Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nâng cao khả năng thu nhận saponin triterpenoid thô từ Đảng sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. bằng enzyme và sóng siêu âm

Anh hưởng của thời gian ủ enzyme đến ham lượng saponin triterpenoidthu nhận được băng enzyme cellulase và sóng siêu âm...- - - c+s+csEsrereree.. Anh hưởng của thời gian ủ enzyme đến ham

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHI MINHTRUONG DAI HOC BACH KHOA

TRUONG HOANG DUY

NANG CAO KHA NANG THU NHANSAPONIN TRITERPENOID THO TU DANG SAM

Codonopsis javanica (Blume) Hook f.BANG ENZYME VA SONG SIEU AM

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm va Đồ uốngMã số: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP Hỗ Chí Minh, tháng 07 năm 2014

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HỌC BACH KHOA —- ĐHQG TP HCMCán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Đống Thị Anh Đào

(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi và chữ ky)

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS Tran Công Luận

(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi và chữ ky)

Cán bộ cham nhận xét 2: TS Trần Bích Lam

(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi và chữ ky)

Luan văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQGTp.HCM ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Ghi rõ họ, tên, học ham, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc si)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lýchuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCM CONG HOA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG DH BACH KHOA TP HCM Độc Lập — Tự Do — Hạnh Phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trương Hoàng Duy MSHV: 12113007Ngày, thang, năm sinh: 05/11/1986 Noi sinh: Long An

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm va D6 uéng = Mi so: 605402I TÊN DE TÀI

Nâng cao khả năng thu nhận saponin triterpenoid tho từ Dang sâm Codonopsisjavanica (Blume) Hook f bang enzyme va sóng siêu âm

NHIEM VU VA NOI DUNG- Nghiên cứu quá trình trích ly thu nhận saponin triterpenoid thé từ Dang sâm bangenzyme cellulase, enzyme pectinase và sóng siêu âm, dong thời khảo sát kêt hợp giữaenzyme vả sóng siêu âm.

- Vi bao hợp chất saponin triterpenoid tao dạng bột bằng phương pháp say phun.Il NGÀY GIAO NHIỆM VU: 24/06/2013

Ill NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 23/05/2014IV CÁN BỘ HUONG DAN: PGS TS Đống Thị Anh Dao

Tp HCM, ngày thang năm 2014

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHU NHIEM BO MON ĐÀO TẠO

TRUONG KHOA KY THUAT HOA HOC

LOI CAM ON

Đề hoàn thành luận văn này, chúng tôi đã nhận được sự giúp đỡ từ nhiều phía

Chúng tôi xin gởi lời cảm ơn đến Trường DH Bách Khoa đã tạo điều kiện chochúng tôi học tập, nghiên cứu Cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ thuật hóa học đã hỗtrợ cho chúng tôi trang thiết bị, thủ tục cần thiết

Đặc biệt chúng tôi xin cảm ơn đến cô Đống Thị Anh Dao là can bộ trực tiếphướng dẫn và định hướng khoa hoc dé chúng tôi hoàn thành tốt bài luận văn nay

Chúng tôi cũng xin cảm ơn đến nhóm sinh viên trường ĐH Công nghiệp Tp.HCM đã hỗ trợ cho chúng tôi hoàn thành các nghiên cứu trong luận văn này

TP HCM, ngày 7 thang 7 năm 2014

TOM TAT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào việc tìm hiểu về quá trình tríchly thu nhận saponin triterpenoid thô từ Đảng sâm theo phương pháp trích ly bằngenzyme cellulase, enzyme pectinase và phương pháp kết hợp giữa hai enzyme trênvới sóng siêu âm.

Đối với quá trình trích ly thu nhận saponin triterpenoid bang enzyme cellulasevới các điều kiện đã được tối ưu hóa thì hàm lượng saponin triterpenoid thu được là4941mg/100gDW.

Tương tự như cách thực hiện trích ly sử dụng enzyme cellulase thì khi tiễn hànhtrích ly thu nhận saponin triterpenoid bằng enzyme pectinase, hàm lượng saponintriterpenoid thu nhận được cao hon và đạt được 5187,97mg/100gDW.

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phương pháp xử lý kết hợp giữa sóng siêu âm vàenzyme Qua thực nghiệm chúng tôi nhận thấy:

+ Khi sử dụng kết hợp sóng siêu âm trước và enzyme cellulase sau thì hàmlượng saponin triterpenoid thu nhận được là 5698,63mg/100gDW Còn khi sử dụngphương pháp xử lý enzyme cellulase trước, sóng siêu âm sau thì hàm lượng saponintriterpenoid thu được là 5498,76mg/100gDW.

+ Khi sử dụng kết hợp sóng siêu âm trước và enzyme pectinase sau thì hàmlượng saponin triterpenoid thu nhận được là 5972,04mg/100gDW Va với phươngpháp xu ly enzyme pectinase trước, sóng siêu âm sau thì hàm lượng saponintriterpenoid là 5531,34mg/100gDW.

Ở phương pháp kết hop giữa sóng siêu âm va enzyme cho kết qua thu nhậnsaponin triterpenoid là cao hon so với việc xử lý riêng lẽ đối với từng loại enzyme

Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng tiễn hành khảo sát trích ly saponintriterpenoid băng nước và bằng sóng siêu âm, hàm lượng saponin triterpenoid nhậnđược là 2374,52mg/100gDW khi trích ly bằng nước Còn đối với sử dung sóng siêuâm, hàm lượng saponin triterpenoid nhận được là 2937,66mg/100gDW.

Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đã bước đầu thực hiện vi bao hợp chất saponintriterpenoid trích ly được bang phương pháp say phun tao dạng bột với chất mang làmaltodextrin va gum arabic.

In this report, we studied the extraction of triterpenoid saponin fromCampanumoea javanica Blumme using enzyme cellulase, pectinase and combiningtwo enzymes with ultrasound.

For the extraction of triterpenoid saponins using cellulase enzymes, conditionshave been optimized, triterpenoid saponins obtained is 4941mg/100gDW.

When we using pectinase enzymes, triterpenoid saponins obtained is5187,97mg/100gDW.

And then, we combine ultrasound and enzyme, the results showed:

+ Method using enzyme cellulase before, ultrasound after, triterpenoid saponinsobtained is 5698,63mg/100gDW And method using ultrasound before, enzymecellulase after, triterpenoid saponins obtained is 5498,76mg/100gDW.

+ Method using enzyme pectinase before, ultrasound after, triterpenoidsaponins obtained is 5972,04mg/100gDW And method using ultrasound before,enzyme cellulase after, triterpenoid saponins obtained is 5531,34mg/100gDW.

In the method of combining ultrasound and enzymes for the results obtainedtriterpenoid saponin is higher than use of each enzyme.

We also conducted extraction of triterpenoid saponin using water andultrasound, triterpenoid saponins is 2374.52mg/100gDW when extracted with water.As for the use of ultrasound, triterpenoid saponins is 2937.66mg/100gDW.

Finally, we use microencapsulation techniques to create a powder fromtriterpenoid saponin compounds extracted by spray drying method with maltodextrinand gum arabic.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên: Trương Hoàng Duy MSHV: 12113007

Sinh ngay: 05/11/1986 Noi sinh: Long AnHiện dang là học viên cao học khóa 2012 ngành Công nghệ Thực phẩm va Đồuống - Trường ĐH Bách Khoa Tp HCM

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung luận văn được trình bày ở đây do chính tôithực hiện, số liệu được thu thập một cách khách quan và không sao chép bất kì nộidung của tác giả nào trong và ngoài nước Việt Nam.

Nêu có gì sai phạm, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đông bảo vệluận văn và nhà trường.

