Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình lên men thu nhận kefiran của chủng lactobacillus từ hạt kefir

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - FG - Người thực hiện: ĐỖ QUANG HUY ĐỂ TÀI: NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN KEFIRAN CỦA CHỦNG LACTOBACILLUS TỪ HẠT KEFIR Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: T.S NGUYỄN VĂN ĐẠO Hà nội 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn thân thực hiện, kết nghiên cứu đưa luận văn thân chưa công bố tạp chí khoa học trước Các số liệu kết thực cách khoa học, trung thực xác LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Đạo – Phó  chủ nhiệm Khoa  Cơng Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, người đã  tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, chỉ bảo, động viên và giúp  đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn thành luận văn.  Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy, cơ giáo Khoa Cơng Nghệ Sinh Học,  Viện Cơng Nghệ Sinh Học & Cơng Nghệ Thực Phẩm, Viện Đào tạo sau Đại  Học, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình dạy bảo tạo điều kiện  thuận lợi để tơi hồn thành luận văn và khóa học thạc sĩ tại trường.  Tơi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Cơng ty TNHH MTV Bia Rượu  Eresson, anh chị em lớp cao học, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã giúp đỡ  tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.  Tơi xin chân thành cảm ơn!  Hà Nội, tháng năm 2011 Học Viên Đỗ Quang Huy DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải thích từ viết tắt EPS Exopolysaccharit CS Cộng PYG10 Dịch gạo thủy phân MT Môi trường TB Tế bào VSV Vi sinh vật Lb Lactobacillus MRS The formulations of deMan, Rogosa and Sharpe OD Optic density (mật độ quang) AMG Glucoamylase rRNA Ribosome ribonucleic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các vi sinh vật nấm Kefir Bảng 1.2: Giá trị nhiệt độ pH tối ưu cho sinh trưởng số loại vi khuẩn Lactic Bảng 1.3: Danh sách EPS Bảng 3.1: Một số đặc điểm chủng vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir Bảng 3.2: Một số đặc điểm sinh hóa chủng phân lập Bảng 3.3: So sánh khả sinh tổng hợp kefiran số chủng vi khuẩn lactic từ hạt kefir Bảng 3.4: So sánh tương đồng trình tự ribonucleotide 16S rRNA chủng vi sinh vật phân lập 16S rRNA Lactobacillus plantarum, partial sequence, strain: NRIC 1594 Bảng 3.5: Ảnh hưởng pH mơi trường lên men đến q trình sinh tổng hợp kefiran Bảng 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả sinh tổng hợp kefiran mơi trường nước mía Bảng 3.7: Ảnh hưởng nồng độ nước mía đến khả sinh tổng hợp kefiran Bảng 3.8: Hàm lượng kefiran sinh tổng hợp theo thời gian mơi trường nước mía 15Bx Bảng 3.9 Các yếu tố ảnh hưởng nghiên cứu Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken yếu tố hàm lượng Kefiran điều kiện khác Bảng 3.11 Phân tích phương sai ANOVA mơ hình Bảng 3.12:Hàm lượng kefiran sinh tổng hợp theo thời gian lên men môi trường dịch gạo thủy phân Bảng 3.13: So sánh trình sinh tổng hợp kefiran mơi trường nước mía môi trường dịch gạo thủy phân Bảng 3.14: Hàm lượng