Với sự phát triển của côngnghệ enzyme, xu hướng sử dụng B-galactosidase cố định để thủy phân lactose thànhcác đường đơn dễ tiêu hóa trở nên phổ biến vì khả năng khắc phục được những nhượ
Trang 1ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH
TRUONG DAI HOC BACH KHOA
aDANG VAN LINH
CO ĐỊNH ENZYME ÿ-GALACTOSIDASE VÀO
THIOLSULFINATE- AGAROSE (TSI-GEL) VA UNG DUNGTHIET KE KY THUAT LEN MEN LIEN TUC SAN PHAM SUA
NGHEO LACTOSE
CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOCMA NGANH: 604280
LUAN VAN THAC SI
TP.HO CHI MINH, thang 08 nim 2014
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA- ĐHQG TP.HCM
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngànhsau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)
CHỦ TỊCH HỘI DONG TRUONG KHOA
Trang 3ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Đặng Văn Linh MSHV: 12313199
Ngày, tháng, năm sinh: 28/05/1989 Nơi sinh: Đồng NaiChuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 604280I TÊN DE TÀI: “Cố định enzyme ÿ-galactosidase vào Thiolsulfinate-Agarose (TSI-gel) và ứng dụng thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose”
NHIỆM VU VA NOI DUNG: Khảo sát hiệu quả cố định của TSI-gel đối với galactosidase Qua đó, thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactosebằng chế phẩm -galactosidase cố định
B-II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 24/06/2013II NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 23/05/2014IV CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương.CÁN BỘ HƯỚNG DÂN Tp HCM ngày tháng năm 20
(Họ tên và chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)
TRƯỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thay cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học,trường Đại hoc Bách Khoa đã ươm mam và nuôi dưỡng em với những kiến thức cũng
như những kinh nghiệm vô cùng quý báu từ khi em mới bước chân vào giảng đường
Đại học cho đến ngày hôm nay.Em xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến cô PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Cô làngười đã truyền đạt và dìu dắt em đến với con đường khoa học Cô luôn động viên vàgiúp đỡ em trong những lúc khó khăn nhất của cuộc sống và học tập Nhờ sự đồnghành và những lời động viên của Cô mà ngày hôm nay em có thé hoàn thành dé tài
này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Trần Văn Thi, Trưởng ban QA nhà máy Sữa Dielacđã tạo điều kiện cho em vừa có thé đi học vừa có thé cống hiến sức lực, trí lực cho nhà
máy Em cũng xin chân thành cảm ơn anh Hoàng Đình Phong, Trưởng ban QA nhà
máy Sữa Bột Việt Nam đã tin tưởng và tạo điều kiện cho em hoàn thành những thínghiệm quan trọng trong đề tài
Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn Lê Thị Mỹ Hương, Trưởng phòng thí nghiệm Visinh nhà máy Orion Việt Nam, người đã giúp đỡ em những kiến thức nên và luôn bêncạnh em giải quyết những van dé khó khăn trong dé tài
Ngoài ra, em xin cảm ơn bạn Nguyễn Huy Thoại, kỹ sư vận hành phòng rót sữa bột,nhà máy Sữa Bột Việt Nam đã hồ trợ em bản vẽ qui trình công nghệ
Và lời cuôi cùng, em xin gửi lời cảm ơn đên gia đình luôn là động lực đê em phân
đấu học tập và trao dồi dao đức dé trở thành người tốt trong xã hội
Trang 5TÓM TẮTNgày nay, hiện tượng không dung nạp lactose do sự thiếu hụt B-galactosidase tronghệ tiêu hóa của con người là vấn đề đang được quan tâm Với sự phát triển của côngnghệ enzyme, xu hướng sử dụng B-galactosidase cố định để thủy phân lactose thànhcác đường đơn dễ tiêu hóa trở nên phổ biến vì khả năng khắc phục được những nhượcđiểm của enzyme tự do B-galactosidase được cố định bằng nhiều phương pháp khácnhau, các đặc tính của dẫn xuất thu được phụ thuộc mạnh mẽ vào các liên kết hóa họcđược tạo ra Trong khi đó, thiolsulfinate-agarose (TSI- gel) được biết đến như một loạichất mang khi cố định sẽ tạo ra mạng lưới gồm những liên kết cộng hóa tri ồn địnhgiữa enzyme và chất mang, ngăn chặn hiệu quả khả năng enzyme cố định bị rửa trôivào môi trường Đặc biệt là khả năng hạn chế được sự thay đổi hoạt tính enzyme trongquá trình tao gel Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu cố định B-galactosidase vàoTSI-gel nhằm khảo sát hiệu quả cố định của TSI-gel đối với B-galactosidase Qua đó,thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose băng chế phẩm enzymecố định.
Kết quả thu được:- - Với ty lệ enzyme: chất mang là 1: 9 (v/v), quá trình cố định B-galactosidase dat
hiệu suất cao nhất 78.24 % khi nồng độ TSI- gel là 2 % (w/v).- Trong điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu (50 °C, pH 7.5) chế phẩm B-galactosidase
có định có hoạt tính đạt 85.53 % so với enzyme tự do trong điều kiện tối ưu.- Chế phẩm ÿ-galactosidase cố định ổn định trong khoảng pH và nhiệt độ rộng
hơn so với j-galactosidase tự do Khoảng pH hoạt động ốn định là 6.0- 8.0 vàkhoảng nhiệt độ hoạt động ồn định là 40- 55 °C
- Khi khảo sát hiệu quả tái sử dụng chế phẩm -galactosidase cố định, sau 9 lầntái sử dụng hoạt tính còn 49.06 % so với hoạt tính ban đầu
- Ché phẩm được bảo quản tốt ở 4 °C Sau 15 ngày bảo quản ở 4 °C hoạt tính củachế phẩm cô định là 95.57 %, sau 20 ngày hoạt tính còn lại là 88.82%
- Ngoài ra, chúng tôi đã bước dau thiết kế qui trình sản xuất sản phẩm sữa nghèolactose với ba thiết bị phản ứng là Packed bed reactor (PBR) được đặt trong cáccông đoạn khác nhau của quá trình chế biến sữa tươi
Trang 6ABSTRACTThe phenomenon of lactose intolerance due to the lack of B-galactosidase in themucosa of human small intestine has become an area concern recent times With thedevelopment of Enzyme Technology, using immobilized B- galactosidase to hydrolyzelactose to utilisable sugars that easily digested has become popular because of itsability to overcome the drawbacks of free enzyme B-galactosidase was immobilized bydifferent methods, the characteristics of the derivatives obtained strongly depends onthe chemical bond is created Meanwhile, thiolsulfinate- agarose (TSI- gel) is known asa support should create a matrix of covalent bonds between enzyme stability andsupport when immobilized, the ability to block enzyme to release into the environmenteffectively Especially, it also has ability to limit the change of enzyme activity in gelprocess Therefore, we researched the immobilized B- galactosidase on thiosulfinate-agarose to investigate the effectiveness of TSI- gel on B- galactosidase Thereby, wedesign the technical of continuous fermentation of lactose to apply in low lactose milkproduction.
The results were:- With a ratio of enzyme: support is 1: 9 (v/v), the immobilized B- galactosidase
is highest efficiency 78.24 % at TSI - gel concentration of 2 % (w/v).
- In terms of temperature and pH optimum (50 °C, pH 7.5), the activity of
immobilized B- galactosidase reached 85.53 % compared with the activity offree enzyme in optimum condition.
- Immobilized B- galactosidase is more stable over a wide temperature and rangeof pH than free B- galactosidase Range of stable pH is 6.0- 8.0 and range of
stable temperature is 40 - 55 °C
- When surveying the effective reuse of immobilized B- galactosidase, after 9reuse the activity was 49.06 % compared with the initial activity.
- After 15 days storage at 4 °C, activity of immobilized enzyme is about 95.57 %,
after 20 days still over 88.82 %.- Design the process low lactose milk production with three Packed bed reactor
(PBR) is placed in various stages of processing fresh milk.
