Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Cố định Enzyme Lactase thu nhận từ vi khuẩn Lactobacillus Acidophilus

Tuy nhiên enzym cố định có nhiều ưu điểm so với enzyme tự do khi ứng dụng vì: Chất mang đóng vai trò như một tác nhân bảo vệ enzyme chống lại các ảnh hưởng bất lợi từ môi trường như nồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS TRẦN BÍCH LAM

2 PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Phản biện 1

3 TS PHAN NGỌC HÒA Phản biện 2

4 TS LẠI QUỐC ĐẠT Thư ký

5 TS TRẦN BÍCH LAM Ủy viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 15/08/1987 Nơi sinh: Quảng Ngãi Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Mã số: 605402

I TÊN ĐỀ TÀI: CỐ ĐỊNH ENZYME LACTASE THU NHẬN TỪ VI KHUẨN

LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

 Tổng quan tài liệu về enzyme lactase (β-galactosidase) và các phương pháp cố định enzyme

 Khảo sát chọn phương pháp cố định enzyme lactase tinh chế từ Lactobacillus

acidophilus

 Tối ưu hóa điều kiện cố định lactase  Xác định tính chất động học và khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme cố định

 Thử nghiệm khả năng sử dụng chế phẩm để thủy phân lactose trong sữa

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/07/2012 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14/03/2013 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS TRẦN BÍCH LAM

Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 03 năm 2013

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Bích Lam Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên những lúc em gặp trở ngại khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy cô Bộ môn công nghệ thực phẩm đã truyền đạt kiến thức, cũng như kinh nghiệm quý báu trong suốt những năm học tại trường

Con xin cảm ơn má và anh hai, các em đã luôn yêu thương và là chỗ dựa vững chắc về mọi mặt trong cuộc sống

Em xin thành cảm ơn chị Phượng, các bạn ở Phòng thí nghiệm Vi sinh đã tạo điều kiện, chia sẻ và động viên trong thời gian thực hiện luận văn

Xin cảm ơn các thành viên trong lớp Cao học thực phẩm 2010, 2011, các bạn sinh viên khóa 08 – Công nghệ thực phẩm, cũng như các anh chị và bạn bè thân quen đã luôn chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 03 năm 2013

ĐÀO THỊ MỸ LÂM

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cố định enzyme lactase từ

vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và khảo sát khả năng thủy phân lactose của

enzyme cố định trong sữa và dịch whey Để chọn phương pháp cố định thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát 3 phương pháp cố định: phương pháp cố định lactase trên silica bằng liên kết cộng hóa trị; cố định lactase trên chitosan bằng liên ngang bởi chất liên kết glutaradehyde và cố định nhốt lactase trong gel Ca-alginate Kết quả cho thấy enzyme lactase cố định bằng phương pháp nhốt trong gel Ca-alginate là hiệu quả nhất với nồng độ dung dịch tạo gel là 2.5%, hiệu suất cố định đạt 63.81% và enzyme cố định còn 62% hoạt tính so với enzyme tự do Chế phẩm enzyme lactase cố định có hoạt tính 0.311 U/g hạt gel ướt với Topt khoảng 40 –45oC so với enzyme tự do là 400C và pHopt 7.5, bằng kết quả pH tối ưu của enzyme tự do Enzyme cố định bền nhiệt hơn enzyme tự do, ở 400C sau thời gian 180 phút còn 62.22% hoạt tính so với ban đầu Ở 400C thời gian bán hủy là 346.6 phút và hằng số tốc độ là 0.002 phút-1 Chế phẩm enzyme cố định có tốc độ phản ứng cực đại Vm và hằng số động học Km lần lượt là 1.68µmol/phút và 1.09mM với cơ chất ONPG Tốc độ phản ứng cực đại của chế phẩm enzyme cố định giảm 1.37 lần và hằng số động học tăng 1.50 lần so với enzyme tự do Enzyme cố định có khả năng tái sử dụng, sau 10 lần sử dụng hoạt tính của enzyme cố định còn 85.87% so với ban đầu Chế phẩm enzyme cố định có khả năng thủy phân 57.40% lactose trong 10ml sữa với tỷ lệ chế phẩm 3g hạt (tương ứng hoạt tính tổng 0,95U) sau thời gian 2 giờ 30 phút và thủy phân 82.42% lactose trong 10ml dịch whey với tỷ lệ chế phẩm 2.5g hạt (tương ứng hoạt tính tổng 0,79U) sau thời gian 3 giờ

In this study, we studied to immobilize lactase enzyme from Lactobacillus

acidophilus and experiment to apply immobilized enzyme to hydrolyze lactose in milk

and whey To select appropriate immobilization method, we experimented three methods: immobilize lactase on silica gel by a covalent bonding method; immobilize lactase on glutaradehyde-crosslinked chitosan and immobilize lactase in Ca-alginate gel by the trapping method The results showed that immobilized lactase in Ca-alginate gel was more effective than those immobiliztion methods, with immobilization yield 63.81% and its catalytic activity retention 62% compared to the free enzyme The immobilized lactase enzyme has catalytic activity 0.311 U/g wet gel particles at pH 7.52 and temperature 46.20C The optimum temperature for free enzyme and immobilized enzyme were 400C and about 40-450C, the optimum pH for free enzyme and immobilized enzyme were 7.5, respectively The immobilized enzyme was more stable at high pH and temperature than the free enzyme At 400C after 180 minutes, the immobilized enzyme has activity retention 62.22% compared to the initial activity At 400C, the half-life of immobilized lactase was 346.6 minutes and Ki was 0002 min-1 The kinetic parameters for immobilized lactase were also determined with ONPG, Vm 1.68μmol/minute, decreased 1.37 times and Km 1.09mM, increased 1.50 times compared to the soluble enzyme The operational stability showed 85.87% retention of the immobilized enzyme activity after 10 reuses The immobilized enzyme showed lactose hydrolysis of 57.40% of lactose in 10ml milk in 2 hours 30 minutes and 82.42% of lactose in 10ml whey in 3 hours

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi và được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Trần Bích Lam

Các số liệu, những kết luận nghiên cứu trong luận văn là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác cũng như chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 03 năm 2013

Học viên thực hiên

ĐÀO THỊ MỸ LÂM

1.1.2 Nguồn thu nhận enzyme lactase 11

1.2 Enzym lactase của vi khuẩn L acidophilus 14

1.2.1 Vi khuẩn L acidophilus 14

1.2.2 Lactase từ L acidophilus 16

1.3 Tổng quan enzyme lactase cố định 16

1.3.1 Định nghĩa enzyme cố định 16

1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme lactase 16

1.3.3 Tính chất của enzyme lactase cố định 19

1.3.4 Ứng dụng enzyme lactase cố định thủy phân lactose trong sữa/dịch whey và tổng hợp GOS 24

1.3.5 Tính chất của một số chất mang dùng cố định enzyme 26

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 33

2.3.2 Khảo sát điều kiện cố định 39

2.3.3 Xác định tính chất của chế phẩm enzyme lactase cố định 39

2.3.4 Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme cố định thủy phân lactose trong sữa và dịch whey 40

2.4 Các phương pháp phân tích 41

2.4.1 Xác định hoạt tính enzyme lactase với cơ chất ONPG beta-D-galactopyranoside) 41

(o-nitrophenol-2.4.2 Định lượng protein bằng phương pháp Lowry 42

2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng lactose 43

2.4.4 Xác định các thông số động học Km, Vm 44

2.4.5 Phương pháp xác định hiệu suất cố định 44

2.4.6 Hệ số tốc độ và thời gian bán hủy của enzyme lactase 45

2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 46

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47

3.1 Xác định tính chất enzyme lactase tự do: 47

3.2 Khảo sát phương pháp cố định: 48

3.3 Xác định điều kiện cố định 51

3.3.1 Khảo sát nồng độ Na-alginate trong dung dịch tạo gel 51

3.3.2 Khảo sát tỷ lệ enzyme / alginate 55

3.4 Xác định tính chất của enzyme cố định: 57

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme cố định: 57

3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cố định: 60

3.4.3 Khả năng tái sử dụng 66

3.5 Xác định tính chất động học của enzyme cố định 67

3.6 Ứng dụng enzyme cố định thủy phân lactose trong sữa và dịch whey 68

3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm enzyme cố định/thể tích sữa và dịch whey đến hiệu suất thủy phân lactose 68