kefiran tổng hợp bổ sung N vào mơi trường nước mía Bảng 3.15: So sánh ảnh hưởng số nguồn C đến khả sinh tổng hợp Kefiran DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Hình dạng kích thước hạt nấm Kefir Hình 1.2: Ảnh chụp nấm Kefir kính hiển vi Hình 1.3 Sản phẩm sữa kefir Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo Curdlan Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo chitosan Hình 1.6: Cấu trúc phân tử gellan Hình 1.7: Cấu trúc phân tử Indican Hình 1.8: Cấu trúc phân tử pullulan Hình 1.9: Cấu trúc phân tử Welan Hình 1.10: Cấu trúc phân tử Xanthan gum Hình 1.11: Cấu trúc phân tử Kefiran Hình 2.1: Phản ứng tạo màu Polysacchart Anthrone Hình 3.1: Hình dáng khuẩn lạc vi khuẩn lactic phân lập dự đoán vi khuẩn lactobaciluss sp Hình 3.2: Hình ảnh tế bào vi sinh vật phân lập chụp kính hiển vi điện tử Hình 3.3: Trình tự 16S rRNA chủng vi sinh vật phân lập Hình 3.4: Hình chụp kính hiển vi chủng L Plantarum Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH môi trường lên men đến trình sinh tổng hợp kefiran Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh Kefiran từ mơi trường nước mía Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ nước mía đến khả sinh Kefiran Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn hàm lượng Kefiran sinh tổng hợp theo thời gian mơi trường nước mía Hình 3.9 Bề mặt đáp ứng hàm lượng Kefiran Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng kefiran sinh tổng hợp mơi trường dịch gạo thủy phân Hình 3.11: Đồ thị so sánh hàm lượng Kefiran sinh tổng hợp từ mơi trường nước mía dịch gạo thủy phân Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn hàm lượng Kefiran sinh tổng hợp bổ sung Nitơ vào môi trường nước mía Hình 3.13: Đồ thị so sánh ảnh hưởng số nguồn Cacbon đến khả sinh tổng hợp Kefiran Hình 3.14: Sơ đồ quy trình thu nhận kefiran quy mơ phịng thí nghiệm Hình 3.15: Hình ảnh sản phẩm Kefiran sấy khơ có độ tinh 96% LỜI MỞ ĐẦU Trong thời đại phát triển mạnh mẽ công nghệ nghiên cứu khoa học, vấn đề mà người quan tâm hàng đầu sản phẩm phục vụ sức khỏe nhân loại Như biết, sức khỏe người phụ thuộc vào yếu tố di truyền, mơi trường sống, dinh dưỡng phịng trị bệnh, việc dinh dưỡng để phịng ngừa bệnh tật đóng vai trị vơ quan trọng việc bảo vệ sức khỏe Cơ thể cần cung cấp đầy đủ vitamin khoáng chất ngày để đảm bảo lượng cần thiết cho hoạt động, nhu cầu khơng thỏa mãn nhiều yếu tố Ngày nay, việc sử dụng thực phẩm chức ngày biện pháp có hiệu quả, có tác động tích cực việc hỗ trợ điều trị phịng chống số bệnh Nhờ tính chất chống oxy hóa, tăng miễn dịch giúp tế bào thể chống lại lão hóa, giúp bổ sung cho thể Vitamin khống chất nhóm chất hữu cần thiết mà thể không tự tổng hợp Nhiều lồi thực vật vi sinh vật có khả tổng hợp exopolysaccharit – chất có hoạt tính sinh học người khai thác để làm thuốc thực phẩm chức phục vụ cho mục đích chữa bệnh tăng cường sức khỏe người Kefiran exopolysaccharit có lợi người biết đến từ lâu Kefiran có chất polysaccharit, chất xơ, khung, giá đỡ mô, tế bào thực vật có sức chống đỡ với loại men tiêu hóa người Vi khuẩn lên men tạo Kefiran phần lớn Lactobacillus có hạt kefir Các thực phẩm