Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Cố định Enzyme Amylase trên Chitosan

TÓM TẮT LUẬN VĂN Enzyme amylase cố định đã được sử dụng hiệu quả trong công nghệ sản xuất glucose từ tinh bột nhờ vào khả năng thủy phân liên tục, khả năng điều khiển quá trình sản xuất

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN LIỆU

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng α-amylase của hãng Novo (Termamyl 120L), dạng lỏng Enzyme này là một α-amylase bền nhiệt, sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis Đây là một endo–amylase, thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong phân tử amylose, amylopectin tạo các dextrin có phân tử lượng thấp hơn, maltose và glucose

− Termamyl chịu được nhiệt độ cao: 90 – 100 o C, có pHopt 6 – 6,5 và nhiệt độ tối ưu là 80 o C

− Termamyl được sử dụng trong những ngành công nghiệp: tinh bột, cồn, bia, đường, dệt…

Trong kỹ nghệ tinh bột: Termamyl được dùng cho việc dịch hoá liên tục tinh bột trong nồi hơi hoặc trong những thiết bị tương tự hoạt động ở nhiệt độ cao và vì vậy lợi dụng được tính ổn định ở nhiệt độ rất cao của enzyme

Trong kỹ nghệ nấu cồn: Termamyl được dùng để thủy phân tinh bột khi nghiền và chưng cất Và ở giai đoạn này, cũng lợi dụng được độ ổn nhiệt của enzyme Hơn nữa, rất có thể thực hiện việc chưng cất không cần điều chỉnh pH và thêm Ca mặc dù các điều kiện có hơi khác điều kiện tối ưu Điều này là do phạm vi pH hoạt động của Termamyl tương đối lớn và việc đòi hỏi Canxi của enzyme tương đối thấp Nó làm cho qui trình sản xuất được đơn giản và mức độ rủi ro của cặn bẩn canxi được giảm thiểu trong cột chưng cất

Trong kỹ nghệ nấu bia: Termamyl được dùng để đẩy mạnh quá trình dịch hoá Do tính ổn định nhiệt cao của enzyme, qui trình nấu có thể được đơn giản hoá

Trong kỹ nghệ đường: Termamyl được sử dụng để phân giải lượng tinh bột hiện diện trong nước mía Vì vậy, hàm lựơng tinh bột trong đường thô được giảm và việc lọc đường tại nhà máy tinh luyện được dễ dàng hơn

Trong kỹ nghệ dệt: Termamyl được sử dụng ở nồng độ cao, nhiệt độ cao để rũ hồ trước khi nhuộm Loại enzyme kỹ thuật đươc áp dụng cho công nghệ này

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Termamyl: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme:

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của Termamyl

Chất ổn định: 30-60 ppm Canxi pH: 5,7 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme Termamyl tại các nhiệt độ 37 o C, 60 o C, 90 o C

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của Termamyl tại các nhiệt độ Ảnh hưởng của canxi với độ ổn định của Termamyl:

Trong dung dịch hồ tinh bột, tính ổn định của Termamyl được thoả mãn với sự hiện diện từ 50-70ppm ion Ca 2+ Trong bảng sau, các số liệu cho thấy độ ổn định của Termamyl trong dung dịch hồ tinh bột ở nồng độ 30% trong cùng điều kiện nhiệt độ và pH ở các nồng độ ion Ca 2+ khác nhau (ppm) Các số liệu được so sánh có cùng giá trị đương lượng DE (đương lượng dextrose) và trong phạm vi từ 0-12

Chất ổn định: 30-60ppm canxi

Bảng 3.1: Độ ổn định của Termamyl (số phút cần thiết để mất 50% hoạt tính)

Ion Ca 2+ 70ppm pH 6,5 pH 6,0 pH 5,5

Ion Ca 2+ 20ppm pH 6,5 pH 6,0 pH 5,5

Ion Ca 2+ 5ppm pH 6,5 pH 6,0

Bảo quản: khi Termamyl được giữ ở nhiệt độ 25 o C, hoạt tính duy trì tối thiểu là 3 tháng Giữ ở 5 o C, hoạt tính được duy trì tối thiểu là một năm

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng Amyloseglucosidase của hãng Sigma Enzyme này là một γ-amylase bền nhiệt, sản xuất từ vi khuẩn Aspergillus niger Đây là một exo – amylase, thủy phân liên kết α-1,4; α-1,6; α-1,3 glycoside bằng cách cắt từng phân tử glucose từ đầu không khử trong phân tử amylose, amylopectin tạo ra β-D-glucose

Enzyme này có pI = 3,4, pH tối ưu là 3,6 – 4,2, nhiệt độ phản ứng tối ưu là 60 o C

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng Glutaraldehyde nồng độ 25 % của nhà cung cấp Mecrk

Glutaraldehyde là chất hoạt hóa chất mang điển hình và có hiệu quả cao, hiện nay đựơc sử dụng phổ biến khi cố định enzyme

- Glutaraldehyde là một chất có khả năng liên kết đặc biệt với nitrogen, ammoniac, amin, protein Vì vậy, nó là chất khử trùng mạnh Nó tấn công protein trong tế bào của vi sinh vật, AND và protein áo của virus Do đó, vi sinh vật không tạo được sức đề kháng, chống chịu đối với glutaraldehyde

- Glutaraldehyde hoạt động tối ưu ở pH trung tính đến pH kiềm Tuy nhiên khó ổn định glutaraldehyde ở pH trung tính 6,5-7,5

- Glutaraldehyde ổn định ở trạng thái nguyên chất (thô) của nó (pH acid)

Xu hướng hiện nay trên thế giới là ổn định glutaraldehyde ở pH trung tính bằng dung dịch đệm Glutaraldehyde không ổn định ở pH kiềm (chỉ đạt được sự ổn định ở pH kiềm khoảng 14-28 ngày)

- Glutaraldehyde kém bay hơi ở pH trung tính

- Glutaraldehyde kém kích thích ở pH trung tính

Nguồn gốc: Đại học thủy sản Nha Trang

− Chỉ số deacetyl hóa (chỉ số DD): 75%

− Phân tử lượng trung bình: 5,187x10 4 đvC.

DỤNG CỤ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis Thermo Spectronic

Máy khuấy từ Magnetic Stirrer HANNA, BIBBY

Máy đo pH Mettler Toledo

Bể điều nhiệt Gallenkamp No.WF250

Cân 4 số lẻ OHAUS PA214, tủ sấy, tủ lạnh….