3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân

lactose của sữa và dịch whey 70

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn thu nhận enzyme lactase 11

Bảng 1.2 Các tính chất của enzyme lactase từ các nguồn vi sinh vật 13

Bảng 1.3 Các chất mang sử dụng cố định lactase bằng phương pháp hấp phụ 17

Bảng 1.4 Các chất mang sử dụng cố định lactase bằng phương pháp nhốt (bẫy) 18

Bảng 1.5 Các chất mang sử dụng cố định lactase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị 19

Bảng 1.6 Những nghiên cứu cố định lactase ứng dụng trong công nghiệp thủy phân lactose có hiệu quả cao 26

Bảng 2.1 Các bước xác định hoạt tính β-galactosidase 42

Bảng 3.1 Tính chất của enzyme lactase tự do 47

Bảng 3.2 Hiệu suất cố định và hoạt tính enzym cố định trên các loại chất mang 49

Bảng 3.3 Độ nhớt của dung dịch alginate theo nồng độ 52

Bảng 3.4 Hiệu quả cố định enzyme theo nồng độ Na-alginate trong dung dịch tạo gel 53

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme trong gel alginate đến hoạt tính chế phẩm enzyme lactase cố định 55

Bảng 3.6 Thời gian bán hủy và hệ số tốc độ vô hoạt ki của enzyme lactase tự do và cố định trong chất mang Ca-alginate 60

Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện hoạt động của enzyme cố định 62

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hàm mục tiêu trong điều kiện hoạt động của enzyme cố định 63

Bảng 3.9 Kết quả phân tích phương sai của thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện hoạt động của enzyme cố định 64

Bảng 3.10 Hiệu suất thủy phân lactose trong sữa và dịch whey theo lượng chế phẩm enzyme cố định sử dụng 68

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thủy phân lactose bởi xúc tác enzyme lactase 10

Hình 1.2 Hình ảnh vi khuẩn L acidophilus 15

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Chitosan 27

Hình 1.4 Hình ảnh và cấu trúc của hạt silica gel 28

Hình 1.5 Hình ảnh các kiểu block của alginate 29

Hình 1.6 Phương pháp tạo gel từ bên ngoài và bên trong 30

Hình 1.7 Sự hình thành gel với ion Ca2+ 31

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 34

Hình 2.2 Quá trình xử lý aminoalkyl hóa silica gel 36

Hình 2.3 Gắn kết enzyme lên chất mang 36

Hình 2.4 Phản ứng phân giải ONPG dưới tác dụng của -galactosidase (lactase) 41

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định và hoạt tính enzyme cố định trên các chất mang khác nhau 50

Hình 3.2 Hoạt tính enzyme cố định tái sử dụng lần 2 51

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Na-alginate đến độ nhớt dung dịch tạo gel 52

Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch alginate đến hiệu suất cố định và hoạt tính của enzyme cố định 54

Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ đơn vị hoạt tính enzyme bổ sung trên mililit dung dịch tạo gel đến hiệu suất cố định và hoạt tính của chế phẩm enzyme cố định 56

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme tự do và cố định 58

Hình 3.7 Độ bền nhiệt của enzyme 59

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme tự do và cố định 61

Hình 3.9 Đồ thị bề mặt đáp ứng của điều kiện môi trường đến hoạt động của enzyme cố định 65

Hình 3.10 Hình chiếu bề mặt đáp ứng trên mặt phẳng trong phương pháp tối ưu hóa điều kiện hoạt động của enzyme cố định 65

Hình 3.11 Hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme cố định sau những lần tái sử dụng

66

Hình 3.12 Đồ thị xác định Km và Vmax theo phương pháp Lineaweaver Burk 67

Hình 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm đến hiệu suất thủy phân lactose trong

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

GRAS: Generally reognized as safe

galactopyranoside

ONPG:o-Nitrophenyl-β-D-GOS: Galacto-oligosaccharides

CMC: Carboxylmethyl cellulose

DEAE: Diethylaminoethyl cellulose

Km: Hằng số Michaelis – Menten Vm: Vận tốc cực đại

G: Acid α-L-guluronic

M: acid 1,4-β-D-mannuronic

pHopt: pH tối ưu Topt: Nhiệt độ tối ưu U: Unit

3-APTES:3-aminopropyl triethoxysilane

PEI: polyethyleneimine

PVC: polyvinyl clorua

PVA: polyvinyl alcohol

RSM:Response surface methodology

CCD: Centre composite design

OD: mật độ quang Optical Density

Demand_Nhu cầu oxy hóa sinh học mPOS-PVA: polysiloxanse-polyvinyl alcohol

MỞ ĐẦU

Enzym lactase, còn có tên gọi là enzyme β-galactosidase xúc tác phản ứng thủy phân lactose tạo glucose và galactase Lactase là một enzyme quan trọng bậc nhất trong công nghiệp chế biến sữa, đặc biệt cần cho những người không dung nạp lactose do cơ thể thiếu gen mã hóa loại enzyme này, gây kém tiêu hóa do không thể chuyển hóa đường lactose trong ruột, dẫn đến sự khó chịu, chuột rút và tiêu chảy Enzyme lactase còn xúc tác phản ứng chuyển vị galactose (transgalactosyl) tạo thành galacto-oligosaccharide (GOS), là một prebiotic có lợi cho sức khỏe

Việc sản xuất lactase có giá trị ứng dụng công nghiệp và nhiều ứng dụng khác:  Tăng khả năng dung nạp thực phẩm chứa lactose cho những người không dung nạp lactose

 Cải tiến tính chất công nghệ và các đặc tính cảm quan vì làm tăng độ hòa tan, tăng độ ngọt, tăng năng lượng

 Sự thủy phân lactose hình thành các monosaccharide giúp vi sinh vật dễ dàng chuyển hóa trong một số sản phẩm lên men

 Ứng dụng quan trọng trong chế biến dịch whey phomat, nâng cao giá trị sản phẩm

 Sản xuẩt GOS, là một prebiotic hỗ trợ sự phát triển của hệ vi khuẩn đường ruột tốt cho sức khỏe con người

Có nhiều nguồn thu nhận lactase: động vật, thực vật và vi sinh vật Trong đó thu nhận từ vi sinh vật được quan tâm nhiều nhất và đã thương mại hóa bởi nhiều ưu điểm: thu nhận đơn giản, nguồn nguyên liệu ổn định và phong phú (dễ nuôi cấy và sinh trưởng nhanh), hiệu suất cao

Nguồn vi sinh vật cho enzyme lactase gồm nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

Nguồn enzyme lactase từ nhóm vi khuẩn lactic, trong đó có Lactobacillus acidophilus

đang được tập trung nghiên cứu và ứng dụng do có tính ổn định, điều kiện nhiệt độ và pH hoạt động thích hợp trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là công nghệ chế biến sữa Và một đặc tính quan trọng nữa là tính an toàn, do đó thích hợp ứng dụng cho thực phẩm và dược phẩm Tuy nhiên hoạt tính xúc tác của enzyme này khi sử dụng vi

khuẩn L acidophilus trực tiếp trong sản xuất sữa là không cao, chỉ thủy phân chưa tới

20% lactose trong sữa, do đó để tăng hiệu suất thủy phân thì cần thiết thu nhận và tinh chế nguồn enzyme này và sử dụng