Tp HCM, ngày tháng 7 năm 2014

Học viên

Trương Hoàng Duy

MỤC LỤC900.000 P :' |CHƯƠNG 1: TONG QUAN cac 1 1 1515111115151 515111 1111111111111 E111 krki 41.1 Tổng quan về nguyên liệu sâm và Đảng sâm + + SE exeeeeeeeeee 4

I9 6RUN M6 ta oo 61.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu của rỄ - «+ sex S331 1119151111111 1 1 11x rreg 71.1.2.3 Nơi sống và phân bỒ - + xxx E1 1111915111111 111 111gr rreg 71.1.2.4 Thành phan hóa học của rễ cây Dang sâm - + Sex eeeereeree 81.2 Tổng quan về hợp chat saponin va saponin triterpenoid -.- 5 +sss+sscse 81.2.1 Khai miGM SAPONIN 1n 81.2.2 Phân lOat cccccccccceccccccccsssssseccccceeesseccccseeesssesccssseeussesscssseesscecssssseussescessseueeeeseeess 81.2.3 Saponin trIfCTD€TOIC - 0101101010111 1111 1111111111999 11 1111 11g v4 91.2.4 Công dụng CUA SaDOTIT (01001010101 111131331111111999333 11111111 ng ng và 161.3 Tim hiểu vé sóng siêu AM ecscsecccesscscessssssssscevscsesesececscscssasasavevevevensteeseeee 17D.3.1 Khai na 171.3.2 Cơ chế tác dỤng - «<1 1111111515151 11111111111 H111 100 1xx 181.3.3 Thiết bi phát sóng siêu âm - - - E E5 SE ct v1 E111 Erxreeo 191.3.4 Ứng dụng của sóng siêu âim - - - - EE+ESEExSxSScvcv cv E1 g1 xrxrees 201.4 Tong quan về enzyme cellulsae va pecfintase ¿6-6 kx+E#E£EeEsEsrerererees 221.4.1 Enzyme cllulase 0200101010111 1111388111111119993351 11111111 ng ng vờ 22

CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 292.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hóa CHAt cccceccccssescscssesesescescscssescseseesesesscssscssescsessescseeees 29“8È N NQuUy@n HEU oe — a ae 292.1.2 Dụng cu, thiết bị, hóa Chat ccxxSt k3 SE EE9E9E9 5111 111 1111 cEnEnrrrrree 292.1.2.1 Dụng cu, thiẾt bị - SE TT T111 111 11111 11g ng greg 292.1.2.2 Hóa chất csc t2 tt HH Hee 302.2 Phuong phap nghien 0006) 0-4 302.2.1 Khảo sát nguyên liệu dang sâm - 5 5 2221296111111 1 1111 EEEESssssersee 322.2.2 Khao sát quá trình trích ly bằng nưỚC - - - + + ExSkkckckekevekeeeeeree 322.2.2.1 Khảo sát ti lệ nguyên lIỆU:ƯỚC 5 2222233296111 111111111 322.2.2.2 Khảo sát nhiệt độ trích ly G 0 1100011111111 11 111111 kg 322.2.2.3 Khảo sát thời gian trich Ïy - << -cc c1 1100011111111 1 11111 1kg ng 332.2.2.4 Tối ưu hóa c:5+c2ct2 t2 t2 t2 t2 2 332.2.3 Khảo sát quá trình trích ly bằng sóng siêu âm - ¿+ +s+x+x+x+x+eseseee 332.2.3.1 Khao sát tỉ lệ nguyên lIỆU:ƯỚC 5 5 2222332211111 1111 EEEESsssssrsse 332.2.3.2 Khảo sát nhiệt độ siêu âm - <5 << E113 111111131 1 vs rrree 342.2.3.3 Khảo sát thời ø1an SIÊU Âm -GG 01 100001111111999331 1111111111 ng v2 342.2.3.4 Ti ưu hóa ::5+c t2 t2 2 t2 t2 2 352.2.4 Khảo sát quá trình thu nhận saponin triterpenoid bằng enzyme cellulase vàENZYME PECINASE 00008885888 — ằa 362.2.4.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên lIỆU : TƯỚC - 75c 111111 EEEEEsssesssssss 362.2.4.2 Khao Sat PHo oe .c.dŸỔẢỔỔẦẢd5 362.2.4.3 Khảo sát thời ø1an Ủ 0011111111110 30 111 1k kg 2v 362.2.4.4 Khao sát nhiệt dO Ủ - 1 111g ng ngu 372.2.4.5 Khảo sát nồng độ enZyme c3 SE#E9E9 5 SE gen greg 372.2.4.6 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tô đến quá trình trích ly bang enzyme va

2.2.5 Khao sát kết hop: xử lý bang sóng siêu âm trước, xử lý bang enzyme sau 382.2.5.1 Khao sát hàm lượng €nZzVI© - c1 1300011111155 1 111111 kg ng v2 382.2.5.2 Khảo sát thời gian xử ly bằng enZyime + + sex ckeveveeeeeree 392.2.5.3 Khảo sát thời gian xử lý bằng sóng siêu AM - ¿c6 +x+x+x+xexseseseee 40

2.2.5.4 Khảo sát nhiệt độ xử ly băng sóng siêu âm - csx+x+x xe eeeeeeseee 412.2.6 Khảo sát kết hop: xử lý bang enzyme trước, xử lý bang sóng siêu âm sau 412.2.6.1 Khảo sát nồng độ enZyIme - - - k+kkSESEEE#E9E9 SE SE gvcvcưcggvnegerreg 412.2.6.2 Khảo sát thời gian xử lý bằng enZyime + + sExsxsxxckckckevekeeeeeree 422.2.6.3 Khảo sát thời gian xử lý bằng sóng siêu AM - ¿c6 +x+x+x+xeeseseseee 432.2.6.4 Khảo sát nhiệt độ xử ly băng sóng siêu âm - - cv +k+xexexeeeesree 432.2.7 So sánh các điều kiện trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận ƯỢC - - << E E01 1E11030300 21 911v vớ 442.2.8 Bước đầu ứng dung kỹ thuật vi bao hợp chat saponin triterpenoid thu nhậnUOC tly MAN SAM 0000777 na 442.3 Các phương pháp phân tÍch - - - << << 5111 13333313111559533111 111111111111 188g 2.2 452.3.1 Xác định độ âm -c-+ct 2tr2 re 452.3.2 Xác định hàm lượng trO - - - << << 55511 1333333131115599311 1111111111111 332 452.3.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 452.3.4 Xác định hàm lượng saponin frIterpeno1d << << << «+ se+ssssssssss 452.3.4.1 Xây dựng đường chuẩn bang acid oleanoli€ - 5s ss+s+x+x+xex+esesese 45

2.3.4.2 Xác định saponin triterpenoid trong mẫu + 5 se £+E+Eeeeererseeed 46

2.3.5 Quy trình trích ly và phân tích mẫyu 2= +sE+E+E£E+E+E£eEeEeEeeeererseeed 47CHƯƠNG 3: KET QUA VA BAN LUẬN - cv EEeEeEeEsrsesrserered 503.1 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu ban đầu của nguyên liệu - - -s: 503.2 Khảo sát quá trình trích ly saponin triterpenoid bằng nước - - +: 503.2.1 Khảo sát tỉ lệ nước và nguyên lIỆU << << 551111 EEEsssssssssssssessa 503.2.2 Khảo sát nhiệt độ của nước ảnh hưởng đến quá trình thu nhận saponin

triterpenoid DANG NUGC - << -G c1 1332330111111 101 11111111111 180021511 1 kh rre 523 2.3 Khao sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thu nhận saponin triterpenoid015i ae 543.2.4 Tối ưu hóa quá trình trích ly saponin triterpenoid bang nước - 563.3 Khảo sát quá trình trích ly triterpen saponin bang sóng siêu âm 583.3.1 Khao sát tỉ lệ nguyên liệu:nước ảnh hưởng đến quá trình trích ly saponintriterpenoid bằng sóng siêu âim G1199 9 9 SE 1111111 reo 593.3.2 Khảo sát nhiệt độ siêu âm ảnh hưởng đến quá trình thu nhận saponin

3.3.3 Khảo sát thời gian siêu âm ảnh hưởng đến quá trình thu nhận saponin

3.3.4 Tối ưu hÓa -:-5c:+5+2xt+Ex2 E2 1212112111212 1 643.4 Khảo sát quá trình thu nhận saponin triterpenoid bằng enzyme cellulase vàENZYME PECINASE 00008885888 — ằa 673.4.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên lIỆU:ƯỚC - 0101011111111 1111111111885 sx2 67

