Tối ưu hóa quá trình thu nhận chitin – chitosan từ phế liệu tôm thẻ chân trắng nhằm nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm

Với lượng lớn đầu và vỏ tôm tạo ra từ ngành công nghiệp chế biến tôm, Việt Nam có đủ nguồn nguyên liệu để hình thành ngành công nghiệp sản xuất chitin và các dẫn xuất của nó tuy nhiên tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGÔ THỊ HOÀI DƯƠNG

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THU NHẬN CHITIN-CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ VÀ CHẤT LƯỢNG

SẢN PHẦM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

KHÁNH HÒA - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGÔ THỊ HOÀI DƯƠNG

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THU NHẬN CHITIN-CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ VÀ CHẤT LƯỢNG

SẢN PHẦM

NGÀNH ĐÀO TẠO: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

MÃ SỐ: 62 54 01 05

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA GS.TS KJELL MOTEN VARUM

KHÁNH HÒA - 2015

Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình

Tác giả luận án Ngô Thị Hoài Dương

Luận án hoàn thành là nhờ có nhà trường, các tổ chức có liên quan tạo điều kiện; thầy cô, bạn bè giúp đỡ và hỗ trợ nhiệt tình Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang và các phòng , ban, khoa, viện liên quan đã cho phép và tạo điều kiện thực hiện luận án,

Đại sứ quán Nauy tại Hà Nội và Ban quản lý dự án SRV2701 đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện để tôi có cơ hội nâng cao trình độ và trau dồi kinh nghiệm nghiên cứu,

Phòng thí nghiệm NOBIPOL của trường đại học Khoa học và công nghệ Nauy đã hỗ trợ thực hiện các phép phân tích,

PGS TS Ngô Đăng Nghĩa, TS Nguyễn Anh Tuấn và GS TS Kjell M Varum, những người Thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng trong quá trình thực hiện luận án,

Các cán bộ kỹ thuật của viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trung tâm Thí nghiệm Thực hành - trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong quá trình tiến hành nghiên cứu,

Các bạn đồng nghiệp, đặc biệt là TS Khổng Trung Thắng và Ths Nguyễn Công Minh đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu,

Các em sinh viên ngành Công nghệ Chế biến Thủy sản các khóa từ 48 đến 52, đặc biệt là em Đào Thị Tuyết Mai đã hỗ trợ trong việc triển khai các thí nghiệm nghiên cứu,

Cuối cùng, xin gửi tấm lòng ân tình tới Gia đình, những người thân yêu luôn

là nguồn động viên và chia sẻ mọi khó khăn để luận án đươc hoàn thành

Ngô Thị Hoài Dương

ANOVA Analysis of Variance: Phân tích phương sai

AOAC Association of Official Analytical Chemists: Hiệp hội các nhà hoá phân

tích chính thống

BHA Butylated hydroxyanisole

CrI Crystalline Index: Chỉ số kết tinh

DA Degree of Acetyl: Độ acetyl

DD Degree of Deacetyl: Độ deacetyl

db Dry basis: Theo khối lượng chất khô

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl

FT-IR Fourier Transform Infrared : Quang phổ hấp thụ hồng ngoại chuỗi GlcN D-glucosamine

GlcNAc N- acetyl glucosamine

HPLC High-Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu năng cao HQK Hiệu quả khử

LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện

MHS Phương trình Mark-Houwink-Sakurada

Mw Phân tử lượng trung bình khối lượng

Mv Phân tử lượng trung bình độ nhớt

nd not detected: Không phát hiện

NMR Nuclear Magnetic Resonance: Cộng hưởng từ hạt nhân

OD Optical density: Độ hấp phụ quang học

RSM Respone Surface Methodology: Phương pháp bề mặt đáp ứng

RMS Mức năng lượng tổng

SEM Scanning Electron Microscope: Kính hiển vi điện tử quét

SS Sum of Squares: Tổng bình phương độ lệch

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TNLK Tổng năng lực khử

χcr Degree of crystallinity: Độ kết tinh

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 5

1.1.TÔM THẺ CHÂN TRẮNG VÀ TÌNH HÌNH CHẾ BIẾN Ở VIỆT NAM 5

1.2. GIÁ TRỊ CỦA NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TỪ QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN TÔM .8

1.2.1.Tỷ lệ nguyên liệu còn lại trong công nghiệp chế biến tôm 8

1.2.2.Thành phần hóa học của nguyên liệu còn lại trong công nghiệp chế biến tôm và tiềm năng khai thác 9

1.2.3.Hệ protease trên đầu tôm 10

1.2.4.Thu hồi protein từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến tôm 11

1.3. CHITIN VÀ CÔNG NGHỆ THU HỒI TỪ VỎ ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC 12

1.3.1.Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 12

1.3.2.Tính chất của chitin 13

1.3.3.Công nghệ thu hồi chitin từ vỏ động vật giáp xác 15

1.4. CHITOSAN VÀ QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN 20

1.4.1.Chitosan và tính chất của nó 20

1.4.2.Quá trình deacetyl chitin 21

1.5. ĐẶC TRƯNG TÍNH CHẤT CỦA CHITIN, CHITOSAN 23

1.5.1 Phương pháp xác định độ tinh sạch 23

1.5.2 Phương pháp xác định phân tử lượng 24

1.5.3 Phương pháp xác định độ deacetyl 25

1.5.4 Phương pháp đánh giá mức độ kết tinh 26

1.6. ỨNG DỤNG CỦA CHITIN, CHITOSAN VÀ DẪN XUẤT 26

1.7. THU HỒI VÀ XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT TÔM Ở VIỆT NAM 28

1.7.1 Các nghiên cứu cải tiến công nghệ thu nhận chitin và chitosan 28

1.7.2 Các nghiên cứu về thu hồi protein và enzyme protease 30

1.8. TỐI ƯU BẰNG PHƯƠNG PHÁP MẶT ĐÁP ỨNG 32

1.9. PEPSIN VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG 33

1.9.1 Đặc điểm và cơ chế hoạt động của pepsin 33

1.9.2 Nguồn thu nhận Pepsin 34

1.9.3 Tiềm năng ứng dụng của pepsin 35

1.10 NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC ENZYME 36

1.10.1 Xu hướng hiện đại trong nghiên cứu động học enzyme 36

1.10.2 Động học quá trình thủy phân protein 37

1.11.ỨNG DỤNG SÓNG SIÊU ÂM TRONG THU HỒI SẢN PHẨM HỮU ÍCH 37

1.11.1 Sóng siêu âm và cơ chế tác động 37

1.11.2 Tác dụng của sóng siêu âm đến hoạt động của enzyme 39

1.11.3 Ứng dụng sóng siêu âm trong quá trình thu hồi chitin - chitosan 39

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 43

2.1.1 Nguyên liệu tôm thẻ chân trắng (Panaeus vannamei) 43

2.1.2 Pepsin 43

2.1.3 Hóa chất 43

2.1.4 Thiết bị tạo sóng siêu âm 44

2.2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 44

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 44

2.2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 44

2.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết 46

2.3. PHƯƠNG PHÁP THU THẬP THÔNG TIN, DỮ LIỆU 65

2.3.1 Xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu 65

2.3.2 Xác định các thành phần hóa học cơ bản 65

2.3.3 Xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng 65

2.3.4 Xác định hoạt độ enzyme 65

2.3.5 Xác định khả năng chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân protein 66

2.3.6 Xác định tính chất của chitin và chitosan 66

2.3.7 Xác định các thông số động học 68

2.3.8 Xác định các hàm mục tiêu 68

2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 69

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 71

3.1. THÀNH PHẦN CỦA ĐỐI TƯỢNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG 71

3.1.2.Thành phần acid amin, khoáng và kim loại nặng của đối tượng nghiên cứu 72

3.2 THU HỒI CHITIN VÀ DỊCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NGUYÊN LIỆU ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG 75

3.2.1.Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ đến sự biến đổi của nguyên liệu còn lại 75

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng hoạt động của hệ enzyme protease nội tại trên đầu tôm thẻ chân trắng tươi 77

3.2.3 Nghiên cứu chế độ thu hồi protein và chitin từ đầu tôm thẻ chân trắng 78

3.3. THU HỒI CHITIN VÀ DỊCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG 85

3.3.1.Thiết lập chế độ xử lý với HCl 85

3.3.2 Đánh giá khả năng sử dụng pepsin để kết hợp khử protein và khử khoáng 87

3.3.3 Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng enzyme pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng 91

3.3.4.Kết hợp sóng siêu âm để tăng cường hiệu quả khử protein và khoáng khi xử lý với pepsin 95

3.4. ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH KHỬ PROTEIN CỦA PEPSIN 106

3.4.1.Đặc điểm quá trình khử protein với xúc tác của pepsin 106

3.4.2 Xác định phương trình động học 109

3.5. NÂNG CAO HIỆU QUẢ DEACETYL TRONG ĐIỀU KIỆN DỊ THỂ 113

3.5.1 Tác dụng hỗ trợ của công đoạn tiền xử lý 113

3.5.2 Đánh giá khả năng hỗ trợ quá trình deacetyl của sóng siêu âm 116

3.5.3 Động học quá trình deacetyl khi có sự hỗ trợ của sóng siêu âm 120

3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian đến độ deacetyl và độ hòa tan trong điều kiện deacetyl dị thể với sóng siêu âm 125

3.5.5 Tối ưu quá trình deacetyl 127

3.6.ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH THU NHẬN CHITIN, CHITOSAN, PROTEIN THEO CÔNG NGHỆ CẢI TIẾN VÀ ĐÁNH GIÁ LỢI ÍCH 134