chức loại thường chế biến từ sản phẩm sữa, gạo lên men, nước dừa, nước hoa nước mía,… Đây nguyên liệu sẵn có, giá thành rẻ, nguyên liệu dồi phong phú, dễ tìm mơi trường tốt để lên men vi khuẩn lactic, có khả sinh tổng hợp kefiran cao Kefiran biết đến thực phẩm chức để trì cân vi sinh vật đường ruột, kích thích tăng trưởng hay hoạt động số vi khuẩn đường ruột, tạo điều kiện cho vi khuẩn có lợi phát triển, giúp cải thiện sức khỏe Ngoài Kefiran chứng minh hợp chất có tác dụng nâng cao khả miễn dịch người, chống ung thư, có lợi cho hệ tuần hồn tim mạch Chính chúng tơi thực đề tài: “ NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN KEFIRAN CỦA CHỦNG LACTOBACILLUS TỪ HẠT KEFIR “ Để hồn thành đề tài chúng tơi tập trung nghiên cứu số nội dung chính: - Phân lập tuyển chọn chủng giống vi khuẩn lactic sinh tổng hợp kefiran cao - Nghiên cứu phương pháp phân tích Kefiran - Nghiên cứu tối ưu mơi trường ni cấy thích hợp, rẻ tiền từ nguồn nguyên liệu nước - Nghiên cứu tối ưu số điều kiện ảnh hưởng đến suất thu nhận kefiran từ chủng phân lập nhiệt độ, pH môi trường, nguồn C, N, thời gian lên men,… - Đưa quy trình lên men tối ưu thu nhận kefiran quy mô phịng thí nghiệm - Nghiên cứu phương pháp thu nhận kefiran dạng khô CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu Kefir lợi ích 1.1.1 Hạt nấm kefir nguồn gốc chúng 1.1.1.1 Nguồn gốc hạt nấm kefir Kefir sản phẩm lên men sữa có từ lâu đời Sản phẩm bắt nguồn từ tu sĩ ấn Tạng vùng núi Caucasus thuộc Liên Xô cũ Hàng ngàn năm qua người dân vùng núi Caucasus, nấm Kefir dùng để phòng trị bệnh Từ Kefir cho bắt nguồn từ tiếng Thổ Nhĩ Kỳ “Keif” có nghĩa “ cho cảm giác tốt” Sữa lên men từ nấm Kefir trở thành đồ uống quý báu yêu thích người dân Caucasus Họ sử dụng đồ uống thường xuyên phần sản phẩm chế độ ăn uống Điều đặc biệt họ đến bệnh ung thư, bệnh đường tiêu hoá (như bệnh dày, bệnh đại tràng), bệnh lao, u bướu…và tuổi thọ họ cao, trung bình tới 110 tuổi Sữa chua Kefir sản phẩm sữa lên men có vị chua đặc trưng mùi rượu nhẹ Sữa chua Kefir có độ đặc vừa phải, đồng có vị chua dịu với hương thơm tự nhiên nấm men tươi Khác với sữa chua khác thêm vào nấm Kefir tự sản sinh CO2 tạo cho sản phẩm có lượng ga nhỏ Sâm banh lượng rượu nhỏ (0.6 – 3%) Tạo nên sản phẩm giải khát hấp dẫn hoàn hảo, để lại cho người sử dụng ấn tượng khó quên Cho tới kỉ IXX vùng núi Cacasus nằm kiểm soát Nga bác sĩ người Nga người kiểm nghiệm lợi ích to lớn nấm Kefir đến sức khoẻ người [6] Nấm Kefir thức phổ biến vào năm đầu thập niên 1900 Matxcova Irina Sakharova – người phụ nữ trẻ mang cốc nấm Kefir Matxcova Ngày hầu hết nấm Kefir toàn giới hệ cháu cốc nấm Kefir này, số có nguồn gốc từ nấm Kefir Tây kể Lượng kefiran tạo môi trường nước mía đạt kết cao lượng kefiran tạo môi trường dịch gạo thủy phân (2,27 g/l ) sau 48 ni cấy Trong lượng kefiran sinh tổng hợp môi trường nước mía đạt 4,2 g/l cao gần gấp 1,9 lần lượng kefiran sinh tổng hợp môi trường dịch gạo Vì vậy, quy trình sản xuất kefiran, chúng tơi dùng mơi trường nước mía, mơi trường đơn giản, phong phú, rẻ tiền để đạt kết mong muốn 3.8 Nghiên cứu bổ sung nguồn N vào môi trường nước mía Nhằm nâng