3.4.3 Khao sát thời ø1an Ủ €ñZVIT€ Gc 1000000011111 111 111 111111 00255511 kg 723.4.4 9:0 6i n6 0n cố .ằe 743.4.5 Khảo sát hàm lượng ©€nzV1e 5 3 3200222191111 11111111 1111111882235 55 11kg 763.4.6 Tối ưu hÓa -.-5c:+5+2 t2 E2 1221211221111 11 793.4.6.1 Enzyme ce€lÏUÌSG - - - (<< <1 1 11111138313113119993311 111111111 1111119002355 ke 793.4.6.2 EMZyMe D€CfITIAS© 0010010011 1111111 1111800311111 11H00 661kg 823.5 Khao sát sử dụng kết hop enzyme cellulsase, enzyme pectinase va sóng siêu âm— $63.5.1 Xử lý bằng siêu âm trước kết hợp với xử lý bang enzyme sau - $63.5.1.1 Khảo sát hàm lượng enzyIme - + 0101010101011 111 1111111182235 1 1x4 863.5.1.2 Khao sát thời 21a Ủ ©IZVIT€ 5 2 3000222211111 101 111111 1111111888535 5 111kg 883.5.1.3 Khảo sát thời ø1an SIGU AM 00.0 cece eccceessssscceeeeeeceeeseeseeessnsaceeeeeeeceeeeseeeeeenaas 903.5.1.4 Khao sat nhiệt độ siêu âm eeeecccccccceeessecccceeeesssscccsseeesseecsesseeeesess 933.5.2 Xử ly bang enzyme trước kết hợp với xử ly bằng sóng siêu âm sau 953.5.2.1 Khao sát hàm lượng enzyIme - + 001001001111 11 1111111100233 1 1kg 953.5.2.2 Khảo sát thời Ø1an Ủ ©IZVIT€ 5 2 3200222211111 11111111 1111111882255 11kg 973.5.2.3 Khảo sát thời ø1an SIÊu Âm 5 2 2101010111111 11111 1111118882551 xx2 993.5.2.4 Khao sát nhiệt độ siêu âm -.-.- c5 5< EE1111 1£ E113 ke 1013.6 So sánh các điều kiện trích ly anh hưởng đến ham lượng saponin triterpenoidthu nhận ƯỢC - - CC E2 2111111303099 111v vn net 1033.6.1 So sánh các điều kiện trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận ƯỢC - - CC E2 2111111303099 111v vn net 1033.6.2 Kết quả chụp SEÌM «sec 1111111151111 1111p 1053.7 Kết quả kiểm tra sản phẩm vi bao hợp chat saponin triterpenoid 106

3.7.2 Kết quả chụp SEÌM - «s11 11111111111 111111 greg 1073.8 Kiểm tra và so sánh khả năng chống oxy hóa của hợp chất saponin triterpenoidthô thu nhận được - - + + - + <1 E111 net 108CHUONG 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHI o cececcccscecccscescecsscscscssesesessestssssesessees 1104.1 K@t luận ¿SE 1 1 3 15 1115151111515 111111 1111111111511 01 111101111110 1111 re 110z4 ï 0 111TÀI LIEU THAM KHẢO 2i te Sa 3e S8 EESEEE+ESEEEESEEEEEEEESEEeErErereerseersrrees 112

DANH MỤC HÌNHHình 1.1 Vi phẫu Dang sâm Trung Qu6c -¿- - 5 S+E+E+ESESEEEESEEcE+EeEeeeeeesree 7Hinh 1.2 Phan 8v 0 0i 115 ố 9Hình 1.3 Cau trúc hóa hoc cơ bản của saponin (a: triterpenoid; b: steroid) 9Hình 1.4 Cau trúc cơ bản của Triterpenoid sapogenins với vòng ABCDE 10Hình 1.5 Công thức cầu tạo của nhóm oleanann 2-5 + 2 2 +E+E+E+Ee£+E+EeEsreei 11Hình 1.6 Công thức cấu tạo của nhóm ursan (a: ursan, b: œ-amyrin) -: 12Hình 1.7 Công thức cầu tạo của nhóm lupan s22 + + +EE+E+E+E+EeErkzxeesreee 12Hình 1.8 Công thức cầu tạo của nhóm hopan - - 2-2-2 +E+E+E+E+EeE+E+Eeesreei 13Hình 1.9 Công thức cau tao của nhóm dammaran - 2: + 2 2s s+S+£e£E+E+E+Eszeei 14Hình 1.10 Công thức cấu tạo của nhóm lanosfan - 2 2s+s+s+E+£e+e+xeesreei 14Hình 1.11 Công thức cấu tạo của nhóm cucurbitan - 2 2+s+s+s+Ee£e+e+xeesreee 15Hình 1.12 Công thức cau tao saponin Ï~4 ¿- + + s+x+k+k+EeEEE+EeEeEererkrkrrerees 17Hình 1.13 Cơ chế phá vỡ tế bao vật liệu của xâm thực bang sóng siêu âm 19Hình 1.14 Sơ đồ tác dung của enzyme pectinase lên pectin 5-5-5 +s+sscse 26Hình 1.15 Sơ đồ phân loại enzyme pecfifiaSe - 5-5 + + xxx +keveeeeeeesee 27Hình 2.1 Mẫu đảng sâm 3 năm tuÔi - - k+k+k+k#E#E#ESEEEk SE cvcvcvgvgvrerree 29Hình 2.2 Sơ đỗ nghiên cứỨu ¿- + SE k* SE SE EEEEEE11311 1111111111111 1 1e 31Hình 2.3 Đường chuẩn acid oleano liC - + 2s + +E+EE+E+E+E+ESEEEE+EEEeEeEerkrkrrerees 46

Hình 2.4 Quy trình trích ly và phân tích mẫu ¿+5 +E+E+e£sE+EeEeeeerersesed 49

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước trích ly đến -.- - <<: 51ham lượng saponin triterpenoid thu nhận được - 5< +<<<++++++ssssss 51Hình 3.2 Anh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận ƯỢC - - c1 011100300 0111 net 53Hình 3.3 Anh hưởng của thời gian trích ly đến ham lượng saponin triterpenoid thunhận ƯỢC - - c1 011100300 0111 net %4Hình 3.4 Mặt đáp ứng hàm lượng saponin triterpenoid theo tỉ lệ nguyên liệu:nướcVA NIE AG eee 58Hình 3.5 Mat đáp ứng ham lượng saponin triterpenoid theo thời gian và nhiệt độ.58Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : nước đến hàm lượng saponin

triterpenoid thu nhận được băng sóng siêu AM - << ssseeeesss 59

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận ƯỢC - - c1 011100300 0111 net 61Hình 3.8 Anh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận ƯỢC - - c1 011100300 0111 net 63Hình 3.9 Mặt đáp ứng hàm lượng saponin triterpenoid theo - - - - -<- 67tỉ lệ nguyên liệu : nước và nhiỆt đỘ - - - - << << <5 51111111111 1111118885535515151111xexee 67Hình 3.10 Mặt đáp ứng ham lượng - 5555522222115 5EEEEssesssssss 67saponin triterpenoid theo thời gian và nhiệt đỘ - 55552 +++++++++++ssssss2 67Hình 3.11 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước đến hàm lượng saponin

triterpenoid thu nhận được băng enzyme celÏuÌaSe -¿- - +s+s+E+EsEsEeEereree 68Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước đến hàm lượng saponin

triterpenoid thu nhận được băng enzyme pectÏniase -¿- - - +s+x+E+EsEsEsEererees 68Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận đượcbang enzyme ceÍÏUÌ4SG - - - E199 9E E91 E11191511 111111111 greg 71Hình 3.14 Anh hưởng của pH đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận đượcbằng enzyme pD€CfiflASe - - - - 1119191515 E1 111 1 1 1111111011115 311111111 greg 71Hình 3.15 Anh hưởng của thời gian ủ đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhậnđược bang enzyme cellulaS€ - - s + kEESEEE#E#E#ESESEEE SE vn gerree 73Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhậnđược bằng enzyme p€Cfi'IAS€ - s31 1911151911311 11111 11111 gegreg 73Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhậnđược bang enzyme cellulaS€ - - s + kEESEEE#E#E#ESESEEE SE vn gerree 75Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hàm lượng saponin triterpenoid thu nhậnđược bằng enzyme p€Cfi'IAS€ - s31 1911151911311 11111 11111 gegreg 75Hình 3.19 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được băng enzyme ceÏÏUÌSG + xxx #EEEEEeEeEererererees 77Hình 3.20 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được băng enzyme p€CfÏTIASG + SE EE E1 EErerees 78Hình 3.21 Mat đáp ứng hàm lượng saponin triterpenoid theo hàm lượng enzyme vàthời gian ủ enzyme Cellulase + + 1111113111111 1111111888552311 11111 rrrre 82Hình 3.22 Mặt đáp ứng ham lượng saponin triterpenoid theo ham lượng enzyme vathoi Gian U ENZYME PeCTINASE - 86Hình 3.23 Anh hưởng hàm lượng enzyme đến ham lượng saponin triterpenoid thunhận được khi trích ly bang enzyme cellulase và sóng siêu âm -. - 87