3.6.1 Qui trình thu nhận chitin, chitosan và protein theo công nghệ cải tiến đề xuất

134

3.6.2 Chất lượng của chitin và chitosan thu được theo qui trình đề xuất 138

3.6.3 Đánh giá hiệu quả của các qui trình theo công nghệ đề xuất 140

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 145

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 147

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 167

PHỤ LỤC

Bảng 1.1: Danh pháp của tôm thẻ chân trắng 5Bảng 1.2: Tỷ lệ các thành phần còn lại sau chế biến của một số loài tôm có giá trị thương mại (% so với khối lượng tôm) 9Bảng 1.3: Thành phần hóa học của nguyên liệu còn lại từ một số loài tôm có giá trị thương mại (% theo trọng lượng chất khô) 9Bảng 1.4: Giá bán tham khảo của chitin và các dẫn xuất của nó 10Bảng 2.1: Miền nghiên cứu thí nghiệm tối ưu quá trình xử lý với pepsin 53Bảng 2.2: Sự thay đổi nồng độ enzyme và cơ chất trong thí nghiệm nghiên cứu phương trình động học quá trình khử protein của pepsin 59Bảng 2.3: Miền nghiên cứu thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của 3 nhân tố: nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH khi deacetyl với sóng siêu âm 62Bảng 2.4: Miền nghiên cứu thí nghiệm tối ưu quá trình deacetyl với sóng siêu âm 37kHz (RMS=35W) 63Bảng 3.1: Thành phần khối lượng của đối tượng tôm thẻ chân trắng (cỡ 60÷160 con/kg) 71Bảng 3.2: Thành phần hóa học cơ bản của đối tượng tôm thẻ chân trắng (cỡ 81÷120 con/kg) 72Bảng 3.3: Thành phần acid amin của đối tượng tôm thẻ chân trắng (cỡ 81÷120 con/kg) (g/100g amino acid) 73Bảng 3.4: Hàm lượng acid amin của đối tượng tôm thẻ chân trắng (cỡ 81÷120 con/kg) (mg/100g nguyên liệu) 73Bảng 3.5: Thành phần khoáng và kim loại nặng trên đối tượng nghiên cứu (mg/kg) 74Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ ở nhiệt độ phòng (27÷30oC) đến màu sắc

và mùi của phần đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng 76Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng hoạt động của hệ enzyme nội tại trên đầu tôm thẻ chân trắng tươi 78Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm theo mô hình Box-Behnken với miền nghiên cứu ở Bảng 2.1 92Bảng 3.9: Hiệu quả khử protein của pepsin theo phương trình hồi qui và theo thực nghiệm 94Bảng 3.10: Kết quả đánh giá khả năng thu hồi protein từ dịch thủy phân với pepsin 103Bảng 3.11: Hằng số vận tốc quá trình loại protein khi xử lý với pepsin và NaOH 108

Bảng 3.12: Giá trị hệ số động học a và b tương ứng với các điều kiện xử lý pepsin

110Bảng 3.13: Độ rắn của chitin sau khi được tiền xử lý và mẫu đối chứng 115

deacetyl đến độ deacetyl 117Bảng 3.15: Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của nồng độ NaOH và cách thức deacetyl đến độ hòa tan 117Bảng 3.16: Vận tốc deacetyl (%/phút) (x102)a 122Bảng 3.17: Hệ số vận tốc deacetyl (phút-1) (x103)a 123Bảng 3.18: Kết quả thực nghiệm theo mô hình Two-Level Factor với miền nghiên cứu ở Bảng 2.3 125Bảng 3.19: Kết quả phân tích thống kê ảnh hưởng của các nhân tố đến độ deacetyl 2theo biến mã hóa (p=0,05) 126Bảng 3.20: Kết quả phân tích thống kê ảnh hưởng của các nhân tố đến độ hòa tan 3theo biến mã hóa (p=0,05) 126Bảng 3.21: Kết quả thực nghiệm theo mô hình Central Composite với miền nghiên cứu ở Bảng 2.4 128Bảng 3.22: Giá trị các hệ số hồi qui của hàm mục tiêu độ deacetyl 4 và độ hòa tan

5 theo biến mã (p=0,05) 128Bảng 3.23: Kết quả kiểm định thống kê phương trình hồi qui (3-13) và (3-14) (p=0,05) 129Bảng 3.24: Độ deacetyl và độ hòa tan theo phương trình hồi qui và thực nghiệm 129Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chế độ deacetyl đến phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitosan (Mv, kDa) 131Bảng 3.26: Chất lượng chitin sản xuất theo qui trình đề xuất 138Bảng 3.27: Chất lượng chitosan thu được khi deacetyl với sóng siêu âm ở 80oC với [NaOH]=60% trong 4h (sử dụng chitin thu hồi từ phần vỏ theo qui trình đề xuất) 139Bảng 3.28: So sánh một số thông số của qui trình đề xuất với qui trình thực tế (ước tính cho 1000kg nguyên liệu ban đầu/mẻ) 141Bảng 3.29: Ước tính lợi ích đạt được khi áp dụng công nghệ kết hợp để thu nhận chitin, chitosan và protein so với qui trình thực tế [9] (với 1000 kg nguyên liệu ban đầu/mẻ) 143

Hình 1.1: Thống kê diện tích và sản lượng nuôi tôm thẻ chân trắng ở nước ta giai

đoạn 2005-2012 6

Hình 1.2: Thống kê khối lượng và giá trị các sản phẩm xuất khẩu từ tôm thẻ chân trắng của Việt Nam trong giai đoạn 2002-2012 7

Hình 1.3: Thống kê sản lượng tôm nuôi ở tỉnh Khánh Hòa giai đoạn 2002-2011 8

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của chitin 12

Hình 1.5: Mô hình cấu trúc vỏ động vật giáp xác 13

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của chitosan 20

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 45

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng hoạt động của hệ enzyme protease nội tại trên đầu tôm thẻ chân trắng tươi 48

Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu chế độ thu hồi chitin và dịch protein có hoạt tính chống oxy hóa từ nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng 50

Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng khử protein và khoáng của pepsin 52

Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu khả năng kết hợp sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả xử lý với pepsin 55

Hình 2.6: Sơ đồ nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đề xuất và đặc trưng tính chất sản phẩm chitin thu được 56

Hình 2.7: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu động học quá trình khử protein với pepsin 58 Hình 2.8: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của công đoạn tiền xử lý đến quá trình deacetyl 60

Hình 2.9: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình deacetyl 61

Hình 2.10: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu động học quá trình deacetyl với sóng siêu âm 62

Hình 2.11: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu tối ưu quá trình deacetyl có kết hợp với sóng siêu âm 63

Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ ở nhiệt độ phòng (27÷30oC) đến sự hao hụt khối lượng, hao hụt protein và hàm lượng bazơ nitơ bay hơi của phần đầu tôm thẻ chân trắng 76

Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian và lượng nước bổ sung đến hiệu suất thu hồi nitơ và sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa khi thực hiện quá trình tự thủy phân đầu tôm ở 60oC, pH tự nhiên 79

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian và lượng nước bổ sung đến hàm lượng protein còn lại trên phần vỏ đầu và hiệu quả khử protein khi thực hiện quá trình tự thủy phân đầu tôm ở 60o C, pH tự nhiên 80

lại trên phần vỏ đầu và hiệu quả khử khoáng khi thực hiện quá trình tự thủy phân ở

60oC, pH tự nhiên 81Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian và tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng khử gốc tự

do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) của dịch thủy phân 82Hình 3.6: Sự thay đổi hàm lượng khoáng và hiệu quả khử khoáng khi xử lý vỏ tôm với HCl 0,25M theo thời gian ở nhiệt độ phòng (27÷30oC) 85Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ pepsin đến hiệu quả khử protein và khử khoáng 87Hình 3.8: Ảnh chụp SEM vỏ tôm trước (A) và sau khi xử lý với dung dịch HCl 0,25M trong 2h (B) 89Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử khoáng và protein trong quá trình xử lý với pepsin 90Hình 3.10: Sự thay đổi hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử protein của pepsin theo thời gian xử lý 91Hình 3.11: Đồ thị không gian 3D và 2D biểu diễn hàm mục tiêu - hiệu quả khử protein theo các biến khảo sát 93Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sóng siêu âm (37kHz, 35W) đến hoạt độ của pepsin 96Hình 3.13: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sóng siêu âm đến hàm lượng khoáng (A)

và hàm lượng protein (B) trên vỏ tôm (đã xử lý với HCl 0,25M) 97Hình 3.14: Ảnh chụp SEM (10kV) vỏ tôm - (A): sau khi xử lý 2h với ddHCl 0,25M

ở nhiệt độ phòng; (B): tiếp tục ngâm nước nóng ở 40oC trong 90 phút; và (C):chiếu sóng siêu âm trong vòng 90 phút ở 40oC 98Hình 3.15: Ảnh hưởng của cách thức sử dụng sóng siêu âm và thời gian đến hàm lượng protein còn lại trên vỏ tôm khi xử lý với pepsin (20U/g protein, 40oC, pH=2) 99Hình 3.16: Ảnh hưởng của cách thức sử dụng sóng siêu âm đến hàm lượng khoáng còn lại trên vỏ tôm khi xử lý với pepsin (20U/g protein, 40oC, pH=2) 101Hình 3.17: Ảnh hưởng của công đoạn tiền xử lý pepsin với sóng siêu âm đến khả năng loại protein trên vỏ tôm (20U/g protein, 40o

C, pH=2) 102Hình 3.18: Phổ nhiễu xạ tia X của chitin thu được theo qui trình sử dụng pepsin kết hợp với HCl và NaOH 104Hình 3.19: Phổ FT-IR của chitin thu được theo qui trình sử dụng pepsin kết hợp với HCl và NaOH 104Hình 3.20: Phổ H1NMR của chitin thu được theo qui trình sử dụng pepsin kết hợp với HCl và NaOH 105Hình 3.21: Sự thay đổi lượng protein trên vỏ tôm theo thời gian xử lý với pepsin ở điều kiện nhiệt độ 40o

C, pH2, nồng độ enzym 0,42g/L 106

ở điều kiện nhiệt độ 40oC, pH2, nồng độ enzym 0.42g/L 107Hình 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ pepsin và thời gian đến hiệu quả khử protein

trong điều kiện S o=18g protein/L, ở 40oC và pH=2 109

Hình 3.24: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất S o và thời gian đến hiệu quả khử protein

khi e o= 0,25g/L (175U/L), ở 40oC và pH=2 110

Hình 3.25: Quan hệ hồi qui giữa hệ số a với tỷ lệ enzyme so với cơ chất (e o /S o) 111

Hình 3.26: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme:cơ chất (e o /S o) và thời gian đến hiệu quả khử protein ở nhiệt độ 40oC và pH=2 112Hình 3.27: Ảnh hưởng của cách thức tiền xử lý đến khả năng deacetyl 114Hình 3.28: Ảnh chụp SEM (10kV) mẫu chitin đã được xử lý trong 60 phút ở 60oC với nước nóng (A) và chiếu siêu âm (B) 114Hình 3.29: Phổ nhiễu xạ tia X của chitin được tiền xử lý và mẫu đối chứng 115Hình 3.30: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và phương thức deacetyl đến độ deacetyl

và độ hòa tan của mẫu sau 6h xử lý ở 80oC 118Hình 3.31: Phổ nhiễu xạ tia X của chitosan được deacetyl trong điều kiện có (A) và không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (B) với [NaOH]=60% ở 80oC, 4h 119Hình 3.32: Phổ FT-IR của chitosan được deacetyl với [NaOH]=60% (w/w) ở 80oC trong 4h trong điều kiện có (đường màu đỏ) và không có sự kết hợp với sóng siêu âm (đường màu đen) 120Hình 3.33: Sự thay đổi của độ deacetyl theo thời gian deacetyl trong điều kiện có và không có siêu âm với các nồng độ NaOH (w/w) khác nhau 121Hình 3.34: Mối quan hệ giữa giá trị logarith của độ deacetyl với thời gian khi thay đổi nồng độ NaOH (w/w) trong điều kiện có và không có sự kết hợp với sóng siêu