Trang 7MỤC LỤC
2720 6 2 |CHUONG 1 TONG QUAN TALI LITỆU - 2 2 E9 + *E£SE£E£EE£EEESEEEeEEEevkeEexeei 31.1Tống quan về B- øalactOSidasSe - +22 22 ©E©E2EE9EE2EEEEE39E1123212723113E 21123 3
I.].[ Phân load - G G5 SG G53 303833 301313 9 30 81 311 0911 16g n0 01g x6 3
1.1.2 Cấu trúc ctha B- galactOSidase ¿+22 ©S+ S2 ++*EEE2EEEEEEEEEEEEEE1.EA.ckere 51.1.3 Cơ chất của B- galactOSidase ¿+52 ©s+ Sex EEE1EE1211211 11221 xe 51.1.3.1 Giới thiệu VỀ [aCOS€ - 2 S%©Ss SE EEk ke SE SE EE cv vvtgEerkerkersrkd 5
11.3.2 Hiện tượng không dung nap lactose - 5-53 1 re 7
1.1.4 Cơ chế xúc tác của B- galactosidase lên lactose -+- 22552 55e5 81.2 Tổng quan về enzyme cố Ginh eceecccccccssesssssesssssssssessscssesseesesssessecssessesseeseesssssesseesseeseen 912.1 Khái niệm về enzyme CỐ ịnHh - 5° - St St E2 SE 3v vn vn gered 91.2.2 Các phương pháp cố định - + ¿+2 ©5£+E££E++EE££EE£EEtEEerkerrerrkerrerred 101.3 Tổng quan về chất mang cô định enZyme - 2 22+ £+£++££x2£x£+Ex+rxerrzcreee 14
I.3.[ Giới thiệu chung - «5 se SH HH 14
1.3.2 Chất mang agarOSe - ¿2+2 t9 3 15215111111111 1111111112121 11 xe 171.3.3 Chất mang thiolsulfinate- agarose c.ccccccsscsssesssesssssessesesssesseessessesseessessseseeees 181.4 Tống quan về thiết bi phan ứng sinh hoc dành cho enzyme thủy phân lactose 2114.1 Thiết bi phản ứng packed bed reactor ceccscccsssessessesssssesssessessessesseeseeseeeseen 211.4.2 Thiết bi phan ứng fluidized bed reactor cceccsecsssssssessesssssssessessessssseessesseeseeees 23143 Thiết bi phan ứng membrane r©aCfOT cecceesesssessesssesssesesssssssssessessseseeseesseen 23
1.5 Tinh hình nghiên cứu trong nước và NYO Al NƯỚC «0 eee eeeeecceeeeneeeeeeceeeceeceneceeeaeeeeees 24L5.1 Các nghién cứu trong nue - 2 5 5S 1911 9 1 ng ke 24
Trang 81.5.2 Các nghiên cứu ngOi TƯỚC 5 << + 9 9 91 1 3 ng ghe 26
CHUONG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 5 6S eEkS+EeEEeEsrEexeexered 282.1 Trang thiết bị, hĩa chat, vật liệu - ¿2£ Sẻ +sẻ+E£+Ee+EE+EE£EE£EE£EEEEEEEEEEEErrkrrkrrkd 282.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên €ỨU - 2 2 s2 £+£££++£x++xz+Eszcsecrer 282.1.2 Trang thiẾt bị ¿5< << E13 13211115135 151111 1111111110111 E111 cty 282.1.3 Hĩa chất và nguyên vật liỆU -. - + 255-522 ©E£2EE+EEEEEEEeEEEEEErEerrkrrrrre 28
2.2 Nội dung Nghi€n CỨU G55 5E 1 90 019030 gu 292.3 Phương pháp nghiÊn CỨ U - <5 %3 1E 939109 919 1 HH ng k 30
2.3.1 Khảo sát tiền đỀ tài ccccscrrtrhnhhhhH Hee 302.3.2 Cĩ định B-galactosidase vào chất mang TSI-gel -. -2cs2 5s 332.3.3 Nghiên cứu tính chất của chế phẩm B-galactosidase cố định 34
2.34 Nghiên cứu động học của B-galactOsidase - 55 55c sxsseexe 352.3.5 Khảo sát sơ lân tái sử dụng và nhiệt độ bảo quan của chê phâm enzyme cơ
2.3.6 Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose 38
2.4 Phương pháp phân tich - - G133 1 9.919 010009 HH ng 3824.1 Phương phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein- enzyme 3824.2 Phương pháp xác định lượng đường khử theo Miller - 40
24.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cố định . - +2 40
244 Phương pháp tạo thiolsulfinate- aØ4fOS© - cv ssereeeeke 41
24.5 Phương pháp xử lý số liệu ¿225252 £EE£EE+EEEEEEEEEEEErEErrkrrkrrrrrre 43CHUONG 3 KET QUA VA BAN LUẬN -6- 2-5 2kSESEEkEEkvkerkeeereersred A43.1 Khao sát tiền dé ti ec cceesccsssssescssssesccessnseccssssecessnsecessseseessnsecessnseecssnueseessnesensneeeeesen 44
Trang 93.1.1 Định lượng protein-enZyMe - s5 <5 S5 S3 9 9 1 g1 ng rec 41
3.12 Xác định hoạt tính, hoạt tính riêng và các yếu tố ảnh hưởng lên
§-Pal actOsidase TỰ O Gv 45
3.2 Có định B-galactosidase vào chất mang TSI-gel + 2-52 52©s+cscrscred 493.3 Nghiên cứu tính chất của chế phẩm B-galactosidase cố định - <- 513.3.1 Ảnh hưởng của pÚH 55+ ©+<+SE£SEE+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEESEEEEEEELerrkrrkrre 513.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt đỘ - + 5£ 5£ ©5<+SEEEESEE£EE+EEEEEEEEEEEEEEErkrrkrrrrrre 533.3.3 Khảo sát khả năng bền nhiệt 25-52 2+S22E£E£EEEEEEEEEEEEEEEEerrerreee 56
3.4 Nghiên cứu động học của -gaÌ aCfOSICÌAS - <5 S5 SH re 58
3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ Chat - 22s 5+2 EzeEkvrkrvsrrkerkerreee 5834.2 Xác định hệ số phương trình động hoc Michaelis — Menten 593.5 Khảo sát khả năng tái sử dụng và nhiệt độ bảo quản của chế phẩm enzyme cố
Gin oe eee cece c cc eee ee eceeeecesueeseuee besa seeesesseuesssueeseasaseeaeseaeueeeeaeewess 61
3.5.1 Khảo sát số lần tái sử Ung ececcescesccscessessessessessesstestsstessesesssuessessssessssssesneenes 61
3.5.2 Khảo sát nhiệt độ bảo quản . c1 11.1 1 1 ng ng ng ng 63
3.6 Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo Lactose - 643.6.1 Qui trình sản xuất SỮa tươi - -%cs SE EkSEkkSkE SE SE grtckregerkd 653.6.2 Bài toán thiẾt KẾ - 2+ 2e SE< S21 11 E121521112121115 1511111111111 11 67CHUONG 4 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ - - + 5+ EE+EEEexkeErEerkeEsrkersred 72AL KKẾ( luận - <2 sStS% 9S 13191 1111 91021011 1111191911071 E1071 110111 ven rker 724.2 Kiến nghị, -. - 55-5 SE SE EkEEE 1E 1115115 15111111115111 11 11111111111111 1111111111111 72
Trang 10DANH MỤC BANGBang 1.1 Nguồn vi sinh vật thu nhận -galactosidase - - -<- <<: 4
Bang 1.2 Các phương pháp cố định J-galactosidase - . -< : 16
Bang 3.1 Nong độ protein-enZyme cee ceeeceeccececeecueecueceaseeeenesaeeeeeess 45Bảng 3.2 Hoạt tính, hoạt tính riêng của B-galactosidase 45
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của B- galactosidase tự do 46
Bảng 3 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên ho ạt tính B-galactosidase tự do 48
Bảng 3.5 Hiệu suất có định với các nồng độ khác nhau của agarose và TSI-gel 50
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH lên chế phẩm B-galactosidase cô định 51
Bang 3.7 Anh hưởng của nhiệt độ lên B-galactosidase tự do và cô định 53
Bảng 3.8 Khả năng bên nhiệt của B-galactosidase tự do và B-galactosidase có định 56
Bảng 3.9 Thông số động học B-galactosidase tự do và cố định 60
Bang 3.10 Khảo sát số lần tái sử dụng chế phẩm B-galactosidase cố định băng ok) 61Bang 3.11 Hiệu quả thủy phân ONPG của enzyme có định băng TSI- gel 63
TSI-Bang 3.12 Mối quan hệ giữa nhiệt độ bảo quản và thời gian bảo quản 63
Trang 11DANH MỤC HÌNHHình 1.1 Câu trúc khơng gian của J-galactosidase - . -<: 5Hình 1.2 Cấu trúc hĩa học của ơ- lactose và -lacfOSe - -c- <<: 6
Hình 1.3 Phản ứng thủy phân lactose bởi B-galactosidase - 8
Hình 1 4 Liên kết cộng hĩa tri giữa chất mang và enzyme - - - IIHình 1.5 Enzyme được cố định băng phương pháp hấp phụ trên bề mat 12Hình 1.6 Enzyme được cố định băng phương pháp bao gĩi và phương pháp bay .13Hình 1.7 Câu trúc €Ủa aØaTOSe - c-.cc nn 921111111 nh nh xa 17Hình 1.8 Enzyme va chat mang thiolsulfinate- àarose - -: 19Hình 1.9 Tao pha ran thiol-agarOSe - - c c2 21211211210 11151 113111 6 ens 20Hình 1.10 Nhĩm thiol bị oxy hĩa bang K;Fe(CN), tạo thành cấu trúc disulfide 20Hình 1.11 Nhĩm disulfide được chuyển hĩa thành thiosulfinate khi pha răn disulfide-agarose phản ứng với chất oxy hĩa magnesium mono peroxyphthalate 21Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm eee ceccecccecceccuscueceuceuscusceseecuecensenss 29Hình 2.2 Thủy phân cơ chất ONPG - -c c1 21191 vn rệt 31Hình 2.3 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo 3ĨHình 2.4 Đường chuẩn nồng độ ONP - .ccc SE 2211211 1n xa 41Hình 3.1 Thiết bi Packed bed reactor 0 cccccecceccececcucecceececeuceecceucetcuaeeneas 65Hình 3.2 Qui trình cơng nghệ chế biến sữa tươi - .-c c2 ce 66Hình 3.3 Qui trình chế biến sữa nghèo lactOSe .cc-cc c2 S222: 70Hình 3.4 Sơ đồ qui trình cơng nghệ sản xuất sản phẩm sữa nghèo lactose 7]
Trang 12DANH MỤC DO THỊĐồ thị 3.1 Đường chuẩn nồng độ albumin (mg/ml) - . -<< <<- <<: 44
Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính B- galactosidase tự do 47
Đồ thi 3.3 Anh hưởng cua nhiệt độ lên hoạt tính B- galactosidase tự do 49
Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme cố định - : 52
Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên B-galactosidase tự do và cô định 54
Đồ thị 3.6 Khả năng chịu nhiệt của B-galactosidase tự do và cô định 57
Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ ONPG lên vận tốc thủy phân 59
Đồ thị 3.8 Phương trình trình động học Michaelis — Menten 60Đồ thị 3.9 Khả năng tái sử dụng của chế phẩm B- galactosidase cố định băng TSI-gel.62
Trang 13ĐẶT VAN DENgay nay, enzyme cố định được nghiên cứu sâu rộng nhăm ứng dụng vào lĩnh vựcthực phẩm Trong đó, B-galactosidase hay còn được gọi là lactase đặc biệt được quantâm mạnh mẽ Ứng dụng chủ yếu của B-galactosidase trong việc sản xuất sản phẩm sữa
nghèo lactose được tiêu thụ bởi người không dung nạp được loại đường này.