Chế phẩm enzyme lactase được sử dụng ở dạng tự do và cố định Tuy nhiên enzym cố định có nhiều ưu điểm so với enzyme tự do khi ứng dụng vì:

Chất mang đóng vai trò như một tác nhân bảo vệ enzyme chống lại các ảnh hưởng bất lợi từ môi trường như nồng độ cơ chất cao, sự thay đổi pH, nhiệt độ, sự có mặt của các chất ức chế như galactose, ion kim loại…

 Khoảng nhiệt độ hoạt động của enzyme cố định rộng hơn, nhờ đó tăng khả năng ứng dụng của chế phẩm trong thực tiễn

 Dễ dàng thu hồi sản phẩm, giảm bớt công đoạn phân riêng, do đó giảm chi phí về thiết bị và năng lượng

 Có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần trong khi vẫn đảm bảo được hoạt tính sinh học ổn định

 Có thể sử dụng cho quá trình sản xuất liên tục

Trong nghiên cứu này, enzyme lactase thu nhận từ L acidophilus sẽ được nghiên

cứu phương pháp gắn trên một chất mang phù hợp nhằm tạo được một chế phẩm lactase cố định và nghiên cứu các đặc tính của chế phẩm này, cũng như khả năng ứng dụng của chế phẩm

Nội dung nghiên cứu gồm:

 Khảo sát chọn phương pháp cố định lactase  Xác định quy trình và các thông số tạo chế phẩm lactase cố định  Nghiên cứu tính chất của chế phẩm lactase cố định

 Thử nghiệm ứng dụng thủy phân lactose trong sữa và dịch whey

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Enzyme lactase 1.1.1 Phản ứng xúc tác của lactase

Lactase là tên gọi thông thường của β-D-galactosidase, hay β-D-galactoside galactohydrolase, E.C 3.2.1.23), thủy phân liên kết β-D-1,4-galactosidic, bao gồm lactose, oligosaccharides và polysaccharides (Rark và cộng sự, 2010)

Lactase xúc tác phản ứng thủy phân lactose tạo glucose và galactase

Hình 1.1 Thủy phân lactose bởi xúc tác enzyme lactase

Ngoài xúc tác phản ứng thủy phân lactose, lactase còn xúc tác phản ứng transgalactosyl chuyển hóa lactose thành Galacto-oligosaccharide (GOS) (Zárate và López-Leiva, 1990) GOS bao gồm Galacto-disaccharides (GOS-2), Galacto-trisaccharides (GOS-3), Galacto-tetrasaccharides (GOS-4), và pentasaccharides GOS được coi như một prebiotic, kích thích sự sinh sôi của hệ vi khuẩn lactic và hệ vi sinh vật đường ruột giúp cải thiện sức khỏe con người (Sako và cộng sự, 1999)

Khả năng xúc tác của lactase cho phản ứng transgalactosyl và phản ứng thủy phân lactose là như nhau Tỷ lệ xảy ra giữa 2 phản ứng trên phụ thuộc vào nguồn thu lactase

(Cheng và cộng sự, 2006) Enzyme lactase từ Eschrichia coli và Aspergillus niger,

Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis có tác dụng mạnh cho xúc tác phản ứng

thủy phân Trong khi đó lactase từ Aspergillus oryzae hay Bacillus circulans có tác

dụng mạnh cho xúc tác phản ứng transgalactosyl (Prenosil và cộng sự, 1987; Nakanishi và cộng sự, 1983; Mahoney, 1985; Sheu và cộng sự, 1998)

1.1.2 Nguồn thu nhận enzyme lactase

Nguồn thu enzyme lactase có trong cả động vật, thực vật và vi sinh vật Thường

thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật, đặc biệt là từ nấm mốc Aspergillus và Penicillium (Nagy và cộng sự, 2001; Haider và Husain, 2008), nấm men Kluyveromyces (Kim và cộng sự, 2004), vi khuẩn E coli, Bacillus, Bifidobacterium (Phan Tran và cộng sự, 1998; Moller và cộng sự, 2001) và Sulfolobus và Pyrococcus (Petzelbauer và cộng sự, 1999) Ngoài ra còn có nguồn enzyme lactase chịu nhiệt từ Sulfolobus solfataricus (Pisani và cộng sự, 1990), Pyrococcus woesei (Xiong và cộng sự, 2007), Thermotoga

maritime (Kim và cộng sự, 2004) và Thermus sp T2 (Ladero và cộng sự, 2003),

…(Park và Oh, 2010) Cụ thể được tổng hợp trong bảng sau:

Bảng 1.1 Nguồn thu nhận enzyme lactase (Sanders và Klaenhammer, 2001; Fatma, 2007;

(Amygdalus

communis)

Trái cây chín (tồn tại ở quá trình chín giúp làm mềm vỏ, do làm enzyme này thủy phân làm giảm nồng độ galactosyl trong vách tế bào và thành phần liên kết với

pectin)

Vi sinh vật

Candida pseudotropicalis Saccharomyces anamensic, S lactis, S fragilis Kluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K

marxianus

Nấm mốc Aspergillus niger, A oryze, A foelidis, A fonsecaeus, A

carbinarius Penicillum canescens, P chrysogenum, P expansum

Streptomyces violaceus Curvularia inaequalis Alternaria alternate, Alternaria palmi

Auerobasidium pullulans

Fusarium monilliforme, Fusarium oxysporum

Mucor meihei, Muco pusillus Neurospora crassa Saccharopolyspora rectivergula

Scopulariapsis sp

Lactobacillus acidophilus; L delbrueckii; L bulgaricus; L kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L

themophilus, L Delbrueckii; Streptococcus thermophilus Bifidobacterium bifidum, B breve, B longumstrains; B

infantis Alicyclobacillus acidocaldarius subsp; A rittmannii

Arthrobacter sp Bacillus acidocaldarius, B circulans, B coagulans, B

subtilis, B megaterum, B stearothermophilus

Bacteriodes polypragmatus Clostridium acetobutylicum,C thermosulfurogens

Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E cloaceae

Klebsiella pneumoniae Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, P pento

Propioionibacterium shermanii Pseudomonas fluorescens Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, S lactis, S thermophius

Sulfolobus solfatarius Thermoanaerobacter sp Thermus rubus, T aquaticus

Trichoderma reesei Vibrio cholera Xanthomonas campestris

So sánh enzyme từ các nguồn phân bố khác nhau

Enzyme lactase từ nấm mốc có thể là enzyme ngoại bào và nội bào Enzyme lactase từ nấm men, vi khuẩn là enzyme nội bào Enzyme ngoại bào được thu nhận dễ dàng hơn, còn với nguồn enzyme nội bào để thu nhận cần phá vỡ tế bào vủa vi sinh

Chất ức chế

A oryae

124 90

3.0-4.0 5.0

55-60 50-55

- -

- -

Enzyme lactase từ nấm mốc không những có pH tối ưu là vùng acid từ 3-5 mà còn có khoảng nhiệt độ tối ưu cao từ 55-600C làm ức chế nhiều vi sinh vật phát triển Tuy nhiên nguồn enzyme này thường không tinh khiết bằng các nguồn enzyme còn lại, chúng thường có lẫn các enzyme khác như protease, lipase và amylase Do đó làm hạn

chế khả năng ứng dụng loại enzyme từ nguồn này trong các sản phẩm không có tính acid hay sử dụng cho dược phẩm (Mahoney, 1985)

Enzyme từ nấm men, đặc biệt từ nguồn K lactis được sản xuất thương mại và sử

dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa tạo sản phẩm cho những người không dung nạp lactose, có hoạt tính cao ở pH từ 6-7 (Pivarnik, Senecal, và Rand, 1995; Rech và Ayub, 2007)