âm 123Hình 3.35: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hàm mục tiêu độ deacetyl 127Hình 3.36: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến

độ hòa tan 127Hình 3.37: Đường đẳng trị của hàm mục tiêu độ deactetyl và độ hòa tan 130Hình 3.38: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian đến phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitosan được deacetyl với sự hỗ trợ của sóng siêu âm 132Hình 3.39: Qui trình thu nhận chitin và protein từ phần đầu tôm thẻ chân trắng đề xuất 135Hình 3.40: Qui trình thu nhận chitin và protein từ phần vỏ tôm thẻ chân trắng đề xuất 136Hình 3.41: Qui trình xác định chế độ deacetyl và sản xuất chitosan đề xuất 137

PHẦN MỞ ĐẦU

Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu tôm hàng đầu trên thế giới với hai đối tượng nuôi chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, tổng khối lượng sản phẩm tôm sú và tôm thẻ năm 2012 đã đạt trên 480 ngàn tấn, trong đó lượng tôm thẻ chân trắng đạt trên 130 ngàn tấn và có xu hướng gia tăng [102] Song song với các sản phẩm xuất khẩu chính, một lượng đáng kể đầu và vỏ tôm cũng được tạo ra từ các qui trình sản xuất, ước tính lên đến 200 ngàn tấn mỗi năm [20] Trên đầu và vỏ tôm

có chứa một lượng đáng kể protein, chitin, protease và astaxanthin Do đó, việc xử

lý kịp thời và hiệu quả lượng đầu và vỏ tôm không những sẽ góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh và hiệu quả sử dụng tài nguyên thông qua việc thu hồi các hợp chất có hoạt tính sinh học [27]

Với lượng lớn đầu và vỏ tôm tạo ra từ ngành công nghiệp chế biến tôm, Việt Nam có đủ nguồn nguyên liệu để hình thành ngành công nghiệp sản xuất chitin và các dẫn xuất của nó tuy nhiên trên thực tế lĩnh vực này ở nước ta hiện còn nhiều hạn chế: qui mô sản xuất nhỏ lẻ, chủng loại sản phẩm không đa dạng, chất lượng thấp, khả năng ứng dụng và thương mại hóa sản phẩm kém, không cho phép thu hồi đồng thời protein và các hợp chất có giá trị sinh học khác nên hiệu quả kinh tế không cao

và đặc biệt là gây ô nhiễm môi trường rất nghiêm trọng [9], [20] Do vậy, để có thể khai thác hiệu quả nguồn nguyên liệu còn lại dồi dào từ quá trình chế biến tôm ở nước ta, đặc biệt là với tôm thẻ chân trắng - một đối tượng nuôi mới, đồng thời thúc đẩy sự hình thành và phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm

có giá trị gia tăng từ nguồn nguyên liệu này cần có thêm các nghiên cứu chuyên sâu làm cơ sở cho việc cải tiến công nghệ thu hồi chitin, chitosan và cả protein

Công nghệ thu hồi chitin đang được áp dụng chủ yếu dựa vào phương pháp hóa học nhưng đến nay phương pháp này đã bộc lộ nhiều nhược điểm cần xử lý: ảnh hưởng sâu sắc đến các đặc tính sinh học quí giá của protein và sắc tố có trên nguyên liệu tôm, gây ảnh hưởng lớn đến mạch polysaccaride của chitin và thải ra một lượng lớn hóa chất và chất thải [95], [98] Phương pháp thu hồi chitin bằng công nghệ sinh học hạn chế được ô nhiễm môi trường, cho phép thu hồi đồng thời

các hợp chất sinh học khác, giữ được đặc tính của mạch polysaccarite nhưng lại chưa đáp ứng được yêu cầu về mặt hiệu quả kinh tế do chi phí lớn, thời gian kéo dài

và mức độ tách tạp chất không triệt để [27], [120], [164] Kết hợp phương pháp sinh học và phương pháp hóa học đang là hướng đi được quan tâm do hạn chế được lượng hóa chất sử dụng và cho phép thu hồi đồng thời các hợp chất có hoạt tính sinh học khác, mà chủ yếu là protein, bên cạnh chitin Tuy nhiên để có thể áp dụng phương pháp này vào thực tiễn vẫn cần có thêm các giải pháp công nghệ bổ sung để rút ngắn thời gian và tiết giảm chi phí chung đồng thời thu thập các thông tin động học để kiểm soát quá trình [151]

Xu thế mới trong cải tiến công nghệ hiện nay là chú trọng khai thác và áp dụng tác nhân vật lý để hỗ trợ quá trình hóa học và sinh học, trong đó sóng siêu âm đang đặc biệt được quan tâm Sóng siêu âm là một tác nhân vật lý "xanh" đã được chứng minh hiệu quả và triển khai ở qui mô công nghiệp trong nhiều lĩnh vực như chế biến thực phẩm, công nghiệp hóa học, công nghiệp dệt [40], [42], [52], [140]

Do đó nghiên cứu kết hợp xử lý sóng siêu âm trong quá trình sản xuất chitin, chitosan có thể mở ra một hướng đi mới, giúp cải tiến hiệu quả công nghệ thu hồi chitin, chitosan hiện có

Luận án " Tối ưu hóa quá trình thu nhận chitin-chitosan từ phế liệu tôm

thẻ chân trắng nhằm nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm" được thực

hiện với mục đích nghiên cứu kết hợp phương pháp enzyme, phương pháp hóa học với phương pháp vật lý để đề xuất một hướng đi mới cho phép cải tiến công nghệ sản xuất chitin, chitosan ở Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu: Mục tiêu của luận án là tối ưu hóa các công đoạn

chính trong quá trình thu nhận chitin, chitosan bằng công nghệ kết hợp nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm lượng hóa chất sử dụng, tận dụng được nguồn protein có giá trị sinh học và hạn chế ô nhiễm môi trường

Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu trong luận án là nguyên liệu

còn lại (phần đầu và phần vỏ thân) của quá trình chế biến tôm thẻ chân trắng

(Penaeus vannamei) xuất khẩu, có kích cỡ trung bình khoảng từ 81÷120 con/kg,

được thu mua ngay sau khi chúng được đưa ra khỏi dây chuyền chế biến tôm ở công

ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), đảm bảo độ tươi, có mùi và màu sắc đặc trưng

Phạm vi nghiên cứu: Quá trình thu nhận chitin, chitosan bao gồm nhiều

công đoạn trong đó các công đoạn khử protein, khử khoáng và deacetyl là 3 công đoạn quan trọng nhất, có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm và hiệu quả của quá trình Vì vậy, luận án sẽ tập trung nghiên cứu cải tiến 03 công đoạn này nhằm cải thiện chất lượng của sản phẩm và nâng cao hiệu quả về mặt môi trường

Nội dung nghiên cứu: Các nội dung chính trong luận án bao gồm:

- Xác định thành phần (thành phần khối lượng, thành phần hóa học, thành phần khoáng và thành phần acid amin) của đối tượng tôm thẻ chân trắng,

- Nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thu nhận chitin và protein từ phần đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng,

- Nghiên cứu động học quá trình khử protein trên vỏ tôm thẻ chân trắng bằng pepsin,

- Nghiên cứu tối ưu hóa và động học quá trình deacetyl chitin, thu hồi từ đối tượng tôm thẻ chân trắng, trong điều kiện dị thể với sự hỗ trợ của sóng siêu âm,

- Đề xuất qui trình thu nhận chitin, chitosan và protein sử dụng công nghệ cải tiến (kết hợp phương pháp enzyme, phương pháp hóa học và phương pháp vật lý) cho phép nâng cao chất lượng sản phẩm và hiệu quả của quá trình

Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài

Luận án đã công bố dẫn liệu về thành phần khối lượng và thành phần hóa học của đối tượng nguyên liệu tôm thẻ chân trắng được nuôi và chế biến ở khu vực Khánh Hòa, đồng thời đánh giá tác động của việc chậm xử lý đến sự biến đổi của đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng Kết quả thu được là căn cứ khoa học để các doanh nghiệp chế biến tôm và sản xuất chitin thực hiện các điều chỉnh cần thiết cho quá trình xử lý nguyên liệu còn lại, từ đó nâng cao được hiệu quả sử dụng tài nguyên, hạn chế được các tác động xấu đến môi trường

Lần đầu tiên việc nghiên cứu động học quá trình khử protein dưới xúc tác của enzyme protease (pepsin) cũng được thực hiện Kết quả nghiên cứu động học thu được giúp hiểu rõ hơn đặc điểm cấu trúc của vỏ tôm, bản chất quá trình khử protein bằng enzyme pepsin đồng thời cung cấp mô hình toán hỗ trợ cho việc mở rộng qui mô áp dụng cũng như kiểm soát, điều chỉnh quá trình khử protein bằng enzyme

Các kết quả nghiên cứu tối ưu hóa và động học quá trình deacetyl trong điều kiện dị thể có kết hợp với sóng siêu âm lần đầu tiên được công bố giúp hiểu rõ hơn tác dụng của hỗ trợ quá trình deacetyl của sóng siêu âm, đồng thời cung cấp các căn

cứ khoa học để mở rộng phạm vi áp dụng sóng siêu âm vào lĩnh vực sản xuất chitin, chitosan

Việc áp dụng công nghệ kết hợp (Integrated) giữa phương pháp sinh học, hóa học và vật lý vào quá trình thu hồi chitin, chitosan và protein cũng lần đầu tiên được

đề cập trong luận án Các qui trình được đề xuất sẽ mở ra một hướng đi mới trong việc cải tiến công nghệ thu hồi chitin, chitosan hiện có: cho phép nâng cao chất lượng sản phẩm, thu hồi protein có hoạt tính sinh học, đồng thời tiết giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng và chất thải

Việc khai thác và sử dụng các thiết bị, phương pháp nghiên cứu hiện đại cùng với các phần mềm chuyên dụng cho phép giải thích và chứng minh các kết quả nghiên cứu của luận án một cách khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án có thể

sử dụng làm tài liệu tham khảo cho sinh viên và những ai quan tâm đến công nghệ sản xuất các sản phẩm kỹ thuật và y dược từ nguồn nguyên liệu vỏ động vật giáp xác