Lactose là một loại carbohydrate chính có trong sữa với nông độ thường từ 2% đến10% (w/v) tùy thuộc vào nguồn gốc của sữa [36] Do thiếu B-galactosidase, đườnglactose không được tiêu hóa, gây bất dung nạp lactose Do đó, giải pháp đưa ra là sửdụng B-galactosidase tự do hoặc cố định dé thủy phân lactose thành các đường đơn détiêu hóa hơn Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme tự do bị hạn chế vì tính 6n định enzymethấp, chi phí tách enzyme ra khỏi sản phẩm cao và không thé ứng dụng vào sản xuấtliên tục Những hạn chế này có thé khắc phục khi sử dụng enzyme cố định
B-galactosidase được cố định bởi nhiều phương pháp, bao gồm nhốt vào hệ gel, hấpphụ liên kết cộng hóa tri hoặc sự kết hợp giữa các phương pháp với nhau Việc lựachọn phương pháp cố định phù hợp phụ thuộc vào các liên kết hóa học được tạo ra bởienzyme và chất mang Trong đó, agarose là loại chất mang đã được biết đến với khảnăng tạo gel mạnh ngay cả ở nồng độ thấp Agarose có cấu trúc xốp, tạo điều kiệnthuận lợi cho việc cố định enzyme lrong quá trình tạo gel, hạn chế được sự thay đôihoạt tính của enzyme Tuy nhiên, hiệu suất cố định B-galactosidase vào agarose chưacao Trong khi đó, phương pháp cố định enzyme băng thiolsulfinate- agarose (TSI- gel)cho thấy hiệu quả cố định cao hon TSI-gel tạo ra mạng lưới gồm những liên kết cộnghóa trị 6n định giữa enzyme và chất mang, diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chấtlớn, ngăn chặn khả năng enzyme phát tán vào môi trường và hoạt tính enzyme được énđịnh trong quá trình sản xuất liên tục [11]
Nhận thấy được tầm quan trọng và ý nghĩa thực tiễn của vấn đề trên, chúng tôi thựchiện đề tài “ Cổ định enzyme f-galactosidase vào Thiolsulfinate-Agarose (TSI-gel)
Trang 14và ứng dụng thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose” nhằmkhảo sát hiệu quả cố định của TSI-gel đối với B-galactosidase Qua đó, thiết kế kỹ thuậtlên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose băng chế phẩm -galactosidase cố định.
Mục tiêu chung:
Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ sữa, bao gồm việc sử dụng galactosidase có định để thủy phân lactose có trong sữa nhăm tạo ra dòng sảnphẩm mới dành cho người không dung nap được lactose
ÿ-Nghiên cứu kha năng ứng dụng vào qui trình sản xuất sữa, góp phan hoàn thiệnquy trình sản xuất dòng sản phẩm dành cho người không dung nạp lactose
Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát đặc điểm hóa sinh của B-galactosidase tự doKhảo sát quá trình cố định B-galactosidase bang TSI-gel.Khảo sát động học B-galactosidase tự do và cố định.Khảo sát số lần tái sử dung và nhiệt độ bảo quản chế phẩm enzyme cố định.Thiết kế kỹ thuật lên men liên tục sản phẩm sữa nghèo lactose bằng ÿ-galactosidase cô định trên TSI-gel
Tính mới của đề tài:Tạo chế phẩm enzyme j-galactosidase cô định trên TSI-gel.Khai thác nhu cầu sử dụng sản phẩm sữa không dung nạp lactose trên thị
trường sữa ở Việt Nam.
Giới hạn của đề tài:Dé tài chỉ nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm Thiết kế kỹ thuật lên menliên tục sản phẩm sữa nghèo lactose chỉ dừng lại ở cơ sở lý thuyết
Trang 15CH ONG 1.TỎNG QUAN TÀI LIEU1.1 Tổng quan về B- galactosidase
B-galactosidase (EC 3.2.1.23) còn được gọi là enzyme lactase, là một loại enzymexúc tác cho phản ứng thủy phân đường lactose thành các đường đơn là a-D-glucose và
B-D-galactose Việc sử dụng B-galactosidase để thủy phân lactose có trong sữa và dịchwhey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến sữa và các
sản phâm từ sữa.1.1.1 Phân loại
B-galactosidase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh vật, thực vậtvà động vat Tuy nhiên, B-galactosidase từ những nguồn khác nhau thì thuộc tinh cũngkhác nhau như trọng lượng phân tử, cau trúc không gian, gid trị nhiệt độ tối ưu và pH
tÔô1 ưu.
Thu nhận B-galactosidase có nguồn gốc từ động vật và thực vật thường không manglại giá trị kinh tế Trong khi đó nguồn thu nhận B-galactosidase từ một số vi sinh vậtmang lại giá trị thương mại cao Những lợi thế khi sử dụng nguồn vi sinh vật như dễ xửlý, ty lệ nhân giống cao và năng suất sản xuất cao [26, 44] Nguồn vi sinh vật thu nhậnB-galactosidase đa dạng, được khai thác từ vi khuẩn, nấm và nắm men Một số vi sinhvật được xem là nguồn thu nhận tiềm năng của enzyme -galactosidase được thê hiện ở
bang 1.1.
Ta có thé chia galactosidase từ vi sinh vật làm 2 loại chính dựa vào nguồn gốc galactosidase từ nắm sợi được gọi là B-galactosidase acid Sở di có tên gọi này là vìenzyme này có thé hoạt động tốt trong môi trường pH dao động trong khoảng 3.0- 5.0và nhiệt độ hoạt động từ 50- 60 °C Loại thứ hai có nguồn sốc từ vi khuẩn và nắm menđược gọi là B-galactosidase trung tính vì nó hoạt động trong khoảng pH bang 7.0 vànhiệt độ hoạt động từ 30- 40 °C [26, 44]
Trang 16B-Bang 1.1 Nguồn vi sinh vật thu nhận B-galactosidaseNguồn Vi sinh vật
Alicyclobacillus acidocaldariusBacteriodes polypragmatusBifidobacterium bifidum, B infantisEnterobacter agglomerans, E cloaceaeEscherichia coli
Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus,L helviticus, L.kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus, L.Vị khuẩn delbrueckii
Streptococcus cremoris, S lactis, S thermophiusSulfolobus solfatarius
Thermoanaerobacter sp Thermus rubus, Ï aquaticusTrichoderma reesei; Vibrio cholera; Xanthomonas campestrisAlternaria alternate, A palmi
Aspergillus foelidis, A fonsecaeus, A fonsecaeus, A.carbonarius, A oryzae
Auerobasidium pullulansCurvularia inaequalisMucor meihei, M pusillusNắm Neurospora crassa
Penicillum canescens, P chrysogenum, P expansumSaccharopolyspora rectivergula
Scopulariapsis spStreptomyces violaceusBullera singularis
Nắm men Candida pseudotropicalis
Saccharomyces anamensis, S lactis, S fragilisKluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K marxianus
[42,51]
Trang 171.1.2 Cấu trúc của B- galactosidaseCấu trúc của B-galactosidase khá phức tạp Cấu trúc tinh thé của enzyme này baogồm bốn tiểu phan đơn vị giống hệt nhau Mỗi tiểu đơn vị chứa một chuỗi gồm 1023amino acid Khi cấu trúc này được xác định, nó trở thành một cấu trúc nguyên tử vớichuỗi polypeptide dài nhất.
Hình 1.1 Câu trúc không gian của -galactosidase [38]Trong ruột của con người, B-galactosidase kết hợp với một enzyme khác làphlorizin hydrolase để tạo thành một phức hop enzyme được gọi là lactase- phlorizinhydrolase B-galactosidase trong phức hop enzyme này là phan duy nhất hoạt động
thủy phan lactose [38].