Enzyme lactase từ nguồn vi khuẩn, đặc biệt nhóm vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đa dạng của lactococci, streptococci và lactobacilli đã và đang trở thành trọng tâm nghiên cứu vì chúng được coi là an toàn (theo GRAS, Generally recognized as safe) nên enzyme từ nguồn này có thể sử dụng mà không cần quá trình tinh sạch phức tạp (Vasiljevic và Jelen, 2001) Ngoài ra, khả năng hoạt động của enzyme từ nguồn vi

khuẩn là mạnh và có tính ổn định

Trong các enzyme lactase từ vi khuẩn thì nguồn từ E coli được dùng làm mô hình

nghiên cứu cơ chế hoạt động nhưng không dùng trong thực phẩm vì sinh ra độc tố Ngoài ra, để tăng khả năng sinh tổng hợp lactase ngày nay có nhiều nghiên cứu tạo giống vi sinh vật tái tổ hợp

1.2 Enzym lactase của vi khuẩn L acidophilus 1.2.1 Vi khuẩn L acidophilus

Theo phân loại của Bergey thì L acidophilus

 Giới: Bacteria  Ngành: Firicules  Lớp: Bacilli  Bộ: Lactobacillales  Họ: Lactobacillaceae  Chi (giống): Lactobacillus

 Loài: L acidophilus

Hình 1.2 Hình ảnh vi khuẩn L acidophilus

L acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lactic Là trực khuẩn Gram dương, không di

động, có chiều dài 1.5 đến 6.0 µm, chiều rộng 0.6 đến 0.9 µm Các tế bào vi khuẩn này thường xếp theo dạng cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn Khuẩn lạc trong môi trường thạch có kích thước 2 đến 5 mm, lồi, đục, mịn, bóng và không có sắc tố (Gopal, 2011)

L acidophilus sử dụng nguồn carbon lactose, glucose, sucrose, maltose, mannose,

esculin, salicin; không lên men arabinose, xylose, rhammose, ribose, sorbitol Nguồn cacbon được sử dụng để sản sinh năng lượng và sinh acid lactic

Ở người L acidophilus thường cư trú ở đường tiêu hóa, miệng và âm đạo L

acidophilus là vi khuẩn vi hiếu khí hoặc kỵ khí Nhiệt độ tối ưu cho L acidophilus

phát triển thường từ 35-40oC, có một vài loài phát triển ở 45oC, pH tối ưu từ 5.5 đến 6.0, tuy nhiên chúng có thể sống ở môi trường có tính acid cao pH 4-5 hoặc thấp hơn

L acidophilus sinh sản bằng cách chia đôi hay trực phân L acidophilus đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men nhiều loại thực

phẩm như sữa, lên men trái cây và rau quả Có rất nhiều sản phẩm sữa lên men sử

dụng L acidophilus ví dụ ở thị trường Mỹ có sản phẩm sữa acidophilus ngọt và sữa

acidophilus chua, được tiêu thụ bởi người kém tiêu hóa và những người không dung nạp lactose

L acidophilus cũng được sử dụng cùng với các vi khuẩn lactic khác trong công

nghệ sản xuất sữa đề làm giảm pH, đưa sữa về điểm đẳng điện để tạo tính động tụ, tạo gel cho sữa chua Trong quá trình lên men yogurt và nước uống yogurt điều quan trọng

là phải chọn chủng L acidophilus có thể kết hợp với S thermophilus Tốc độ tăng trưởng của S thermophilus cao hơn nhiều so với L acidophilus, sự phát triển của L

acidophilus trong sữa sẽ giúp chuyển hóa một số sản phẩm của S thermophilus như

acid formic, pyruvate và CO2 (Jafarei và Ebrahimi, 2011)

1.2.2 Lactase từ L acidophilus

Enzym lactase thu từ vi khuẩn L acidophilus phân lập từ lên men Ragi (Eleusine

coracana) được phát hiện có hoạt tính tốt hơn so với lactase thương mại được sản xuất

bởi K lactis Enzym lactase từ L acidophilus có pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu là 5

và 500C, Km là 3.8mM, Vm là 120mM/ml.phút trên cơ chất nền sử dụng là nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (Akolkar và cộng sự, 2005)

p-Theo các nghiên cứu in vitro, Lactase của L acidophilus NCFM có hoạt tính

4.43.10-7 µg σ-nitrophenol/cfu.phút, đạt mức cao trong số tất cả các loại probiotic

Lactobacillus thử nghiệm Mức dao động hoạt tính của các probiotic Lactobacillus

khác là 0.01 – 4.73.10-7 µg của σ-nitrophenol/cfu.phút Tuy nhiên so với mức độ hoạt

động của lactase của các chủng S.thermophilus là 11.8 – 189.10-7 µg của

σ-nitrophenol/cfu.phút thì mức độ lactase của probiotic Lactobacillus là thấp

Theo Hughes và Hoover (1995), khi so sánh hoạt tính Lactase của NCFM với một số chủng bifidobacteria cho thấy rằng hoạt tính của Lactase NCFM là tương đương với

B bifidum, B.breve, và B longumstrains

Lactase nguồn L acidophilus được sử dụng để tổng hợp các prebiotic GOS từ

lactose với sản lượng GOS tối đa là 38.5% với sự chuyển đổi lactose là 75% Ngoài ra, còn có những kết quả như nhiệt độ hoạt động tối ưu là 550C, phạm vi pH hoạt động là 6.5 – 8 (Thu Ha và Barbara, 2006)

1.3 Tổng quan enzyme lactase cố định

1.3.1 Định nghĩa enzyme cố định

Enzyme cố định là những enzyme bị giữ bên trong hay gắn kết với các chất mang không tan trong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được khả năng xúc tác, có thể sử dụng lặp lại nhiều lần (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2009)

Các yêu cầu của quá trình cố định enzyme: (Cao và cộng sự, 2005)  Hiệu suất cố định và hoạt tính enzyme sau khi cố định càng cao càng tốt  Enzyme cố định có hoạt tính ổn định cao để có thể sử dụng được nhiều lần, giảm chi phí sản xuất

 Enzyme cố định có giá thành phù hợp

1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme lactase

Để cố định enzyme lactase thường có các phương pháp cố định sau:

Phương pháp vật lý hấp phụ

Là phương pháp mà enzyme được gắn kết với chất mang nhờ hấp phụ vật lý trên bề mặt chất mang, dựa vào sự tương tác vật lý như lực Vander Waals, liên kết hydro, tương tác kỵ nước, …

Chất mang sử dụng có thể là nguồn vô cơ (nhôm, thép không rĩ, silica, thủy tinh xốp, gốm sứ, mùn đất, đất sét, bentonits, …) hay hữu cơ (cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion như Amberlite, Sephadex, Dowex) Chất liên kết hỗ trợ có thể dùng là glutaraldehyde

Bảng 1.3 Các chất mang sử dụng cố định lactase bằng phương pháp hấp phụ (Parmjit và cộng

sự, 2010)

A.oryae Polyvinyl chloride & Silica gel membrane

Pisum sativum Sephadex G-75 & chitosan bead

Enzyme lactase từ K fragilis và K latis được nghiên cứu cố định trên chitosan có

hoạt tính 0.9-2.2U/mg tế bào khô Để hoạt tính thể hiện cao nhất khi sử dụng phương pháp cố định hấp phụ cho enzyme của nấm men cần sử dụng chất hỗ trợ Ostsorb-DEAE-cellulose

Enzym lactase từ A oryae cố định trên polyvinyl (PVC) và màng silica gel đã

được sử dụng cho quá trình thủy phân lactose trong sữa tách kem Hay enzyme thu từ

E coli có thể hấp phụ trên chromosorb-W

Enzym lactase từ nấm mốc A niger cố định trên polyvinyl ancohol gel có khả

năng chịu nhiệt hơn enzyme hòa tan, giữ được 70% hoạt tính sau 24 giờ ở nhiệt độ 500C và 5% hoạt tính ở 600