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TÔM THẺ CHÂN TRẮNG VÀ TÌNH HÌNH CHẾ BIẾN Ở VIỆT NAM

Tôm thẻ chân trắng(Litopenaeus vannamei, tên gọi trước đây là Penaeus

vannamei) là một dạng củatôm panđancủa vùng đôngThái Bình Dương Mặc dù tôm thẻ chân trắng có nguồn gốc tự nhiên nhưng hiện giờ tôm nuôi là nguồn nguyên liệu được sử dụng chủ yếu để sản xuất các sản phẩm tôm xuất khẩu Danh pháp phân loại của tôm thẻ chân trắng được trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1: Danh pháp của tôm thẻ chân trắng

Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Phân ngành: Crustacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Phân bộ: Dendrobranchiata Họ: Penaeidae

Chi: Litopenaeus Loài: L vannamei

Tôm thẻ chân trắng được nuôi đầu tiên ở châu Mỹ La Tinh và sau đó được di giống đến rất nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam Giá đầu tư thấp, mùa

vụ nuôi ngắn (khoảng từ 120 đến 180 ngày), có khả năng thích ứng tốt trong điều kiện nuôi với độ muối rộng, cho năng suất cao, ít bị cảm nhiễm bệnh tật hơn tôm sú, kích cỡ tôm lại phù hợp với nhu cầu tiêu thụ của thế giới và giá cả ổn định là những điều kiện để tôm chân trắng chiếm được vị trí ưu tiên trong nuôi trồng thuỷ sản tại các nước, cũng như ở Việt Nam

Ở nước ta, tôm thẻ chân trắng được nuôi ở hầu khắp các tỉnh trong cả nước với vụ nuôi chính chủ yếu từ tháng 2 đến tháng 10 hàng năm Diện tích và sản lượng tôm thẻ chân trắng liên tục tăng (Hình 1.1), dự kiến đạt 449.500 tấn vào năm

2015 [12]

Diện tích Sản lượng

Hỡnh 1.1: Thống kờ diện tớch và sản lượng nuụi tụm thẻ chõn trắng ở nước ta

giai đoạn 2005-2012 [12]

So với tụm sỳ, tụm thẻ chõn trắng ngày càng cú vị trớ quan trọng trong cơ cấu sản xuất và xuất khẩu cỏc mặt hàng tụm Năm 2010 xuất khẩu tụm đạt trờn 2 tỷ USD chiếm hơn 1/3 tổng kim ngạch xuất khẩu trong đú tụm thẻ chõn trắng chiếm 26% giỏ trị xuất khẩu đến năm 2011 xuất khẩu tụm đó đạt 2,39 tỷ USD với 704 triệu USD chiếm 29,3% từ tụm thẻ chõn trắng, tăng 70% so với năm 2010 [102] Đến năm 2013, giỏ trị xuất khẩu cỏc sản phẩm từ tụm thẻ chõn trắng đó chiếm trờn 50% trong gần 4 tỷ tổng giỏ trị xuất khẩu cỏc sản phẩm từ tụm Tỷ lệ tụm thẻ chõn trắng cú xu hướng tăng dần trong cơ cấu chung bởi loại tụm này cú năng suất cao, chất lượng tốt, kớch cỡ và giỏ cả phự hợp với nhu cầu tiờu dựng hiện nay ở nhiều nước trờn thế giới Số liệu thống kờ của FAO trong giai đoạn 2002-2012 ở Hỡnh 1.2 cho thấy khối lượng và giỏ trị xuất khẩu tụm thẻ chõn trắng luụn duy trỡ ở mức trờn

100 ngàn tấn sản phẩm với giỏ trị xuất khẩu trờn 500 triệu USD mỗi năm ngoại trừ năm 2008 và 2009

Cỏc dạng sản phẩm chế biến từ tụm thẻ chõn trắng chủ yếu gồm tụm nguyờn con (HOSO); tụm cũn vỏ bỏ đầu (HLSO); tụm lột vỏ, lấy (PD hoặc PND) hoặc khụng lấy chỉ (PUD); tụm lột vỏ, chừa đuụi (PTO); tụm duỗi NOBASHI; tụm

SUSHI và tụm bao bột Cỏc sản phẩm trờn cú thể ở dạng tươi hoặc hấp và cơ cấu sản phẩm cú xu hướng nghiờng về cỏc sản phẩm tụm đó qua chế biến [21]

Hỡnh 1.2: Thống kờ khối lượng và giỏ trị cỏc sản phẩm xuất khẩu từ tụm thẻ chõn trắng của Việt Nam trong giai đoạn 2002-2012 (Nguồn FAO, [86])

Sản lượng cỏc sản phẩm chế biến từ tụm thẻ chõn trắng tăng nhanh kộo theo nguồn nguyờn liệu cũn lại từ quỏ trỡnh sản xuất cỏc sản phẩm này cũng tăng nhanh chúng, đũi hỏi phải được xử lý để tận thu cỏc sản phẩm hữu ớch và kiểm soỏt ụ nhiễm mụi trường Tuy nhiờn, vỡ là một đối tượng nguyờn liệu mới, chỉ được chấp nhận cho nuụi đại trà với diện tớch lớn từ năm 2008, nờn số lượng cỏc nghiờn cứu liờn quan đến việc thu hồi cỏc sản phẩm hữu ớch từ nguồn nguyờn liệu cũn lại của quỏ trỡnh chế biến đối tượng tụm này ở nước ta cũn khỏ khiờm tốn so với đối tượng tụm sỳ

Trong cỏc tỉnh ở khu vực Nam Trung Bộ, Khỏnh Hũa là một tỉnh cú tiềm năng về nuụi trồng và chế biến cỏc nguyờn liệu thủy sản Số liệu thống kờ ở Hỡnh 1.3 cho thấy sản lượng tụm nuụi trong giai đoạn 2002-2011 tại Khỏnh Hũa luụn đạt

và vượt mức 7000 tấn/năm trong đú chủ yếu là tụm thẻ chõn trắng Trong số cỏc doanh nghiệp chế biến thủy sản hiện cú tại Khỏnh Hũa, Cụng ty Cổ phần Thủy sản

800

Khối lượng Giá trị

Nha Trang (F17) là một trong những đơn vị dẫn đầu về chế biến tôm thẻ chân trắng, sản lượng vào khoảng 5000 tấn nguyên liệu/năm

Hình 1.3: Thống kê sản lượng tôm nuôi ở tỉnh Khánh Hòa giai đoạn 2002-2011

(Nguồn Bộ Công thương, [8])

1.2 GIÁ TRỊ CỦA NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TỪ QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN TÔM

1.2.1 Tỷ lệ nguyên liệu còn lại trong công nghiệp chế biến tôm

Phần còn lại sau quá trình chế biến tôm nguyên liệu thành các sản phẩm chính trước đây được gọi là phế liệu, tuy nhiên nếu tiếp cận theo quan điểm sản xuất hiện đại về "Zero Waste" (Không phế liệu) chúng sẽ được gọi với khái niệm mới là nguyên liệu còn lại (By-products) Nguyên liệu còn lại sau khi chế biến tôm gồm có đầu, vỏ, đuôi và một lượng không đáng kể thịt vụn; Tỷ lệ giữa các phần thay đổi tùy thuộc vào giống loài, độ tuổi, mùa vụ và phương pháp chế biến Số liệu thống kê tỷ

lệ giữa nguyên liệu còn lại so với khối lượng toàn thân tôm của một số loài tôm được trình bày trong Bảng 1.2 cho thấy sau quá trình chế biến các sản phẩm tôm xuất khẩu sẽ có trung bình khoảng 50% lượng nguyên liệu không được sử dụng Do

đó sẽ có khoảng trên dưới 50% lượng nguyên liệu tôm còn lại sau quá trình sản xuất

các sản phẩm chính cần được tiếp tục xử lý để góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng tài nguyên và hạn chế ô nhiễm môi trường

Bảng 1.2: Tỷ lệ các thành phần còn lại sau chế biến của một số loài tôm có giá trị thương mại (% so với khối lượng tôm)

Farfantepenaeus paulenis Tôm São Paulo 28 ± 3 8 ± 1 4 ± 1 [200]

Metapenaeus dobsonii Tôm sắt 33,5 ± 1,83 15,1 ± 1,35 [198]

Pandalus borealis Tôm hồng biển Bắc 38,9 10,7 2,3 [100]

Parapenaeopsis stylifera Tôm đất 45,0 ± 1,16 11,0 ± 1,14 [198]

Penaeus indicus Tôm thẻ Ấn Độ 33,9 ± 2.03 14,6 ± 0,68 [198]

Penaeus monodon Tôm sú 34,4 ± 1.56 14,3 ± 2,59 [198]

Trachypena curvirostris Tôm đanh móc 37,9 11,5 2,3 [100]

1.2.2 Thành phần hóa học của nguyên liệu còn lại trong công nghiệp chế biến tôm và tiềm năng khai thác

Thành phần hóa học của nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến của một

số loài tôm có giá trị thương mại đã được một số tác giả nghiên cứu và được tổng hợp trong Bảng 1.3

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của nguyên liệu còn lại từ một số loài tôm có giá trị thương mại (% theo trọng lượng chất khô)

Crangon crangon Tôm thường 40,6 17,8 27,5 9,95 [210]

Số liệu tổng hợp cho thấy mặc dù có sự khác nhau về tỷ lệ các thành phần hóa học ở các loài tôm nhưng protein luôn là thành phần chiếm tỷ trọng lớn nhất (từ 33÷49,8% khối lượng chất khô), tiếp đến là chất khoáng và chitin (tương ứng từ 21,6÷38% và từ 13,5÷20% khối lượng chất khô) Thành phần có sự khác biệt lớn nhất giữa các loài tôm là lipid, dao động từ 0,3 đến 9,75% Tuy nhiên hầu hết các kết quả đã công bố đều chưa quan tâm đến việc làm rõ sự khác biệt về thành phần hóa học của phần đầu và phần vỏ tôm (vỏ thân và đuôi)

Như vậy, nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến tôm là nguồn nguyên liệu quan trọng để thu nhận protein và chitin Từ chitin có thể tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau và tùy thuộc vào dạng, đặc tính và chất lượng của chúng mà giá bán có

sự chênh lệch khá lớn Bảng 1.4 So với chitin, giá của các sản phẩm ở dạng dẫn xuất cao hơn rất đáng kể tuy nhiên để có thể tạo ra các sản phẩm có giá trị đó đòi hỏi phải có nguồn chitin đầu vào phù hợp [81], do đó việc sản xuất được chitin có các thông số kỹ thuật đáp ứng yêu cầu công nghệ để sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng là rất quan trọng, điều này sẽ làm tăng đáng kể hiệu quả sản xuất, kinh doanh Với những giải pháp công nghệ hợp lý còn có thể thu nhận lượng protein rất lớn có trên nguyên liệu còn lại ở dạng các sản phẩm có giá trị sinh học [31], [47]