cao suất thu nhận kefiran thời gian lên men, thử nghiệm bổ sung hàm lượng ammonium sulphate nguồn N thích hợp vào mơi trường ni cấy Vì mơi trường nước mía, hàm lượng cacbon chủ yếu, cần cung cấp đủ hàm lượng Nitơ cho suất đạt kefiran cao Kết tổng hợp lại bảng đây: Bảng 3.14: Hàm lượng kefiran tổng hợp bổ sung N vào mơi trường nước mía Nồng độ (NH4)2SO4 bổ sung Hàm lượng kefiran (g/l) Ngày Ngày Ngày Ngày 0.5 3.745 4.56 4.42 3.284 3.898 3.41 3.3 1.5 3.823 4.159 4.2 3.8 3.679 3.417 3.683 3.55 vào nước mía (%) Từ kết bảng ta vẽ đồ thị theo hỡnh di õy 64 5.0 0,5% 1% Hàm lợng Kefiran (g/l) 1,5% 4.5 2% 4.0 3.5 3.0 Thời gian nuôi cấy (ngày) Hỡnh 3.12: Đồ thị biểu diễn hàm lượng Kefiran sinh tổng hợp bổ sung Nitơ vào mơi trường nước mía Sau ngày ni cấy có bổ sung hàm lượng Nitơ, kết cho thấy hàm lượng kefiran tăng lên đáng kể cao đạt 4,56 gam sau 48 nồng độ Nitơ bổ sung 0,5% Trên sở đó, để tăng khả sinh kefiran q trình ni cấy ta nên bổ sung nồng độ Nitơ thích hợp 0,5% 3.9 Kết nghiên cứu so sánh ảnh hưởng số nguồn Cacbon đến khả sinh tổng hợp Kefiran Cacbon nguồn dinh dưỡng quan trọng nhu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon thay từ glucose, lactose, saccharose, mơi trường nước mía đến hàm lượng kefiran tạo thành q trình lên men Mơi trường CB thay thành phần C loại đường khác với nồng độ 15% để so sánh với mơi trường ni cấy sử dụng nước mía 15% Tiến hành nuôi cấy điều kiện 33oC với tỷ lệ giống 1% lên men ngày Kết trình bày bảng 3.12 65 Bảng 3.15 So sánh ảnh hưởng số nguồn C đến khả sinh tổng hợp Kefiran Hàm lượng kefiran (g/l) Nguồn C Ngày Ngày Ngày Ngày Nước mía 3.434 4.2 4.08 3.695 Lactose 2.195 2.959 3.845 3.31 Glucose 3.126 2.622 3.97 2.86 Saccharose 3.473 4.113 3.913 3.7 Từ kết bảng ta vẽ đồ thị theo hình Hình 3.13 Đồ thị so sánh ảnh hưởng số nguồn Cacbon đến khả sinh tổng hợp Kefiran Dựa vào bảng 3.12 đồ thị cho thấy, với nguồn Cacbon khác nhau, hàm lượng kefiran sinh tổng hợp môi trường khác Hàm lượng kefiran tạo môi trường nước mía sau ngày đạt lớn (4.2g) so với hàm lượng kefiran tạo sử dụng nguồn cacbon khác Do 66 đó, chúng tơi lựa chọn nguồn nước mía để đưa vào tiến hành thí nghiệm đắn 3.10 Quy trình lên men thu nhận kefiran quy mơ phịng thí nghiệm Mơi trường: mơi trường nước mía nồng độ đường 15 Bx đem hấp trùng nhiệt độ 121oC 30 phút Nước mía sau trùng làm nguội xuống nhiệt độ 33oC Môi trường chủ yếu chứa đường, ngồi cịn có carbon hydrat, axit amin, đặc biệt nhiều axit amin cần thiết, có thành phần quan trọng việc bổ sung chất dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển như: Vitamin B1, B2, B6, C; Các muối vô Canxi, phospho, sắt,… axit hữu có chứa axit succinic, axit fumaric, axit malic, axit citric,…Đây môi trường rẻ tiền, dễ kiếm, dễ pha chế mà đảm bảo lượng kefiran thu lớn Bổ sung men giống: giống Kefir M5 bổ sung vào môi trường với hàm lượng giống 1% Bổ sung nitơ nồng độ 0.5% vào môi trường lên men Lên men: tiến hành lên men nhiệt độ 33oC nhiệt độ tối ưu cho chủng M5 sinh tổng hợp kefiran Thời gian lên men 48 Sau lên men, dịch lên men ly tâm, kết tủa cồn để thu kefiran 67 Mía (NH4)2SO4 Ép lấy nước Hấp tiệt trùng 1210C, 