C, thủy phân 75% lactose trong 5-6 giờ và mức độ thủy phân còn đến 50% sau 30 lần sử dụng

Phương pháp nhốt (bẫy)

Là phương pháp mà enzyme được cố định bằng cách nhốt trong một cấu trúc mạng lưới gel hay màng polymer nhằm ngăn chặn sử giải thoát protein enzyme ra bên ngoài cấu trúc đó nhưng vẫn cho phép cơ chất và sản phẩm đi qua

Chất mang sử dụng là vật liệu polymer Ca-aginate, agar, κ-carragenin, polyacrylamide, collagen hay vật liệu rắn có cấu trúc ma trận như than hoạt tính, gốm xốp, đất mùn Hay cố định bởi các màng membrane như nylon, cellulose, polysulfone, polyacrylmide

Bảng 1.4 Các chất mang sử dụng cố định lactase bằng phương pháp nhốt (bẫy)

(Parmjit và cộng sự, 2010)

K lactis, A oryae, S cerevisiae Poly(vinylalcohol) hydrogel

Phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị

Là phương pháp cố định bằng cách hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa enzyme và chất mang Các phân tử enzyme liên kết bởi các chất hỗ trợ liên kết thông qua các nhóm chức như amin, cacboxyl, hydroxyl và nhóm sulfydryl Và các nhóm chức liên kết này không phải là nhóm chức hoạt động của enzyme Để tránh sự ức chế của cơ chất cũng như chất ức chế cạnh tranh, và cũng để bảo vệ nhóm chức hoạt động

của enzyme thì sử dụng các chất hỗ trợ liên kết như cyanogens bromide, carbodimide, và glutaraldehyde

Bảng 1.5 Các chất mang sử dụng cố định lactase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị

(Parmjit và cộng sự, 2010)

A.oryae Silica gel được hóa hóa bởi TiCl3 & FeCl3

E coli (Recombinant β-galactase) Cyanuric chloride-actived cellulose

B circulans Eupergit C (Spherical acrylic polymer)

 Makkar và cộng sự (1981) đã cố lactase từ L bulgaricus trong gel

polyacrylamide, hoạt tính của enzyme cố định chỉ đạt 31% so với hoạt tính của enzyme tự do

 Benevides và cộng sự (2007) cố định lactase từ E coli lên các chất mang khác

nhau và thấy rằng hiệu suất cố định đều đạt 100% Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme cố định cao nhất là ở chất mang sepharose được hoạt hóa bởi BrCN, hoạt tính chỉ đạt 95% so với enzyme tự do Và hoạt tính lactase cố định thấp nhất là ở chất mang agarose được hoạt hóa bởi polyethyleneimine (PEI), sử dụng tay nối glutaraldehyde, hoạt tính chỉ bằng 55% so với enzyme tự do

 Szczodrak, 2000 nghiên cứu cố định lactase từ K fragilis trên thủy tinh xốp

được xử lý bằng alkylamine và chất liên kết glutaraldehyde giữ được 90% hoạt tính của enzyme tự do

 Lactase từ K lactis được nghiên cứu cố định trên các chất mang xốp khác

nhau, CPC-silica và agarose CPC-silica được silanic hóa và gắn với enzyme nhờ chất liên kết glutaraldehyde, còn chất liên kết khi dùng chất mang agarose là cyanyl (CDAP) So sánh 2 loại chất mang cố định này cho thấy, hiệu suất cố định enzyme lactase lên CPC-silica (hiệu suất tối đa là 23mg/ml) cao hơn với CDAP-agarose (12,6mg/ml, 100% enzyme đem cố định chỉ có 34% thể hiện hoạt tính)

 Lactase nấm men cố định trên chitin và chitosan bởi liên kết ngang được tối ưu hóa và cho kết quả hoạt tính tương ứng là 4.105

U/Kg và 2,2.105U/Kg, tương ứng 33 và 23% so với hoạt tính của enzyme tự do

Nguyên nhân xảy ra hiện tượng giảm hoạt tính của enzyme khi cố định trên chất mang có thể là do:

 Khi gắn enzyme vào chất mang, dưới ảnh hưởng của điện tích ở chất mang, cấu hình của phân tử enzyme sau khi cố định bị thay đổi làm cho khả năng xúc tác của enzyme cũng bị thay đổi

 Khi gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị, một số hóa chất sử dụng trong quá trình cố định có thể làm vô hoạt bất thuận nghịch enzyme

 Tương tác protein-protein giữa các phân tử enzyme đã cố định làm biến đổi một phần cấu trúc không gian của phân tử enzyme, do đó hoạt độ xúc tác cũng giảm

Đối với trường hợp enzyme cố định bằng phương pháp nhốt trong khuôn gel, sự có mặt của chất mang có thể hạn chế khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme (nhất là đối với các cơ chất có kích thước phân tử lớn), do đó hoạt lực của enzyme cố định bị giảm đi (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004; Bailey và cộng sự, 1986)

1.3.3.2 Động học của enzyme lactase cố định

Các hằng số động học của enzyme cố định có thể bị biến đổi bởi do những thay đổi cấu trúc bên trong của phân tử enzyme cũng như do sự hạn chế khả năng tiếp xúc của enzyme và cơ chất Kết quả của hầu hết các nghiên cứu về enzyme lactase cố định cho thấy động học phản ứng thủy phân lactose bằng lactase cố định cũng tuân theo định luật Michaelis-Menten Đa số enzyme cố định có hệ số Km lớn hơn enzyme tự do:  Lactase từ A oryzae được cố định trong hệ gel alginate-gelatin có hằng số Km

của enzyme tự do và cố định lần lượt là 42mM và 51mM; Vm của enzyme tự do và cố

định lần lượt là 1.30 và 0.73 (mg glucose/phút.mg enzyme) (Tanriseven và cộng sự, 2002)

 Lactase từ A oryzae trong gel polyvinyl alcohol (PVA) có Km của enzyme lactase cố định là 71mM, giá trị Km của enzyme tự do là 61mM (Grosova và cộng sự 2008)

 Lactase từ A oryzae tự do cố định bằng phương pháp nhốt trong gel

alginate-gelatin với sự hỗ trợ của chất liên kết glutaraldehyde của nghiên cứu Freitas và cộng sự (2011) khi so sánh tính chất động học trong quá trình thủy phân lactose cho kết quả enzyme tự do thủy phân với nồng độ cơ chất lactose tối đa là 90g/L và enzyme cố định thủy phân với nồng độ cơ chất lactose tối đa là 140g/L ở nhiệt độ 350C và pH 4.5 Mô hình Michaelis-Menten với chất ức chế galactose cạnh tranh phù hợp với cả 2 loại enzyme tự do và cố định, giá trị Km và Vm của enzyme tự do là 52.13 ± 2.8mM và 2.56 ± 0.3 gglucose /L.phút.mgenzyme, và enzyme cố định tương ứng 60.30 ± 3.3 mM và 1032.07 ± 51.6 glactose/phút.m3enzyme cố định

 Nghiên cứu so sánh các hằng số động học của enzyme hòa tan và enzyme cố

định từ K lactis của Mateo và cộng sự (2004) cho kết quả: enzyme hòa tan có Km là 3.6mM, hằng số ức chế cạnh tranh gởi galactose là 45mM, và hằng số ức chế không cạnh tranh bởi glucose là 758mM Các giá trị Km và hằng số ức chế cạnh tranh của enzyme cố định có giá trị tương tự, nhưng trong một số trường hợp giá trị ức chế không cạnh tranh lại cao hơn nhiều so với enzyme hòa tan Trong nghiên cứu này còn cho biết, khi hỗ trợ glyoxyl hoặc glutaraldehyde trong cố định enzyme , hằng số ức chế không cạnh tranh được giảm đi rất nhiều (Ki ~ 15000>40000mM, tương ứng)