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.3.1 Đối với enzyme α – amylase: pHopt

Hiệu quả tái sử dụng Tỉ lệ enzyme/chất mang Thời gian cố định enzyme Vận tốc lắc

Kích thước chitosan Nồng độ glutaraldehyde

Tạo chế phẩm enzyme α – amylase cố định

Nghiên cứu tính chất enzyme α – amylase cố định Tối ưu hóa điều kiện cố định α - amylase Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định α – amylase trên chitosan Khảo sát phương pháp cố định α - amylase

3.3.3.2 Đối với enzyme glucose – amylase:

Hiệu quả tái sử dụng Tỉ lệ enzyme/chất mang Thời gian cố định enzyme Vận tốc lắc

Kích thước chitosan Nồng độ glutaraldehyde

Tạo chế phẩm enzyme glucose – amylase cố định

Nghiên cứu tính chất enzyme glucose – amylase cố định Tối ưu hóa điều kiện cố định glucose - amylase Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định glucose – amylase trên chitosan Khảo sát phương pháp cố định glucose - amylase

Thử nghiệm thủy phân tinh bột bằng α – amylase và glucose – amylase cố định

3.3.2 Phương pháp cố định enzyme Để tìm ra phương pháp cố định α-amylase thích hợp, chúng tôi đã tiến hành so sánh hai phương pháp cố định α-amylase sau:

− Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị

− Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và kết hợp giữa các enzyme

1.3.3 Phương pháp 1: Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị

Hoạt hóa Nước, cồn 70 Rửa

Rửa α-amylase đã cố định trên chitosan

− Trong tất cả các thí nghiệm, lượng chitosan được lấy cố định là 1g

− Rửa: rửa với cồn 70 o C và nước cất nóng, sau đó rửa nhiều lần với nước cất nhằm tiêu diệt VSV và loại bỏ cồn trong chitosan

− Làm khô: tách nước trong chitosan bằng cách sấy ở 50 o C

− Hoạt hóa: Quá trình hoạt hóa nhằm tạo điều kiện để nhóm aldehyde của glutaraldehyde liên kết với nhóm amin của chitosan

• Cho vào erlen chứa 1g chitosan 10ml glutaraldehyde 1%

• Erlen được lắc trong 4 giờ với vận tốc lắc 150 vòng/phút

− Rửa: Sau khi glutaraldehyde đã liên kết với chitosan, chúng tôi tiến hành rửa chất mang bằng nước cất, nhằm mục đích loại bỏ những glutaraldehyde không liên kết với chitosan

− Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase liên kết với chitosan qua trung gian của cầu nối glutaraldehyde, ngoài ra vẫn xảy ra quá trình chitosan hấp phụ α-amylase

• Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml rồi cho vào erlen chứa chitosan đã được rửa sạch

• Erlen được lắc trong 4 giờ với vận tốc lắc 150 vòng/phút

− Rửa: sau khi đã gắn kết α-amylase vào chitosan, chúng tôi tiến hành rửa để loại bỏ enzyme không liên kết, nước rửa sẽ được định mức lên 50ml

− Sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein enzyme tan trong nước rửa Từ đó sẽ xác định được hiệu suất cố định enzyme

− Tiếp sau đó xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của chế phẩm α- amylase cố định

2.3.3 Phương pháp 2: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và tạo liên kết giữa các enzyme

− Rửa: rửa với cồn 70 o và nước cất nóng, sau đó rửa nhiều lần với nước cất nhằm tiêu diệt VSV và loại bỏ cồn trong chitosan

− Làm khô: tách nước trong chitosan bằng cách sấy ở 50 o C

− Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase được hấp phụ vào cấu trúc lỗ xốp của chitosan

Làm khô Chitosan α-amylase Cố định

Liên kết mạng lưới với enzyme

Rửa α-amylase đã cố định trên chitosan

• Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml

• Cho dung dịch enzyme vào erlen chứa chitosan đã trương nở, lắc trong 4 giờ với vận tốc lắc 150 vòng/phút

− Rửa: sau khi đã gắn α-amylase vào chitosan, chúng tôi tiến hành rửa để loại bỏ những enzyme không liên kết, nước rửa sẽ được định mức lên 50ml Sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein enzyme tan trong nước rửa

− Liên kết mạng lưới với enzyme: Quá trình này nhằm tạo điều kiện để nhóm aldehyde của glutaraldehyde liên kết với nhóm amin của α-amylase và của chitosan tạo nên cấu trúc mạng lưới, mục đích để enzyme liên kết với chitosan chặt chẽ hơn và được giữ trong mạng lưới

• Cho vào chitosan đã hấp phụ α-amylase 10ml glutaraldehyde 2%, lắc trong 4 giờ với vận tốc lắc 150 vòng/phút

− Rửa: Rửa chế phẩm bằng nước cất, nhằm mục đích loại bỏ những glutaraldehyde không liên kết

− Nước rửa được định mức 50ml, và xác định nồng độ protein enzyme không liên kết Từ đó xác định hiệu suất cố định α-amylase

− Xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của chế phẩm α-amylase cố định

Các thông số được chọn để so sánh:

− Hiệu suất cố định enzyme

− Hoạt tính còn lại của enzyme cố định

Sau khi đã chọn được phương pháp cố định, chúng tôi tiến hành xác định các thông số của quá trình cố định:

− Khảo sát các yếu tố ảnh hướng quá trình cố định

− Qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa thông số công nghệ

− Từ kết quả tối ưu hóa, tạo chế phẩm ở điều kiện tối ưu và nghiên cứu tính chất của chế phẩm: pHopt, Topt

− Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định

− Khảo sát điều kiện bảo quản của enzyme cố định

3.3.3 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme

Quá trình cố định được thực hiện ở nhiệt độ 30 o C, trong erlen 250ml Mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần để kiểm tra sự khác nhau có nghĩa theo phương pháp ANOVA Ở thí nghiệm này chúng tôi khảo sát 5 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định gồm có: lượng enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc, kích thước chitosan và nồng độ glutaraldehyde Để khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố, ban đầu chúng tôi cho 5 yếu tố các giá trị sau:

− Thời gian cố định: 4 giờ

− Vận tốc lắc đảo: 150 vòng/phút

Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một yếu tố, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, còn những yếu tố còn lại sẽ được cố định Sau đó, khi khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tiếp theo, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, đồng thời lấy giá trị tối ưu của yếu tố vừa khảo sát và giữ cố định những yếu tố còn lại

3.3.3.1 Khảo sát thể tích enzyme sử dụng

− Đối với enzyme α – amylase thể tích enzyme đậm đặc theo các thứ tự như sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml được pha loãng và định mức lên 25 ml để đem đi cố định

− Đối với enzyme glucose – amylase dùng enzyme đậm đặc pha loãng 100 lần sau đó lấy dung dịch này theo thứ tự: 1; 2; 3; 4; 5 ml đem định mức lên 25 ml để đem đi cố định

Giá trị các yếu tố khác được giữ cố định

3.3.3.2 Khảo sát thời gian thực hiện phản ứng cố định enzyme

Lần lượt thay đổi thời gian cố định: 2, 4, 6, 8, 10 giờ

Thể tích enzyme lấy từ thí nghiệm trước Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định

3.3.3.3 Khảo sát vận tốc lắc đảo

Lần lượt thay đổi vận tốc lắc: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút

Thể tích enzyme và thời gian lấy từ thí nghiệm trước Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định

3.3.3.4 Khảo sát kích thước của chitosan

Lần lượt thay đổi kích thước chitosan như sau: 0,35 – 0,7; 0,7 – 1,4; 1,4 - 2,8 mm Giá trị các yếu tố khác giữ cố định

Giữ cố định yếu tố về glutaraldehyde Các yếu tố còn lại là những giá trị tối ưu của các thí nghiệm trước

3.3.3.5 Khảo sát nồng độ glutaraldehyde

Nồng độ glutaraldehyde thay đổi đối với α – amylase như sau: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%

Do glucose – amylase có khoảng pH tối thích nằm trong khoảng axit, ngoài ra chitosan bị tan trong axit loãng nên không thể thực hiện thí nghiệm khi không có mặt của glutaraldehyde Do đó thí nghiệm được thực hiện với các nồng độ glutaraldehyde sau: 1%; 2%; 3%; 4%; 5%

Thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc đảo và kích thước chitosan là những giá trị tối ưu của những thí nghiệm trước

Thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc đảo và kích thước chitosan là những giá trị tối ưu của những thí nghiệm trước

3.3.4 Tối ưu hóa quá trình cố định

Sau khi có kết quả sự ảnh hưởng của 5 yếu tố công nghệ đến quá trình cố định, chúng tôi chọn được 2 yếu tố tác động mạnh nhất đến hiệu quả cố định và tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2, có cấu trúc tâm

Phương trình hồi quy được xây dựng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 có tâm Vì chúng tôi tối ưu 2 yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu nên số thí nghiệm được tính như sau: N = 2 k + 2k + no

− Trong đó: k: là số yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu

2 k = 4: số thí nghiệm ở nhân phương án

2k = 4: số thí nghiệm tại giao điểm của đường tròn với các trục no = 1: số thí nghiệm ở tâm (tối thiểu bằng 1), Vì vậy tổng số thí nghiệm là: N = 2 k + 2k + no = 2 2 + 2.2 + 1 = 9 Để kiểm tra sự khác không có nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy, chúng tôi thực hiện thêm 2 thí nghiệm tại tâm

Bảng 3.2: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm, hai yếu tố

Số thí nghiệm ở các điểm giao với trục

Số thí nghiệm ở tâm làm thêm 11 +1 0 0 0 -λ -λ

− α: cánh tay đòn được chọn phụ thuộc vào số yếu tố k và số thí nghiệm ở tâm no

− Xo: là biến ảo ứng với hệ số bo

− X1: là yếu tố ảnh hưởng thứ nhất

− X2: là yếu tố ảnh hưởng thứ hai

− Y: hàm mục tiêu, hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định (%)

Phương trình hồi quy có dạng: Y = bo + b1X1 + b2X2+ b12X1X2+ b11X1 2+ b22X2 2

Ngoài ra, còn có thể sử dùng phần mềm Modde 5 để thiết kế thí nghiệm, từ đó xác định phương trình hồi quy và giá trị cực đại

3.3.5 Xác định tính chất enzyme cố định:

3.3.5.1 Xác định pH tối ưu:

Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme tan và enzyme cố định ở nhiệt độ 50 o C, ứng với pH có giá trị thay đổi như sau: 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8

Dung dịch tinh bột có pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm phosphate

Từ đó xác định pH tối ưu

3.3.5.2 Xác định nhiệt độ tối ưu:

Nhiệt độ tối ưu được xác định bằng cách đo hoạt tính α-amylase ở những nhiệt độ khác nhau tại giá trị pH tối ưu

Những nhiệt độ khảo sát: 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 Những giá trị nhiệt độ này được điều khiển bằng bể điều nhiệt

3.3.6 Xác định hiệu suất cố định enzyme

3.3.6.1 Hiệu suất cố định enzyme

Hiệu suất của quá trình cố định được tính theo công thức sau:

Với: m: là hàm lượng protein enzyme có trong thể tích enzyme ban đầu (mg) m1: là hàm lượng protein enzyme không liên kết (mg)

3.3.6.2 Phương pháp xác định protein tan Để xác định nồng độ protein ta sử dụng phương pháp Lowry Phản ứng Lowry đặc trưng cho sự tạo thành phức chất màu của các amino acid vòng với thuốc thử Folin-Xiocanto Ngoài ra, trong thuốc thử Folin có acid phosphomolipdic và acid phosphovonphramic làm tăng độ nhạy của phức chất đồng-protein (biure)

Phản ứng Lowry có độ nhạy cao, được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng protein

Trước tiên để xác định nồng độ protein tan trong mẫu thí nghiệm, ta sẽ phải xây dựng đường chuẩn bằng một loại protein tinh khiết thường là albumin huyết thanh bò Từ đường chuẩn, khi có giá trị mất độ quang sẽ xác định được nồng độ protein tan

Giá trị mật độ quang được đo bằng máy quang phổ hấp thu UV – Vis tại bước sóng λ = 750nm

Phương pháp này được sử dụng chính xác nhất với những dung dịch có nồng độ protein từ 0,01 đến 1mg/ml

• Pha dung dịch albumin chuẩn có nồng độ: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25;

• Dung dịch A: Cân 4g NaOH và 20g Na2CO3 pha trong 1000ml nước cất

• Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.H2O pha trong dung dịch Natri-Kali Tartrat 1%

• Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 50 : 1

• Thuốc thử Folin pha loãng bằng nước cất tỉ lệ: 1:3

• Cho vào ống nghiệm 1ml mẫu và 5ml dung dịch C, để yên trong 10 phút

• Cho vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút

• Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 750nm Từ đó lập được đường chuẩn A = f(C)

3.3.7 Xác định hoạt tính enzyme và hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme cố định

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

CHẾ PHẨM ENZYME α-AMYLASE TỰ DO

Bảng 4.1: Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của α-amylase tự do

Hàm lượng protein (mg/ml)

Hoạt tính riêng (U/mg protein)

CHẾ PHẨM ENZYME GLUCOSE - AMYLASE TỰ DO

Bảng 4.2: Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của glucose - amylase tự do

Hàm lượng protein (mg/ml)

Hoạt tính riêng (U/mg protein) 379807 35,41 93,24

KHẢO SÁT THỬ NGHIỆM 2 PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME α – AMYLASE

Thí nghiệm này nhằm so sánh hiệu quả cố định của 2 phương pháp:

− Cố định enzyme α – amylase bằng liên kết cộng hóa trị trên bề mặt chitosan

− Cố định enzyme α – amylase bằng hấp phụ trong lớp xốp của chitosan và kết nối giữa các phân tử enzyme

Hiện tại các nghiên cứu cố định α – amylase với chitosan thường ở dạng dung dịch, chỉ có 1 nghiên cứu chitosan ở dạng không hòa tan của các tác giả M A Abd El-Ghaffar, M S Hashem So với quá trình cố định enzyme với chitosan dạng dung dịch, cố định chitosan dạng hạt/vẩy có các ưu điểm sau:

Không phụ thuộc vào tính tan và tạo màng của chitosan

Thí nghiệm đơn giản hơn so với quá trình nhốt enzyme trong gel chitosan hay cho enzyme hấp phụ lên giá thể rắn có bọc chitosan

Khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất tốt hơn so với phương pháp nhốt từ đó hoạt tính của enzyme cố định sẽ cao hơn so với phương pháp này

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Hình 4.1: So sánh hiệu quả của 2 phương pháp cố định α - amylase

Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy hiệu suất cố định và hoạt tính enzyme cố định trong phương pháp 1 cao hơn phương pháp 2 Đối với phương pháp 1, ban đầu nhóm NH2 của chitosan sẽ liên kết cộng hóa trị với nhóm CHO của glutaraldehyde, sau đó khi cho enzyme vào, thì nhóm NH2 trong phân tử α-amylase sẽ liên kết với nhóm CHO còn lại của glutaraldehyde đồng thời phân tử enzyme cũng bị hấp phụ vào cấu trúc lỗ xốp của chitosan:

Chitosan – NH2 + CHO – (CH2)3 – CHO → Chitosan – N = CH – (CH2)3 – CHO →

Chitosan – N = CH – (CH2)3 – CH = N – Enzyme

Ngược lại, trong phương pháp 2, ban đầu chất mang chitosan chỉ tương tác hấp phụ enzyme vào cấu trúc lỗ xốp, sau đó khi cho glutaraldehyde vào, thì nhóm CHO hoạt động của glutaraldehyde sẽ liên kết với nhóm NH2 của enzyme và của chitosan Dẫn đến kết quả là giữa các enzyme sẽ liên kết với nhau, đồng thời liên kết với chitosan Ở cả 2 phương pháp hoạt tính còn lại đều thấp hơn so với enzyme tự do Có thể do enzyme không tiếp xúc trực tiếp được với cơ chất hoặc do sự biến đổi cấu trúc và trung tâm hoạt động của enzyme

Hiệu suất cố định (%) Hoạt tính còn lại (%)

Hình 4.2: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết các enzyme

So sánh giữa 2 phương pháp cố định thấy rằng ở phương pháp 1 các phân tử enzyme được gắn vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị nên bền vững hơn, enzyme tiếp xúc với cơ chất khá dễ dàng Ở phương pháp 2 ngoài liên kết cộng hóa trị với glutaraldegyde như phương pháp 1 thì giữa các phân tử enzyme còn liên kết với nhau, hoặc enzyme được bọc trong mạng lưới glutaraldehyde Có thể vì vậy mà enzyme khó tiếp xúc với cơ chất hơn, đặc biệt là trường hợp cơ chất có phân tử lượng lớn, kích thước cồng kềnh như phân tử tinh bột Thực tế thì hoạt tính còn lại khi cố định α – amylase trên chitosan bằng phương pháp 2 - phương pháp liên kết mạng lưới thì chế phẩm có hoạt tính còn lại thấp hơn so với phương pháp 1 và hiệu suất cố định cũng thấp hơn đáng kể

Tác giả M A Abd El-Ghaffar, M S Hashem khi nghiên cứu cố định enzyme α – amylase trên chitosan không hòa tan cũng xử lý glutaraldehyde trước khi tiến hành cố định Phản ứng tạo liên kết của enzyme với chitosan phụ thuộc vào thời gian tiến hành cố định Kết quả thu được cho thấy: phương pháp liên kết cộng hóa trị được thực hiện trong 24 giờ, hoạt tính còn lại của enzyme cố dịnh là 60%

Tuy nhiên phương pháp liên kết ngang tương ứng với thời gian cố định là 4 giờ thì hoạt tính còn lại của enzyme cho kết quả cao hơn (68.59%) so với thời gian cố định 24 giờ

Vì lý do này, chúng tôi quyết định chọn phương pháp 1 – Cố định α-amylase bằng phương pháp cộng hóa trị

Hấp phụ Liên kết giữa các enzyme

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH α - AMYLASE

ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH α - AMYLASE

Trong phần này, chúng tôi sử dụng phương pháp thực nghiệm cổ điển để khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố công nghệ đến hiệu suất cố định Từ đó chúng tôi sẽ thu được những giá trị tối ưu của từng yếu tố công nghệ

4.4.1 Khảo sát thể tích enzyme sử dụng

Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định α-amylase :

− Thời gian cố định: 4 giờ

− Vận tốc lắc đảo: 150 vòng/phút

− Thể tích enzyme thay đổi: 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1 ml Định mức lần lượt các thể tích enzyme trên đến 25 ml trong dung dịch đệm sau đó đem đi tiến hành thí nghiệm

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Thể tích enzyme sử dụng (ml)

Hình 4.3: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên hiệu suất cố định

Bảng 4.3: Hoạt tính của chế phẩm α-amylase cố định khi ở các thể tích enzyme sử dụng khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định (%)

Từ kết quả, chúng tôi thấy rằng hiệu suất cố định protein enzyme cao nhất đạt được là 57.8 % ở 0,9 ml và 1,1 ml tuy nhiên hoạt tính còn lại của enzyme có giá trị cao nhất ở thể tích 0,7ml

Diễn biến tăng sau đó không thay đổi của hiệu suất cố định khi tăng enzyme sử dụng (hình 4.3) được giải thích như sau: trong quá trình cố định enzyme, vừa xảy ra sự gắn kết α-amylase bởi liên kết cộng hóa trị giữa enzyme và glutaraldehyde vừa hấp phụ α-amylase vào chitosan Trong khi đó, nhóm aldehyde của glutaraldehyde, diện tích bề mặt chitosan và số lượng lỗ xốp của chitosan là không đổi Cho nên khi thể tích enzyme sử dụng càng nhiều thì lượng enzyme gắn vào càng tăng, tuy nhiên chỉ tăng đến một giới hạn tới khi hàm lượng glutaraldehyde đã gắn kết hết, đồng thời các lỗ xốp của chitosan bị lấp đầy Vì vậy, nếu enzyme ban đầu sử dụng càng nhiều thì lượng enzyme được cố định càng tăng, nhưng tốc độ tăng sẽ chậm dần cho đến khi đạt bão hòa

Xét về hoạt tính riêng còn lại thấy rằng có sự giảm đáng kể hoạt lực của enzyme cố định so với enzyme tự do, nguyên nhân là do tương tác giữa enzyme và cơ chất trong môi trường hoạt động của enzyme đã bị ảnh hưởng của tương tác giữa enzyme với chất mang, cơ chất với chất mang và nồng độ sản phẩm tăng dần Hoạt tính riêng của enzyme cố định bị giảm so với enzyme tự do là tất yếu Tuy nhiên trong nghiên cứu cố định enzyme cần tìm điều kiện để giảm thiểu sự ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme

4.4.2 Khảo sát thời gian thực hiện phản ứng cố định enzyme

Thời gian tiến hành thí nghiệm cố định enzyme là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất cố định và hoạt lực của enzyme cố định

Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định α-amylase :

− Vận tốc lắc đảo: 150 vòng/phút

− Thể tích enzyme sẽ sử dụng là 0,7ml

− Thời gian cố định thay đổi như sau: 2, 4, 6, 8, 10 giờ

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Thời gian cố định (giờ)

Hình 4.4: Ảnh hưởng của thời gian thực hiện phản ứng cố định enzyme lên hiệu suất cố định enzyme

Bảng 4.4: Hoạt tính của chế phẩm α-amylase cố định ở những thời gian thực hiện phản ứng cố định enzyme khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định (%)

Từ kết quả hình 4.4, chúng tôi thấy rằng khi tăng thời gian cố định thì hiệu suất cố định sẽ tăng Và hiệu suất cố định đạt được cực đại là 62,3%, sau khi cố định 10 giờ

Kết quả này có thể giải thích như sau, khi cố định enzyme, enzyme và chất mang được lắc đảo, nhằm mục đích để enzyme phân bố đều và dễ dàng tiếp xúc, gắn kết với chất mang Theo thời gian, lượng enzyme cố định vào chất mang càng lúc càng nhiều

Có thể tiếp tục kéo dài thời gian cố định và hiệu suất cố định có thể càng tăng, tuy nhiên xét về hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định, chúng tôi nhận thấy có sự biến đổi tăng rồi giảm Hoạt tính riêng của α-amylase cố định tăng dần trong khoảng thời gian thực hiện phản ứng cố định enzyme từ 2 - 6 giờ là đạt cao nhất Nhưng khi kéo dài thời gian phản ứng cố định enzyme thì hoạt tính riêng bắt đầu giảm, nguyên nhân là khi kéo dài thời gian hơn 6 giờ thì, lượng enzyme phân bổ bên trong chitosan tăng, hiệu suất cố định tăng nhưng không gian hoạt động của các enzyme cố định ở lớp trong bị hạn chế nên hoạt tính riêng giảm