1.1.3 Co chất của B- galactosidase1.1.3.1 Giới thiệu về lactose
Lactose (B-D-galactopyranosyl-(I, 4)-D-glucose) là đường đôi có ở động vật có vú,
ngoại trừ một vài loài, nồng độ trong khoảng 2 — 10% Hàm lượng lactose trung bình ởsữa bò khoảng 4,4 — 5,2 % Lactose là một disaccharide, gdm 2 monosaccharide tao
Trang 18nên là B-galactose và a-glucose hoặc B-glucose liên kết với nhau bởi liên kết B- (144)glucoside Trong sữa, lactose tôn tại dưới hai dạng đồng phân a-lactose và B-lactose.
Hình 1.2 Cầu trúc hóa hoc của a- lactose và B-lactose [1Š |Sự khác biệt của hai đồng phân này là do sự định hướng khác nhau của nhóm -H vànhóm -OH Chính sự khác nhau này dẫn đến sự khác nhau về nhiệt độ pH, nong độcủa dung dịch Dung dịch lactose luôn có sự tồn tại cân băng động giữa hai đồng phântrên Tại nhiệt độ phòng, người ta thấy tỷ lệ giữa hai loại đồng phân này là 40% a-lactose và 60% -lactose Chính sự tồn tại khác nhau về thành phan của hai loại đồngphân trong dung dịch sẽ dẫn đến sự khác nhau về tính chất của lactose như tính chất bềmặt, cấu trúc tinh thé và độ hòa tan [9, 27, 55]
Về độ tan, lactose tan tốt trong nước, tuy nhiên độ tan của nó thấp hơn so với các
loại đường cùng loại khác Độ tan của lactose cũng sẽ tăng theo nhiệt độ Lactose có
thé làm cơ chất phù hop cho vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men và nắm mốc phat triển.Do đó người ta thường dùng lactose như một nguồn carbon trong các quá trình lên mennuôi cây vi sinh vật [9, 27, 55]
Lactose có vị ngọt và là thành phần quan trọng nhất trong sữa, nên lactose còn đượcgọi là đường sữa Do đó, khi sản xuất các sản phẩm đi từ sữa thì người ta rất quan tâmđến hàm lượng lactose trong sữa Ngoài ra, lactose còn là một trong những tá dược
Trang 19được sử dụng rộng rãi nhất trong ngành công nghiệp dược phẩm Có nhiều lý do nóđược sử dụng, chăng hạn như lactose trơ, tương đối rẻ, không độc và lactose có lịch sửlâu dài được áp dụng trong hàng nghìn công thức thuốc trên thế giới [27, 55].
1.1.3.2 Hiện tượng không dung nap lactose
Cơ thể không thể hấp thu được lactose, muốn hấp thu được nó phải bị thủy phânthành các monosaccharide đơn giản hơn là galactose và glucose Muốn thủy phân
lactose ta phải có -galactosidase B-galactosidase được hình thành và hoạt động ngay
từ khi sinh ra và giảm dan trong thời gian cai sữa Tuy nhiên nó vẫn còn tổn tại và cóthé khôi phục lại nếu được dùng sữa Hiện nay có khá nhiều người dân chau A khôngthé hấp thu được lactose Do đó nhu cau các sản phẩm từ sữa có ít hoặc không cólactose cũng được hình thành Muốn thu được các sản phẩm sữa như vậy can phải dùngB-galactosidase dé loại bớt một phan hoặc toàn bộ lactose trong sữa [26, 51]
Có 3 nguyên nhân cơ bản dẫn đến sự bất dung nạp lactose: (A) nguyên phát, (B) thứphát, (C) bam sinh
(A) Nguyên phát: Đây là nguyên nhân thường gặp nhất của bất dung nạp lactose dothiếu lactase tương đối, xuất hiện ở trẻ em vào những độ tuổi khác nhau trong những
nhóm chung tộc khác nhau.
(B) Thứ phát: Do tôn thương ruột non sau viêm da dày ruột do siêu vi (Rotavirus),trẻ bị bất dung nạp lactose thoáng qua, có thể hồi phục sau khi vấn đề bệnh viêm dạdày ruột đã được giải quyết hoặc trẻ bị tiêu chảy kéo dài dẫn đến niêm mạc ruột tốnthương, men lactase không sản sinh đủ nên cơ thể trẻ không thé hap thu được lactosedẫn đến triệu chứng bat dung nạp Khi ấy sẽ khiến cho tình trạng tiêu chảy kéo dai vàtram trọng hơn là trẻ bị suy dinh dưỡng, và khi trẻ bị suy dinh dưỡng thì lượng menlactase càng giảm, vì vậy suy dinh dưỡng và tiêu chảy là vòng luan quan khó giảiquyết
(C) Bam sinh: Nguyên nhân này rất hiếm gặp, biểu hiện ngay sau sinh do rối loạn
nhiém sac thê, gây ngăn can sản xuât men lactase.
Trang 20Để tăng dung nạp lactose trong sữa, lý tưởng nhất là tăng sinh tổng hợp đượcenzyme này ngay trong cơ thể người Tuy nhiên con đường này rất khó khăn Enzymetừ nguồn vi sinh vật vẫn là nhu cầu trước mắt Tuy nhiên phải chọn loại enzyme cóhoạt động pH tối ưu tương tự như sữa dé tránh hiện tượng đông tụ sữa [9, 15, 27].1.1.4 Cơ chế xúc tác của B- galactosidase lên lactose
B-galactosidase là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân lactose thành B- galactose và a- D-glucose B-galactosidase thủy phân tác dụng lên nhóm O-glucosylcủa lactose.
D-i 4 5 LH | Ti galactosyÌ ẾuudbŠ—O 0# S| ¡ Thủy phan
GH;OH nucleophile \ galactose
Sản pham chuyên hóa glucose
Hình 1.3 Phan ứng thủy phân lactose bởi B-galactosidase [55]
Vi trí hoạt động của B-galactosidase đã được dé xuất và được chấp nhận rộng rãitrong những năm gan đây Dư lượng acid glutamic được dé xuất là vị trí hoạt động B-galactosidase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau có hai dư lượng acid glutamic(chăng hạn như Glu482 và Glu551) là vị trí cho proton và nuclephile/base (nhận
proton) cùng thời gian trong phản ứng enzyme [55].
Các cơ chế phản ứng: Bước đầu tiên là hình thành phức hợp enzyme-galactosyl vàđồng thời giải phóng glucose Trong bước thứ hai, phức hợp enzyme-galactosyl được
Trang 21chuyển cho cấu tử nhận chứa một nhóm hydroxyl Mặc dù các enzyme có nguôn gốc từcác vi sinh vật khác nhau thì có thuộc tính khác nhau như trọng lượng phân tử, chiềudài chuỗi protein, và vị trí hoạt động nhưng có cùng một dư lượng acid amin, acid
glutamic là vị trí xúc tác của enzyme [25, 55].
1.2 Tổng quan về enzyme cố định1.2.1 Khái niệm về enzyme cố định
Enzyme cố định là enzyme được giới hạn hay khu biệt vé mặt vật lý ở một vùngkhông gian nhất định nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thê tái sử dụng nhiềulần [20]
Ưu điểm của enzyme cô định:e Khả năng tái sử dụng: enzyme có định có thé được sử dụng lại nhiều lần, quá
trình xúc tác có thé xảy ra liên tục và có thể được kiểm soát triệt để nên việcsử dụng enzyme cố định kinh tế hơn so với enzyme hòa tan
e Sản phẩm của quá trình chuyển hóa có thé được tách ra dễ dàng trong khivẫn giữ được các đặc tính của enzyme
e Có thé thay đổi các đặc tính hóa lý như độ ôn định, pH tối ưu, khả năng chịunhiệt và tính đặc hiệu Sự thay đôi này phụ thuộc vào phương pháp cố định
hoạt tính của chúng ở nhiệt độ cao trong thời gian đài và do có nhiệt độ hoạt động cao
nên quá trình ít bị ảnh hưởng bởi sự nhiễm khuẩn Các thông số quan trọng của một
Trang 22enzyme cố định cần có: nguồn enzyme thu nhận, giá cả chất mang hay các hóa chất cỗđịnh, hoạt tính, độ bên va khả năng tái sử dụng.
1.2.2 Các phương pháp cố địnhB- galactosidase được cố định vào nhiều hệ chất mang bởi nhiều phương pháp khácnhau, bao gồm phương pháp liên kết cộng hóa trị, phương pháp hấp phụ vật lý, phươngpháp bao gói và phương pháp bay Do mỗi phương pháp đều có những ưu điểm vàkhuyết điểm riêng, nên việc lựa chọn phương pháp cố định phù hợp phụ thuộc vào đặcđiểm của enzyme (sự khác biệt về loại B- galactosidase như trọng lượng phân tử, chiềudài chuỗi protein và vị trí trung tâm hoạt động), chất mang điều kiện phản ứng và thiết
bị phan ứng [49].
1.2.2.1 Phương pháp liên kết cộng hóa trịTrong phương pháp này, các enzyme được duy trì trên bề mặt chất mang băng sựhình thành các liên kết cộng hóa trị Các phân tử enzyme liên kết với chất mang bằng
các nhóm chức năng như amino, carboxyl, hydroxyl và sulfydryl Các nhóm chức năng
này không thuộc trung tâm hoạt động của enzyme Phương pháp được khuyến khíchthực hiện là cố định enzyme với sự có mặt của cơ chất hay chất ức chế cạnh tranh củaenzyme để bảo vệ trung tâm hoạt động Các nhóm chức năng của chất mang thườngđược hoạt hóa băng các tác nhân hóa học như cyanogen bromide, carbodimide và
ølutaraldehyde.