 Nghiên cứu Elnashar và cộng sự (2009) khi cố định lactase bằng liên kết cộng hóa trị trên chất mang chịu nhiệt carrageenan được phủ lớp chitosan (hydrogel), kết quả cho thấy các hằng số động học enzyme cố định tăng so với enzyme tự do, Kmtăng từ 13.2 lên 125mM, Vm tăng từ 3.2 lên 6.6 mM/phút so với enzyme tự do Khả năng chuyển đổi lactose của enzyme tự do và cố định thay đổi không đáng kể, tương ứng là 87% và 70% sau 7h

1.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme lactase cố định Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Enzyme lactase ứng dụng nhiều nhất trong công nghiệp chế biến sữa, do đó có nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất và sản phẩm thủy phân của lactase đến hoạt tính của chúng Kết quả nhiều nghiên cứu khẳng định galactose có tác dụng ức chế hoạt tính cả enzyme lactase tự do và cố định, trong khi đó glucose lại không có ảnh hưởng đáng kể

 Lactase bị ức chế ngược trở lại bởi sản phẩm thủy phân galactose, tuy nhiên

enzyme β-galactosidase của A oryzae cố định trên chitosan bằng phương pháp cộng

hóa trị được nghiên cứu chứng tỏ khả năng giảm sự ức chế hơn so với chất mang cố định là màng nylon (nylon membrane) (Portaccio và cộng sự, 1998)

 Nghiên cứu của Park và Oh (2010) về enzyme lactase từ C saccharolyticus tái

tổ hợp cho thấy galactose ức chế không cạnh tranh với enzyme Glucose có khả năng ức chế là thấp nhất Khi bổ sung 50g/L galactose thì hoạt động thủy phân của enzyme lên pNPGal giảm còn 26% Trong khi đó, nếu bổ sung 400g/L glucose thay vì galactose thì hoạt động của enzyme còn đến 82% Khi thêm 200g/L galactose chỉ có 14% lactose được thủy phân sau 180 phút Ngược lại khi bổ sung 400g/L glucose thì không ảnh hưởng đến quá trình thủy phân lactose, và hơn 99% lactose thủy phân sau 120 phút

 Kết quả nghiên cứu enzyme lactase từ K marxianus cố định trên chitin khi so

sánh khả năng ảnh hưởng của galactose, lactose và glucose đến sự giảm hoạt tính của enzyme, kết quả cho thấy, galactose là yếu tố tác động tích cực sự giảm hoạt tính của enzyme cố định, trong khi đó lactose lại có tác động ngược lại (làm tăng khả năng hoạt động của enzyme) và glucose có tác động không đáng kể (Illanes và cộng sự, 1998; Illanes và cộng sự, 2000)

Tuy nhiên, nhiều kết quả nghiên cứu cũng khẳng định enzyme cố định tỏ ra bền hơn dưới tác dụng của các chất ức chế, ví dụ:

 Nghiên cứu của Haider và cộng sự (2009) khi cố định enzyme lactase từ A

oryzae cho kết quả: hoạt tính của lactase tự do bị giảm 72% trong dung dịch có 5.0%

galactose sau 1h ở 370C; trong khi đó, hoạt tính của lactase cố định chỉ bị giảm đi 35% trong điều kiện tượng tự

 Tương tự kết quả nghiên cứu của Grosova và cộng sự (2008) khi cố định lactase bằng phương pháp nhốt trong PVA hydrogel cũng khẳng định enzyme cố định hạn chế được sự ức chế của cả hai sản phẩm của quá trình thủy phân lactose (là glucose và galactose) so với enzyme tự do, trong đó galactose là chất ức chế chính

Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH

Nhiệt độ và pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt động của enzyme Enzyme cố định do được bảo vệ bởi chất mang nên có tính bền nhiệt hơn Về điều kiện hoạt động tối thích, enzyme cố định cũng có thể thay đổi hoặc không thay đổi Topt và pHopt so với enzyme tự do

 Nghiên cứu của Freitas và cộng sự (2011) khi so sánh enzyme lactase từ A

oryzae tự do và enzyme lactase cố định bằng phương pháp nhốt trong gel

alginate-gelatin với sự hỗ trợ của chất liên kết glutaraldehyde cho kết quả rằng cả 2 enzyme tự do và cố định có khoảng pH hoạt động 4.5-7, tuy nhiên có sự thay đổi pH và nhiệt độ về điều kiện hoạt động tối thích của enzyme cố định so với enzyme tự do Cụ thể hoạt động tối thích của enzyme tự do và cố định lần lượt là pH 4.5 và pH 5.0, nhiệt độ 550C và 600C

 Lactase nguồn A oryzae cố định bằng phương pháp hấp phụ sinh học đặc hiệu

cho kết quả không có sự khác biệt pHopt giữa enzyme tự do và cố định, tuy nhiên enzyme cố định có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với enzyme tự do Ngoài ra, enzyme cố định bền nhiệt hơn so với enzyme tự do Enzyme cố định còn 87% hoạt tính ban đầu sau 2 giờ ở 600C trong khi ở dạng tự do, enzyme chỉ còn lại 15% hoạt tính ở điều kiện đó (Haider và Husain, 2008)

 Lactase từ loài A oryzae cố định trong hệ gel alginate-gelatin có sử dụng

glutaraldehyde để làm tăng độ cứng của gel và cũng thu được kết quả tương tự Nhiệt độ tối thích cho cả hai loại enzym cố định và tự do là 500C Hai loại enzyme cùng có giá trị pH tối ưu như nhau là 4.5 Ở nhiệt độ 700C và pH 4.5, enzyme tự do mất hết hoạt tính nhưng enzyme cố định trong gel alginate-gelatin vẫn còn giữ lại 27% hoạt tính ban đầu Ở pH 9.0 và nhiệt độ 500

C, enzyme cố định còn 25% hoạt tính ban đầu trong khi enzym tự do chỉ còn lại 11.5% hoạt tính (Tanriseven và cộng sự, 2002)

 Lactase từ A oryzae cố định trong gel polyvinylalcohol Sự cố định không làm

thay đổi pHopt, nhưng làm tăng độ bền của enzyme cố định đối với pH (Grosova và cộng sự 2008)

 Lactase cố định trên chất mang có từ tính polysiloxane-polyvinyl alcohol (mPOS-PVA) không làm thay đổi Topt và pHopt so với enzyme tự do (David và cộng sự, 2008)

 Lactase từ E coli ATCC2757 cố định trong gel polyacrylamide, enzyme tự do

có hoạt tính lớn nhất ở pH xấp xỉ 8.5, còn enzyme cố định có pHopt dịch chuyển về phía kiềm hơn và cao hơn (Gonzalez và cộng sự, 2001)

 Lactase từ A.oryzae cố định bằng phương pháp ngưng tụ trên màng Nylon gắn

glycidyl methacrylate Nhiệt độ tối ưu cho enzyme cố định là 660C, cao hơn so với enzyme tự do là 500C Ngoài ra, pHopt của enzyme cố định dịch chuyển về vùng acid hơn so với dạng tự do, pHopt của enzyme cố định là 3.5 trong khi pHopt của enzyme tự do là 4.7 (Albayrak và cộng sự, 2002)

Sự thay đổi pHopt của enzyme cố định so với enzyme tự do phụ thuộc vào trường tĩnh điện do chất mang gây ra Sự có mặt của trường tĩnh điện mạnh làm nồng độ ion H+ xung quanh gần chất mang và trong dung dịch khác nhau Khi lực ion của dung dịch thấp thì nồng độ ion H+ gần chất mang điện tích âm cao hơn so với trong dung dịch Kết quả là pHopt của enzyme liên kết với chất mang (-) sẽ dịch chuyển về pH kiềm hơn Và ngược lại, hơn khi lực ion của dung dịch lớn, thì nồng độ ion H+

gần chất mang điện tích dương thấp hơn so với trong dung dịch Kết quả là pHopt của enzyme liên kết với chất mang (+) sẽ dịch chuyển về phía pH acid hơn so với enzyme tự do