Hình 3.24 Ảnh hưởng hàm lượng enzyme đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận được khi trích ly bang enzyme pectinase và sóng siêu âm - 88Hình 3.25 Anh hưởng của thời gian ủ enzyme đến ham lượng saponin triterpenoidthu nhận được băng enzyme cellulase và sóng siêu âm - - - c+s+csEsrereree 89Hình 3.26 Anh hưởng của thời gian ủ enzyme đến ham lượng saponin triterpenoidthu nhận được bang enzyme pectinase vả sóng siêu âm - - scsesEsrereree 90Hình 3.27 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được băng enzyme cellulase và sóng siêu âm - - - c+cscsEsrereree 92Hình 3.28 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được bang enzyme pectinase vả sóng siêu âm - - c+cscsEsrererees 92Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận được bằng enzyme cellulase và sóng siêu âm ¿+ + +x+x+x+x+x+x+xsesxse 94Hình 3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận được bằng enzyme pectinase và sóng siêu âm - - + + +x+x+k+x+xexeeeeseee 94Hình 3.31 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được băng enzyme cellulase và sóng siêu âm - - - c+s+csEsrereree 96Hình 3.32 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được bang enzyme pectinase vả sóng siêu âm - - - c+c+cscsrereree 96Hình 3.33 Ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến ham lượng saponin triterpenoidthu nhận được băng enzyme cellulase và sóng siêu âm - - - c+s+csEsrereree 98Hình 3.34 Anh hưởng của thời gian ủ enzyme đến ham lượng saponin triterpenoidthu nhận được bang enzyme pectinase vả sóng siêu âm - - - c+c+cscsrereree 98Hình 3.35 Anh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được bang enzyme cellulase và sóng siêu âm - - - c+cscscxecee: 100Hình 3.36 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoidthu nhận được bang enzyme pectinase và sóng siêu âm «<<<<<++++2 100Hình 3.37 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận được bang enzyme cellulase và sóng siêu âm ¿- - s+s+s+EsEsEsrrerees 102Hình 3.38 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hàm lượng saponin triterpenoid thunhận được bang enzyme pectinase và sóng siêu âm -¿- - s+e+e+esesEsrrerees 102Hình 3.39 Hình biểu diễn hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận được qua cácphương pháp trích ly khác nhau (<< << 11111113131111111155885535355111111xeree 104Hình 3.40 Hình ảnh phân tích bề mặt bằng kỹ thuật kính hién vi điện tử quét (SEM)

Hình 3.41 Hình ảnh phân tích bề mặt của mẫu bột sau say phun bằng kỹ thuật kínhhiển vi điện tử quét (SEM|) k1 1191915151 1111 TT H11 111 xxx 108

DANH MỤC BANGBảng 1.1 Nguyên Gu SÂ1m - ( c 0010101033188138831111119999331 111111111 ng và 4Bảng 1.2 Các ứng dụng của sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm 21Bảng 1.3 Tác dung của năng lượng siêu AM ccceessseccceccceceeeeseesssseceeeeeeeeeeeeees 21Bang 2.1 Xây dựng đường chuẩn acid oleano ÏÏC «5+ + 5s ssxsxsxsx+xexeeeeeeeeee 46Bang 3.1 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu của nguyên liệu ¿2 sss+s+esesese 50Bảng 3.2 Các yếu tố dùng trong R.SM - 6k SESESESE HS cvc cv nererreg 56Bảng 3.3 Kế hoạch thực nghiệm theo RSM để tối ưu hóa hàm lượng saponin

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các bién đến hàm mục tiêu - ¿565656 +x+xeE+eeesese 57Bảng 3.5 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy - + <6 6sx+s+x+e+essse 57Bảng 3.6 Các yếu tố dùng trong R.SM - 6k SE HT cccvgnnrerreg 64Bảng 3.7 Kế hoạch thực nghiệm theo RSM để tối ưu hóa hàm lượng saponin

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của các bién đến hàm mục tiêu + 565656 +x+x+E+eeeseee 66Bảng 3.9 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy - + <6 65s+x+x+x+e+essse 66Bảng 3.10 Các biến trong ma trận Plackett-Burman và ảnh hưởng của chúng 79Bảng 3.11 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman - 52-2 <5: 80Bang 3.12 Các yếu tố dùng trong RSM wun ecccecsescsesesesecessssssessevscscsescecscscssesasavaens 80Bang 3.13 Kế hoạch thực nghiệm theo RSM để tối ưu hóa hàm lượng 81SAPOMIN triterPCNOI ~.- a a ad 81Bang 3.14 Anh hưởng của các bién đến hàm mục tide esesesesecectcseeseeeeees 81Bảng 3.15 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy - ¿5 6s s+s+s+escse 82Bảng 3.16 Các biến trong ma trận Plackett-Burman và ảnh hưởng của chúng 83Bảng 3.17 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman - 5 2-5 <5: 63Bảng 3.18 Các yếu tố dùng trong RSM ou cececsescsesssscesesssssescecsesesescecscscesasavevaens 84Bảng 3.19 Kế hoạch thực nghiệm theo RSM để tối ưu hóa hàm lượng saponin

Bang 3.20 Anh hưởng của các bién đến hàm mục tiêu 5-2 66s+s+s+esesese 85Bang 3.21 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy - 5266 s+s+s+essse 85Bang 3.22 Thông số trích ly của các phương pháp đã khảo sát 104

Bang 3.23 Các chỉ tiêu của sản phẩm Vi bao - - St #ESEsEsEsEerrerees 106Bảng 3.24 Khả năng chống oxy hóa của các chất và mau saponin triterpenoid 109

MỞ DAU

Saponin là một thành phần của thực vật, có mặt trong hơn 90 loại thực vật trongtự nhiên trong đó có Dang sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook f Chúng có khảnăng chống viêm, kháng khuẩn, kháng nam, ức chế virus Một số có tác dụng tốttrong điều trị viêm loét dạ dày và viêm da [1]

Đảng sâm là một loại dược liệu quan trọng được ứng dụng nhiều trong dượcphẩm Thượng đảng nhân sâm có vị ngọt, tính bình Đông y coi Đảng sâm có thểdùng thay thế nhân sâm trong các bệnh thiếu mau, da vang, bénh bach huyét, viêmthượng thận, nước tiểu có anbumin, chân phù đau Thượng đảng nhân sâm còn làmthuốc bổ da day, chữa ho, tiêu dom, lợi tiểu tiện [2] Tại Việt Nam, Dang sâm hiệnnay nằm trong sách do Việt Nam, đây chính là nguồn thực vật cần được bảo ton Tuynhiên, thời gian gần đây, các nhà khoa học đã thành công trong việc nhân giống vàtrồng rộng rãi loại cây này, đặc biệt là ở tỉnh Lâm Đồng

Ở Việt Nam, năm 2002, nhóm tác giả Hoàng Minh Chung và cộng sự đã tiễnhành nghiên cứu xác định một số thành phan hóa hoc trong rễ củ Đảng sâm va đã kếtluận răng trong rễ củ Đảng sâm có mặt của saponin [3] Trên Thế giới vẫn chưa cónhiều công bô rộng rãi về nghiên cứu loại cây này.

