu nhận nattokinase với quy mô pilot 10 lítđ cóth sử dụng lamthực phẩm chức năng [33]

> Hoàng Thi Khánh Hong (2012) đã nghiên cứu bi u hiện và tiết enzyme nattokinasetái to hợp ở Bacillus subtilis Tác giả đã phân lập được chủng Bacillus subtilis từ sảnphẩm natto thương mại làm nguồn thu nhận gen mã hóa thích hợp cho nattokinase Thiếtlập thành công hệ thống vector bi u hiện mang gen mã hóa nattokinase nhân ban đượctrong E.coli và hoạt động ở Bacillus subtilis gồm hệ thống vector cho phép sát nhập cassetbi u hiện vào bộ gen (pAX0I-aprE) và hệ thống vector tôn tại độc lập với tế bao (pBG01-aprE) Bi u hiện và tiết vượt mức nattokinase tái tổ hop ở chủng Bacillus subtilis đượcloạib các serin protease quan trọng Nattokinase tái tổ hop sơ bộ được chứng minh là cóhoạt tính phân hủy fibrin gấp 5-10 lần so với chủng tự nhiên sau 3 giờ cảm ứng và hoạttính bền trong suốt thời gian nhân nuôi 25 giờ Nghiên cứu này là cơ sở thuận lợi cho tỉnhchế và thu nhận nattokinase sạch, không tạp nhiễm các serin protease có hoạt tính

subtilisin [34].

> Lê Thị Bich Phượng va cs (2012) thuộc Viện công nghệ sinh hoc nhiệt đới đã thực

hiện dé tài “Phân lập va tuy n chọn một số chủng Bacillus sinh tong hợp nattokinase”

Trong nghiên cứu này, hai chung Bacillus sp.7.2 va Bacillus sp.NP3 đã được chọn lọc có

khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme tan huyết khối nattokinase Trên môi trường đậunành, chiều day môi trường 2,5 cm, ở nhiệt độ phòng và thời gian lên men 40 giờ thuđược nattokinase (470 FU/g), chiếm khoảng 70-85% so với hoạt tinh protease tong [35]

> Nguyễn Thúy Huong va cs (2014) tién hành dé tai tối ưu hóa môi trường lên menđ thu nhận sinh khối Bacillus subtilis natto và bước đầu khảo sát hoạt độ enzyme

nattokinase thu được Các tác giả đã sử dung ma trận thực nghiệm Plackett Burman đ

tiễn hành sang lọc 6 yếu t6 trong môi trường lên men bao gồm: glucose, soybean peptone,K2HPOu, MgSOx.7HaO, NaCl, CaCh Kết quả cho thấy, hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhấtđến sinh khối tế bào là soybean peptone và CaCla Tiến hành thí nghiệm tối ưu với haiyếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm mục tiêu đã tìm được thông qua ma trận PlackettBurman, các yếu tô còn lại được giữ ở mức trung tâm Thực hiện thí nghiệm tối ưu với bềmặt đáp ứng cau trúc có tâm (RMS — CCD) Kết quả thực nghiệm tối ưu thành phan môi

trường lên men gồm (g/l): glucose 5,625, soybean peptone 13, K¿HPOx 2,15,MgSOq4.7H20 0,875, NaCl 5, CaC]: 0,05 Với môi trường lên men tối ưu trên, lượng sinhkhối tế bao thu được 3,033 + 0,243 g/l, hoạt độ enzyme nattokinase là 31,06 + 0,297FU/ml Kết quả hoạt độ enzyme thu được khi lên men trên môi trường tối ưu nay cao hon

30% so với hoạt độ enzyme thu được khi lên men trên môi trường NB [36].

1.4.2 Các công trình trên thé giới

> Hiroyuki Sumi và cộng su (2009) khảo sat tang nattokinase va Vitamin K2 trong

natto với acid Dipicolinic làm chất cảm ứng Dé tai đã chứng minh được khi thêm aciddipicolinic vào dung dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis natto thì diện tích fibrin hòa

tan bởi nattokinase và các hoạt động amidase của nattokinase dựa trên

SucAlaAlaProPhepNA tăng lên Ví du trong quá trình sản xuất natto từ đậu nành, việc bố sung 10 64mM acid dipicolinic làm tăng hoạt động amidase hơn 10 lần Nông độ vitamin K2 cũngtăng 4 lần khi b6 sung 10mM acid dipicolinie vào môi trường lên men natto [37]

