Tối ưu hoá trích ly thu nhận dịch SAPONIN từ đảng sâm CODONOPSIS JAVANICA BLUME HOOK f bằng ENZYME ALPHA AMYLASE

HOẠT ĐỘNG NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG « TĨI ƯU HĨA TRÍCH LY THU NHẬN DỊCH SAPONIN THÔ TỪ ĐẢNG SAM CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK F BẰNG ENZYME ALPHA AMYLASE Tóm tắt: Đảng sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook f thuộc họ hoa chuông Campanulaceae, trồng nhiều Lâm Đồng, Việt Nam Trong nghiên cứu chúng tơi sử dụng enzyme alpha-amylase để tiến hành trích ly xác định hợp chat saponin thô từ đảng sâm Saponin thành phần dược liệu tập trung chù yếu rễ củ Kết nghiên cứu cho thấy ràng tiến hành trích ly bang enzyme alpha-amylase với pH 5,5; ù 85°c thời gian tối ưu 1,9 giờ; hàm lượng enzyme sử dụng 0,47% hàm lượng saponin tổng thu 1557,23 mg/100g cao hom 1,5 lan không sử dụng enzyme điều kiện Từ khóa: Đảng sâm, enzyme alpha-amylase, trích ly, saponin thô I PHẦN M Ở ĐẦU Đảng sâm Codonopsis ịavanica (Blume) Hook f thuộc dạng nhỏ, mọc bị hay leo có rễ hình trụ dài, cong queo, phân nhánh có rễ dạng tua nhỏ, dài - cm, đường kính cùa rễ trồng dược liệu từ 0,5 đến 1,5 cm1'1 Trong rễ Đảng sâm sống chế biến có đường, saponin, acid amin chất béo, sắc ký lớp mỏng, bước đầu xác định vết saponin cùa Đảng sâm sống chưng cất giờ, hàm lượng saponin mẫu chế (1,47%) thấp mẫu sống (2,17% )121 Saponin hay saponosid nhóm glycoside có phần genin có cấu trúc triterpen hay steroid 27 carbon gặp rộng rãi thực vật, tìm thấy rộng rãi động vật thân mềm hải sâm Strichobus japonicus Selenka, biến Astropecten polyacanthus Tiền tố latinh sapo có nghĩa xà phịng khả tạo bọt nhu xà phịng Tuỳ theo tính chất hóa học aglycone (được gọi sapogenin), saponin chia thành saponin steroid triterpenoid1“11 Triterpenoid saponin chủ yếu chứa aglycones với 30 nguyên tử carbon dẫn xuất chúng Các cấu trúc cốt lõi thường xảy oleanans pentacyclic (saponin triterpenoid vịng) dammarans tetracyclic (saponin triterpenoid vịng)131 Cơng dụng saponin có khả chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus Một số có tác dụng điều trị viêm loét dày viêm da|51 Hoon H Sunwoo (2013) tiến hành kết hợp enzyme cellulase, anpha amylase, viscozyme để thủy phân nhân sâm thu nhận saponin kết cho thấy sử dụng enzyme anpha amylase thu hàm lượng saponin khơng có khác biệt nhiều với việc sử dụng enzyme cellulase161 Như việc sử dụng enzyme anpha amylase vào việc tách chiết cho đối tượng Đảng sâm II Th.s Trương Hoàng Duy1 II Th.s Lê Phạm Tấn Quốc1 II Th.s Trần Thị Hồng cẩm ¡1Thằs Phạm Thị Kim Ngọc3 ¡1 G$ỄTS Đống Thị Anh Đao4 Viện CN Sinh học & Thực phẩm, Trường ĐH Cơng nghiệp Tp Hố Chí Minh ,2)Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm Tp Hổ Chí Minh 131Khoa hóa học CNTP, trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu (4) Trường ĐH Bách Khoa Tp Hổ Chí Minh hướng khả thi Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng enzyme a-amylase để tiến hành trích ly hợp chat saponin thơ từ Đảng sâm II ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2Ề1 Vật liệu nghiên cứu Đảng sâm: năm tuổi lấy từ Công ty Sâm Cao Lâm, thành phố Đà Lạt, tinh Lâm Đồng Mầu thượng đẳng nhân sâm sau lấy xay nghiền nhỏ, đóng gói chân không bảo quản 4°c mẫu sử dụng nghiên cứu Enzyme a-amylase sử dụng enzyme thương mại có tên Termamyl 120L cung cấp Công ty Novozymes 2.2ẵ Phương pháp nghiên cứu ĐẠC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ < » HOẠT ĐỘNG NGHIÊN u KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG 2ễ2.1 Khảo sát nguyên liệu Đảng sâm Độ ẩm nguyên liệu đo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Định danh saponin dựa vào phương pháp quang phổ: vanilin acid vô mạnh (acid sunfuric, acid photphoric, acid perchloric) kết hợp với genin cho sản phẩm màu hấp thụ cực đại bước sóng ánh sáng khoảng 510 - 620 nm Một phản ứng tách nước xảy tạo thành nhóm methylene chưa no gây nên màu tím hoa cà cho sản phâm với aldehyde131 2.2.2 Xác định hàm lượng saponin - Dựng đường chuan bang acid oleanolic Dung dịch acid oleanolic pha với nồng độ 2000ppm, sau cho vào ống nghiệm với thể tích khác nhau, sau bổ sung vào chat vanillin - acetic acid (8%), acid pechoric (đậm đặc), ethyl - acetat, đun nhiệt độ 60°c thời gian 45 phút dung dịch chuyển sang màu tím hoa cà, đo độ hấp thu bước sóng 550 nm|71 - Xác định saponin mẫu Mau sau trích ly lọc định mức lên 100 ml Hút 0,2 ml mẫu từ bỉnh định mức cho vào ống nghiệm, bổ sung 0,2 ml vanillinacid acetic (8%), 1,2ml acid perchloric, đun cách thủy (nhiệt độ khoảng 60°C), thời gian đun 45 phút Khi mẫu chuyển sang màu tím hoa cà, đo độ hấp thu bước sóng 550 nm 2Ề2.3 Thiết kế Plackett-Burman sàng lọc thí nghiệm tối iru hóa theo phương pháp bề mặt RSM Đe xác định yếu tố ảnh hưởng đến trinh trích ly thu nhận saponin từ Đảng sâm bang enzyme a-amylase, yếu tố chọn từ khảo sát bao gồm: ti lệ nguyên liệu: nước (w/v), pH, nhiệt độ ủ, thời gian ủ, hàm lượng enzyme Thí nghiệm thiết kế theo ma trận Plackett-Burman với yếu tố 12 thí nghiệm để sàng lọc yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến q trình trích ly TS từ thượng đẳng nhân sâm (Bảng 2) Các yếu tố sàng lọc có ảnh hưởng đến q trình trích ly đua vào tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt RSM dạng ngoại tiếp đường trịn tồn phương, ngẫu nhiên Hàm đáp ứng chọn hàm lượng saponin Mơ hình hóa biểu diễn phương trình bậc 2.2.4 X lý số liệu Số liệu thực nghiệm lặp lại lần lấy giá trị trung bình sau dùng phần mềm JMP 9.0 Modde 5.0 để phân tích số liệu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế Plackett-Burman sàng lọc thí nghiệm Giá trị ảnh hưởng ti lệ nguyên liệu: nước (w/v), pH, nhiệt độ ủị thời gian ủ, hàm lượng enzyme tính tốn phần mem JMP (Bảng 1) Giá trị có ảnh hưởng dương lớn ảnh hưởng đến hàm lượng saponin thu nhận dùng enzyme a-amylase để trích ly Hàm lượng enzyme sử dụng (%) thời gian ủ (giờ) có ảnh hưởng mạnh đến q trình trích ly thu nhận saponin từ Đảng sâm với mức ý nghĩa 5% Vì hàm lượng enzyme sử dụng (%) thời gian ủ (giờ) yếu tố chọn để tiến hành tối ưu hóa 3.2 Tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt RSM Sau tiến hành sàng lọc yếu tố ảnh hưởng, tác giả tiến hành tối ưu hóa yếu tố chọn Yeu tố hàm lượng enzyme (%) chọn khoảng 0,4 đến 0,6, giá trị tâm 0,5 yếu tố thời gian ủ (giờ) chọn khoảng đến giờ, giá trị tâm Các thơng số cịn lại tỉ lệ nguyên liệu: nước (w/v) 1:8, pH 5,5, nhiệt độ ủ 85°c > ĐẠC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ cố định (căn vào thí nghiệm sơ bộ) Sử dụng phần mềm Modde để phân tích kế hoạch thực nghiệm kiện trình Mơ hình tồn phương bậc xác định bàng phương pháp hồi quy đa biến, sau phân tích liệu, phương trình hồi quy bậc có dạng: Y = 15,35 + 263,5X4 - 82,48X -300.03X ; -302,23 X / + 136,38X4X ị Trong giá trị Y, x^, X5 hàm lượng saponin thu nhận xử lý bàng enzyme ct-amylase, hàm lượng enzyme (%), thời gian ủ (giờ) Dựa vào phương trình hồi quy ta nhận thấy X, có ảnh hưởng dương đến hàm lượng saponin thu nhận được, X5, X42, X 52có ảnh hường âm