B- galactosidase thường được cố định chủ yếu bởi phương pháp này Enzyme đượcliên kết bởi các liên kết cộng hóa tri nhờ vào sự hỗ trợ của những nhóm cấu trúc trênenzyme, những nhóm này không ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme Sosánh với những phương pháp cố định khác, phương pháp này mang lại nhiều lợi ích:enzyme không bị rửa trôi hay tách ra khỏi chất mang, hoạt tính xúc tác được thực hiệndễ dàng vì enzyme được gắn trên bề mặt chất mang Nhược điểm lớn nhất của phươngpháp là chi phí cao và hoạt tính enzyme sẽ giảm khi phản ứng với những chất gây ứcchế hoặc trong điều kiện phản ứng khắc nghiệt [49]
Trang 23L n Kích hoạt °
NH NH» ae ios TM~ NHÀ } N “ADO Enzyme
Amino resin Resin được kích hoạt
F
Enzyme được có định bang liên kết cộng hóa trị
Hình 1 4 Liên kết cộng hóa trị giữa chất mang và enzyme [31]Liên kết Disulphi de
Liên kết disulphite thường được áp dụng cho cố định enzyme và có thể được xemnhư là một dạng của liên kết cộng hóa tri, có những liên kết hóa trị 6n định hình thànhgiữa chất mang và nhóm thiol tự do (ví dụ như cysteine) Tuy nhiên, những liên kết cóthé dễ dàng bị phá vỡ băng cách sử dụng các tác nhân phù hợp Dithiothreitil (DTT) làmột tác nhân phô biến nhất cho việc thủy phân liên kết disulphide
Vật liệu làm chất mang có thể được kích hoạt băng cách sử dụng các tác nhân hóahọc như maleimide hoặc iodoacetyl để kích hoạt silica [22, 24] hoặc băng cảm ứng
quang tử [35].
1.2.2.2 Phương pháp hấp phụ vật lýĐây là phương pháp cố định đơn giản nhất, các chất xúc tác sinh học được giữ trênbề mặt của chất mang không hòa tan trong nước bằng các liên kết vật lý như liên kếtVanderwaals Ngoài ra còn có các liên kết khác giữa chất mang và chất xúc tác sinhhọc như các tương tác ky nước, câu hydrogen và liên kết ion
Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện và ít ảnh hưởng lên cấu tạo của chấtxúc tác sinh học Nhược điểm của phương pháp là lực liên kết hấp phụ tương đối yếu
Trang 24nên enzyme dễ bị giải hấp phụ khi thay đôi nhiệt độ, pH, lực ion hoặc sự có mặt của cơchất Ngoài ra, những chất lạ cũng có khả năng hấp phụ vào chat mang, có thé gây ranhững van để khác nhau bao gồm cả việc làm biến tinh enzyme.
Các chất mang sử dụng trong phương pháp hấp phụ gồm chất mang vô cơ nhưalumina, silica, thủy tinh xốp, gdm, đất sét Chất mang hữu cơ như cellulose, tỉnh bột,than hoạt tính, nhựa trao đổi ion như Amberlite, Sephadex, Dowex Sự hấp phụenzyme có thé được ôn định khi xử lý băng glutaraldehyde [39]
Hình 1.5 Enzyme được cố định băng phương pháp hấp phụ trên bề mặt [30]B- galactosidase thường được hấp thụ trên nhựa phenol- formaldehyde, vật liệu xốpceramic và giữa các phân tử có liên kết ngang với glutaraldehyde Ngoài ra, một sốchất mang được dùng dé hấp thụ B- galactosidase đã được nghiên cứu như celite, cáchạt zeolite, vai bông không thâm nước và chromosorb W [49]
1.2.2.3 Phương pháp bao gói
Là phương pháp nhốt enzyme trong một không gian nhỏ Bao gói mạng lưới và baogói màng (bao g6m vi gói) là các phương pháp bao gói chính
Ưu điểm chính của kỹ thuật này là tính đơn giản, trong đó, các phan tử hình cauđược thu nhận thông qua sự nhỏ giọt dịch treo polymer- tế bào vào môi trường chứa
Trang 25các ion tích điện dương hay băng phương pháp polymer hóa nhiệt Nhược điểm chínhcủa kỹ thuật này là có sự thất thoát enzyme trong suốt quá trình sử dụng liên tục dokích thước enzyme nhỏ Tuy nhiên, nhược điểm này có thể được khắc phục bằngphương pháp liên kết thích hợp.
Chất mang thường được sử dụng là các vật liệu polymer như Ca-alginate, agar,
K-carragenin, polyacrylamide và collagen.
Một số chất mang răn cũng có thể được sử dụng như than hoạt tính, gốm xốp Đốivới phương pháp bao gói màng, chất mang thường được sử dụng là nylon, cellulose,
polysulfone và polyactyamide [39].
1.2.2.4 Phương pháp bayPhương pháp bẫy là một phương pháp không thể đảo ngược, nơi các hạt cố địnhhoặc tế bào bị kẹt trong một ma trận chất mang hoặc sợi bên trong
Những nhược điểm của loại cố định này thường là chi phí của cố định, hạn chếkhuếch tán, giảm hoạt tính trong quá trình hoạt động và chất mang không bền trong
Trang 26phụ có thể được thực hiện chỉ trên bề mặt bên ngoài Mặt khác, khi kích thước hạt quálớn, khả năng hấp phụ bị giảm tải [22].
Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu nhăm kiểm soát sự sap xếp hat trong ma trận gel.Trong số đó có thể tìm thấy các thử nghiệm thực hiện với sóng siêu âm, mà không làmgián đoạn khả năng di động của nắm men, bảo vệ các tế bào động vật có vú hoặc hồngcầu [34] Có thể sử dụng các polyme sau như một ma trận cố định: alginate,
carrageenan, collagen, polyacrylamide, gelatin, cao su silicon, polyurethane, polyvinylalcohol với các nhóm styrylpyridium.
Chúng tôi lựa chọn phương pháp cố định B-galactosidase băng liên kết cộng hóa trigiữa gốc thiol của enzyme và gốc disulfide oxide của chất mang nham khai thác các ưuthế của phương pháp cố định này như tạo ra mạng lưới gồm những liên kết cộng hóa trị6n định giữa enzyme và chất mang, diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất lớn,
ngăn chặn hiệu quả khả năng enzyme phát tán vào môi trường và hoạt tính enzyme
được 6n định trong quá trình sản xuất liên tục.1.3 Tổng quan về chất mang cố định enzyme
1.3.1 Giới thiệu chung
Các tính chất của chất mang đóng vai trò quan trọng trong hệ thống enzyme cốđịnh Một số đặc điểm lý tưởng của chất mang như khả năng tương thích sinh học, khảnăng kháng khuẩn, trơ với enzyme và chi phí thấp luôn được khai thác triệt để Đểđánh giá hiệu quả của sự có định, có thể dựa vào các chỉ số sau: độ bền cơ học của chấtmang, được đánh giá trên co sở chúng có sức chịu đựng ở pH, nhiệt độ: hiệu suất cốđịnh và số lần tái sử dụng Chất mang dùng cố định enzyme có thể được chia thành hainhóm lớn: chất mang vô cơ và chất mang hữu cơ (gồm polymer sinh học và polymertổng hợp) [39, 54]
e Chat mang võ cơ:
Là những loại vật liệu có câu trúc lỗ xốp, kích thước các lỗ này có thé điêu chỉnhđược Loại vật liệu này có khả năng hấp thụ tốt các enzyme và tế bào Thông dụng là
Trang 27các vật liệu thủy tinh XỐp, vật liệu oxide kim loại (oxide nhom, oxide mangan, oxidemagie, oxide titan) và các vật liệu khác như diatomide (celit) và gốm [21, 31].
e Chat mang hữu cơ: g6m polymer sinh học và polymer tổng hợp:+ Chất mang polymer tổng hợp:
Gồm một số polymer thường dùng như: polystyrene, polyvinylacol, polyacryamid,polyvinylacetate, polyacrylic Hầu hết các polymer tổng hợp được dùng cố địnhenzyme và tế bào băng phương pháp nhốt trong lòng chất mang [17, 31] Tuy nhiênphương pháp hấp thụ hay liên kết cộng hóa trị vẫn được nghiên cứu khi sử dụng loạichất mang này cố định enzyme hay tế bào
+ Chất mang polymer tự nhiên (polymer sinh học):Chất mang polymer tự nhiên gdm chất mang protein và chất mang polysacharid.Trong đó, các chất mang protein phải ké đến như gelatin, keratin và albumin Phươngpháp cố định chủ yếu với loại chất mang này là nhốt enzyme vào trong cấu trúc gel.Trong những năm gan đây có một số công trình nghiên cứu tiến hành ghép gelatin vớimột số polymer tổng hợp như polyhydrosyethylmethacrylate mang lại nhiều lợi ích choquá trình cố định enzyme và tế bào
Đối với chất mang polysacharid, phải kế đến như cellulose, agarose, sephadex vàmột số dẫn xuất của chúng Trong đó, cellulose là một trong các loại chất mangpolymer sinh học phổ biến nhất Cellulose là vật liệu đầu tiên được sử dụng để cố địnhenzyme Các gốc hydroxyl của cellulose không đủ mạnh để hình thành liên kết cộnghóa tri với enzyme, nhưng chúng có thể được cải thiện nhờ vào sự can thiệp của cácphương pháp hóa học Ngoài ra, còn có một số vật liệu mới có nhiều triển vọng là tinh
bột, chitin, alginate, carrageenan, carboxymethylcellulose (CMC) [17, 31].