1.3.3.4 Khả năng tái sử dụng

Các công trình nghiên cứu thấy rằng khả năng tái sử dụng của lactase cố định khá tốt, hoạt tính enzyme vẫn còn khá cao: lactase cố định bằng phương pháp hấp phụ sinh học trên chất mang immunoglobulin-cellulose sau 10 lần tái sử dụng vẫn còn khoảng 46% hoạt tính so với ban đầu (Haider và Husain, 2008); lactase cố định lên bề mặt gel carageenan được phủ bởi màng chitosan và hoạt hóa bởi glutaraldehyde, sau 15 lần tái sử dụng, hoạt tính enzyme cố định còn 97% so với ban đầu (Elnashar và cộng sự, 2009)

1.3.4 Ứng dụng enzyme lactase cố định thủy phân lactose trong sữa/dịch whey và tổng hợp GOS

Theo khảo sát, trên thế giới có gần đến 50% số người thiếu enzyme lactase để có thể dung nạp đường lactose, do đó họ không thể sử dụng sản phẩm sữa động vật thông thường

Việc sản xuất lactase có giá trị ứng dụng công nghiệp và nhiều ứng dụng khác:  Tăng khả năng dung nạp thực phẩm chứa lactose cho những người không dung nạp lactose

 Cải tiến công nghệ và các đặc tính cảm quan vì làm tăng độ hòa tan, tăng độ ngọt, tăng năng lượng, giảm các phản ứng Maillard

 Do sự thủy phân hình thành các monosaccharide giúp dễ dàng trong sự chuyển hóa của vi sinh vật cho một số sản phẩm lên men

 Ứng dụng quan trọng trong chuyển đổi dịch whey phomat, là nguồn phế phụ phẩm trong ngành công nghiệp sữa làm nâng cao giá trị sản phẩm, giảm ô nhiễm môi trường

 Sản xuẩt GOS, là một prebiotic hỗ trợ sự phát triển của hệ vi khuẩn đường ruột

Sử dụng lactase để thủy phân lactose là một ứng dụng quan trọng trong công nghệ thực phẩm nhằm góp phần hỗ trợ, thích hợp cho các đối tượng không dung nạp lactose Lactase đã được ứng dụng từ lâu vào công nghiệp chế biến sữa gián tiếp qua các vi khuẩn lactic trong các sản phẩm yaourt và phomat Do lactose có độ hòa tan, độ ngọt thấp hơn so với hai đường đơn glucose và galactose nên thủy phân lactose còn giúp cải thiện một số tính chất cảm quan cho sản phẩm như tăng độ ngọt cho sản phẩm, tránh được hiện tượng kết tinh trong sữa cô đặc, kem (Panesar và cộng sự, 2006)

Không chỉ trong sữa, lactose còn hiện diện trong whey Whey là một phụ phẩm trong công nghiệp sản xuất phomat Ước tính cứ 1 kg phomat thành phẩm được sản xuất thì sẽ cho ra 9 lít whey và trung bình có hơn 160 triệu tấn whey trên thế giới cho ra mỗi năm Trước đây whey là một nguồn thải vì sự hiện diện của lactose, whey có nhu cầu oxy để xử lý sinh học ở mức cao (BOD = 30 đến 50g/lít) nên đây là nguồn gây ô nhiễm môi trường đáng quan tâm Ngày nay whey được tận dụng để sản xuất thành bột whey và nhiều sản phẩm khác được ứng dụng cho nhiều loại sản phẩm, đặc biệt là nó được sử dụng như nguồn bổ sung đạm, chất vi bao, …Vấn đề thủy phân lactose trong whey bằng lactase vừa giải quyết vấn đề môi trường vừa giúp tăng khả năng ứng dụng của whey vào công nghiệp chế biến thực phẩm Whey sau khi được thủy phân lactose có thể dùng làm chất tạo ngọt dùng trong công nghệ sản xuất kẹo, bánh và nước uống (Oliveira, 2011)

Ngoài ứng dụng thủy phân lactose, lactase còn được ứng dụng để tổng hợp GOS nhờ hoạt tính galactosyl-transferase GOS được xem là prebiotic giúp kích thích sự

phát triển của các vi khuẩn đường ruột có lợi như Bifidobacteria sp hay Lactobacillus

sp Ngoài ra, GOS còn có nhiều chức năng khác như tăng khả năng hấp thu khoáng ở

ruột non, giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, giảm áp lực máu và nhiều chức năng khác (Panesar và cộng sự, 2006)

Sự hình thành GOS tăng khi nồng độ lactose cao hay giảm nồng độ nước Sản xuất GOS đạt hiệu suất từ 2% đến 32% khi nồng độ lactose ban đầu từ 14% đến 40% (w/v) Do đó, khi sử dụng lactase thủy phân lactose trong những sản phẩm có nồng độ lactose ban đầu thấp như sữa và whey thì lactase không thể hiện hoạt tính galactosyl-transferase (Valero, 2009)

Một số kết quả nghiên cứu cố định enzyme lactase và ứng dụng của enzyme cố định

Sau đây là một số enzyme lactase cố định đã được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp với hiệu suất thủy phân lactose cao

Bảng 1.6 Những nghiên cứu cố định lactase ứng dụng trong công nghiệp thủy phân lactose có

hiệu quả cao Nguồn enzyme Chất mang cố định Hiệu suất thủy phân

(%)

Thời gian thủy phân

(giờ) Fungal galactosidase

(Miles Chemie)

Bằng phương pháp tối ưu hóa bằng mô hình trực giao cấp 2 RSM (Response surfacemethodology) có tâm xoay (CCD, Centre composite design) Dwevedi và

Kayastha (2009) đã tối ưu hóa điều kiện cố định lactase từ P sativum trên 2 chất mang

là Sephadex G-75 và hạt chitosan, hiệu suất cố định là 75.66% và 75.16% tương ứng

Lactase từ A oryzae cố định trên silica gel hoạt hóa bởi TiCl3 và FeCl3 cho kết quả thủy phân 81% và 84% tương ứng với dung dịch thủy phân có nồng độ lactose là 4% (Kozhukharova và cộng sự, 1991)

Lactase tái tổ hợp chịu nhiệt từ B stearothemophilus cố định trên chitosan sử

dụng Tris-hydroxymethyl phosphine (THP) và Glutaraldehyde cho kết quả thủy phân lactose 80% trong sữa sau 2 giờ hoạt động trong lò phản ứng kín (a packed bed reactor) (Di Serio và cộng sự, 2003)

1.3.5 Tính chất của một số chất mang dùng cố định enzyme

Dựa trên những yêu cầu chung với chất mang là khả năng cố định enzyme cao, tính chất cơ lý bền vững, thân thiện với enzyme cố định và môi trường phản ứng, có tính kháng khuẩn, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, ngoài ra chất mang còn cần có giá thành hợp lý và kỹ thuật cố định đơn giản để tăng hiệu qua cho quá trình sản xuất chế phẩm và ứng dụng thương mại Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm trên 3 loại chất mang để chọn phương pháp cố định enzyme tốt nhất: cố định trên hạt silica xốp bằng liên kết cộng hóa trị, cố định trên chất mang chitosan và cố

1.3.5.1 Chitosan

Chitosan là sản phẩm khử acethyl của chitin, là lớp vỏ bên ngoài của động vật giáp xác như cua, tôm và cả ở thành tế bào của một số loại nấm Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, được cấu tạo từ cáo D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine bởi liên kết β-(1-4) glucoside