Chính vì những lý do đó mà chúng tôi quyết định chọn thời gian cố định là 6 giờ để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

4.4.3 Khảo sát vận tốc lắc đảo

Trong quá trình cố định, việc lắc đảo chất mang và enzyme rất quan trọng, vì nhờ lắc đảo mà enzyme phân bố đều và dễ dàng tiếp xúc để gắn vào chất mang Với vận tốc lắc đảo phù hợp, thì hiệu suất cố định sẽ tăng lên đáng kể

Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định α-amylase :

− Thể tích enzyme sử dụng 0,7 ml và thời gian lắc là 6 giờ

− Vận tốc lắc đảo thay đổi như sau: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Vận tốc lắc đảo (vòng/phút)

Hình 4.5: Ảnh hưởng của vận tốc lắc đảo lên hiệu suất cố định enzyme

Bảng 4.5: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định ứng với những vận tốc lắc đảo khác nhau

Hoạt tính (U/g enzyme cố định)

Hoạt tính riêng (U/mg protein cố định)

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định (%)

Dựa vào kết quả biểu diễn trên hình 4.5, chúng tôi thấy có sự khác biệt rất rõ giữa việc cố định enzyme có lắc đảo và không có lắc đảo Khi cố định enzyme có lắc đảo, hiệu suất cố định tăng nhiều hơn so với không có lắc đảo Từ đây, sẽ thấy được rằng việc lắc đảo rất quan trọng trong việc cố định enzyme

Trên hình 4.5, chúng tôi nhận thấy ở vận tốc lắc đảo 50 vòng/phút và 100 vòng/phút có hiệu suất cố định không khác nhau, điều này xảy ra có thể do ở vận tốc 100 vòng/phút, lực tác động lên enzyme vẫn chưa đủ lớn để enzyme có thể hấp phụ sâu vào bên trong lỗ xốp của chitosan Vì vậy hiệu suất cố định đã tăng lên khi tăng vận tốc lắc lên 150 v/p Nhưng khi vận tốc lắc đảo tiếp tục tăng lên, hiệu suất cố định giảm xuống Điều này xảy ra do vận tốc lắc đảo cao làm cho lực cơ học tăng cao có thể dẫn đến một phần enzyme bị giải hấp phụ, tách ra khỏi chất mang

Ngoài ra hoạt tính còn lại của enzyme cố định tăng dần từ 0 v/p đến 150 v/p, điều này do vận tốc lắc càng tăng thì hiệu suất gắn của enzyme càng tăng Tuy nhiên, đến vận tốc 200 v/p thì hoạt tính riêng giảm do hiệu suất gắn enzyme giảm, ngoài ra liên kết giữa enzyme với enzyme tăng, và giữa enzyme với glutaraldehyde tăng, enzyme với chất mang tăng làm cản trở những enzyme nằm bên trong các lỗ xốp bị những liên kết này che chắn bên ngoài, cản trở phản ứng giữa enzyme với cơ chất, do vậy hoạt tính riêng của enzyme cố định giảm

Từ những lý do đó cho thấy, tốc độ lắc đảo sẽ có một giá trị tối ưu mà ở đó hiệu suất cố định đạt cực đại Và dựa vào kết quả, chúng tôi xác định hiệu suất cố định đạt cực đại là 59,6% ở vận tốc lắc đảo là 150 vòng/phút

Hoạt tính protein enzyme đạt cao nhất là 150 vòng/phút, vận tốc này sẽ được dùng để khảo sát những yếu tố tiếp theo

4.4.4 Khảo sát kích thước chitosan

Kích thước chitosan ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm cố định enzyme trên chitosan do nghiên cứu này thực hiện hai loại liên kết là liên kết cộng hóa trị và hấp phụ lên bề mặt của chitosan Do đó kích thước chitosan càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc của enzyme với bề mặt xốp của chitosan càng tăng, trong khi số lượng các gốc amin tự do của chitosan là không đổi vì vậy tỷ lệ giữa enzyme liên kết cộng hóa trị và enzyme hấp phụ càng giảm

Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định α-amylase :

− Thể tích enzyme: 0,7 ml và thời gian lắc là 6 giờ

− Vận tốc lắc: 150 vòng/phút

− Kích thước chitosan thay đổi 0,35 – 0,7; 0,7 – 1,4; 1,4 – 2,8mm Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Hình 4.6: Ảnh hưởng của kích thước chitosan lên hiệu suất cố định enzyme

Bảng 4.6: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những kích thước chitosan khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định

Từ kết quả hình 4.6, chúng tôi nhận thấy rằng, kích thước của chitosan càng giảm thì hiệu suất cố định lại càng tăng Điều này dễ dàng giải thích, khi kích thước chitosan giảm, diện tích bề mặt chất mang sẽ tăng lên, tạo điều kiện cho enzyme α- amylase gắn vào chitosan Nhưng khi ứng dụng vào mô hình thực tế, nếu kích thước chitosan quá nhỏ sẽ khó khăn trong quá trình tái sử dụng enzyme cố định, bởi vì sẽ rất khó tách riêng chế phẩm ra khỏi sản phẩm thủy phân Ngoài ra khi ứng dụng ở qui mô công nghiệp, việc sản xuất chất mang có kích thước lớn sẽ giảm một phần chi phí, đồng thời khi ứng dụng để thủy phân tinh bột sản xuất syrup sẽ dễ dàng thực hiện bằng lọc hay ly tâm

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH GLUCOSE - AMYLASE

ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH GLUCOSE - AMYLASE

Tương tự như đối với enzyme α - amylase, chúng tôi sử dụng phương pháp thực nghiệm cổ điển để khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố công nghệ đến hiệu suất cố định Từ đó thu được những giá trị tối ưu của từng yếu tố công nghệ

4.5.1 Khảo sát nồng độ glutaradehyde

Trong thí nghiệm này, giá trị của các thông số cố định glucose - amylase :

− Thể tích enzyme: 2 ml và thời gian lắc là 4 giờ

− Vận tốc lắc: 150 vòng/phút

− Nồng độ glutaraldehyde thay đổi như sau: 1%, 2%, 3%, 4%; 5%

Trong quá trình thí nghiệm chúng tôi nhận thấy rằng khi không sử dụng glutaraldehyde thì chitosan bị tan khi cho enzyme glucose – amylase đã được pha loãng trong dung dịch đệm có pH = 3,9 Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ glutaraldehyde từ 1 – 5%

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Hình 4.10: Ảnh hưởng của nồng độ Glutaraldehyde lên hiệu suất cố định enzyme

Bảng 4.9: Hoạt tính riêng của các mẫu glucose - amylase cố định ứng với những nồng độ glutaraldehyde khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định(%)

Dựa vào hình 4.10, hiệu suất cố định enzyme glucose – amylase trên chitosan đạt cao nhất 45,5% ở nồng độ glutaraldehyde 3 %

Tuy nhiên trong nghiên cứu này hoạt tính enzyme cao nhất ở nồng độ glutaraldehyde 1 % Nguyên nhân do gốc CHO trong glutaraldehyde làm giảm hoạt tính của glucose – amylase, khi nồng độ glutaraldehyde tăng dần thì hoạt tính của enzyme cố định giảm dần