-> Young-Han Cho va cs (2010) với nghiên cứu sản xuất nattokinase bang phươngpháp lên men gián đoạn và lên men bán liên tục sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis Trongnghiên cứu này nattokinase đã được sản xuất theo hai phương pháp 1a lên men theo mẻ valên men bán liên tục Với việc bổ sung các hỗn hợp môi trường chứa các chất (peptone,yeast extract, tryptone) ở các nồng độ khác nhau Khi bố sung dịch chiết nắm men vàomôi trường nuôi cấy với nồng độ từ 5g/1 đến 100g/1, kết qua cho thay với nông độ dịchchiết nắm men bồ sung là 50g/1 thì sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis diễn ramạnh nhất, đồng thời enzyme nattokinase thu được sau 12 giờ lên men cũng có hoạt độcao nhất Với nồng độ dịch chiết nắm men bé sung vào là 5g/1 đến 20g/1 thì hoạt lực củaenzyme nattokinase rat thap Ngược lại, khi bổ sung dịch chiết nắm men với nông độ từ70g/1 đến 100g/1 thì sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis bị ức chế va quá trìnhsinh tổng hợp nattokinase cũng bị ức chế Ảnh hưởng của pepton lên sự sinh trưởng của tếbào vi khuẩn Bacillus subtilis và quá trình sinh tổng hợp nattokinase cũng đã được xácđịnh khi tiến hành bé sung pepton với nông độ từ 5g/1 đến 100g/1 Kết qua cho thay rang,

ở tất cả các nồng độ pepton khảo sát thì sự sinh trưởng của tế bao vi khuẩn Bacillussubtilis tăng đến thời đi m 8 giờ lên men va sau 8 giờ lên men thì sự sinh trưởng củaBacillus subtilis bat đầu giảm Hoạt độ enzyme nattokinase dat mức cao nhất khi bổ sungpepton với nồng độ 50g/1 Đối với trypton, nồng độ bồ sung cũng từ 5g/1 đến 100g/1 và kếtquả thu được là bố sung nồng độ trypton 50g/1 thi enzyme nattokinase thu được có hoạtđộ cao nhất sau 10 giờ lên men Với nồng độ trypton cao hơn 50g/1 thì sự sinh trưởng củatế bảo và quá trình sinh tổng hợp nattokinase bi ức chế Đặc biệt ở nông độ trypton bốsung là 100g/1 thì không có sự sinh trưởng của tế bào Bacillus subtilis và quá trình sinhtong hop nattokinase không xuất hiện Từ các dữ liệu về động học của quá trình lên mennày chỉ ra rằng, quá trình tạo sản phẩm nattokinase liên quan đến sự tăng trưởng của tếbao Bacillus subtilis trong quá trình lên men Ð thu nhận lượng nattokinase tôi đa thi cầnphải thu hoạch trước pha 6n định Trong lên men bán liên tục, điều chỉnh pH theo các giai

đoạn của quá trình lên men Nattokinase thu được ở thời đi m 22 giờ lên men là 7100

unit/ml, cao gap 2,1 lần so với lượng nattokinase cao nhất thu được trong lên men theo

mẻ [38].

> Dja-Shin Wang và cộng sự (2006) khảo sát quá trình tối ưu đ lên men san xuấtnattokinase bằng phương pháp đáp ứng bé mặt Các tác giả đã chứng minh được việc lênmen sản xuất nattokinase có th bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: nhiệt độ, tốc độ lắc,thời gian lên men,th tích môi trường lên men Quá trình tối ưu hóa các yếu tố cho quátrình lên men sản xuất nattokinase được thực hiện bởi phương pháp đáp ứng bề mặt qua 3bước Bước dau tiên tìm các yếu tố quan trọng cho quá trình lên men thông qua L8orthogonol array experiment Yếu t6 lựa chọn nhiệt độ (37°C hoặc 45°C), tốc độ lac(110rpm hoặc 150rpm), th tích môi trường (80ml hoặc 120ml) Brix của nước chiết cámlúa mì (1,5° hoặc 3°), Brix của nước chiết thịt (1° hoặc 2°), nồng độ glucose (0,6% hoặc1,2%) và thời gian lên men (24 giờ hoặc 36 giờ) Bước thứ 2 là thiết lập các phương trìnhhồi quy giữa các yếu t6 và giữa hai yếu tô có ý nghĩa thống kê (vi dụth tích môi trườnglên men và thời gian lên men) Tìm giải pháp tối ưu cho th tích môi trường lên men và