Nhận định đây là một loại nguyên liệu rẻ tiên và có giá trị về mặt dược liệu nênchúng tôi quyết định chon Đảng sâm làm đôi tượng nghiên cứu và mục tiêu chính làthu nhận hợp chất saponin từ cây nảy

Trên Thê giới đã co rat nhiêu đề tài nghiên cứu về hop chat saponin, chủ yêu làtiễn hành trích ly hợp chất saponin băng nhiều phương pháp:

Jianyong Wu và cộng sự (2000) đã tiễn hành sử dụng sóng siêu âm kết hop vớidung môi (methanol, n-butanol, nước) dé tiễn hành tách chiết saponin từ nhân sâm sosánh với việc tách chiết bằng dung môi bang sử dung Soxlet Sóng siêu âm dùng vớitan số 38,5 kHz với công suất là 810W, nhiệt độ 25°C Kết quả nhận thay răng, việc

tách chiết băng dung môi kết hop sóng siêu âm đã thu được kết quả tốt hon, hamlượng các chất tách chiết ra cao hơn so với phương pháp tách chiết băng phương phápdùng dung môi trong hệ thống Soxhlet [4]

Rebecca M Corbit và cộng sự (2005) đã tiễn hành việc tách chiết các hợp chấtsaponin băng dung môi là methanol kết hợp với nước, sau đó xác định hàm lượng cácchất băng cách dùng HPLC Trong đó, phương pháp dùng 100% dung môi methanoldé tách chiết (có hồi lưu ở 60°C) thì hàm lượng Rb; là cao nhất so với việc dùng cácphương pháp khác như chỉ sử dụng 100% là nước, 100% là methanol không hồi lưuở nhiệt độ phòng, hay nồng độ methanol 70% Qua kết qua này ta nhận thay hamlượng Rb; khi tiến hành tách chiết luôn cao hơn so với các chất khác trong nhóm Re(Rgi, Re, Rd, Re, Rbz) [5]

Hoon H Sunwoo va cộng sự đã sử dung phương pháp kết hop giữa việc sử dungenzyme thương mại và dùng áp lực cao dé khai thác ginsenoside từ nhân sâm Nhómtác giả đã sử dụng các enzyme thương mại như Celluclast (C), Termamyl (T),Viscozyme (V) cùng với áp lực thủy tĩnh cao (100 Mpa, 50°C trong 12 gid) Và kếtquả nhận được là ginsenoside tổng số tăng 184% trong khi đó Rg: va Rb; tăng 273%.Mẫu nhân sâm sử dụng trong nghiên cứu là những mẫu tươi, có độ tuổi là 5 tuổi vàđược cắt nhỏ, thêm 200 ml nước tỉnh khiết, xay nhỏ và rây qua rây Sau đó các mẫuđược tiễn hành khảo sát với từng loại enzyme hoặc kết hợp các loại enzyme lại vớinhau Lay 30 ml dịch nhân sâm sau khi ray ở trên, bố sung lần lượt vào 60 p11 cho mỗiloại enzyme hoặc kết hop (30 wl C + 30 wl T: 30 pl C + 30 pl V; 30 wl T + 30 pl V;20 nl C + 20 wl T + 20 pl V), tiếp đó kết hợp với áp lực thủy tĩnh 100 Mpa ở 50°Ctrong 12 gid, sau quá trình nay, mẫu được tiễn hành ly tâm 11000 vòng/phút trong 10phút, sau đó lọc với giấy lọc Whatman số 5 [6]

Qua những nghiên cứu trên đây, ta nhận thấy răng để trích ly hợp chất saponintừ rễ củ nhân sâm ta có thể kết hợp nhiều phương pháp như sử dụng sóng siêu âm, sửdụng dung môi, sử dụng enzyme hoặc kết hợp với áp lực cao

Với mục tiêu là thu nhận được nhiều nhất hàm lượng saponin từ Đảng sâm thìviệc trích ly thu nhận saponin bằng nhiều phương pháp hoàn toàn có thể thực hiệnđược Saponin thu nhận được có thể tạo thành dang cao, dạng bột hòa tan để sử dung,bồ sung như một thực phẩm chức năng.

Từ những nhận định trên, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nang cao khả năng thunhận saponin triterpenoid thô từ Dang sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook f.băng enzme và sóng siêu âm”

Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gôm: khảo sát khả năng thu nhận saponintriterpenoid sử dụng sóng siêu âm, enzyme cellulase, enzyme pectinase và sau đó làphương pháp kết hợp giữa sóng siêu âm và enzyme

CHƯƠNG 1: TONG QUAN

1.1 Tong quan về nguyên liệu sâm và Dang sâm

1.1.1 Nguyên liệu samĐông y coi sâm là vi thuốc đứng đầu các vị thuốc bồ Sâm nói ở đây là vị nhânsâm Vì vị nhân sâm giống hình người nên một số vị thuốc có hình gidng hình ngườicũng được gọi là sâm, sâm là một vi thuốc bố nên dan dần một số vị thuốc có tácdụng bé cũng được gọi la sam Sâm được phan biệt theo tên địa phương san xuất nhưsâm bố chính (sản xuất ở huyện Bố Trạch) hay Thượng đảng nhân sâm (sản xuất ởhuyện Thượng Đăng) hoặc mau sắc của sâm như hồng sâm, huyện sâm [2]

Nhân sâm là một loại thảo mộc phổ biến ở Trung Quốc được sử dụng từ vàinghìn năm như một loại thuốc trị bách bệnh nhằm nâng cao tuôi thọ [7] Đảng samcó vị thuốc giống như sâm, sản xuất ở quận Thượng Đăng, Trung Quốc [2] Và rấtnhiều loại thảo mộc khác có vị sâm như: sâm bố chính, thô cao ly sâm, sa sâm, tế điệpsa sâm, huyền sâm, sâm rừng [2] có nhiêu tác dụng trong chữa bệnh, tăng cườngsức khỏe.

Bảng 1.1 Nguyên liệu sâmTên gọi chung Tên khoa học Họ Nguồn gốc

, ^ Codonopsis javanica Việt Nam,Đảng sâm (Blume) Hook.f Campanuloideae Trung Quốc

: ^ ¬ Việt NamĐảng sâm leo Codonopsis pilosula Campanuloideae Trung QuốcĐảng sâm Codonopsis viridiflora khoa xanh Mxim Campanuloideae Trung quôc

Dang sam Codonopsis tubulosa Kom Campanuloideae Trung Quốc

hoa ôngXuyên đảngsâm Codonopsis tangshen Oliv Campanuloideae Trung Quốc

pane chó Codonopsis nervosa Nannf Campanuloideae Trung Quốc

Nhân sâm châu Á, Hàn Quốc,Trung Quốc,Hàn Panax ginseng C.A Meyer Araliaceae Trung Quốc,

Sâm Mỹ Panax quinquefolius L Araliaceae My, Canada

Sam Brazil Ffafht a paniculata (Mart) Amaranthaceae BrazIl

Kuntze

Sâm lùn Panax trifolius L Araliaceae Đông Bắc Mỹ

AC ca Panax zingiberensis CY kSam ginger Wu and K.M Feng Araliaceae Trung QuocNhân sâm Panax pseudoginseng Trung Quoc,Himalaya Wallich day Himalaya

Sâm Án Độ Withania somnifera (L.) Solanaceae Ue, Dong A,

Dunal chau PhiSam Nhat hay Panax japonicus C.A Nhat Ban,Chikutsu Meyer Trung QuocSam Noto hay Panax notoginseng k

Yunnan (Burkill) FLH Chen Araliaceae Trung Quoc

Sam San-chi hay sa ; Nepal, Đôngsâm Feathe-leaf Panax bipinnatifi dus Seem Araliaceae day Himalaya

Sam Siberia hay Eleutherococcus senticosus Nea, Trung

^ Araliaceae Quốc, Hànsâm Nga (Rupr & Maxim.) Maxim k

QuocSâm K5, sâm

Ngọc Linh, sâm Panax vietnamensis Ha & Araliaceae Việt Nam

tre Grushy.

Hibiscus sagittifolius Kurz

Sâm bố chính (A belmoschus sagittifolius Malvaceae Viet Nam

L Merr., Hibiscusabelmoschus L.)Talinum crassifolium Willd Trung Quéc

Tho cao ly sam (Talinum patens L., Talinum Portulacaceae ne ,

Việt Nampaniculatum Gaertn.)