Việc sử dụng glutaraldehyde có thể dẫn đến các liên kết cộng hóa trị đa điểm của glucose – amylase với glutaraldehyde, làm cản trở sự xúc tác của enzyme đến cơ chất và gây mất hoạt tính enzyme

Theo tác giả Agnieszka Hamerska-Dudra , Jolanta Bryjak, Andrzej W

Trochimczuk khi nghiên cứu cố định glucose – amylase và trypsin trên nhựa phản ứng nhiệt cũng đưa ra kết luận nồng độ glutaraldehyde tối ưu trong cố định và bảo quản enzyme là 1%

4.5.2 Khảo sát vận tốc lắc đảo

Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định glucose - amylase :

− Thể tích enzyme sử dụng 2 ml và thời gian lắc là 4 giờ

− Vận tốc lắc đảo thay đổi như sau: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Vận tốc lắc đảo (vòng/phút)

Hình 4.11: Ảnh hưởng của vận tốc lắc đảo lên hiệu suất cố định enzyme

Bảng 4.10: Hoạt tính riêng của các mẫu glucose - amylase cố định ứng với những vận tốc lắc đảo khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định(%)

Dựa vào kết quả biểu diễn trên hình 4.11, chúng tôi nhận thấy hiệu suất gắn enzyme thấp nhất khi không có lắc đảo Điều này do vị trí tiếp xúc giữa enzyme và chất mang có một giới hạn xác định, enzyme nào nằm gần với chất mang thì sẽ liên kết hoặc hấp phụ lên chất mang, những enzyme nào không tiếp xúc sẽ không phản ứng được với chất mang Quá trình lắc đảo trong phản ứng enzyme nhằm thay đổi liên tục vị trí tiếp xúc giữa enzyme với chất mang Nhờ đó hiệu suất gắn enzyme sẽ cao hơn

Dựa vào bảng 4.10, chúng tôi nhận thấy ở vận tốc lắc đảo 50 vòng/phút và 100 vòng/phút có hoạt tính riêng còn lại không khác nhau, tuy nhiên hiệu suất cố định của enzyme cố định ở vận tốc lắc 100 v/p lại cao hơn so với vận tốc 50 v/p Điều này có thể giải thích như sau, hoạt tính riêng của enzyme được tính trên lượng protein - enzyme phản ứng Do vậy ta có thể kết luận hoạt tính riêng của enzyme cố định trên chitosan ở hai vận tốc lắc không khác biệt nhau

Khi vận tốc lắc đảo tiếp tục tăng lên, hiệu suất cố định giảm xuống Điều này xảy ra do vận tốc lắc đảo cao làm cho lực cơ học tăng lên dẫn đến enzyme bị giải hấp phụ, tách ra khỏi chất mang Ngoài ra, lực ly tâm tác động lên α-amylase và chất mang càng lớn thì khả năng tiếp xúc của enzyme với chất mang càng bị hạn chế

Dựa vào kết quả hình 4.11 và bảng 4.10, chúng tôi xác định hiệu suất và hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định đạt cực đại là ở vận tốc lắc đảo là 150 vòng/phút Do đó vận tốc này sẽ được dùng để khảo sát những yếu tố tiếp theo

4.5.3 Khảo sát thể tích enzyme sử dụng

Nghiên cứu thể tích enzyme sử dụng trong phản ứng cố định enzyme thực tế là khảo sát tỉ lệ protein – enzyme so với chất mang Ở đây, chúng tôi giới hạn hàm lượng chitosan có nghĩa là giới hạn nhóm NH2 và kích thước lỗ xốp của chitosan, chỉ thay đổi lượng enzyme glucose – amylase Ngoài ra chúng tôi cũng cố định một số yếu tố khác như sau:

− Thời gian cố định: 6 giờ

− Vận tốc lắc đảo: 150 vòng/phút

− Pha loãng enzyme glucose - amylase 100 lần, sau đó hút lần lượt enzyme đã được pha loãng theo các thể tích sau: 1; 2; 3; 4; 5 ml Sau đó định mức các lượng enzym trên bằng dung dịch đệm acetate có pH = 3,9 lên 25 ml và đem đi cố định

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Thể tích enzyme sử dụng (ml)

Hình 4.12: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên hiệu suất cố định

Bảng 4.11: Hoạt tính riêng của các mẫu glucose - amylase cố định ứng với những thể tích enzyme sử dụng khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định(%) 1 2280,07 a ± 17,02 33,4 a ± 0,2 35,8 a ± 0,27 2 3041,52 b ± 12,76 37,2 b ± 0,3 39,9 b ± 0,17 3 4190,06 d ± 21,27 40,9 d ± 0,2 43,8 d ± 0,22 4 4190,06 d ± 12,76 41,0 d ± 0,1 44,0 d ± 0,13 5 3666,84 c ± 25,52 37,6 c ± 0,4 40,4 c ± 0,28

Dựa vào hình 4.12 ta thấy hiệu suất cố định đạt cao nhất ở 5 ml, tuy nhiên từ 3 ml trở đi thì hiệu suất cố định tăng không đáng kể Giải thích cho hiện tượng trên như sau: các nhóm CHO của glutaraldehyde, bề mặt tiếp xúc của chitosan có giới hạn xác định, khi phản ứng cố định enzyme được thực hiện thì bề mặt chitosan dần được lấp đầy đến cực đại, khi đó lượng enzyme thừa không liên kết sẽ bị loại bỏ trong quá trình rửa

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định tăng dần theo thể tích enzyme sử dụng từ 1 – 3 ml, hoạt tính riêng ở 3 và 4 ml không khác biệt nhau lớn, tuy nhiên tại 5 ml thì hoạt tính lại giảm đi Điều này được giải thích như sau: ứng với thể tích từ 1 ml đến 3 ml hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định tăng dần do khi lượng enzyme thấp hơn nhu cầu cần thiết của liên kết cộng hóa trị và hấp phụ thì lượng glutaraldehyde dư thừa sẽ làm giảm hoạt độ của enzyme, ngoài ra các enzyme bên trong lỗ xốp chitosan cũng bị glutaraldehyde che chắn bên ngoài làm cản trở khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất Ở thể tích 3ml và 4ml hoạt tính riêng tương đối gần nhau, đến thể tích 5ml thì hoạt tính riêng của enzyme lại giảm do lượng enzyme càng lớn thì liên kết giữa enzyme với enzyme càng lớn, tạo ra liên kết glutaraldehyde – enzyme – enzyme – chitosan che chắn bên ngoài các lỗ xốp của chitosan, cản trở khả năng hấp phụ của chitosan Hơn nữa hoạt tính của enzyme hấp phụ lên chitosan tốt hơn so với enzyme liên kết cộng hóa trị với chất mang Do vậy hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định giảm khi tăng thể tich

Hoạt tính còn lại của enzyme cố định đạt cao nhất ở 4 ml Do đó ta chọn 4 ml làm tối ưu cho các kết quả thí nghiệm tiếp theo

4.5.4 Khảo sát thời gian cố định

Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định glucose - amylase :

− Vận tốc lắc đảo: 150 vòng/phút

− Thể tích enzyme sẽ sử dụng là 4 ml

− Thời gian cố định thay đổi như sau: 2, 4, 6, 8, 10 giờ

Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Thời gian cố định (giờ)

Hình 4.13: Ảnh hưởng của thời gian cố định lên hiệu suất cố định enzyme

Bảng 4.12: Hoạt tính chế phẩm glucose - amylase cố định ứng với những thời gian cố định khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định(%)