thời gian lên men dựa vào phương pháp đáp ứng bẻ mặt phản ứng của phương trình hồiquy Theo phân tích thì điều kiện tôi ưu choth tích môi trường lên men là 80ml và thời

gian lên men là 37,08 giờ Dự đoán hoạt độ cua enzyme thu được là 459,11 FU/ml [39].

> Hiện nay van chưa có nghiên cứu nao về con đường sinh tong hợp nattokinase củachủng Bacillus subtilis natto được công bố Tuy nhiên, các nhà khoa hoc của trường đại

hoc King Mongkut’s của Thái Lan đã xây dựng mô hình mạng lưới tương tac cua Bacillus

subtils bang cách sử dung công cu phân tích dựa trên các con đường sinh tổng hợp cơ bản

Công cụ phân tích này đã được sử dụng đ xây dựng mạng lưới những ảnh hưởng khi

thay đổi các điều kiện của môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzymenattokinase của chủng Bacillus subtilis Dựa vào các con đường sinh tổng hop, với giathuyết sự tổng hợp nattokinase dat năng suất cao nhất dưới các điều kiện về cơ chất vàhàm lượng oxy cần cung cấp từ đó tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và môi trường đ thunattokinase Sau đó tiễn hành lên men theo mẻ đ thu nhận nattokinase với các cơ chất vàhàm lượng oxy đã được tối ưu [40] Mô hình về mạng lưới chuy n hóa của Bacillussubtilis đã được xây dựng băng cách kết hop chặt chẽ tất cả các con đường chuy n hóatrung tâm cho sự sinh trưởng của tế bao, sản xuất các sản phẩm lên men, sinh tong hợpnattokinase va năng lượng sinh ra Bao gồm các con đường: glycolysis, pentose phosphate,lên men, đồng hóa, phosphoryl hóa, và chu trình TCA Bang cách sử dung hai loại cơ chấtkhác nhau là glucose và glycerol Tat cả các tương tác trong mô hình này đều được định

vị trong hai vùng là nội bào và ngoại bào Mạng lưới các phản ứng có chứa 50 chuy n hóanội bào và 13 chuy n hóa ngoại bào.

Mô hình con đường sinh tổng hop nattokinase cũng được xây dựng tương tự phươngpháp trên Đánh giá lý thuyết về kha năng sinh tổng hợp nattokinase từ hai cơ chất khácnhau là glucose va glycerol Kết qua từ mô hình đánh giá cho thay rang, hàm lượngnattokinase thu được khi sử dụng cơ chất là glycerol cao hơn 9% so với sử dụng glucose.Đồng thời mô hình cũng chỉ ra khi sử dụng cơ chất là glycerol thì lượng sinh khối thuđược cũng cao hơn khi sử dụng glucose, hàm lượng sản phẩm phụ của quá trình lên men

cũng ít hơn Từ những dữ liệu của mô hình EMA, tiến hành lên men băng Erlen và

Biorector đ thu nhận nattokinase [41].

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Thí nghiệm được tiên hành tại phòng 116B2 của Bộ môn Công nghệ sinh học, Dai

học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh.Thời gian tiến hành thí nghiệm kéo dải từ tháng 07/2015 đến tháng 03/2016

- Alginate có nguồn gốc từ Nhật Bản.- Chitosan có nguồn gốc từ viện thủy sản Nha Trang

2.2.1 Moi trường su dụng trong nghiên cứu

- Môi trường giữ giống: - Môi trường nhân giống

+ Cao thịt: 5g/I + Cao thịt: 5g/1+ NaCl: 5g/I + Pepton: 10g/1+ Pepton: 10g/I + NaCl: 5ø/1

+ Agar: 20g/I pH: 7,4 dén 7,6pH: 7,4 dén 7,6

- - Môi trường lên men [36].+ Glucose: 5,6 g/I

+ Pepton: 13g/I+ MgSOq4.7H20: 0,875¢/1+ NaCl: 2,5ø/1

+ CaClo: 0,025¢/1