Bảng 1.4: Giá bán tham khảo của chitin và các dẫn xuất của nó

Dạng sản phẩm thu hồi Giá bán

Loại siêu tinh khiết có thể lên đến hơn 10.000USD/kg

1.2.3 Hệ protease trên đầu tôm

Trên đầu tôm có chứa một hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau trong đó một lượng đáng kể là enzyme protease Hệ enzyme protease trên đầu tôm bao gồm

cả endoprotease và exoprotease, nhưng thành phần và điều kiện hoạt động của

chúng thay đổi theo giống loài, độ tuổi và khu vực sinh sống [2], [3], [16], [91]

Enzyme protease trong nội tại tôm he (Penaeus orientals) đánh bắt ở vùng biển Hàn

Quốc hoạt động ổn định trong môi trường trung tính và môi trường kiềm nhưng không ổn định trong môi trường acid [173] Hệ enzyme trong nội tạng tôm thẻ Ấn

độ (Penaeus indicus) trưởng thành ở bờ biển Kenya chứa enzyme chymotrypsin,

trypsin và elastase, không có enzyme pepsin; pH hoạt động tối ưu của trypsin là 7,5 – 8,0 chymotrypsin 7,2 – 7,8, elastase 6,8 – 8,5 [175] Hệ protease đầu tôm bộp

(Metapenaeus affinis) có hai thành phần với nhiệt độ và pH thích hợp tương ứng là

60oC; 7,5 và 50oC; 8,5 [3] Nghiên cứu của Heu và cs trên tôm biển hồng biển Bắc

(Pandalus borealis) và tôm thẻ miền Nam (Trachypena curvirostris) cho thấy hệ

protease trên đầu tôm có hoạt lực tương đương một số protease thương mại tuy nhiên chúng rất dễ bị tổn thất theo lượng protein hòa tan [101] Đối với tôm thẻ

chân trắng (Penaeus vannamei), hệ protease hoạt động mạnh ở vùng nhiệt độ

50÷60oC trong vùng pH=7,5÷8, đây cũng chính là giá trị pH tự nhiên của đầu tôm tươi [50], [51], [101]

1.2.4 Thu hồi protein từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến tôm

Ngoài chitin, protein và các dẫn xuất của nó cũng có giá trị thu hồi rất lớn tuy nhiên giá trị dinh dưỡng và tính chất chức năng của sản phẩm phụ thuộc vào phương pháp thu hồi Protein có trên nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến tôm

bị biến đổi nghiêm trọng và mất hoạt tính sinh học khi tiếp xúc với acid và kiềm [70] vì vậy thủy phân dưới tác dụng của enzyme protease là cách thức hiệu quả nhất

để thu hồi protein Dịch thu hồi sau thủy phân được chứng minh có hoạt tính sinh học rất cao: khả năng chống oxy hóa, khả năng kiểm soát enzyme gây cao huyết áp [31], [73], [91], [105], [158]

Nguồn protease có thể bổ sung từ ngoài một cách trực tiếp bằng các enzyme thương mại hoặc gián tiếp qua các chủng vi sinh vật, hay có thể sử dụng ngay hệ protease nội tại của nguyên liệu Nhiều loại enzyme thương mại khác nhau đã được nghiên cứu sử dụng như Alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, Neutrase, Protamex, Flavourzyme [31], [54], [70], [73], [105], [129], [158], [210] Bên cạnh

đó, hệ protease trên đầu tôm có khả năng hoạt động khá mạnh với cả hai hệ endo và exoprotease cũng đã được khai thác để thu hồi protein [44], [91], [101]

Sau khi thủy phân, dịch thủy phân thường được xử lý bằng phương pháp lọc,

ly tâm và/hoặc kết tủa để thu các dạng sản phẩm khác nhau như carotenoprotein, astaxanthin [28], glycosaminoglycans [47], các peptite có chứa khoáng như canxi [106], sắt [107], các peptid có khả năng chống oxy hóa và /hoặc kiểm soát enzyme gây cao huyết áp [105], [158]

1.3 CHITIN VÀ CÔNG NGHỆ THU HỒI TỪ VỎ ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC 1.3.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên

Chitin là một polysaccaride được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 và được chiết tách bởi Odier vào năm 1823 [209] Chitin có cấu trúc đa phân tử, mạch thẳng, đồng trùng hợp từ hai tiểu đơn vị là 2-amino-2 deoxy-D glucopyranose (GlcN) và 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose (GlcNAc) thông qua liên kết β(1-4) glucosidic [45] (Hình 1.4) Chitin được xem như là một dẫn xuất của cellulose

mà ở đó nhóm hydroxyl ở C2 được thay thế bằng nhóm acetamide (-NH-CO-CH3) [194]

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của chitin

Chitin là thành phần tham gia cấu tạo vỏ của các loài giáp xác, thành tế bào

vi sinh vật, ngoài ra chitin còn được phát hiện thấy trong một số động và thực vật bậc thấp như nấm mốc, một số loại tảo và côn trùng [219] Tùy thuộc vào nguồn, chitin có thể tồn tại 1 trong 3 dạng thù hình là α, β hay; các dạng thù hình này có

sự khác nhau về sự sắp xếp các chuỗi polysaccharide trong vùng kết tinh [209] Trong các dạng tồn tại, dạng α-chitin là phổ biến và có kết cấu chặt chẽ nhất, tồn tại chủ yếu trong vỏ các loài giáp xác, thành tế bào của nấm men và nấm mốc β-chitin được phát hiện thấy trong nang của mực ống và trong ống tiêu hóa của một số loài

sâu, còn-chitin rất khó phát hiện bằng các phương pháp phân tích thông thường và

nó còn được coi là một dạng dẫn xuất của α-chitin [194]

Trong vỏ của các loài giáp xác, chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do và gần như luôn luôn liên kết với các protein dưới dạng phức hợp chitin - protein, và với một số các chất vô cơ, hữu cơ khác như khoáng, chủ yếu ở dạng CaCO3, sắc tố

và lipid trong một cấu trúc hệ thống đan xen, nhiều bậc thông qua các liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro và liên kết kỵ béo [133] Sơ đồ cấu trúc vỏ của động vật giáp xác đã được Raabe và cs khái quát ở Hình 1.5 [188] Đơn vị cấu trúc nhỏ nhất hình thành vỏ các loài giáp xác là các sợi nanochitin tinh thể, mỗi sợi gồm từ 18÷25 chuỗi chitin có đường kính 2÷5nm và dài khoảng 300nm Các sợi nano chitin được bao xung quanh bởi các phân tử protein, hình thành sợi chitin-protein với đường kính khoảng 30÷300nm Các sợi chitin-protein lại sắp xếp đan xem với nhau trong không gian 2 chiều và định kỳ phân nhánh tạo nên các lớp chitin-protein Trong các lớp này, các sợi chitin-protein liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và khoáng ở dạng vô định hình Các lớp chitin-protein tiếp tục chồng và xoắn ốc với nhau để hình thành lớp vỏ của động vật giáp xác [62], [168] Cho đến nay bản chất của tương tác giữa chitin và protein vẫn chưa được làm rõ [109] tuy nhiên tương tác này rất mạnh và do đó khó có thể tách triệt để protein ra khỏi chitin

Hình 1.5: Mô hình cấu trúc vỏ động vật giáp xác [188]

Trong đó: (1) lớp mô sừng; (2) lớp cu-tin bên ngoài (vỏ ngoài); (3) lớp cu-tin bên trong (vỏ trong)

1.3.2 Tính chất của chitin

(1) (2) (3)

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng rắn với cấu trúc bán tinh thể (có các vùng

vô định hình phân bố trong vùng kết tinh) α-chitin có tỷ lệ vùng kết tinh chiếm ưu thế nhưng ngược lại vùng vô định hình lại chiếm tỷ lệ lớn ở β-chitin [45] Tinh thể chitin gồm nhiều chuỗi polymer hình sợi liên kết chặt chẽ với nhau bằng các liên kết hydro và tạo thành một cấu trúc có trật tự cao [209]

Chitin hầu như không tan trong các dung môi phân cực và không phân cực thông thường do trong nội phân tử cũng như giữa các phân tử chitin luôn tồn tại liên kết hydro bền vững giữa các nhóm amin và cacbonyl Điều này gây cản trở cho các phương pháp nhận dạng, xác định tính chất của chitin cũng như hạn chế khả năng ứng dụng của chitin Các dung môi hiện đang được dùng để hòa tan chitin gồm có hỗn hợp của N,N-dimethylacetamide (DMAc) với lithium chlorite [71] hoặc NaOH/ure/H20 với tỷ lệ 8/4/88 [142] hay dung dịch NaOH 2,77M [80] Liên kết β-(1-4)-glucosidic của chitin dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: bazơ, tác nhân oxy-hóa, các enzym thuỷ phân, và đặc biệt nhạy cảm khi có sự tham gia của ion H+

ở nhiệt độ cao [209]

Phân tử chitin có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-axetyl-D-glucosamine và nhóm -OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là alcol, vừa là amin, và cũng vừa là amide, do đó chitin có thể tham gia nhiều phản ứng hoá học khác nhau như phản ứng ether hóa, phản ứng ester hóa, phản ứng liên kết mạch bên, phản ứng polymer hóa, [184],

[194] Nhóm N-acetyl của phân tử chitin có thể bị khử trong cả môi trường acid lẫn

bazơ nhưng theo hai cơ chế hoàn toàn khác nhau Trong môi trường bazơ đặc và nóng, ion OH- sẽ lần lượt tấn công vào vị trí của cacbon acyl trong nhóm amide để tạo nên sản phẩm trung gian có dạng dianion, sản phẩm trung gian này tiếp tục biến đổi và giải phóng ra sản phẩm polymer được deacetyl hóa, đó chính là chitosan theo Phương trình phản ứng (1-1) Phản ứng này luôn ưu tiên xảy ra ở vùng vô định hình trong phân tử chitin và tốc độ phản ứng tùy thuộc vào mức độ khuếch tán của các gốc OH-

vào sâu bên trong cấu trúc của chitin [138] Ngược lại, khi đun nóng chitin trong acid HCl đậm đặc thì chitin bị thuỷ phân hoàn toàn, theo Phương trình phản

ứng (1-2), tạo thành 88,5% D-Glucosamine và 22,5% acid acetic đồng thời có sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3), nhưng mức độ khử gốc N-acetyl chậm đáng kể so

với tốc độ thủy phân liên kết glucosidic [82]

(Phương trình phản ứng 1-1, [124])

(Phương trình phản ứng 1-2, [124])