30 phút Lên men 330C, pH = 6, time = 48h 1% Giống Ly tâm 15000 rpm time = 15 Ethanol Kết tủa cồn Sấy khô 50 – 600C Kefiran khơ Hình 3.14 Sơ đồ quy trình thu nhận kefiran quy mơ phịng thí nghiệm 3.11 Kết đánh giá độ tinh sản phẩm Sản phẩm thu hồi sau kết tủa cồn 50% hỗn hợp kefiran số polysaccharit khác tổng hợp trình lên men Ngồi ra, cịn số protein khác bị kết tủa Sau ly tâm thu hồi sản phẩm ta thu sản phẩm dạng nhão, sấy khơ nhiệt độ q cao chúng bị hồ hóa biến tính làm cho sản phẩm trở nên cứng khó hịa tan trở lại nước Để làm khô sản phẩm, tốt ta sấy nhiệt độ 50 – 60oC đến hàm ẩm lại khoảng -10% Sản phẩm sau 68 khô phải bảo quản túi lọ có nắp đậy kín tránh cho sản phẩm bị tái ẩm trở lại bảo quản lâu dài Muốn xác định mức độ tinh khiết sản phẩm, mang sản phẩm khô sấy lại đến trọng lượng khơng đổi, sau cân lấy 0,1g hòa tan 10ml nước cất Đun sơi dịch 10 phút để kefiran hịa tan hồn tồn Dựa vào đồ thị chuẩn mà ta tính mức độ tinh sản phẩm Sản phẩm chúng tơi thu có độ tinh khiết 96% Hình 3.15 Hình ảnh sản phẩm Kefiran sấy khơ có độ tinh 96% 69 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu đề tài thu kết tốt tương đối phù hợp với nghiên cứu trước nhiều tác giả, đến kết luận sau: Phân lập M5 chủng có khả sinh tổng hợp kefiran cao (1,4g/l) so với chủng vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir Đề tài xác định chủng thuộc loài Lactobacillus, chủng gần với lồi Lb Plantarum Xác định mơi trường lên men thích hợp tối ưu cho trình lên men thu nhận kefiran mơi trường nước mía với nồng độ đường 15Bx có bổ sung 0.5% N Qua nghiên cứu tối ưu quy hoạch thực nghiệm cho thấy yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến khả thu nhận kefiran: + Nhiệt độ lên men: 33.30C + Thời gian lên men: 46.33 (h) + Nồng độ đường: 15.23 Bx Khi giữ pHmt = 6, tỷ lệ tiếp giống 1% cho hàm lượng kefiran thu > g/l (đạt tới 4.56 g/l) Từ kết nghiên cứu tối ưu chúng tơi đưa qui trình lên men thu nhận kefiran quy mơ phịng thí nghiệm: mơi trường lên men, bổ sung men giống, trình lên men Chúng tơi thực bước tính chế phẩm đánh giá độ tinh đạt 96% Chế phẩm sấy khô nhiệt độ từ 50 – 60 0C, đến hàm ẩm đạt – 10% 70 KIẾN NGHỊ Đây đề tài có nhiều triển vọng ứng dụng vào thực tế đời sống sản xuất Đề nghị nghiên cứu sâu triển khai đề tài quy mô pilot công nghiệp 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phan Văn Ty, (1997), Vi sinh vật học NXB Giáo dục – Trang 176-189, 224-230 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, (1996), Vi sinh vật học NXB Giáo dục – Trang 133-138 Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hồng, (2002), Cơng nghệ chế biến sữa sản phẩm sữa Hà Nội: NXB Khoa Học Kỹ Thuật Lâm Xuân Thanh, (2003), Giáo trình cơng nghệ chế biến sữa sản phẩm từ sữa Hà Nội: NXB Khoa Học Kỹ Thuật Lê Văn Việt Mẫn, (2004), Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa.TPHCM: NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM Đặng Thị Cẩm Tú, (2006), Nghiên cứu chế biến sữa kefir – Luận Văn Tốt Nghiệp, An Giang: Khoa Nông nghiệp – Trường ĐH An Giang, trang 1528 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, (1992), Hóa sinh học NXB