Launaea pinnatifida Cass(Microrhynchus

Sa sam sarmentosus DC., Asteraceae Việt Nam

Prenanthes sarmentosaWilld.)

- Adenophora verticillata Việt Nam.Sa sâm Fisch (Adenophora Campanulaceae Trung Quéc

tetraphylla (Thunb) Fisch.) ©

Wahlenbergia gracilis ` `

Tế diệp sa sâm A.DC (Campanula Campanulaceae Vigt Nam, Lao,

vincaeflora Vent) Campuchia

Glehnia littoralis F.

Trung Quoc,Bắc sa sâm Schmidt (Phellopteris Umbelliferae Đài Loan

littoralis Benth)Dan sam Salvia multiorrhiza Bunge Lamliaceae Việt Nam

Huyén sam Ma hularia buergeriana Scrophulariaceae Trane Quốc

Tuc doan Dipsacus japonicus Dipsacaceae Viet Nam

Schefflera octophyllaNam sâm (Lour.) Harms (Aralia Araliaceae Việt Nam

octophylla Lour)Boerhaavia repens L (B.

Sam rung hie Ih tuiaee — Nyctaginaceae Việt Nam

Chinensis Lour)Sophora flavescens AitKhổ sâm (Sophora angustifolia Sieb Fabaceae Trung Quốc

et Zucc.)Spirathes sinensis (Pers) Viet Nam,Ban long sam Ames (Spiranthes australis | Orchidaceae Trung Quốc,

(Nguồn: [2]; [8]; [9])

1.1.2 Dang sam

- Tén khoa hoc: Campanumoea javanica Blumme

- Họ: Hoa chuông Campanulaceae

- Bộ: Hoa chuông Campanulales

1.1.2.1 M6 taCay nho, moc bo hay leo, song lau nam, phién lá hình tim hoặc hình trứng, đầu

tù hoặc nhọn, mép lá nguyên hoặc hơi lượn sóng Rễ hình trụ dài, hơi cong queo,

phân nhánh và có rê con dạng tua nhỏ, dài 10 — 20cm, đường kính của rê đôi với câytrồng dược liệu từ 0,5 đến 1,5cm, cứng vả giòn, mặt bẻ gẫy không chắc có vết nút,hoặc hơi phăng và đặc, phan vỏ mau đỏ nau và phan g6 mau vàng xám hoặc màu nautia với bó mach màu trăng vàng, xêp theo hướng xuyên tâm Mùi nhẹ, vi hơi đăng vase [10] [11]

1.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu của rễ

Mat cat có hình tròn, từ ngoài vao trong có: lớp ban khoảng 4-5 hàng tế baohình chữ nhật xếp đều đặn thanh hàng đồng tâm và dãy xuyên tâm, hoi rách Mômềm, vỏ cấu tạo bởi các tế bào hình nhiều cạnh hơi dai det, xếp lộn xộn, rai rắc cócác đám tế bao mô cứng Các tế bao libe nhỏ xếp sit nhau, trong libe có ông nhựa mủxếp rải rác thành hàng và thành vòng ứng với bó libe gỗ Libe thành dải dài chiếmphân lớn lát cắt Các mạch gỗ xếp thành hàng (hai hàng) tạo thành hệ thống hình nan

Hình 1.1 Vi phẫu Dang sâm Trung Quốc [13]

1.1.2.4 Thành phần hóa học của rễ cây Đảng sâm

Năm 2002, Hoàng Minh Chung và cộng sự [3] đã bước đầu nghiên cứu thànhphan hoá học của vị thuốc Dang sâm cho thay:

- Trong rễ Đảng sâm có đường, saponin, acid amin, chất béo và khoáng

- Băng sắc ký lớp mỏng, bước đầu đã xác định được 5 vết saponin của Đảngsâm tươi chưng cất 2 giờ Hàm lượng saponin trong mẫu tươi là 2,17%

Cũng chính hai tác giả này khi bước đầu nghiên cứu thành phần saponin của rễcây Đảng sâm thì kết quả cho thấy trong mẫu Đảng sâm có saponin triterpenoid.Nghiên cứu cho thay chi số tao bọt của Dang sâm tươi là 8; chỉ số phá huyết là 5,7;

hàm lượng saponin là 3,12 + 0,08% [3 |

1.2 Tổng quan về hợp chất saponin và saponin triterpenoid

1.2.1 Khái niệm saponinSaponin hay saponosid là một nhóm các glycoside có phần genin có cau trúctriterpen hay steroid 27 carbon gặp rộng rãi trong thực vật, cũng được tìm thấy rộngrãi trong động vật thân mềm như Hải sâm, Sao biên Tiền tổ latinh sapo có nghĩa làxa phòng vì khả năng tạo bọt như xa phòng [14] [15]

1.2.2 Phân loạiTuy theo tinh chất hóa học của aglycone (được gọi là sapogenin), các saponinđược chia thành saponin steroid và triterpenoid.

Saponin khi thủy phân cho glycon (gốc đường, bao gồm glucose, arabinose,xylose và acid glucoronic) vả aglycon (gốc sapogenin, bao gém saponin trung tinh vasaponin acid)

Câu trúc hóa hoc cơ bản cua nhóm saponin trung tính là steroid còn của nhómsaponin acid là triterpenoid (Hình 1.3)

2 Arabinose3 Xylose

4 Glucuronic acid Steroids Triterpenoids

Hinh 1.2 Phan loai Saponin

Hình 1.4 Cau trúc cơ bản của Triterpenoid sapogenins với vòng ABCDE- Saponin triterpenoid năm vong

Saponin triterpenoid năm vòng có phan sapogenin có khung 30 carbon với 5vòng và 8 nhóm methyl Nhóm methyl ở carbon 28 thường được oxi hóa thànhnhóm carboxyl Nhóm nay có thé kết hợp với phan đường tạo các dây nốipseudoglycosid, nhóm methyl trên khung có thé được oxi hóa thành -CH2OH (nhưở C-23, C-28), -CHO hay —COOH (như ở C-23, C-27 hay C-30).

Nhóm này lại được chia thành các nhóm nhỏ Năm phân nhóm gặp trongsaponin là oleanan, ursan, taraxasteran, lupan và hopan.

+ Nhóm oleanan:Nhóm này có khung cơ bản là oleanan phần lớn các saponin triterpenoid trongtự nhiên đều thuộc nhóm này Phan aglycon thường gặp nhất là dẫn chat của 3/-hydroxy-olean-12-en, tức là 6-amyrin C-28 thường là nhóm carboxyl Các nhómmethyl khác có thé bị oxy hóa là C-23 và C-30

Trong các sapogenin có cấu trúc Ø-amyrin thì acid oleanolic là genin phố biếnnhất khi tao glycoside, mạch đường thường nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khimạch thường nối vào C-28 theo dây nối ester Người ta đã phân lập được saponinthuộc nhóm này có đến 11 đơn vị đường trên cả 2 mạch, riêng một mạch có thé đến

Hình 1.5 Công thức cau tao của nhóm oleanan+ Nhóm ursan:

Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm oleanan chỉ khác là nhómmethyl C-30 không đính vào vi trí C-20 của khung mà đính ở vi trí C-19 Cácsapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3/-hydroxy-ursan-l2-en tức làœ-amyrin Những saponin nhóm ursan ít gặp hơn với nhóm oleanan Cinchona

glycosid A, cinchona glycoside B có trong cây Canh-ki na, asiaticosid, madecassosid

Hình 1.6 Công thức cau tạo của nhóm ursan (a: ursan, b: a-amyrin)+ Nhóm teraxasteran:

Cac saponin eclabasaponin VII, VIII, [X, X có trong co mực (Elipta alba L.)thudc nhom nay.

+ Nhom lupan:

: l

COOHO

OH (IIIa)

Hình 1.7 Công thức cau tạo của nhóm lupanNhóm lupan III có các vòng A, B, C, D giống hai nhóm trên, chỉ khác là vòngE là vòng 5 cạnh với C-20 ở vòng ngoài và hướng a.