Trang 28Bang 1.2 Các phương pháp cố định B-galactosidase
Phương phápcô định
Nguôn gôc B-galactosidaseChât mang cô định
Cộng hóa tri
Escherichia coliGelatineKluyveromyces lactisThiosulphate-thiosulphonateBacillus circulansEupergit-C
Kluyveromyces lactisGraphite surfaceAspergillus oryzaeChitosan granules va Nylon
membranesAspergillus oryzaePVA hydrogel và chitosan
magnetic particles
Hap phu vatly
Kluyveromyces fragilis vaKluyveromyces lactis
Chitosan
Aspergillus oryzaePhenol-formaldehyde resinAspergillus oryzaePVC va silica gel membraneEscherichia coliChromosorb-W
Bacillus circulansPVC va silicaBacillus stearotermophilusChitosan
Phuong phapbao gói
Kluyveromyces bulgaricusBaCl, alginateEscherichia coliPolyacrylamide gelAspergillus oryzaeNylon-6 va zeolite
Thermus aquaticum YT-1Agarose granulePenicillium expansum F3Calcium alginate
[39]Để cố định enzyme -galactosidase, có nhiều chất mang được lựa chon Nhưng mỗiloại chất mang khác nhau mang lại hiệu quả cố định khác nhau Mặt khác, việc đánh
giá hiệu quả cô định enzyme, có thê dựa vào các tiêu chí sau: độ bên cơ học của chât
Trang 29mang (độ bên pH và bên nhiệt), hiệu suất cố định và số lần tái sử dụng Trong đó, cácchất mang polymer sinh học hay có nguồn gốc là polymer sinh học như agarose và
thiolsulfinate-agarose được đặc biệt quan tâm.
1.3.2 Chất mang agaroseAgarose là một polysaccharide tự nhiên được chiết xuất từ tế bào của một số loạitảo Rhodophyceae Được tạo thành bởi các đơn vị cơ bản của agarobiose liên kết nhauvà được chiết xuất từ agar băng cách loại bỏ agaropectine [7.41]
1.3.2.1 Câu trúcAgarose là một polymer tự nhiên mạch thăng với trọng lượng phân tử khoảng120.000, bao gồm liên kết giữa 3-O-B-D galactopyranose và liên kết 4-O-3 ,6- anhydro-ø-L-galactopyranose bởi các liên kết a-(1 —> 3) và B-(1 — 4)- glycosidic Trong đó,3.6-anhydro-L-galactopyranose là một L-galactose có cau liên kết anhydro giữa vị trí 3và 6 Một disaccharide bao gồm liên kết 1.3- galacto-pyranose và liên kết 1.4 với 3.6-
anhydro- L- galactopyranose [41].
— —
HO O OHHO oO ~
HO O OH ~o +O+
Oo
Oo :HO xo ` Me OH
~⁄ oO
OH
Hình 1.7 Câu trúc của agarose [41 |Mỗi chuỗi agarose chứa khoảng 800 phân tir galactose và các chuỗi polymeragarose có hình sợi xoắn ốc được tổng hợp thành cấu trúc siêu xoắn với bán kính 20-30 nm [52].Các sợi được liên kết cứng nhắc và có độ dài tùy thuộc vào nồng độagarose [7| Khi các liên kết được hình thành vững chắc, các sợi tạo thành một lưới bachiều có đường kính từ 50 nm đến hơn 200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose sửdụng Cấu trúc 3-D được sắp xếp cùng với các liên kết hydro và do đó có thé bị phá vỡbằng cách nung nóng trở lại trạng thái lỏng
Trang 301.3.2.2 Tính chấtAgarose thương mại là một loại bột màu trăng, hòa tan trong nước nóng và tạo
thành gel khi nó nguội đi Gel agarose nóng chảy ở nhiệt độ khác nhau tùy thuộc vào
loại agarose Agarose tiêu chuẩn có nguồn gốc từ Gelidium có nhiệt độ tạo gel từ 38 °C và nhiệt độ nóng chảy là 90- 95 °C, trong khi các gel có nguồn gốc
35-từ Gracilaria có nhiệt độ tạo gel là 40- 42 °C và nhiệt độ nóng chảy 85- 90 °C Nhiệt
độ tạo gel và nhiệt độ nóng chảy có thể phụ thuộc vào nông độ của gel, đặc biệt là ởnồng độ thấp, dưới 1% [7 41 52]
Cấu trúc hóa học của agarose đã tạo ra một khả năng tạo gel rất mạnh ngay cả khi ởnồng độ thấp Agarose thé hiện là một chất mang tuyệt vời, với độ xốp cao góp phannâng cao hiệu suất cố định protein vào trong nó Thém một lợi thế của việc sử dụngagarose làm chất mang là khả năng ưa nước, dễ dẫn xuất Sự văng mặt của các nhómphân cực giúp ngăn ngừa hấp phụ không đặc hiệu của cơ chất và sản phẩm Ngoài ra,nhiệt độ tạo gel thấp (35- 42 °C) và nhiệt độ nóng chảy cao cua agarose (85- 95 °C) làmột yếu tổ quan trọng khi được sử dụng làm chất mang có định [7 41,52]
1.3.3 Chất mang thiolsulfinate- agarose
1.3.3.1Giới thiệu
Thiolsulfinate- agarose (TSI- gel) được tạo ra từ các phản ứng hình thành gốc liênkết thiolsulfinate và sau đó được gắn trên những hạt agarose Ban dau, các hạt agaroseđược phản ứng với chất khử enpichlorohydrin C;H;CIO_ trong môi trường kiềm để tạo
thành epoxy- agarose Sau đó epoxy- agarose phan ứng với sodium thiosulfate va DTT
dé tao thanh thiol- agarose Tir thiol- agarose, dé tao thanh TSI- gel thi phai qua haigiai đoạn phan ứng: Dau tiên, phan ứng oxy hóa của nhóm liên kết thiol-agarose thànhcau trúc disulfide với potassium ferricyanide; Giai đoạn hai, duy trì phản ứng oxy hóacủa agarose- disulfide dé hình thành nhóm thiosulfinate được thực hiện bằng cách sửdụng tác nhân oxy hóa là magnesium monoperoxyphthalate Số lượng nhómthiosulfinate hình thành có thể được điều chỉnh băng cách chọn một tý lệ phân tử phù
Trang 31hợp giữa các tác nhân oxy hóa và nhóm chức năng disulfide trên gel agarose Chính vì
thế mà việc tạo nhóm liên kết thiosulfinate- agarose trở nên quan trọng khi sử dụngchất mang này cố định enzyme
Các liên kết thiosulfinate- gel thường 6n định ở khoảng pH từ 3.0- 8.0 Do đó, pharắn mang theo các nhóm cau trúc trên có thé được lưu ở nhiệt độ 4 °C ở pH là 5.0 dùngcho thời gian dài mà không làm giảm số lượng các liên kết Mặc khác, disulfide oxidegel không can phải thêm chất bảo quản bởi vì không có sự phát triển của vi khuẩn haynam khi lưu ở4”C tại pH 5.0 [1 1]
Sử dụng TSI- gel để cố định B-galactosidase là dựa trên cơ sở liên kết cộng hóa trỊgiữa gốc thiol của enzyme và cấu trúc phản ứng disulfide oxide trên agarose- gel [10,11] Lợi ích từ việc cố định B-galactosidase băng TSI- gel có thê kể đến như: nhờ cácliên kết cộng hóa trị giữa enzyme và chất mang mà enzyme trở nên 6n định hơn khi
tham gia phản ứng thủy phân và khả năng enzyme bị thoát ra ngoài môi trường phản
ứng được giảm tối thiểu; enzyme còn có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn so vớienzyme tự do nhờ được bảo vệ bởi lớp agarose- gel chịu nhiệt Ngoài ra chế phẩm cốđịnh còn có khả năng tái sử dụng nhiều lần là một lợi ích quan trọng trong quy mô sảnxuất công nghiệp
Trang 321.3.3.2 Phương pháp tạo TSI-gel
Bước 1: Tạo pha ran thiol- agarose: Phương pháp tao pha ran thiol-agarose được pháthiện bởi Axén va cộng sự [II] Trong phương pháp này hat agarose dau tiên đượcphản ứng với enpichlorohydrin C,H;CIO trong môi trường kiềm Các gốc Oxiraneđược hình thành sau đó sẽ được chuyên đổi với sodium thiosulfate thành các liên kếtthiosulfate-gel Các liên kết này sẽ được giải phóng thành các nhóm thiol khi cho
Hình 1.10 Nhóm thiol bi oxy hóa băng K;Fe(CN), tạo thành cấu trúc disulfide [11]
Bước 3: Tạo thiolsulfinate-agarose (TSI-Gel): S,- gel trong dung dịch đệm sodium
acetate 0.2 M, pH 5.0 tiếp tục tham gia phản ứng oxy hóa cau trúc disulfide thànhthiolsulfinate Yêu cau đặt ra ở đây là phải bổ sung Magnesium monoperoxyphthalate
Trang 33(MMPP) CgH,Mg0Os; làm tác nhân oxy hóa Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng (22- 25°C) và lắc đều trong suốt 2 giờ.
enzyme chứa nhóm thiol.