Giáo dục – Trang 12-64, trang 61-75, trang 154-173 Aly Savadogol, Cheik A T Ouattaral, Paul W Savadogo, Nicolas Barro, Aboubacar S Ouataral, Alfred S Traore, (2004), Indentification of exopolysaccharit – producting lactic acid bacteria from Burkina Faso fermented milk samples African Journal Biotechnology Vol (3), pp 189194 Barbara Vu, Miao Chen, Russell J Crawford and Elena P Ivanova, (2009), Bacterrial Extracellular Polysaccharides Involved in Biofilm Formation Molecules, 14, 2535-2554 72 10 Benjamas Cheirsilp, (2006), Simulation of kefiran production of Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985 in fed-batch reactor Songklanakarin J Sci, Technol, 28(5): 1059 – 1069 11 Burcu Ünsal, (2008), Phylogenetic Analysis of Bacterial Communities in Kefir by Metagenomics Master of in Molecular Biology and Genetics 12 Chittra Yeesang A Supitchaya Chanthanchum, Benjamas Cheirsilp, (2008), Sago starch as a low-cost carbon source for exopolysaccharide producion by Lactobacillus kefiranofaciens World J Microbiol Biotechnol 24:1195 – 1201 13 Claude P Champagne, Nancy J Gardner, Christophe Lacroix, (2007), Fermentation technologies for the production of exopolysaccharide synthesizing Lactobacillus rhamnosus concentrated cultures Electronic Journal of Biotechnology ISSN, 10(2): 0717 – 3458 14 D C Witthuhn, L M T Dicks, (2006), Bacteriocins and Bacteriocin Producers present in Kefir and Kefir Grains Master of science in food science, Stellennosch University 15 E Simova, D Beshkova, A Angelov, Ts Hristozova, G Frengova and Z Spasov, (2002), Lactic acid bacteria and yeasts in kefir grains and kefir made from them Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 28, 1–6 16 Farnworth E R, (2006), Kefir – A Complex Probiotic Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods, Volume 2, Issue 1,(An online, peerreviewed journal hosted on www.foodsciencecentral.com.) 17 Ginka Frengovaa, Emilina D Simovaa Dora M Beshkovaa and Haruhiko Yokol, Takashi Watanabe, and Yoshitsugu Fuji, Takahiro Toba and 73 Susumu, (1990), Isolation and Characterization of PolysaccharideProducing Bacteria from Kefir Grain, Jod of Dairy Scimce, 73(7) : 1684 – 1689 18 Ginka I Frengova, Emilina D Simova, Dora M Beshkova and Zhelyasko I.Simovb, (2002), Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria of Kefir Grains, Z Naturforsch, 57, 805 – 810 19 Hiroaki Maeda, Xia Zhu, Shiho Suzuki, Kiyoshi Suzuki, and Shinichi Kitamura, (2004), Structural Characterization and Biological Activies of an Exopolysaccharide Kefiran Produced by Lactobacillus kefiranofaciens WT-2BT, Journal agricultural and food chemistry 20 Kbacnhikov E.U.Nhetrepenko O.A, (1975), Mololnokisluc baktepii inhitritri ik ispolzobanleia izg, “Nayka” M (Tiếng Nga) 21 Marie–Pierre St-Onge, Edward R Farnworth, Tony Savard, Denise Chabot, Akier Mafu and Peter JH Jones, (2002), Kefir consumption does not alter plasma lipid levels or cholesterol fractional synthesis rates relative to milk in hyperlipidemic men: a randomized controlled trial, BMC Complementary and Alternative Medicine 22 Micaela Medrano, Pablo Fernando Pérez, Analía