Từ kết quả trên đồ thị hình 4.13, chúng tôi thấy rằng hiệu suất cố định đạt cao nhất ở 6 giờ và hoạt lực enzym cao nhất cũng tại thời gian này Trong thời gian cố định enzyme, enzyme và chất mang được lắc đảo, glutaraldehyde cũng thực hiện vai trò gắn kết enzyme với chất mang, từ đó hiệu suất và hoạt tính riêng ngày càng tăng Đến khi enzyme đã gắn kết hoặc hấp phụ hoàn toàn thì thời gian tăng có tác dụng ngược lại đối với phản ứng cố định enzyme Thời gian lắc đảo lúc này sẽ làm giải hấp phụ enzyme, hoạt động của lớp trong enzyme bị hạn chế, ngăn cản phản ứng của enzyme với cơ chất Ngoài ra ở pH axit glutaraldehyde hoạt hóa chậm hơn trong môi trường trung tính, do vậy ta thấy hoạt tính của enzyme glucose – amylase cố định trên chitosan có hoạt tính riêng còn lại cao trong khoảng 6 – 8 giờ lâu hơn so với enzyme α – amylase cố định là 4 – 6 giờ Thời gian phản ứng cố định càng lâu khả năng bất hoạt enzyme của glutaraldehyde càng lớn hơn Do đó hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định giảm

Hai tác giả Aziz Tanriseven , Zehra O¨ lcer khi nghiên cứu cố định glucose – amylase trờn gelatine, đưa ra kết quả khi hàm lượng enzyme sử dụng là 50 àl thỡ hoạt tớnh của enzyme cố định cao hơn so với thể tớch 75 àl và 100 àl

Chính vì những lý do đó mà chúng tôi quyết định chọn thời gian cố định tối ưu là 6 giờ

4.5.5 Khảo sát kích thước chitosan

Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định glucose - amylase :

− Thể tích enzyme: 4 ml và thời gian lắc là 6 giờ

− Vận tốc lắc: 150 vòng/phút

− Kích thước chitosan thay đổi 0,35 - 0,7; 0,7 – 1,4; 1,4 – 2,8 mm Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Hình 4.14: Ảnh hưởng của kích thước chitosan lên hiệu suất cố định enzyme

Bảng 4.13: Hoạt tính riêng của các mẫu glucose - amylase cố định ứng với những kích thước chitosan khác nhau

Hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE CỐ ĐỊNH TRÊN

ĐỊNH TRÊN CHITOSAN 4.6.1 Enzyme α – amylase cố định:

4.6.1.1 Ảnh hưởng của pH Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme cố định, chúng tôi tiến hành thay đổi giá trị pH của môi trường phản ứng từ 5,5 – 8 bằng dung dịch đệm phosphat và xác định hoạt tính ở nhiệt độ 80 o C Chúng tôi thu được kết quả như sau:

Bảng 4.15: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính riêng còn lại của α-amylase cố định pH

Hoạt tính riêng còn lại (%) 5,5 52,0

Từ bảng 4.15, chúng tôi xác định được pH tối ưu của enzyme tự do khoảng 5,5 - 6 và của enzyme cố định là khoảng 6,5 - 7 điều này chứng tỏ rằng pHopt của enzyme cố định đã dịch chuyển về phía kiềm so với enzyme tự do Nguyên nhân của sự thay đổi pH có thể là do ảnh hưởng điện tích của môi trường xung qua trung tâm hoạt động của α-amylase Ngoài ra, chúng tôi cũng nhận thấy enzyme cố định ổn định trong khoảng pH hoạt động rộng hơn so với enzyme tự do

Kết quả về sự chuyền dời pHopt sang vùng kiềm và ổn định trong khoảng pH rộng cũng phù hợp với kết quả của một số tác giả như Saiyavit Varavinit (2001) khi cố định α-amylase trên cellulose, Min-Yun Chang và Ruey-Shin Juang (2004) khi cố định α-amylase trên hợp chất chitosan-đất sét và cố định amylase trên gel alginate của Nguyễn Thị Thảo Minh (2003) Đối với tác giả M A Abd El-Ghaffar, M S Hashem (2008) điểm pH tối thích của α – amylase cố định trên chitosan trùng với pH tối thích của enzyme tự do

4.6.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Từ thí nghiệm trên, chúng tôi xác định được pHopt của enzyme cố định, và giá trị pH này được dùng để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme Kết quả thu được là:

Bảng 4.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính α-amylase cố định

Nhiệt độ phản ứng ( o C) Hoạt tính riêng còn lại

Từ kết quả trên, Topt của enzyme tự do là khoảng 80 - 85 o C trong khi α- amylase cố định hoạt động tốt trong khoảng 85 – 90 o C Chứng tỏ: nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định đã tăng so với enzyme tự do Đồng thời dựa vào kết quả chúng tôi cũng xác nhận enzyme cố định cố khoảng nhiệt độ ổn định cao hơn so với enzyme tự do

4.6.2 Enzyme glucose – amylase cố định

4.6.2.1 Ảnh hưởng của pH Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme cố định, chúng tôi tiến hành thay đổi giá trị pH của môi trường phản ứng từ 3,0 – 5,5 bằng dung dịch đệm acetat và xác định hoạt tính ở nhiệt độ 60 o C Chúng tôi thu được kết quả sau:

Bảng 4.17: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính glucose - amylase cố định pH

Hoạt tính riêng còn lại (%)

Dựa vào bảng 4.17, chúng tôi xác định được pH tối ưu của enzyme tự do khoảng 3,6 – 4,2 và của enzyme cố định là khoảng 4 – 4,5 điều này chứng tỏ rằng pHopt của enzyme cố định đã dịch chuyển về phía kiềm so với enzyme tự do

Nguyên nhân của sự thay đổi pH có thể là do ảnh hưởng điện tích của môi trường xung qua trung tâm hoạt động của α-amylase Chúng tôi cũng nhận thấy enzyme cố định ổn định trong khoảng pH hoạt động rộng hơn so với enzyme tự do

4.6.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Từ thí nghiệm trên, chúng tôi xác định được pHopt của enzyme cố định, và giá trị pH này được dùng để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme Kết quả thu được như sau:

Bảng 4.18: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính glucose - amylase cố định

Nhiệt độ phản ứng ( o C) Hoạt tính riêng còn lại

Từ kết quả trên, Topt của enzyme tự do là 60 o C trong khi glucose - amylase cố định hoạt động tốt trong khoảng 60 - 65 o C Chứng tỏ: nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định đã tăng so với enzyme tự do Đồng thời dựa vào kết quả chúng tôi cũng xác nhận enzyme cố định cố khoảng nhiệt độ ổn định cao hơn so với enzyme tự do

Ngoài ra, hoạt tính riêng còn lại của enzyme cố định giảm khi ở nhiệt độ 75 o C và 80 o C.