1.3.3 Công nghệ thu hồi chitin từ vỏ động vật giáp xác

Chitin thương mại chủ yếu được tách chiết từ vỏ của các loại giáp xác [194] Nguyên tắc chính của quá trình thu hồi chitin từ vỏ động vật giáp xác là dùng các tác nhân để loại bỏ các tạp chất phi chitin (chủ yếu là protein, khoáng và sắc tố), phần còn lại sẽ là chitin do vậy các qui trình thu hồi chitin đều bao gồm các công đoạn chủ yếu sau: loại khoáng, loại protein và tẩy màu (nếu cần) Tùy thuộc vào tác nhân được sử dụng để loại khoáng và protein các phương pháp thu hồi sẽ được phân thành phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hay phương pháp sinh học kết hợp với hóa học

1.3.3.1 Phương pháp hóa học:

Phương pháp hóa học là phương pháp sử dụng acid để loại khoáng và bazơ

để loại protein, đây là phương pháp đang được áp dụng chủ yếu hiện nay ở qui mô công nghiệp để thu nhận chitin từ phế liệu các loài giáp xác

Các acid vô cơ mạnh như H2SO4, HCl thường được sử dụng để loại khoáng, trong đó HCl cho hiệu quả tốt nhất [58] Thời gian khử khoáng có thể thay đổi từ 1÷48h tùy thuộc vào sự lựa chọn nhiệt độ (từ nhiệt độ phòng đến 100oC) và nồng độ HCl xử lý (0.25÷2M) [182] Khi nâng nhiệt độ và tăng nồng độ acid tốc độ khử khoáng sẽ tăng, thời gian khử khoáng sẽ được rút ngắn tuy nhiên mạch polysaccaride của chitin sẽ bị ảnh hưởng đáng kể [82] Tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung dịch acid sử dụng cũng cần phải cân nhắc, ảnh hưởng của nó đến tốc độ và hiệu quả khử khoáng phụ thuộc vào nồng độ dung dịch acid sử dụng Khi xử lý acid

ở nồng độ thấp tỷ lệ giữa dung dịch acid và vỏ tôm sử dụng có có ảnh hưởng rất đáng kể, tốc độ và hiệu quả khử khoáng tỷ lệ thuận với tỷ lệ sử dụng nhưng ở nồng

độ acid cao, sự ảnh hưởng này giảm đi rõ rệt [55] Do vậy, nhiệt độ tối ưu cho quá trình khử khoáng là nhiệt độ thường, khoảng 30oC [55], nồng độ HCl không nên trên 1M và tỷ lệ dung dịch acid so với nguyên liệu không cần vượt quá 15/1 (v/w) [38]

Để loại protein cần thực hiện quá trình thủy phân và hòa tan protein thông qua việc xử lý nguyên liệu với dung dịch kiềm như NaOH hay KOH Quá trình loại protein được tiến hành với nồng độ kiềm từ 0,125÷2,5M ở điều kiện nhiệt độ cao (từ 65÷100oC) trong thời gian từ 1÷72h và tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch kiềm dao động trong khoảng từ 1/4÷1/15 (w/v), tùy thuộc vào đối tượng xử lý Hiệu quả khử protein luôn tỷ lệ thuận với nồng độ kiềm và nhiệt độ xử lý nhưng quá trình deacetyl và cắt mạch của chitin cũng sẽ gia tăng [220]

Ưu điểm nổi bật của phương pháp hóa học là thời gian thu chitin khá nhanh, khoảng 36÷40h và có thể tách protein và khoáng khá triệt để [53] Tuy nhiên, phương pháp này đến nay đã bộc lộ nhiều hạn chế đòi hỏi cần được khắc phục và

xử lý Việc sử dụng các acid và bazơ mạnh đã làm cắt mạch polymer của chitin, tạo

ra sản phẩm có độ đồng nhất không cao [37], [182], [220], đồng thời gây ô nhiễm

môi trường và làm giảm nghiêm trọng giá trị sinh học của protein và sắc tố, astaxanthin, có trên nguyên liệu tôm [192]

Một số các nghiên cứu nhằm cải tiến phương pháp hóa học đã được triển khai, chủ yếu tập trung ở công đoạn khử khoáng Khi kết hợp xử lý sơ bộ vỏ và đầu tôm sú với dung dịch acid loãng trước khi xử lý với acid đặc HCl có thể giảm gần 50% lượng hóa chất sử dụng so với thông thường [30] Kết hợp sử dụng acid hữu cơ như acid formic, acid acetic, acid benzoic ở dạng đơn chất và hỗn hợp cũng giúp hạn chế những ảnh hưởng không có lợi đến mạch polysaccharide của chitin nhưng hiệu quả khử khoáng không cao, hàm lượng khoáng còn lại trên 20% Khi kết hợp acid hữu cơ với acid HCl có thể nâng cao hiệu quả quá trình với trên 99% lượng khoáng được khử [17], [57], [162]

Trình tự thực hiện 2 công đoạn tách khoáng và tách protein có thể hoán đổi cho nhau tuy nhiên trật tự thực hiện sẽ có ảnh hưởng nhất định đến chất lượng và tính chất sản phẩm thu hồi Khả năng hấp phụ nước và chất béo cao hơn nếu thực hiện công đoạn khử khoáng trước công đoạn khử protein và công đoạn tẩy màu sẽ làm giảm đáng kể khả năng liên kết với nước của chitin và chitosan được tách chiết

từ tôm nước ngọt [197] Nếu xử lý kiềm trước và xử lý acid sau, hàm lượng khoáng

và protein trong sản phẩm sẽ thấp hơn nhưng ngược lại độ nhớt sẽ giảm so với xử lý acid trước [25] Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh mức độ khử khoáng và khử protein sẽ không thể triệt để (hàm lượng khoáng và protein còn lại trên chitin cao hơn 1%) nếu chỉ thực hiện quá trình khử một lần [38], [124]

1.3.3.2 Phương pháp sinh học

Trong phương pháp sinh học, khoáng và protein trên vỏ động vật giáp xác sẽ được loại bỏ thông qua khai thác khả năng hoạt động của enzyme hoặc/và vi sinh vật có sẵn trên nguyên liệu hoặc được bổ sung từ ngoài vào

Việc bổ sung các chủng vi khuẩn lên men lactic đặc hiệu như Lactobacillus

plantarum [241], Lactobacillus paracasei [117], Pediococcus acidolactici [41],

[76] cũng như các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease như Serratia

marcescens FS-3 [116], Bacillus subtilis [206], [234], Pseudomonas aeruginosa

[174] có thể khử được trên 70% khoáng và từ 40÷80% protein, tùy thuộc vào thời gian và điều kiện xử lý như pH, hàm lượng đường bổ sung Bên cạnh chitin còn có thể thu hồi carotenoprotein và/hoặc carotenoid nhưng thời gian của quá trình khá dài, dao động từ 48÷144h [178]

Nhiều loại protease thương mại như Alcalase [70], [222]; pancreatin [70], papain [53]; bromalin [238]; pepsin [115] cũng đã được nghiên cứu để khử protein, hiệu quả khử đạt được dao động trong khoảng từ 60÷86% So với việc sử dụng trực tiếp các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease, việc sử dụng các enzyme thương mại có thời gian xử lý ngắn hơn và hiệu quả khử protein cũng cao hơn Khoảng 86% lượng protein đã bị khử khi xử lý với Alcalase (0,2% Alcalase so với khối lượng, sau 8h xử lý ở nhiệt độ 60oC) [222]

Lợi dụng hệ enzyme sẵn có trên đầu tôm cũng có thể thực hiện quá trình tự thủy phân để khử protein khá hiệu quả, khoảng 87,4% lượng protein có thể được

loại ra khỏi đầu tôm (Penaeus vannamei) khi thực hiện quá trình tự thủy phân bằng

cách nâng nhiệt từ 40 đến 70oC với bước nhảy 5oC [51] Quá trình tự thủy phân cũng cho phép thu hồi protein, chitin, carotenoids và glycosaminoglycans từ đầu

tôm Litopenaeus vannamei [47]

Ưu điểm nổi bật của phương pháp sinh học là ít gây ảnh hưởng phụ đến mạch polysaccharide của chitin, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu hồi protein, sắc

tố và kiểm soát hiệu quả hiện tượng ô nhiễm môi trường do không sử dụng acid và kiềm mạnh Chitin được tách chiết bằng phương pháp sinh học không có sự khác nhau về độ acetyl nhưng khối lượng phân tử trung bình lớn hơn so với chitin thu được khi sử dụng phương pháp hóa học, 1200kDa so với 900kDa [178] Tuy vậy phương pháp sinh học có thời gian xử lý khá dài, có thể từ 2 đến 21 ngày, chi phí cao, đồng thời dư lượng protein và khoáng còn lại trên chitin cao hơn nhiều so với phương pháp hoá học [95]

Với xu thế đảm bảo sự phát triển bền vững, sản xuất chitin theo hướng sử dụng phương pháp sinh học được nhận định là sẽ có vai trò ngày càng quan trọng và

trở thành xu hướng bắt buộc trong tương lai, tuy nhiên cần phải có thêm các giải pháp công nghệ để hạn chế các điểm yếu của nó [120]

1.3.3.3 Phương pháp sinh học kết hợp với hóa học:

Để phát huy đồng thời các ưu điểm và khắc phục các nhược điểm của phương pháp hóa học và sinh học giải pháp kết hợp phương pháp sinh học với hóa học đã được triển khai theo hướng sử dụng tác nhân sinh học để khử phần lớn protein hoặc/và khoáng sau đó sử dụng các tác nhân hóa học để loại tiếp phần còn lại nhằm đạt độ tinh sạch theo yêu cầu cho sản phẩm

Tất cả các nghiên cứu liên quan đến sử dụng phương pháp sinh học trong thu hồi chitin đều cho thấy các tác nhân sinh học không thể khử được lượng protein tồn tại trên vỏ tôm ở dạng các peptide và acid amin liên kết bền với chitin ở các lớp sâu bên trong [151], ước tính khoảng 4,4÷7,9% lượng protein [210] Vì vậy để đáp ứng yêu cầu hàm lượng protein dưới <1% của chitin chất lượng cao cần phải sử dụng các tác nhân hóa học để khử triệt để protein, dd NaOH có nồng độ từ 0,5÷2% thường được sử dụng [178]

Khử khoáng bằng phương pháp sinh học chủ yếu được thực hiện thông qua quá trình lên men với các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic Tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và đối tượng tôm sử dụng hiệu quả khử khoáng đạt được trong khoảng từ 45÷99% [151] Để giảm hàm lượng khoáng xuống dưới 1% cũng cần phải bổ sung công đoạn khử khoáng lần 2 với acid vô cơ mạnh như HCl nhưng

ở nồng độ thấp 1÷2% [70], [98], [178]