Các saponin nhóm này thường có nỗi đôi ở C-20 (29) Ví dụ như saponin arabinofuranosyl-(1^4)-B-D-glucorono-pyranosid]-3B-hydroxy-lup-20(29)-

a-L-en(IIIA) có trong rễ Ô rô Acanthus iliciformis L một số saponin có trong cây Ngũgia bì chân chim (Scheflera heptalphylla (L.) Frodin) cũng thuộc nhóm này.

+ Nhóm hopan:

Hình 1.8 Công thức cau tạo của nhóm hopan

Cấu trúc của nhóm hopan có 5 vòng tương tự nhóm lupan chỉ khác ở nhómmethyl góc đính ở C-18 hướng a Thay vì đính ở C-17 hướng B; C-22 ở ngoài vònghướng a Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cây cỏ thảmMollugo hirta L.

+ Các nhóm khác:Ngoài các nhóm kể trên, saponin triterpenoid năm vòng còn có các nhóm nhỏkhác ít gap hơn như taraxeran, glutinan mà sự khác biệt chủ yếu là ở cau hình củakhung (sự dung hợp giữa các vòng) va sự chuyền vị trí của các nhóm methyl Đôi khicũng øặp các sapogenin có vòng bị mở (các cấu trúc seco~) hay thêm một hay hơnmột carbon (các cau trúc homo ~), thiếu một carbon trên khung (các cấu trúc nor ~)

- Saponin triterpenoid bon vòng [14]

Saponin triterpenoid 4 vòng (saponin triterpenoid tetracyclic) có 4 nhóm làdammaran, lanostan, tirucallan, cucurbitan.

+ Nhóm dammaran:

Hình 1.9 Công thức cau tạo của nhóm dammaranĐại diện cho nhóm này là saponin của Nhân sâm Phần aglycon gồm 4 vòng A,B, C (6 cạnh), D (5 cạnh) và một mạch nhánh 8 carbon Do có nhóm OH đính vào C-

20 nên khi tác dụng bởi acid, mạch nhánh dễ bị đóng vòng tạo thành vòng

tetrahydropyran Băng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, ví dụ như oxihóa bằng iodat, người ta đã thu được 2 genin chính của các saponin nhân sâm làprotopanaxadiol và proropanaxatriol Phần đường nối vào OH ở cacbon C-3 hoặc C-20 dé tạo thành glycoside Cũng có một số saponin có cả hai mạch đường Sponintriterpenoid bốn vòng nhóm dammaran còn gặp trong một số được liệu khác như hạtTáo, Rau đăng biển hay Cô yếm

Cấu trúc của nhóm lanostan gần giống với dammaran, chỉ khác ở chỗ nhómmethyl gốc đính vào vị trí C13 thay vì C-8 Nhóm được chia thành 2 nhóm phụ:

Nhóm phụ holostan: do có sự đóng vòng lacton giữa C-18 và OH ở C-20, đạiđiện là Holotoxin A, B có trong các loài hải sam Holothuria spp.

Nhóm phụ cycloartan: có cau trúc 9,19 cyclo-(9B)-lanostan Các saponinabrusosid A, B, C, D có trong Cam thao dây Abrus precatorius L hay saponin trongAstragalus sieberi DC là những vi dụ.

+ Nhóm tirucallan:Saponin nhóm tirucallan có cấu tạo tương tự như lanostan nhưng khác ở cau hìnhC-20 va các nhóm thé methyl ở C-18, 21 và 30 Các saponin của rễ cây bồ hòn(Sapindus mukorossi gaertn) thuộc nhóm này.

+ Nhóm cucurbitan:

28 29

Hình 1.11 Công thức cau tạo của nhóm cucurbitanPhan lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae do đó macó tên như trên Ở cucurbitan, có một sự chuyển vị của nhóm CH; so với các cautrúc thông thường khác Nhóm CH3 góc thay vi ở vi trí C-10 lại ở C-9 hướng B cònH 6 C-10 là một hydro hướng a.

Quang phố của saponin chủ yếu là kết quả của mức độ hydroxyl khác nhau trênaglycone Các mô hình của nhóm thế trên aglycones thường xảy ra bắt nguồn từ cautrúc oleanane của saponin Nhóm hydroxyl ở vị trí C - 3 được tìm thay trong tất cacác cấu trúc, nhóm hydroxyl thường ở các vi trí C -16 , C-21 và C -22 , và ít hơn ởcác vi trí C-2 và C-15 Các nhóm methyl ở vi trí C - 23, C- 24, € -28,C - 29 và C- 30 có thé bị oxy hóa thành gốc CH2OH- hoặc -COOH, và trong một số trường hoplà nhóm CHO Các nhóm hydroxy! có thé được acyl hóa, và điều nay dẫn đến sự hìnhthành của ester saponin Thành phan axit trong trường hop này thường là formic,axetic, n- và iso- butyric, isovalerianic, a -methyl butyric, angelic, tiglic, benzoic,cinnamic, và axit ferulic, trong một số trường hop là axit sunfuric [16]

1.2.4 Công dụng của saponinSaponin là một thành phần của thực vật, có mặt trong hơn 90 loại thực vật trongtự nhiên Công dụng của saponin được tạo ra từ khả năng hoạt động của chúng, chồngviêm, kháng khuẩn, kháng nam, ức chế virus Một số có tác dụng trong điều trị viêmloét dạ dày và viêm da Trifolium alexandrinum là một loại cây trồng hàng năm trồngở Ai Cap và hạt của nó được sử dung trong điều trị bệnh tiểu đường Báo cáo vé sựcô lập và xác định cau trúc của saponin triterpenoidal oleanene (1-4) như các estemethyl từ hạt của cây này Cấu trúc của saponin 1-4 cho thấy 1 và 2, 3 và 4 là hai cặpdisteriomers, trong đó một hợp chất cho thay sự hiện diện cua galactose trong khichất còn lại chứa glucose (Hình 1.12) [1]

Saponin có một số tác dụng dược lý, những tính chất quan trọng là thâm thấuqua mảng tế bảo, làm giảm cholesterol trong huyết thanh, kích thích hormoneluteinizing dẫn đến say thai, khả năng điều chỉnh miễn dịch thông qua sự tương táccytokine, độc hai tế bao và các hiệu ứng độc tế bào trên các té bào khối u ác tính, bổtrợ với vac xin như phức hợp miễn dịch (ISCOM), và tăng cường hỗ trợ độc tính củaimmunotoxins [16]

1.3.1 Khái niệm

HOHC ở HOH,C ởHO —O —_o“

OH \ «oH ì

Hi (i

0

HO ,—-O HO(CH, \ ⁄CH.

—fh H

L i

HO OHHO OH

1: Ri =S-1, Ro =H2: Ri = 8-2, Ro =H3: Ri = S-1, Ra =8-34: Ri = 8-2, Ro =S8-3

Hình 1.12 Công thức cau tao saponin 1-4

1.3 Tìm hiéu về sóng siêu âm

Các thông sô sóng siêu âm:Siêu âm là một rung động cơ học và được sản xuất bằng cách chuyển đổi nănglượng điện thành năng lượng cơ học Năng lượng siêu âm trong dải tần số 20 —

100kHz với cường độ âm thanh 10-1000 W/cmZ [17]

Sóng siêu âm là sóng dọc: tức là giao động cùng chiêu với chiêu lan truyên sóng.Siêu âm chỉ truyền trong môi trường giãn nở (trừ chân không)

Tan số (Hz): là sô lần cùng một hiện tượng lặp lại trên một đơn vị thời gian

Bước sóng: là khoảng cách giữa hai đỉnh sóng (điểm mà sóng đạt giá trị lớnnhất), hoặc tong quát là giữa hai cấu trúc lặp lại của sóng, tại một thời điểm nhấtđịnh.

Cưởng độ siêu âm: là lượng năng lượng được sóng âm truyên qua một đơn vịdiện tích đặt vuông góc với phương truyền âm (W/em?)