tương tác X4X có ý nghĩa mặt thống kê Từ Bảng 3, hệ số hồi quy R2 tính 0,979 hệ số biến thiên ảo Q2 0,851 Giá trị R2 Q2 tiến đến mức độ tin cậy mơ hình hồi quy cao Điều kiện tối ưu cho q trình trích ly thu nhận saponin từ Đảng sâm xác định phần mềm Modde 5.0: hàm lượng enzyme 0,47%; thời gian ủ 1,9 Ở điều kiện tối ưu này, hàm lượng saponin thu nhận dự đốn theo phương trình hồi quy 1593,52mg/100g Để kiểm chứng hàm lượng saponin dự đốn theo mơ hình, tác giả tiến hành thực thí nghiệm với điều kiện tối ưu hóa (lặp lại lần), đồng thời thực mẫu đối chứng điều kiện không sử dụng enzyme Hàm lượng saponin thu nhận xử lý bang enzyme 1557,23 mg/100g, chênh lệch 2,27% (F 1:7 1:9 -0,58b 0,5824 -1,1b 0,3131 0,2938 Tỉ lệ nguyên liệu: nước pH Nhiệt độ ủ 80 90 -1,15b Hàm lượng enzyme (%) 0,4 0,6 3,31a 0,0161 7,3a 0,0003 Thời gian ủ (giờ) ĩ Mỉ C&L.b Bảng Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman Phương pháp trích ly thu nhận Yếu té X, X, X, X X, Thực ngMỊm (mg/100g) 45 90 0,6 1456,37 35 80 0,6 1440,71 35 90 0,4 1401,04 saponin tối ưu đ ợ c x c định với +++++ -+-++ —+-+ + — +- 45 80 0,6 1195,39 hai yếu tố ảnh hưởng m ạnh -+ — + 35 80 0,4 1430,36 35 90 0,4 807,54 saponin bang en zym e a-a m y la se cho kết quà tốt so với v iệc trích ly nước cùn g điều kiện H àm lượng saponin trích ly c a o 1,5 lần so với n c, điều kiện thu nhận hàm lượng en zym e sử dụng thời gian ủ - 35 80 0,6 1219,22 + + 45 80 0,4 1466,27 + + 45 80 0,4 820,51 +++— 45 90 0,4 851,27 -+ + + - 35 90 Ó,6 1172,16 45 90 0,6 1474,21 + -+ + + Bảng Phân tích phương sai mơ hình hổi quy Nguổn biến thién Hói quy Tổng binh phương Bậc tự Trung bình binh phương p 1,48x1 o6 295084 Phán dư 31570,2 6314,05 Tổng 1,51x106 10 150699 R2 0,979 Q2 0,851 T.H.D, L.P.T.Q, T.T.H.C, PẽTểK.N, Đ.TềA.Đ TÀI LIỆU THAM KHÀO [1] Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập I, NXB khoa học kỹ thuật, 2004, tr xs Hình Biều đồ biểu diễn mói liên hệ hàm lượng enzyme thời gian ủ với hàm lượng saponin thu nhận 739-743 [2] H M Chung, "Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc Đảng sâm Việt Nam," Tạp chí dược liệu, pp 3-6,118-120,2002 [3] K Hostettmann, Saponins, Cambridge University, 1995, p 144 [4] S D Desai/'Saponins and their Biological Activities," Pharma Time, vol 41, no 3,2009 [5] Sammy Emara, Khaled M Mohamed, Tsutomu Masujima a, "Separation of naturally occurring triterpenoiddal saponins by capillary zone electrophoresis," Biomedical Chroma­ tography, pp 252-256, 2001 [6] H H Sunwoo, "Extraction of ginsenosides from fresh ginseng roots (Panax ginsengC.A Meyer) using commercial enzymes and high hydrostatic pressure," Biotechnol Lett, 2013 [7] Xiang, z B., Tang, c H„ Chen, G., & Shi, Y s., "Studies on colorimetric determination of oleanolic acid in Chinese quince," Natural Nroduct Research and Development, vol 13, pp 23-26,2001 ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ < ... hưởng mạnh đến q trình trích ly thu nhận saponin từ Đảng sâm với mức ý nghĩa 5% Vì hàm lượng enzyme sử dụng (%) thời gian ủ (giờ) yếu tố chọn để tiến hành tối ưu hóa 3.2 Tối ưu hóa theo phương pháp... kê Từ Bảng 3, hệ số hồi quy R2 tính 0,979 hệ số biến thiên ảo Q2 0,851 Giá trị R2 Q2 tiến đến mức độ tin cậy mơ hình hồi quy cao Điều kiện tối ưu cho q trình trích ly thu nhận saponin từ Đảng sâm. .. hàm lượng saponin thu nhận xử lý bàng enzyme ct -amylase, hàm lượng enzyme (%), thời gian ủ (giờ) Dựa vào phương trình hồi quy ta nhận thấy X, có ảnh hưởng dương đến hàm lượng saponin thu nhận được,