Graciela Abraham, (2008), Kefiran antagonizes cytopathic effects of Bacillus cereus extracellular factors, International Journal of Food Microbiology 122,1–7 23 Ok- Kyoung Kwon, Kyung-Seop Ahn, Mee-Young Lee, So-Young Kim, Bo-Young Park, Mi-Kyoung Kim, In-Young Lee, Sei-Ryang Oh, and Hyeong-Kyu Lee, (2008), Inhibitory Effect of Kefiran on Ovalbumininduced Lung Inflammation in a Murine Model of Asthma, Arch Pharm Res 31(12) : 1590-1596 74 24 Payot.T, (1998), Developpement d'un procede integer de production et d'extration d'acide lactique par un bacille thermophile – These Doctorat – Institut National Dolytechnique de Lorraine - E'cole National Supe'rieure d'Agronomie et des Industries Alimentaires) 25 Peter H.A.Sneath – N.S.Mair, M.E.Sharper J.G.Holt, (1986) Bergey's manual of systematic bacteriology – Williams & Wilkins , : p.1043 – 1081 – p.1209-1221 26 Rogosa.M.Franklin.J.G and Perry.K.D, (1961), Correlation of the vitamins requirements with cultural and biochemical characters of Lactobacillus spp, J Gen Microbiol, 25, 473-482 27 Roissart H – Luquet F.M, (1994), Bacte'ries Lactiques – Lorica 28 S Badel, T Bernardi, P Michaud, (2010), New perspectives for Lactobacilli exopolysaccharides Biotechnology Advances, 29, 54 – 66 29 Semih Ot-es and Oz-em Cagindi, (2003) Kefir: A Probiotic DairyComposition, Nutritional and Therapeutic Aspects, Pakistan Journal of Nutrition, 2(2): 54-59 30 Zehra Nur Yuksekdag and Belma Aslim, 2008, Influence of different Carbon Sources on Exopolysaccharide Production by Lactobacillus delbrueckii Subsp Bulgaricus (B3, G12) and Streptococus thermophilus (W22) Brazilian Archives Of Biology and Technology, 51(3) : 581- 585 31 Zhelysko I.Simovb, (2002), Exopolysaccharide Produced by Lactic Acid Bacteria of kefir Grains, Z Naturforsh 57c, 805-810 32 Zhu Zhi, Liao Xian-yan, Du Guo-cheng, Chen Jian, (2008), Two-stage Temperature Controlling Strategy for Kefiran Production in the Culture by 75 Lactobacillus kefiranofaciens, The Chinese Journal of Process Engineering, 8(1): 144-147 33 Pablo Sebastian Rimada, Analia Graciela Abraham, (2003), Comparative study of determine the exopolysaccharide produced by kefir grains in milk and whey, EDP Sciences, 79-87 34 http://www.turmerichealthbenefits.net/2011/09/kefir-health-benefits/ 35 http://users.sa.chariot.net.au/~dna/kefirpage.html#order 36 http://www.timelesshealth.net/kefir/allaboutkefir.html 37 http://harmoniousbelly.com/2010/03/cultured-and-fermented-foodsyogurt-kefir-kombucha/ 38 http://www.life-enthusiast.com/nutrition/probiotics/kefir.htm 76 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu Kefir lợi ích 1.1.1 Hạt nấm kefir nguồn gốc chúng 1.1.1.1 Nguồn gốc hạt nấm kefir 1.1.1.2 Hạt nấm kefir 10 1.1.1.3 Đặc điểm hình thái hạt nấm Kefir 12 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Kefir giới Việt Nam 13 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu Kefir giới 13 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu nấm kefir Việt Nam 14 1.1.3 Các trình lên men Kefir 15 1.1.3.1 Phương pháp lên men truyền thống 15 1.1.3.2 Phương pháp lên men quy mô công nghiệp 15 1.1.4 Những lợi ích sử dụng Kefir 16 1.2 Hệ vi khuẩn lactic hạt nấm Kefir khả thu nhận Kefiran 18 1.2.1 Vi khuẩn Lactic 18 1.2.1.