Năng lượng siêu âm (J/em?): là động năng dao động và thé năng dan hồi của cácphân tử trong môi trường

1.3.2 Cơ chế tác dụng

Sóng siêu âm được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành, bao gôm hoá học,vật ly, kỹ thuật, hải dương học, địa chan học, y học, công nghiệp thực phẩm Hầuhêt các ứng dụng này đều dựa trên hai tính năng độc đáo của sóng siêu âm:

- Sóng siêu âm lan truyền chậm hơn sóng điện từ khoảng 100.000 lần Điềunày tao ra khả năng ghi nhận thông tin kịp lúc, cũng như độ thay đồi độ trễ của cácbiến

- Sóng siêu âm có thé dé dàng xâm nhập vào các vật liệu chan sáng, trong khinhiều bức xạ ánh sáng không làm được Nguồn sóng siêu âm không tốn kém mà lạinhạy và đáng tin cậy, tạo nên một phương pháp đáng chờ mong để có được hìnhảnh của các vật liệu chắn sáng [18]

- Sóng siêu âm có thể gây các tác dụng sau [17]

+ Tác dụng nhiệt: Nhiệt là kết quả quá trình hấp thụ năng lượng dao động củasóng siêu âm, đặc biệt là tại điểm tiếp xúc giữa các phần tử có thể xảy ra sự tăng nhiệtcục bộ Nhiệt độ tăng cục bộ này có thể lên đến hơn 4800K với một số sóng siêu âm

+ Tác dụng xâm thực: Xâm thực do siêu âm là sự quá trình hình thành, pháttriên và vỡ của các bọt khí trong lòng chât lỏng do sự biên đôi áp suât gây nên Tạibọt khí ở thời điểm vỡ bọt có thé đạt nhiệt độ lên đến 5000K va áp suất 2000atm trong

bề siêu âm ở nhiệt độ phòng Chính áp lực và nhiệt độ này làm phá vỡ bề mặt vật liệuvà tăng khuếch tán dung môi vào trong và chất trích ly được phóng thích ra bên ngoài.

+ Tác dụng lên cau trúc: khi chat lỏng nam trong trường tac động của sóng siêuâm cường độ cao, dao dộng và áp lực tác động lên độ nhot của nó.

+ Nén và dãn: khi sóng siêu âm năng lượng cao đi qua môi trường rắn, nó gâynên một loạt các chu kỳ nén và dãn liên tục tương ứng với tần số của sóng siêu âm.Mặc dù thay đổi áp lực do nén dan là nhỏ nhưng tac dụng của nó lại mạnh do tốc độnhanh của dao động Vật liệu ran mật độ cao có thé bị phá vỡ do áp lực từ sóng siêu

^

âm.

+ Nhiễu động: Siêu âm cường độ cao có thể làm phân tán các phần tử ở trongcác khí hay chat long có độ nhớt thấp Tại bề mặt phân pha lỏng/ ran hoặc khí/ ran,sóng siêu âm gây ra hỗn loạn lớn gọi là “dòng chảy siêu âm” hay “dòng chảy siêunhỏ” Điều nay làm giảm lớp biên khuếch tan, làm tăng lượng chất chuyển động đốilưu, và từ đó làm tăng tốc độ khuếch tán

+ Tác dụng khác: Trong điều kiện nhất định, siêu âm cường độ cao có thé gayđông tụ nhiều loại phan tử và ứng dụng hiệu qua với huyền phù nồng độ thấp

1.3.3 Thiết bị phát sóng siêu âm

Thiết bị phát sóng siêu âm cũng phải gồm có 3 phân tối cần thiết sau:

Bộ phận chuyền phan lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao đểvận hành bộ phận biến đối

Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những daođộng Phân lớn thiết bị phát sóng siêu âm ngày nay sử dụng kỹ thuật áp điện Hìnhdạng và kích thước của bộ phận này phụ thuộc vào tần số làm việc, bộ phận 20kHzcó chiều dai gấp đôi bộ phận 40kHz Năng lượng qua bộ bién đổi sẽ chuyển ngượclại thành bình phương tần số dao động, vì vậy thiết bị năng lượng cao tần số thấpđược chú trọng Bộ phận biến đổi nối với hệ thông truyền sóng thông qua một thiếtbị phụ.

Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lòng chất lỏng Trongthiết bi phát sóng siêu âm dạng bể, bộ phận biến đồi được gắn ở đáy bề và truyền trựctiếp dao động vào chất lỏng trong bồn Tuy nhiên, đối với thiết bị năng lượng cao(thiết bị dạng thanh/que) dao động được khuyếch đại và truyền vào môi trường lỏngnhờ thiết bị trung gian gắn với bộ phận biến đổi Theo thời gian, đầu của bộ phậntrung gian này có thể bị mòn và bị giảm chiều dài cần thiết vì vậy người ta phải lắpđầu có thể tháo gỡ được [19]

1.3.4 Ứng dụng của sóng siêu âm

Sóng siêu âm chủ yếu dùng để chế biến, bảo quản và trích ly trong công nghệthực phẩm Các ứng dụng cụ thể của sóng siêu âm trong ngành công nghệ thựcphẩm có thé được liệt kê trong Bang 1.2 và Bang 1.3 [20]

- Đối với tế bào sông

+ Kích thích hoạt động: có nhiều ví dụ về việc tăng sản xuất thực phẩm bằngsóng siêu âm mà lam tăng hiệu quả hoạt động của tế bao mà không phá vỡ chúng,chang hạn:

+ Tăng sự sản xuât protein của tảo gâp 3 lần khi sử dụng siêu âm năng lượngthấp

+ Giảm đến 40% thời gian sản xuất sữa chua, lại cải thiện được tính đồng bộvà kết cau sản phẩm.

+ Tăng 30 số hạt hướng dương nay mam

+ Giảm 10 ngày thời gian chín của cà chua.

+ Việc tăng tỉ lệ nay mam và giảm thời gian chín là co sở cho việc thay thê cácphương pháp hoá học dé sản xuất sản phẩm nông nghiệp hữu cơ

Bang 1.2 Các ứng dụng của sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm

Lĩnh vực Ứng dụngChế biến thực phẩm Lọc

Khử bọtBài khíKhử polymerNấu

Tách khuônCắt

Làm lạnh và tạo tỉnh thể đáLàm tan giá

Làm khôLàm mềm thịtƯớp muối, dầm giamTiệt trùng/ thanh trùngNhũ hoá/ đồng hoáBảo quản thực Bất hoạt tế bào vi sinh vậtphẩm Bất hoạt bào tử

Bat hoạt enzymeTrich ly H6 tro trich ly

Bang 1.3 Tac dung cua nang lượng siêu âm [21]Đối tượng tác dung Ảnh hướngTế bào sống Kích thích hoạt động

Phá huỷ tế bàoEnzyme Kich thich hoat dong

Kiém soat su lam bién tinhÁp lực bề mặt Cải thiện quá trình thâm thâu

Cải thiện sự quá trình trích ly

1.4 Tổng quan về enzyme cellulsae va pectinase

1.4.1 Enzyme cllulase

1.4.1.1 Định nghĩa

Cellulase thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng thủy phân cellulose thànhcellobiose rồi thành glucose thông qua xúc tác thủy giải liên kết B-1,4 glycoside trongcellulose.

1.4.1.2 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase

Cellulase là một phức hệ enzyme tùy theo tính chất và cơ chế tác dụng mà ngườita chia ra 3 loại chủ yếu: cellobiohydrolase (ex-cellulase), endoglucanase (endo-cellulase), B-glucosidase (cellobiase) Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chấttheo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó màphân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.Cellulase thủy phân cellulose (liên kết -B-1,4-D-glucoside) tạo ra sản phẩm cuối cùnglà glucose.

1.4.1.3 Phan loại enzyme cellulaseMột hệ thống enzyme thủy phân cellulase chứa 3 thành phan chính:- Endo-p-glucanase (1,4-B-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.14), có khốilượng phân tử trong khoảng 42-49 kDa Phân cắt ngẫu nhiên mach cellulose, phâncat các liên kết B-1,4 glucoside trong cellulose, lichenin và B-D-glucan Sản phẩmcủa quá trình phân giải là các oligosaccharide có độ dài khác nhau, cellodextrin,cellobiose va glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tácđộng yếu đến cellulose kết tỉnh

- Exo-p-glucanase (1,4-B-D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2 7.97), khối lượngphân tử của các enzyme thuộc nhóm nảy trong khoảng 53-65 kDa Phân cắt đầu khôngkhử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này còn có | loạt tên khácnhư: cellobiohydrolase, exo glucanase, exocellulase, cellobiosidase và enzyme này