Cách thức kết hợp giữa phương pháp sinh học và hóa học có thể thực hiện theo các hướng sau: (i) Khử protein lần 1 bằng phương pháp sinh học, khử protein lần 2 và khử khoáng bằng phương pháp hóa học [18], [19], [20], [70], [210], [238]; (ii) Khử khoáng và protein lần 1 bằng phương pháp sinh học, khử protein và khoáng lần 2 bằng phương pháp hóa học [117], [178]; (iii) Khử khoáng lần 1 bằng phương pháp sinh học, khử khoáng lần 2 và protein bằng phương pháp hóa học [37]

Chitin thu được bằng phương pháp kết hợp giữa phương pháp sinh học và hóa học có độ tinh sạch tương đương nhưng lại có một số tính chất được cải thiện

hơn so với phương pháp hóa học truyền thống: phân tử lượng và DA cao hơn [151], [178]

Phương pháp kết hợp cho phép thu hồi protein và giảm lượng hóa chất sử dụng [27], [98], [151] Tuy nhiên vẫn cần có các nghiên cứu bổ sung để đưa ra các giải pháp công nghệ cho phép rút ngắn thời gian sản xuất và giảm chi phí chung Bên cạnh đó việc thu thập các dữ liệu động học của quá trình khử protein và khử khoáng bằng phương pháp sinh học cũng cần được thực hiện để có cơ sở khoa học

cho việc kiểm soát quá trình cũng như mở rộng qui mô sản xuất [98], [151]

1.4 CHITOSAN VÀ QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN

1.4.1 Chitosan và tính chất của nó

Chitosan là dẫn xuất của chitin sau khi đã được deacetyl, có cấu trúc mạch thẳng, được hình thành từ hai monome là N-acetyl-glucosamine (GlcNAc - tiểu phần A) và glucosamine (GlcN - tiểu phần D), với một tỷ lệ phần trăm thấp hơn của tiểu phần A (0÷40%) (Hình 1.6) Trong tự nhiên, chitosan tồn tại trong vách tế bào của các loài nấm nhưng với một tỷ lệ thấp hơn đáng kể so với chitin Chitosan là tên gọi chung của các polymer là dẫn xuất từ chitin với độ deacetyl (DD) trên 60% [132] Tùy thuộc vào mức độ deacetyl, hàm lượng nitơ trong chitosan sẽ dao động

từ 7÷9,5% [235] và chitosan sẽ có sự khác nhau về hoạt tính sinh học, tính chất lưu biến ngoại trừ tính chất chung là đều có thể tan trong dung dịch acid hữu cơ có pH thấp hơn 6,0 như acid acetic, formic, lactic, citric [209] Khi tan trong dung dịch acid, các nhóm amin của chitosan sẽ nhường điện tử và tạo ra dung dịch polymer tích điện dương, một tính chất rất đặc thù so với các dung dịch polymer sinh học khác Khi pH của môi trường tăng lên trên 6,5 chitosan sẽ bị kết tủa [209]

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của chitosan

Trong phân tử chitosan có 3 nhóm chức hoạt động: nhóm hydroxyl ở vị trí

C-6 và C-3, nhóm amino ở C-2 Các nhóm chức hoạt động này có thể tham gia nhiều phản ứng hóa học khác nhau tạo nên các dẫn xuất với các tính chất chức năng rất đặc thù, nhờ đó cho phép mở rộng phạm vi ứng dụng của chitosan [235]

Chất lượng và đặc tính của chitosan được đánh giá thông qua độ tinh sạch,

độ deacetyl, độ tan, độ nhớt, khối lượng phân tử trung bình, mức độ phân bố khối lượng phân tử, kiểu phân bố của các monomer trên chuỗi polymer và cấu trúc hình thái [181], [209], [235]

1.4.2 Quá trình deacetyl chitin

1.4.2.1 Các phương thức deacetyl

Chitosan thương mại chủ yếu thu được từ quá trình deacetyl chitin Quá trình deacetyl để chuyển chitin thành chitosan thường được thực hiện trong môi trường kiềm đặc, nóng (thường là NaOH hoặc KOH) theo Phương trình phản ứng (1-2) và phản ứng có thể diễn ra trong điều kiện đồng thể (homogenous) khi chitin ở trạng thái dung dịch hoặc trong điều kiện dị thể (heterogenous) khi chitin ở trạng thái rắn [56] Deacetyl trong điều kiện đồng thể tạo ra chitosan có phân tử lượng trung bình với độ deactyl thấp (48÷55%) và có thể tan trong nước; trong khi deacetyl ở điều kiện dị thể, chitosan có phân tử lượng và độ deacetyl cao hơn nhưng chỉ tan trong

acid loãng [134] Khi deacetyl trong điều kiện dị thể các gốc N-acetyl chủ yếu được

deacetyl theo khối và một phần theo trật tự ngẫu nhiên, nhưng khi deacetyl trong điều kiện đồng thể quá trình deacetyl theo trật tự ngẫu nhiên lại chiếm ưu thế hơn [134], [225]

Chitin cũng có thể được deacetyl một cách có chọn lọc dưới sự xúc tác của enzyme chitin deacetylase, tuy nhiên hiệu quả kinh tế của quá trình rất thấp và chỉ mới dừng ở phạm vi phòng thí nghiệm do ảnh hưởng bởi khả năng hòa tan của chitin [74]

1.4.2.2 Đặc điểm của quá trình deacetyl trong điều kiện dị thể

Trong các cách thức deacetyl, deacetyl trong điều kiện dị thể là đơn giản, nhanh và chi phí thấp nhất, vì thế được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp [103]

Các yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ và mức độ deacetyl cũng như các đặc tính của sản phẩm khi thực hiện quá trình deacetyl dị thể gồm có nồng độ NaOH, nhiệt độ, thời gian, điều kiện khí quyển và tính chất nguyên liệu dùng để sản xuất chitin, chitosan [22], [90], [135], [193], [209], [217], [219] Mức độ deacetyl được chứng minh là luôn tỷ lệ thuận với nồng độ NaOH hoặc KOH và nhiệt độ [56], [114], [223] Ở nồng độ NaOH thấp hơn 35% (w/w) quá trình deacetyl α-chitin diễn

ra với vận tốc rất chậm và mức độ deacetyl rất thấp ngay cả ở nhiệt độ cao và trong thời gian dài [135], [147] Để đảm bảo chất lượng của chitosan tỷ lệ giữa chitin và dung dịch kiềm phải đủ để giữ chitin luôn được nhúng ngập trong dung dịch kiềm

và quá trình deacetyl thường được thực hiện với tỷ lệ chitin so với dung dịch kiềm trong khoảng từ 1:10 đến 1:20 (w/v) [56], [156], [223] Sự ảnh hưởng của kích thước chitin đến tốc độ deacetyl hiện chưa được thống nhất, mặc dù đa số các nghiên cứu cho rằng tốc độ trương nở của chitin sẽ tăng, và do đó tốc độ deacetyl cũng sẽ được cải thiện khi giảm kích thước của chitin [176] nhưng vẫn có các nghiên cứu cho thấy kích thước chitin không có sự ảnh hưởng lớn đến quá trình deacetyl [235] Chế độ tách chiết chitin cũng có ảnh hưởng nhất định đến tính chất của chitosan Chitosan được deacetyl từ chitin được khử khoáng với nồng độ HCl trên 1,25N; thời gian khử khoáng kéo dài hoặc được khử protein với nồng độ NaOH trên 3% sau khi khử khoáng sẽ có sự suy giảm đáng kể về độ nhớt [235] Công đoạn tẩy màu chitin cũng làm suy giảm đáng kể độ nhớt của chitosan [197]

Trong điều kiện NaOH dư, quá trình deacetyl chitin trong điều kiện dị thể tuân theo phương trình giả bậc nhất (pseudo-first order) [156], [160] Tuy nhiên, thực tế động học của quá trình này phức tạp hơn, nó chịu ảnh hưởng đồng thời của quá trình khuếch tán NaOH và phản ứng deacetyl, trong đó giai đoạn khuếch tán được đánh giá là có ý nghĩa quyết định đến tốc độ và mức độ deacetyl [56], [201]

Song song với việc tham gia vào phản ứng deacetyl, các phân tử NaOH còn thực hiện quá trình depolymer và có sự thay đổi xu hướng theo độ deacetyl đạt được, ở giai đoạn đầu phản ứng deacetyl chiếm ưu thế nhưng khi hỗn hợp phản ứng

đạt đến giá trị DD tới hạn phản ứng depolymer lại diễn ra mãnh liệt hơn [147], [186] Do vậy, chitosan sẽ bị cắt mạch sâu sắc khi kéo dài thời gian deacetyl

Một số kỹ thuật hỗ trợ đã được áp dụng để nâng cao hiệu quả quá trình deacetyl như ngâm chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc trước khi gia nhiệt [22], [136]; deacetyl nhiều lần, qua nhiều giai đoạn [233]; thực hiện deacetyl trong điều kiện áp suất cao; sử dụng môi trường khí trơ [170]; bổ sung chất khử (NaBH4 hoặc thiophenol) [220]; hay gần đây hơn là sử dụng sóng siêu âm của Delezuk và cs [72]

và ứng dụng microwave của Samar và cs [149]

1.5 ĐẶC TRƯNG TÍNH CHẤT CỦA CHITIN, CHITOSAN

Đặc điểm, tính chất của chitin, chitosan thường được đánh giá thông qua các chỉ tiêu về độ tinh sạch, màu sắc, phân tử lượng, mức độ acetyl hóa và trạng thái cấu trúc tinh thể

1.5 1 Phương pháp xác định độ tinh sạch

Độ tinh sạch của chitin, chitosan được phản ánh thông qua lượng protein và khoáng còn lại Để xác định hàm lượng khoáng, phương pháp nung đến khối lượng không đổi được sử dụng phổ biến vì đơn giản, dễ thực hiện trong khi phương pháp phân tích hấp thụ nguyên tử (Atomic Absorption Spectrophotometry - AAS) có độ chính xác cao hơn [183] Hàm lượng protein còn lại trên chitin, chitosan sẽ có ảnh hưởng lớn khi sử dụng trong lĩnh vực y học và thực phẩm, vì vậy nó luôn là chỉ tiêu cần phải được kiểm soát đối với chitin, chitosan thành phẩm

Hiện tại, mặc dù có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để xác định hàm lượng protein còn lại trên chitin, chitosan nhưng chưa có sự thống nhất về việc lựa chọn phương pháp chuẩn Tất cả các phương pháp định lượng protein còn lại trên chitin đang được sử dụng đều là phương pháp gián tiếp, chúng bao gồm phương pháp phân tích sắc ký, phương pháp đo độ hấp thụ quang học (Biuret hoặc Micro-Biuret, Bradford, và Lorry), phương pháp phân tích nguyên tố (elemental analysis), hay phương pháp Kjeldalh Mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng Phương pháp xác định lượng protein thông qua phân tích nitơ tổng số kết hợp với các hệ số qui đổi do Chang và Tsai đề xuất [55] là phương pháp đơn

giản nhưng tốn nhiều thời gian nhất Phương pháp sắc ký [183] mặc dù cho kết quả

có độ chính xác khá cao nhưng vẫn có sai số nhất định do không xác định được sự

có mặt của một số acid amin như tryptophan, cysteine (do bị phá hủy khi thủy phân với HCl đậm đặc) cũng như isoleucine, leucine và phenylalanine (do bị trùng peak với glucosamine, sản phẩm của quá trình thủy phân chitosan) [139], thêm vào đó phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, chi phí phân tích lớn