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Lactic 18 1.2.1.1.1 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 18 1.2.1.1.2 Quá trình trao đổi chất vi khuẩn lactic 19 1.2.1.1.3 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến trình trao đổi chất 20 1.2.2 Hệ vi khuẩn lactic hạt nấm kefir vai trò chúng 22 1.2.3 Vi khuẩn lactic lên men sản xuất kefiran 24 1.3 Exoplolysaccharit hiểu biết chung Kefiran 24 1.3.1 Exopolysaccharit 24 1.3.1.1 Chức dạng đặc trưng EPS 25 1.3.1.2 Một số EPS đặc trưng 26 1.3.2 Tổng quan Kefiran từ chủng Lactobacillus 30 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Nguyên liệu 33 77 2.1.1 Vật liệu hóa chất 33 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 33 2.1.2.1 Môi trường MRS 33 2.1.2.2 Mơi trường nước mía 33 2.1.2.3 Môi trường nuôi cấy dịch gạo (PYG10) 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp EPS 34 2.2.2 Chuẩn bị môi trường nước mía 35 2.2.3 Thủy phân dịch gạo 30% 35 2.2.4 Phương pháp Anthrone 36 2.2.5 Phương pháp lên men sinh tổng hợp Kefiran 38 2.2.6 Phương pháp thu nhận định lượng Kefiran 38 2.2.7 Phương pháp tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm 41 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Kết phân lập chủng giống sinh tổng hợp kefiran từ hạt kefir 42 3.2 Xác định tên loài chủng vi sinh vật phân lập từ hạt kefir 45 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, pH môi trường đến khả sinh tổng hợp Kefiran q trình ni cấy mơi trường nước mía 48 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường saccaroza nước mía đến hàm lượng Kefiran tạo q trình ni cấy 51 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men đến lượng Kefiran sinh tổng hợp mơi trường nước mía 53 3.6 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận kefiran từ chủng Lactobacillus phần mềm Design Expert (DX7) 55 3.6.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm 55 3.6.2 Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp Kefiran 60 3.7 So sánh khả sinh tổng hợp kefiran tạo mơi trường nước mía dịch gạo thủy phân 61 3.8 Nghiên cứu bổ sung nguồn N vào mơi trường nước mía 64 3.9 Kết nghiên cứu so sánh ảnh hưởng số nguồn Cacbon đến khả sinh tổng hợp Kefiran 65 3.10 Quy trình lên men thu nhận kefiran quy mơ phịng thí nghiệm 67 3.11 Kết đánh giá độ tinh sản phẩm 68 KẾT LUẬN 70 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72  78 ... kefiran từ chủng phân lập nhiệt độ, pH môi trường, nguồn C, N, thời gian lên men, … - Đưa quy trình lên men tối ưu thu nhận kefiran quy mơ phịng thí nghiệm - Nghiên cứu phương pháp thu nhận kefiran. .. cao - Nghiên cứu phương pháp phân tích Kefiran - Nghiên cứu tối ưu mơi trường ni cấy thích hợp, rẻ tiền từ nguồn ngun liệu nước - Nghiên cứu tối ưu số điều kiện ảnh hưởng đến suất thu nhận kefiran. .. tổng hợp kefiran số chủng vi khuẩn lactic từ hạt kefir Chủng Nguồn gốc Kefiran môi Vi sinh Kefiran màng Kefiran tổng trường (g/l) tế bào (g/l) (g/l) M1 Hạt kefir 0.212 0.106 0.318 M2 Hạt kefir 0.266