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TÁI SỬ DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH

Enzyme cố định được sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần để thủy phân tính bột với thành phần không thay đổi như sau:

− 25ml dung dịch tinh bột 1%

− 1g chế phẩm α-amylase cố định

− Thời gian thủy phân 10 phút

Chúng tôi thu được kết quả sau:

Số lần tái sử dụng

Hình 4.17: Khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định

Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy enzyme sau không thay đổi hoạt tính sau 2 lần sử dụng Enzyme α – amylase có khả năng tái sử dụng 21 lần và hoạt tính giảm 50% sau 13 lần sử dụng Hoạt tính giảm nhanh có thể là do trong quá trình cố định, một số phân tử enzyme α-amylase được gắn kết bởi quá trình hấp phụ đã bị thất thoát ra ngoài sau quá trình rửa, làm cho hoạt tính sau đó giảm đi đáng kể

Enzyme cố định được sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần để thủy phân tính bột với thành phần không thay đổi như sau:

− 25ml dung dịch tinh bột 1%

− 1g chế phẩm glucose - amylase cố định

− Thời gian thủy phân 10 phút

Chúng tôi thu được kết quả sau:

Số lần tái sử dụng

Hình 4.18: Khả năng tái sử dụng của chế phẩm glucose - amylase cố định

Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy enzyme glucose – amylase có khả năng tái sử dụng 17 lần Tuy nhiên sau lần sử dụng thứ hai, hoạt tính riêng còn lại bắt đầu giảm và còn 50% sau 10 lần sử dụng Hoạt tính giảm nhanh hơn so với α-amylase cố định.

KHẢO SÁT THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH

Thời gian bảo quản đối với enzyme α - amylase tự do ở nhiệt độ phòng là 3 tháng, còn ở nhiệt độ lạnh từ 0 – 10 o C bảo quản được đến 1 năm, enzyme glucose – amylase bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 o C là 2 năm

Theo nghiên cứu của M A Abd El-Ghaffar, M S Hashem thì enzyme α – amylase cố định trên chitosan còn lại 61,12% hoạt tính sau 90 ngày bảo quản ở nhiệt độ 25 o C, trong đệm phosphate:

Hình 4.19: Hoạt tính của chế phẩm α-amylase cố định sau 1 thời gian bảo quản so với enzyme tự do [20]

Chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu thời gian bảo quản của enzyme cố định ở nhiệt độ 0 – 10 o C nhận thấy rằng:

- Hoạt tính của enzyme α – cố định trên chitosan còn lại 68,6% hoạt tính ban đầu sau 60 ngày bảo quản

- Hoạt tính của enzyme glucose – amylase cố định trên chitosan còn lại 57.3% hoạt tính ban đầu sau 60 ngày bảo quản.

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME CỐ ĐỊNH TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT

TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT:

Quá trình thủy phân tinh bột từ các nguồn nguyên liệu khác nhau để tạo ra glucose syrup và maltose syrup được thực hiện bởi các phản ứng enzyme Trong đó enzyme α – amylase và glucose – amylase là 2 enzyme được sử dụng rộng rãi nhất

Việc nghiên cứu cố định enzyme α – amylase và glucose – amylase trên chitosan nhằm mục đích cải thiện một số công đoạn trong quá trình sản xuất syrup nhờ vào tính chất của enzyme cố định như:

- Độ ổn định nhiệt và pH của enzyme cố định tốt hơn so với enzyme tự do

- Nhiệt độ tối thích của enzyme cố định cao hơn so với enzyme tự do, do vậy quá trình làm nguội được rút ngắn

- pH tối thích của enzyme cố định cũng lớn hơn so với enzyme tự do, nhờ đó quá trình điều chỉnh pH cũng được rút ngắn

- Chế phẩm enzyme cố định dễ dàng được loại bỏ trong sản phẩm bằng phương pháp lọc hay ly tâm mà không cần đến các phản ứng vô hoạt như ở enzyme tự do

- Ưu điểm lớn nhất của enzyme cố định là có khả năng tái sử dụng được nhiều lần Nhờ vậy chi phí sản xuất cũng được giảm thiểu

Qui trình công nghệ sản xuất syrup glucose từ tinh bột bằng enzyme cố định:

Tinh bột → Trộn với nước → Chỉnh pH hỗn hợp về pH = 6 → Bổ sung chế phẩm enzyme α – amylase cố định trên chitosan → Gia nhiệt đến 90 – 95 o C và giữ nhiệt trong 1 giờ → Mở van lọc giữ enzyme α – amylase cố định→ Chuyển dịch lọc tới bồn đường hóa , làm nguội về 60 – 65 o C → Chỉnh pH hỗn hợp về 4.5 → Bổ sung chế phẩm glucose – amylase cố định trên chitosan → Giữ hỗn hợp ở 60 – 65 o C trong 24 giờ → Lọc tách enzyme glucose – amylase cố định → Khử màu bằng than hoạt tính → Lọc tách than → Cô đặc → Glucose syrup

Có ba giai đoạn trong việc chuyển đổi tinh bột:

- Hồ hoá, liên quan đến việc giải phóng cấu trúc hạt tinh bột, chuyển từ trạng thái tính thể sang trạng thái vô định hình do hạt tinh bột hydrate hóa mạnh thành dung dịch keo để tạo thành dạng huyền phù nhớt

- Dịch hoá, liên quan đến sự cắt mạch nhanh chóng các chuỗi amilose và amilopectin do tác dụng thủy phân của enzyme α – amylase làm giảm nhanh độ nhớt

- Đường hoá, liên quan đến hoạt động của enzyme gluco-amilase thủy phân nốt các liên kết α-1-4, 1-3 và 1-6 glucoside trong các đoạn oligosaccharide (các dextrin mạch ngắn) thành glucose

Theo lý thuyết, sản phẩm thủy phân kết hợp 2 enzym có khoảng 97% glucose, 3% còn lại chủ yếu là maltose và isomaltose

Do thời gian làm luận văn giới hạn nên chúng tôi chưa thu thập số liệu thủy phân tinh bột bằng hai loại enzyme α – amylase và glucose – amylase cố định Vì vậy chúng tôi có kiến nghị sau:

- Nghiên cứu các điều kiện thủy phân tinh bột bằng enzyme α – amylase và glucose – amylase cố định trên chitosan

- Tối ưu hóa điều kiện thủy phân tinh bột.

THIẾT BỊ ĐỀ NGHỊ TRONG PHẢN ỨNG ENZYME VỚI CƠ CHẤT

Hình 4.20: Sơ đồ thiết bị thủy phân tinh bột bằng hai enzyme α – amylase và glucose – amylase cố định trên chitosan

Trong sơ đồ hệ thống này chúng tôi sử dụng thiết bị phản ứng tuần hoàn có tấm ngăn, do enzyme cố định trên chitosan có kích thước nhỏ và nhẹ, việc sử dụng tấm ngăn không cản trở dòng ra và dòng hoàn lưu của cơ chất nhưng ngăn không kéo theo chế phẩm enzyme cố định

Thuyết minh sơ đồ: dung dịch tinh bột sau khi được hồ hóa sẽ cho qua thiết bị phản ứng enzyme [1] Trong thiết bị này chứa enzyme α – amylase cố định, nhiệt độ và pH bên trong thiết bị phản ứng được giữ ổn định bởi thiết bị điều khiển nhiệt độ và pH Quá trình dịch hóa được thực hiện bởi enzyme α – amylase cố định Dòng hoàn lưu bên ngoài thiết bị nhằm tăng khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất

Dòng tinh bột sau khi được dịch hóa sẽ được cho qua thiết bị phản ứng [2] có chứa enzyme glucose – amylase cố định nhằm thực hiện quá trình đường hóa Sản phẩm cuối cùng sẽ được thu nhận thông qua đường ống bên dưới thiết bị.