Hàm lượng protein còn lại còn có thể xác định theo qui trình của Aye và cs với 2 bước: (1) chiết protein bằng NaOH và (2) định lượng thông qua đo mức độ hấp thụ quang học với chất chuẩn là Bovine Serum Albumin [30] Mặc dù phương pháp này luôn có sai số do không đánh giá được lượng protein đã bị thủy phân thành axit amin hoặc dipeptide và ít nhiều bị ảnh hưởng bởi protein được dùng làm chất chuẩn nhưng với ưu điểm là ít tốn thời gian và dễ thực hiện nên thường được lựa chọn khi phòng thí nghiệm không đáp ứng các yêu cầu của các phương pháp sắc

ký và số lượng mẫu lớn [123], [218]

1.5 2 Phương pháp xác định phân tử lượng

Phân tử lượng của chitin, chitosan được phản ánh qua giá trị phân tử lượng trung bình của các phân tử chitin, chitosan có mặt trong tập hợp, và thường được đại diện bởi phân tử lượng trung bình khối lượng (Mw), phân tử lượng trung bình độ nhớt (Mv) và phân tử lượng trung bình số lượng (Mn) Các phương pháp chủ yếu thường được áp dụng để xác định phân tử lượng trung bình của chitin, chitosan gồm

có sắc ký lọc gel, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt [181] Hiện nay, phương pháp sắc

ký lọc gel kết hợp với phương pháp tán xạ ánh sáng đa chiều (SEC - MALL) là phương pháp chuẩn được áp dụng để xác định phân tử lượng trung bình của chitin, chitosan Phương pháp cho phép xác định trực tiếp và đồng thời cả phân tử lượng trung bình khối lượng (Mw), phân tử lượng trung bình số lượng (Mn) và từ đó xác định được chỉ số đa phân tán (Polydispersity Index- PI) của chitin, chitosan [45], [80], [167], [203] Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, đắt tiền, và khá mất thời gian nên khó áp dụng rộng rãi [181]

Trong các phương pháp xác định phân tử lượng trung bình của chitin, chitosan, phương pháp xác định phân tử lượng trung bình độ nhớt (Mv) dựa vào độ nhớt nội kết hợp với phương trình Mark-Houwink-Sakurada (MHS) là phương pháp

có nhiều ưu điểm nhất: vừa nhanh lại đơn giản, không đòi hỏi thiết bị hiện đại, chi phí thấp và có độ chính xác ở mức chấp nhận được [209]

Phương trình MHS có dạng: [η] = K.(Mv)a , trong đó [η] là độ nhớt nội, K là

hằng số và a là hệ số mũ của phương trình Giá trị của K và a thay đổi tùy thuộc vào

tính chất của hệ dung môi sử dụng để hòa tan chitin, chitosan và nhiệt độ khi tiến hành đo độ nhớt nội, số liệu cụ thể ứng với từng điều kiện đo đã được nhiều tác giả nghiên cứu và công bố trong các bài báo khoa học [39], [71], [80], [121], [142]

1.5 3 Phương pháp xác định độ deacetyl

Bên cạnh khối lượng phân tử, độ acetyl - DA (hoặc deacetyl - DD) cũng là một chỉ tiêu quan trọng có nhiều ảnh hưởng đến các tính chất lý hóa và chức năng của chitin, chitosan Độ acetyl hay deacetyl của chitin, chitosan có thể được đánh giá thông qua nhiều phương pháp khác nhau, các phương pháp này có thể xếp thành

3 nhóm chính: (1) nhóm phương pháp quang phổ (spectroscopic methods) gồm phương pháp NMR, UV và IR; (2) nhóm phương pháp truyền thống (conventional methods) với các phương pháp chuẩn độ và nhuộm màu với ninhydrin; và nhóm phương pháp phá vỡ cấu trúc (destructive methods) gồm phương pháp phân tích nguyên tố, thủy phân với acid/enzyme kết hợp với phân tích sắc ký hoặc so màu

Mỗi phương pháp đều có những ưu và hạn chế riêng, việc lựa chọn phương pháp phân tích sẽ tùy thuộc vào đặc điểm của mẫu cần phân tích và điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, tuy nhiên các phương pháp thuộc nhóm 1 và 3 thường được sử dụng rộng rãi hơn [122] Đối với các nghiên cứu cần xác định độ deacetyl thường xuyên với số lượng mẫu lớn thì các phương pháp xác định thông qua đo

mức độ hấp thụ tia cực tím của N-acetyl glucosamine tỏ ra có ưu thế vì đơn giản,

nhanh và chi phí thấp [99], đặc biệt thủ tục phân tích sử dụng acid phosphoric làm dung môi hòa tan chitin, chitosan do Hsiao và cs đề xuất, sau đó được phát triển bởi Hein và cs, được chứng minh là có độ tin cậy cao với một phổ DD rộng vì vậy thích

hợp cho cả chitin và chitosan [99], [104] Độ deacetyl của mẫu sau deacetyl là giá trị trung bình độ deacetyl của phần tan và không tan trong acid loãng của sản phẩm,

và việc phân riêng hay không phân riêng phần tan và không tan không có ảnh hưởng đến kết quả [176]

1.5 4 Phương pháp đánh giá mức độ kết tinh

Phương pháp nhiễu xạ tia X với góc quét rộng (Wide Angle X-ray diffraction) là phương pháp hữu dụng để đặc trưng tính chất và phân biệt tính đa hình của chitin, chitosan Nó thường được sử dụng để đánh giá mức độ kết tinh và đặc điểm cấu trúc tinh thể của chitin, chitosan Mức độ kết tinh (Degree of Crystallinity) hay chỉ số độ rắn (Crystallinity Index) là các chỉ số thường được sử dụng để phản ánh tỷ lệ vùng kết tinh trên phổ nhiễu xạ tia X, tỷ lệ này thường được xác định thông qua việc so sánh tỷ lệ cường độ tích phân của vùng kết tinh so với vùng vô định hình hoặc tỷ lệ cường độ phản xạ tại các vị trí kết tinh và vô định hình [59], [143], [179], [208]

Ngoài ra, với sự hỗ trợ của kỹ thuật hình ảnh, có thể đánh giá tác động của các yếu tố công nghệ đến đặc điểm trạng thái của chitin, chitosan thông qua so sánh ảnh chụp bề mặt của chitin, chitosan Kỹ thuật chụp ảnh bằng kính hiển vi quét (Scaning electron microscope - SEM) gần đây đã được nhiều tác giả sử dụng để so sánh tác động các phương pháp tách chiết và xử lý khác nhau đến hình thái của chitin, chitosan [53], [127], [131]

1.6 ỨNG DỤNG CỦA CHITIN, CHITOSAN VÀ DẪN XUẤT

Nhu cầu tiêu thụ chitin hiện nay đang gia tăng do chitin và các dẫn xuất của

nó có nhiều tính chất đặc biệt và đặc tính sinh học quí Trong số các dẫn xuất của chitin, chitosan hiện là dẫn xuất quan trọng và có phạm vi ứng dụng rộng rãi nhất [103], [180], [211] Số lượng các ứng dụng thực tế và tiềm năng của chitin, chitosan lên đến trên 200 [133] và trải rộng ở nhiều lĩnh vực khác nhau như y sinh, thực phẩm, công nghệ sinh học, nông nghiệp, mỹ phẩm và một số lĩnh vực khác

Chitosan hoặc phức hợp giữa chitosan - alginate và các hợp chất kỵ béo được ứng dụng rất rộng rãi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm để sản xuất nhiều dạng sản

phẩm chăm sóc da, chăm sóc tóc và chăm sóc răng miệng Việc bổ sung chitosan đã làm tăng khả năng cản tia cực tím, bền màu, giữ ẩm cho sản phẩm kem chống nắng, dưỡng da, kem đánh răng, thuốc nhuộm tóc, Với tính chất của một dung dịch keo tích điện dương và khả năng hấp phụ kim loại nặng, chitosan được ứng dụng trong công nghiệp xử lý nước Chitosan giúp tăng cường mức độ kết lắng các chất bẩn lơ lửng trong nước thải của công nghiệp dệt và công nghiệp thực phẩm, đồng thời làm trong và khử kim loại nặng trong nước uống Chitosan còn được sử dụng công nghiệp sản xuất nước giải khát để khử acid trong công nghiệp chế biến cà phê, làm trong rượu, bia và nước quả Trong công nghiệp giấy, chitosan làm tăng độ mịn, độ láng và chống thấm nước Trong công nghiệp thực phẩm, chitin ở dạng tinh thể với kích thước micro được dùng để làm chất nhũ hóa, tác nhân tạo gel, tăng độ ổn định cho nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau Nó còn được dùng để cung cấp chất xơ, tăng thời hạn sử dụng, cố định tế bào, cố định enzyme nhờ đó tiết giảm được chi phí sản xuất Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng, giảm sâu bệnh, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn Ứng dụng có giá trị và triển vọng phát triển nhất của chitin, chitosan là trong lĩnh vực y học và dược phẩm Với đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, khả năng kết dính và thẩm thấu oxy tốt chitin, chitosan là nguyên liệu lý tưởng để sản xuất các sản phẩm chỉ khâu vết thương, băng chữa bỏng và điều trị vết thương Nhờ có cấu trúc không gian 3 chiều tương tự glycosaminoglycans trong một số mô của cơ thể người, chitosan được phối hợp với collagen, gelatin, canxi trong công nghệ tế bào để điều trị, phục hồi và tái tạo các cơ quan trong cơ thể Chitosan và các dẫn xuất của nó còn được sử dụng để chế tạo chất mang thuốc có khả năng giải phóng thuốc chậm, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị Các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc sử dụng chitin, chitosan trong kỹ thuật điều trị bằng liệu pháp gel, kết quả thu được hứa hẹn một tương lai rộng mở cho lĩnh vực áp dụng này [78], [181], [185], [133], [194], [204]

Khả năng ứng dụng của chitin và các dẫn xuất phụ thuộc vào độ tan, độ tinh sạch, các tính chất hóa lý và tính chất chức năng của chúng Khối lượng phân tử và

độ deacetyl là những thông số quan trọng nhất cần quan tâm khi sử dụng chitin,