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Chitosan

Thông số cần quan tâm của chitosan là chỉ số deacetyl (%DD), chúng có thể xác định bằng máy đo quang phổ NMR DD của chitosan thương mại thường dao động từ 60-100% Trọng lượng phân tử dao động từ 3800 đến 20000 Daltons

Chitosan tan được trong dung dịch acid Chitosan đã được sử dụng làm chất mang trong cố định enzyme và tế bào vi sinh từ lâu đời, tuy nhiên những năm gần đầy những nghiên cứu ứng dụng chitosan ngày càng nhiều Các enzyme D-glucose isomerase, glucoamylase, β-d-galactosidase (lactase), β-d-glucosidase, d-glucose oxidase, AMP deaminase, urease, pronase, subtilisin, trypsin, papain, phosphatase kiềm, phosphatase acid, pepsin, chymotrypsin và lysozyme cũng đã có nhiều nghiên cứu cố định trên loại chất mang này Chất liên kết thường được sử dụng là glutaraldehyde (Muzzarelli và cộng sự, 1980)

Chitosan có các đặc tính ưu điểm sau: (Krajewska, 2004)  Khả năng tương thích sinh học (biocompatibility)  Sản phẩm phân hủy là vô hại

 Không độc hại  Trơ về tính chất sinh lý  Có tính chất kháng khuẩn  Tạo phức với các ion kim loại nặng  Có khả năng tạo gel

 Có tính ái lực với protein (có tính bám dính)

1.3.5.2 Silica gel

Silica gel là dioxide silic, có dạng hạt cứng và xốp, có vô số khoang rỗng li ti trong hạt Có công thức hóa học là SiO2.nH2O, được sản xuất từ natri othosilicat (Na2SiO4) hoặc Silic TetraClorua (SiCl4)

Hình 1.4 Hình ảnh và cấu trúc của hạt silica gel

1.3.5.3 Alginate

Alginate là một polysaccharide mạch thẳng gồm acid 1,4-β-D-mannuronic (M) và acid α-L-guluronic (G) Nguồn Alginate thương mại chủ yếu lấy từ tảo nâu như

Laminariales và Fucales, ngoài ra còn có ở vi khuẩn tổng hợp polysaccharic ngoại bào

như Pseudomonas aeruginosa

Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block Có 3 kiểu block:  Block homopolyguluronate: gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau (-G-G-G-)

 Block homopolymannuronate: gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau M-M-M-)

(- Block heteropolymer: gồm các gốc acid guluronic và acid mannuronic luân phiên nối với nhau (-M-G-M-G-)

Hình 1.5 Hình ảnh các kiểu block của alginate

(a) Homopolyguluronate (b) Homopolymannuronate, (c) Heteropolymer Tính chất cơ học của gel phụ thuộc vào trọng lượng phân tử và tỷ lệ M/G Tuy nhiên, các chất tạo phức với Canxi như phosphate, EDTA và các cation như Mg2+

, K+lại phá hủy cấu trúc gel alginate bởi trao đổi với ion Ca2+

Độ hòa tan

Alginate hòa tan trong nước và khả năng hòa tan phụ thuộc vào ba yếu tố: pH, cường độ ion và sự hiện diện của ion tạo gel trong môi trường Alginate hòa tan khi pH làm cho nhóm COOH chuyển thành COO- Cường độ ion ảnh hưởng đến độ hòa tan thông qua sự thay đổi hình thành polymer, duỗi mạch Gel alginate tạo thành khi có mặt cation hóa trị II như Ca2+

, Sr2+ và Ba2+ Gel alginate chỉ hòa tan trong dung môi hữu cơ khi có sự hình thành muối tetrabutylammonium (TBA) (Pawar và Edgar, 2012)

Sự hình thành gel

 Gel acid Tạo gel acid bằng cách chỉnh pH dung dịch gel alginate thấp hơn pKa của acid uronic, gel này được ổn định nhờ liên kết hydrogen Độ bền của gel acid tương quan với nồng độ block G, không phụ thuộc vào pH khi pH đã dưới 2.5 Gel này chỉ có một vài ứng dụng trong ngành dược phẩm

(b)

(c)

Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phương pháp tạo gel

từ bên trong

Hình 1.6 Phương pháp tạo gel từ bên ngoài và bên trong (Rehn, 2009)

 Phương pháp tạo gel từ bên ngoài Khi nhỏ dung dịch gel alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel, bề mặt ngoài của hạt gel alginate sẽ lập tức bị gel hóa Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài hạt gel alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử gel alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao, nồng độ gel alginate ở bề mặt cao gấp năm so với ở tâm của hạt gel Phương pháp này được ứng dụng phổ biến để nhốt vật liệu sinh học và cố định tế bào

Sự hình thành gel xảy ra do tương tác giữa những block G mạnh hơn những block MG với ion hóa trị II Vì vậy alginate với nồng độ G cao sẽ tạo gel mạnh hơn Sự tạo gel giảm dần theo ion hóa trị II: Pb > Cu > Cd > Ba > Sr > Ca >Co, Ni, Zn > Mn và tùy thuộc vào block

 Block GG: Ba > Sr > Ca » Mg  Block MM: Ba > Sr ≈ Ca ≈ Mg  Block MG: Ba ≈ Sr ≈ Ca ≈ Mg Mặc dù vậy, Ca2+ thường được sử dụng phổ biến trong tạo gel alginate, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm

Hình 1.7 Sự hình thành gel với ion Ca2+

(a) block GG/GG, (b) block MG/MG, (c) block GG/MG (Pawar và cộng sự, 2012)  Phương pháp tạo gel từ bên trong

Gel được hình thành bằng cách cho dạng chưa hoạt động của cation (Ca-EDTA, calcium citrate) vào dung dịch gel alginate Giảm pH của dung dịch nhờ δ-gluconolactone (GDL), giải phóng từ từ các cation ở dạng chưa hoạt động thành dạng hoạt động tham gia vào quá trình tạo gel alginate Phương pháp tạo gel từ bên trong có độ đồng nhất hơn so với phương pháp tạo gel từ bên ngoài Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo gel này: nồng độ và thành phần alginate, kích thước của muối cation, đặc biệt chiều dài của block MG trong chuỗi alginate giúp cho quá trình tạo gel nhanh hơn (Rehn, 2009)

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo gel

Alginate có tính chất đặc biệt là có thể tạo gel ở nhiệt độ thường và hạt gel tạo thành rất bền nhiệt Hạt gel có thể được xử lý ở nhiệt độ cao mà không bị tan chảy Nhưng điều đó không có nghĩa là quá trình tạo gel ít phụ thuộc vào nhiệt độ Ngược lại, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo gel Trên thực tế, nhiệt độ có thể được dùng để điều chỉnh quá trình tạo gel Tính chất của hạt gel cũng thay đổi khi chúng được tạo ra ở các nhiệt độ khác nhau

Để gel đạt độ bền thì chỉ số polymer hóa (DP, Degrees polymerization) lớn hơn 800

Tỷ lệ D-mannuronate và L-guluronate trong sodium alginate là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng tạo gel Gel alginate nhiều L-guluronate thì giòn, bền

nhiệt nhưng dễ bị chảy nước trong trường hợp cần làm tan giá, trong khi gel nhiều mannuronate lại có độ bền cơ học yếu hơn nhưng đàn hồi hơn và không bị chảy nước khi làm tan giá Alginate có tỷ lệ M/G=1.3 với độ nhớt từ 16-994 mPa.s sẽ thích hợp khi tạo gel với Ca2+ (Kakita và cộng sự, 2008)

D-Gel calcium alginate dễ bị hòa tan khi có mặt các tác nhân “bắt” ion calcium như phosphate và citrate Tuy nhiên để giải quyết vấn đề này có thể lặp lại quá trình tạo gel