1.4 Tổng quan về thiết bị phản ứng sinh học dành cho enzyme thủy phân lactoseNgày nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, các thiết bị phản ứngsinh học dành cho enzyme thủy phân đường lactose phát triển đa dạng, đa tính năngphù hợp với nhu cầu nghiên cứu cũng như sản xuất Tuy nhiên, để lựa chọn thiết bịphản ứng phù hợp, người ta dựa vào đặc điểm của enzyme cố định và đặc điểm của quimô ứng dụng Trên thế giới, có ba loại thiết bi phan ứng sinh học được sử dụng phổbiến để thủy phân lactose như packed bed reactor (PBR), fluidized bed reactor (FBR)
và membrane reactor (MR).
1.4.1 Thiết bi phản ứng packed bed reactor (PBR)Thiết bi PBR là một loại thiết bi phản ứng sinh học phô biến nhất hiện nay cho thủyphân lactose bang enzyme cố định Trong thiết bi PBR các hạt enzyme cố định sẽ được
Trang 34bố trí trong một hoặc nhiều cột hướng theo dòng chảy của lactose sữa được bơm vào.Thông thường, enzyme được cố định với đường kính từ 1-3 mm Thiết bị PBR chohiệu suất phản ứng sinh học khá cao khi thê tích phản ứng càng lớn.
Nhược điểm của chính của PBR là nhiệt độ và pH khó điều chỉnh, đặc biệt là đối
với các cột phản ứng có đường kính lớn hơn 15 cm (Lilly và Dunnill 1976) [33].Các nghiên cứu ứng dụng:
Năm 2001, Zhou và Chen đã báo cáo có đến 90 % lactose được thủy phân khi chodòng sữa tươi chảy qua các cột chứa day enzyme cô định băng than chi đặt trong thiếtbi PBR Theo nghiên cứu của nhóm tác giả thì thiết bị PBR chứa 750 em” lớp than chì(kích thước là 3mmx 60 mm x 300 mm) với B-galactosidase được hấp thụ trên bề mặt(0.63- 1.3 mg enzyme trên | cm’ bề mặt than chì) Thiết bi này được sử dụng dé thuyphân liên tục lactose trong sữa tuoi (hàm lượng lactose 20 g/l), với tốc độ dòng sữachảy qua các cột chứa enzyme cố định trên than chì là 7 ml/ phút thì trong 15 phút quátrình này chuyển hóa được 90 % lactose [56]
Theo nghiên cứu cua Siso va cộng sự (1994) sử dụng thiết bị PBR tuần hoàn đểthủy phân lactose trong sữa với tốc độ dòng chảy là 0.8 ml/ phút Thiết bị phản ứngđược lấp day bởi 0.19 g chế phẩm ÿ-galactosidase liên kết cộng hóa trị vớiglutaraldehyde Hệ thống này được sử dụng đến 5 lần khi hoạt tính enzyme không matđi Hiệu suất thủy phân được ghi nhận sau 3 giờ là 50 % |47]
Một nghiên cứu khác của Szczodrak (2000) khi sử dụng thiết bị PBR dé thủy phânlactose có trong whey được báo cáo Có đến 90 % lactose được thủy phân trong hệthống tuần hoàn PBR với B-galactosidase từ K fragilis được cố định vào silanisedporous glass Trong đó dich whey (5% lactose) được tuần hoàn trong những cộtenzyme trong 48 giờ với tốc độ dòng là 0.3 ml/ phút và thời gian lưu là 20.6 phút [48]
Trang 351.4.2 Thiết bị phản ứng fluidized bed reactor (FBR)Trong thiết bị fluidized bed reactor, dòng chất lỏng đi vào được day lên trên cộtenzyme cố định với tốc độ đủ lớn dé làm các hạt trở nên lo lung Tuy nhiên, tốc độdòng đi vào không quá cao vì các hạt có thể bị cuốn ra ngoài theo dòng sản phẩm.Những hạt enzyme cố định thường khá nhỏ (thường có đường kính là 20- 40 mm) vàcó mật độ khá lớn để khắc phục hiện tượng thoát enzyme ra ngoài theo sản phẩm.
Sử dụng thiết bị fluidized bed khác với thiết bị packed bed, FBR cho phép sử dụngenzyme cố định không cần tiền xử lý Phản ứng thường tỏa nhiệt cao, nhiệt độ đượcphân bố đều trong toàn thiết bị
Nhược điểm chính của FBR là rất khó mở rộng qui mô và khả năng sử dụng bị hạnchế vì giá thành cao [40]
Các nghiên cứu ứng dụng:
FBR lần đầu tiên được nghiên cứu ứng dụng vào năm 1978 bởi Coughlin và cộngsự khi thử nghiệm phản ứng thủy phân whey Thiết bị phan ứng chứa -galactosidasethu nhận từ A niger được cố định trên vật liệu xốp alumina và liên kết ngang với
glutaraldehyde [16].
Nhóm tác giả Rupta đã nghiên cứu phản ứng thủy phân lactose khi tuần hoàn wheysữa và sữa nguyên kem Thiết bị phản ứng chứa B-galactosidase cố định trên
epichchlorohydrin kích hoạt trên sợi cellulose Whey sữa (90 ml) được cho vào một cột
tầng sôi chứa day sợi cellulose (khoảng 5 ml) với enzyme được cố định trên đó (hiệusuất cố định dat được 50 %) Với tốc độ dòng chảy khoảng 2 ml/ phút, dòng sản phẩmđược tái tuần hoàn qua cột Kết quả đạt được là sau 30 gid, khoảng 94 % lactose đượcchuyển hóa Tương tự, nhóm tác giả đã sử dụng thiết bị trên để thủy phân lactose trongsữa nguyên chất Nhưng hiệu quả thủy phân chỉ đạt được 60 % do sự hiện diện củachất béo trong sữa làm giảm hiệu suất của các tầng sôi trong FBR [26, 43]
1.4.3 Thiết bi phản ứng membrane reactor (MR)
Trang 36Thiết bị phản ứng membrane reactor có một lớp màng membrane được ngâm trongmột bể khuấy, trong đó enzyme cố định được chứa trong một buồng chứa Cơ chất
được di chuyên vào trong và sản phâm di chuyên ra ngoài.Các ưu điêm chính: Sử dụng được trong các hệ thông sản xuât liên tục với áp suâtthâp và nông nộ enzyme cao.
Khuyết điểm: So với PBR, enzyme ít ốn định do bị ảnh hưởng của quá trình rửathường xuyên Ngoài ra, phương pháp này tốn chi phí vì màng phải thường xuyên đượcthay Một bất lợi phải được ké đến là giới hạn kích thước màng ảnh hưởng lên sựkhuếch tán |43]
Các nghiên cứu ứng dụng:
Nghiên cứu của Bakken và cộng sự (1990) khi sử dụng MR để thủy phân lactose cótrong sữa tươi và whey Nhóm tác giả sử dụng B-galactosidase từ A oryzae cỗ địnhtrên màng polyvinylchloride và silicagel Nhóm tác giả cho rang nghiên cứu có thé ứngdụng với qui mô nhỏ Tuy nhiên enzyme mat ôn định do quá trình rửa enzyme [9]
1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước1.5.1 Các nghiên cứu trong nước
Các nghiên cứu về cố định enzyme ở Việt Nam chưa phố biến và được xem làhướng nghiên cứu mới, chưa ứng dụng nhiều trong thực tiễn và kết quả thu được cònhạn chế Nhưng gan day, dưới su tiép cận khoa hoc công nghệ tiên tiến trên thế giới, đãcó nhiều thử nghiệm về cố định enzyme thu nhận từ tế bào vi sinh vật, thực vật và độngvật Các nghiên cứu liên quan đến B-galactosidase tự do và cô định có thê kế đến:
Nam 2006, Nguyễn Thu Hà và cộng sự nghiên cứu sự biếu hiện của J-galactosidase
ở hai chung Lacfobacilus reuteri L103 va L461 Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản,
cho thay hai enzyme biểu hiện ở hai tiểu phan (2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35
kDa va 85 kDa) Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, từ pH 3.8 — 4.0
Trang 37(chủng L461) và pH 4.6 — 48 (chủng L103) Kết quả nghiên cứu này sau đó được trìnhbày tại Hội nghị lần thứ V, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội, 2006 và đãđăng trong tạp chí quốc tế Nhóm tác giả này về sau có một số nghiên cứu tinh sạchenzyme dé sử dụng tông hợp galactooligosaccharides mang hoạt tính sinh học [5].
Năm 2007, Đặng Thị Thu và cộng sự tuyên chọn và nghiên cứu điều kiện lên mensinh tong hợp B-galactosidase từ chủng nắm mốc Aspergillus oryzae Nhóm tác giả nàyđã tuyên chọn được 3 chủng Asp oryzae từ 29 chủng nắm mốc Aspergillus, thu thập từphòng thí nghiệm Hóa Sinh — Viện Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm — DHBách khoa Hà Nội có khả năng sinh tổng hợp B-galactosidase cao hơn và cao nhất làAsp oryzae 3 Môi trường phù hợp cho lên men chìm sinh tổng hợp B-galactosidasecủa chủng Asp oryzae 3 là MT4, với nguồn carbon thích hợp là lactose (30 g/l), nguồnnito là pepton 2 g/l và NH,NO; 0.5 g/l, pH dau là 7, thời gian lên men 72 giờ Nhómtác giả trên cũng đã khảo sát các điều kiện thích hợp cho phan ứng transgalactosyl sửdụng B-galactosidase Aspergillus oryzae 3 dé sản xuất galacto-oligosaccharide (GOS)từ lactose (2009) và đã thu được kết quả là lactose 60 %; enzyme 7 U/ml; pH là 5,5;nhiệt độ 55 °C: 8 giờ thu chế phẩm ở dạng lỏng, sấy phun, thu chế phẩm GOS dạng bộtvà đánh giá chế phẩm thu được có hàm lượng oligosacchatide det trên 50 % [1]
Năm 2012, Mai Thanh Truyền và cộng sự đã nghiên cứu tạo chế phẩm galactosidase cố định trên phức chất mang CMC- alginate cho hiệu suất thủy phânlactose trong sữa lần thứ nhất đạt 90.69 % và sau 12 lần tái sử dụng hiệu suất còn lại61.1 % Nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định là 50 °C, pH tối ưu là 7.5 với tỷ lệalginate/CMC thích hop để cé định B-galactosidase là 1/1 [3]
B-Các nghiên cứu ở Việt Nam về enzyme -galactosidase tự do và cố định chỉ ở mứcđộ nghiên cứu cơ bản, các nghiên cứu định hướng ứng dụng enzyme có định trong thựcphẩm còn rất hạn chế, đặc biệt chưa có nghiên cứu sản xuất quy mô pilot và chưa cósản phẩm B-galactosidase nào mang thương hiệu Việt Nam
Trang 381.5.2 Cac nghiên cứu ngoài nước
Năm 1991, nghiên cứu của Batista-Viera và cộng sự đã chỉ ra răng thiol-agarose cóthé được chuyên đổi thành thiolsulfonate-agarose (TS-gel) hay thiolsulfinate- agarose(TSI-gel) bằng các phản ứng oxy hóa khác nhau Theo đó, quá trình oxy hóa thiol-agarose với chất khử peroxide tại điều kiện pH acid và nhiệt độ phòng để kéo dài quátrình chuyển đổi nhóm thiol trên chất mang thành thiolsulfonate (disulfide dioxide)[10] Năm 1994, Batista-Viera và cộng sự tiếp tục nghiên cứu nhóm thiolsulfinate(disulfide monoxide), nhóm nghiên cứu đã chi ra rằng thiolsulfinate được tạo ra bởiquá trình oxy hóa thiol-agarose Phương pháp này gồm hai bước: đầu tiên là phản ứngoxy hóa các liên kết gốc thiol- agarose thành cấu trúc disulfide với potassiumferricyanide: sau đó, tiếp tục kiểm soát quá trình oxy hóa của nhóm agarose-disulfideđể hình thành thiolsulfinate với sự hiện diện của magnesium monoperoxyphthalate[11] Năm 1996, Batista-Viera và cộng sự nghiên cứu về các liên kết cộng hóa tri củathiol dựa vào mối nối thiolsulfinate- chất mang, nhóm nghiên cứu cho rằng việc tạogốc thiol với các chất mang khác nhau cũng tương tự như vật liệu đã được báo cáo như
agarose, ngoại trừ vật liệu làm từ sợi thủy tinh.
Nam 1993, Brena và cộng sự nghiên cứu sự chuyển đổi của nhóm thiol để cố địnhB- amylase từ khoai lang vào thiolsulfonate-agarose Khi enzyme thiếu đi nhóm hoạtđộng —SH, enzyme có thé tạo ra-SH từ nhóm de novo thiol băng quá trình thiol hóasử dụng thuốc thử heterobifunctional phù hợp [14]
Nam 1994, Carrara và cộng sự đã nghiên cứu cố định B-galactosidase từKluyeromyces fragilis trên chitosan băng liên kết cộng hóa trị với glutaraldehyde Kết
quả thu được khi có sự tăng pH và nhiệt độ thì hoạt tính enzyme cao hơn so với
enzyme ban đầu [20]
Năm 1995, nghiên cứu của Ovsejevi và cộng sự vê cô định B-galactosidase cónguôn gôc từ E.coli vào thiolsulfonate agarose Nhóm nghiên cứu đã chỉ ra việc cô
định B-galactosidase có nguồn gốc từ E.coli vào thiolsulfonate agarose và thiolsulfinate
Trang 39agarose thé hiện hiệu suất cố định hơn 80% và phan trăm hoạt tinh cao hơn [37] Nhómnghiên cứu của Ovsejevi và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về sự cố định của enzyme B-galactosidase vào năm 1998, nhưng lần này enzyme thu nhận có nguồn gốc từKluyveromices lactis được cố định vào hai loại chat mang thiolsulfinate vàthiolsulfonate để thủy phân đường lactose trong sữa Nhóm cho rang rất can thiết dé
hoạt hóa các nhóm thiol bên ngoài chưa được hoạt hóa.
Năm 1998, Sheu và cộng sự nghiên cứu sự tông hợp galacto- oligosaccharides bằngcách sử dụng B-galactosidase từ Aspergillus oryzae, cô định băng liên kết cộng hóa trịvới glutaraldehyde trên các hat chitosan Mặc dù hiệu quả thủy phân không bằngenzyme tự do nhưng enzyme cố định cho thấy hoạt tính không bị ảnh hưởng trong hệthống sau 30 ngày ở 30 °C [46]
Năm 1998, Giacomini và cộng sự đã so sánh phương pháp cố định -galactosidasetừ K lactic băng 2 chất mang khác nhau: glutaraldehyde- agarose gel và thiosulfinate-agarose gel Glutaraldehyde- agarose cho hiệu suất cố định bé hơn (36-40%) so vớithiosulfinate-agarose (60-85%) nhưng lại chịu nhiệt tốt hơn [21]
Qua cái nhìn tổng thé về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi nhậnthay răng cố định enzyme bang thiolsulfinate- agarose mang lại nhiều lợi ích tiềm năngcho quá trình thủy phân tạo sản phẩm sữa nghèo lactose Tuy nhiên, việc xây dựngthành công qui trình sản xuất sản phẩm sữa nghèo lactose còn phụ thuộc vào nhữngthách thức kỹ thuật nhất định Do đó, cần phải có nhiều nghiên cứu dé hoàn thiện sanphẩm sữa nghèo lactose nhăm đáp ứng nhu cau của người tiêu dùng Vì vậy, nội dungdé tài sẽ tập trung và tiếp tục nghiên cứu kha năng ứng dụng của chế phẩm enzyme cốđịnh băng chất mang mới là thiolsulfinate- agarose và bước đầu thiết kế kỹ thuật lên
men tạo sản phâm sữa nghèo lactose.
Trang 40CH ƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PH ƠNG PHÁP2.1 Trang thiết bị, hóa chất, vật liệu
2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứuĐịa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Kỹ Thuật HóaHọc, Trường Đại Học Bách Khoa, Đại Học Quốc Gia TP.HCM: Phong thí nghiệm Visinh, nhà máy Sữa Dielac, Công Ty Cố Phan Sữa Việt Nam và phòng thí nghiệm Visinh, nhà máy Sữa Bột Việt Nam, Công Ty Cổ Phân Sữa Việt Nam
Thời gian: 24/06/2013- 23/05/2014
2.1.2 Trang thiết bịMáy vortex, phéu lọc thủy tinh, máy đo quang, máy li tâm, pipetman (100ul và1000 mì) bếp từ, ống nghiệm, cân điện tử, máy đo pH, tủ ủ, bể 6n nhiệt, tủ sấy, tủ lạnh,tủ mát, hệ thống lọc chân không
2.1.3 Hóa chất và nguyên vật liệuHóa chất: Agarose; NaOH 1M; Epichlorhoydrin; Sodium phosphate 0.5 M, pH 6.3;
Dung dich đệm sodium bicarbonate 0.2 M, pH 8.5; Ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA) Im M; Acetic acetic 0.IM; DIT; Magnesium monoperoxyphthalate (MMPP,Merck AG); Potassium ferricyanide; Dung dịch đệm sodium phosphate 0.1 M, pH 7.0;NaCl 1M; Dung dich đệm sodium acetate 0.2 M, pH 5.0; Dung dich đệm potassiumphosphate 0.IM, pH 7.5, Magnesium chloride 3mM; o- Nitrophenyl-B-D-
glactopyranose (ONPG, sigma); Coomassi Plus protein; Đường lactose tinh khiết vàđường glucose tinh khiết (Merck)
Enzyme: ÿ-galactosidase từ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, trường
Đại học Bách Khoa TP.HCM Được tinh sạch từ quá trình lên men vi khuẩn Bacillussubtilis tái tô hợp Đoạn gen lac Z được chuyển vào để biểu hiện ngoại bào (phụ lục 8)