SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRUNG TAM KIEM TRA VSTYTWII
TP HỒ CHÍ MINH TP HO CHi MINH
BAO CAO NGHIEM THU
TEN DE TAI:
NGHIEN CUU TOI UU HOA QUY TRINH VA UNG DUNG PHƯƠNG PHÁP FPT XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH TÒN DƯ TRONG THỊT, TRƯNG, SỮA
CHU NHIEM DE TAI: TS NGUYEN TH] HOA LY
Trang 2NAM 2004 SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRUNG TAM KIEM TRA VSTYTWIL ` "TP, HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MỊNH TEN DE TAI:
Trang 3
LỜI CÁM ON
Trân trọng cảm ơn
~ Sở Khoa Học Công Nghệ Tp.HCM đã cấp kinh phí để thực hiện dé tai
—— PGS.TS Trần Đình Từ, PGS.TS Nguyễn Linh Thước dã góp nhiều ý
kiến giúp đỡ hoàn thiện để cương nghiên cứu và báo cáo
— "Th§ Đinh Minh Hiệp Chuyên viên Quản lý khoa học công nghệ Sở KIICN Tp.HCM đã giúp đỡ, động viên chúng tôi trong quá trình thực
hiện đề tài — —
— — Xin cám ơn chỉ cục thú y Tp.HCM, Trung tâm Thú Y Vùng Tp.HCM — Khoa CNTY trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, đã giúp đỡ chúng tôi —_ “Trung tâm phân tích thí nghiệm Sở Khoa Học Công Nghệ TP đã nhận
xét nghiệm mẫu cho đê tải
Chú nhiệm đề tài TS NGUYEN THI HOA LY
Trang 4
CHƯƠNG I: MO DAU Lt TÍNH CÁP THIẾT CŨA ĐÈ TÀI .Aesrsxkesssreser wal 12 — Ý NGHĨA THỰC TẾ I3 — Ý NGHĨA KHOA HQC CUA DE TAL L4 — MỤC TIÊU CỦA ĐẺ TÀI CHUNG I: TONG QUAN VE NGHIEN CUU TON DU’ KHANG SINH 2.1 KHÁNG SINH Jesassceneccensecesneeceanecsseereves 2.2 GIỚI HẠN TÒN DƯ KHANG SINH TRONG THIT
2.2.1 Các yếu tế ảnh hưởng đến tồn dư kháng sinh
222 Ảnh hưởng của du lượng kháng sinh đôi với sức khỏe cộng đông
: ‘
2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯƠNG KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM
2.3.1 Sac ky (Chromatography)
2.3.2 Phương pháp mién dich enzyme (ELISA) 2.3.3 Miễn dịch phóng xạ (Radio Immuno Assay)
2.3.4 Phương pháp sử dung vi sinh vat: FPT (Frontier Post tesf) -s+
24 CÁC NGHIÊN CỨU VẺ DƯ LƯỢNG KHẲNG SINH TRONG THIT GIA SÚC, GIÁ CẢM 12
2.4.1 Nghiên cứu trong nước 12
2.4.2 Nghiên cứu ở nước ngoà
CHƯƠNG HI: NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CỨU + seSeererrrirereareeree 15 BAL ĐỊA ĐIỂM ì ì eeeeerenreennrrittrrrieeereeeeerreterrelrttireere110007 15
3.2 THỜI GIAN THÍ NGHIỆM 3.3 NÓI DUNG VÀ BÓ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.4 PHƯƠNG PHÁP 3.4.1 _ Nguyên lý của phương pháp FPT 3.4.2 Vật liệu 3.5 SƠ ĐÓ XÁC ĐỊNH KSTD TRÔNG SẢN PHẨM ĐỘNG VẬTT ccecsssrreerrrrrrrrerirrrrrire 27 3.6 XỬ LÝ SỞ LIỆU CHƯƠNG IV: KÉT QUÁ THẢO LUẬN 4.1 TINH HiNH SAN XUẤT, NHẬP KHẨU VÀ PHAN PHOI KHANG SINH TAI TP HO cHi MINH 29
4.1.1 Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các trại chăn nuôi tại Tp Hồ Chí Minh, Bình
Dương Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu
Trang 5
4.1.2 Phân tích về cơ sở của việc lựa chọn kháng sinh trong các hộ chăn nuôi -erreeerrrrrrr 35
42 TỎLƯU HÓA QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH KHÁNG SINH TÒN DƯ
4.2.1 'Thí nghiệm I Lựa chọn môi trường nhạy cam
4.2.04 Lựa chọn môi trường cho Penicillin
42.12 Lựa chọn môi trường cho Streptomycin 4.2.1.3 Lựa chọn mỗi trưởng cho Tetracyclin
4.2.1.4, Lựa chọn môi trường cho Sulfamethazin 4.2.1.5 Lựa Chọn HÔI t"ƯỜnNG cho Erythromycin
4.2.1.6 Lựa chọn môi trưởng cho Flumequin, Enrofloxacin
4.2.2 Thi nghiém 2 Chon nhiét độ và thời gian thích hợp cho phương pháp - - -„42
43 BẢN ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH TỒN DƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP FPT
443.1 Hân định lượng trên mẫu thịt tÂm kháng sỉnh 4432 Bán định lượng kháng sinh tổn dư trên sữa gẫy 4.3.3 — Bán dịnh lượng kháng sinh tôn dư trên mẫu trừng
4.4, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH HƯỚNG CÁC KHÁNG SINH KHI PHÓI HỢP CÁC MÔI TRƯỜNG50
4.4.1 Định hướng kháng sinh phát hiện 0 4.4.2 Kết quả kiểm tra KSTD mẫu bán định lượng so với HPUC
4.4.3 “T¡ lệ mẫu đương tính trong, kiểm tra thực tế bằng phương pháp ví sinh vat 444, Két qua mau kiém tra thuc tế so với HPLC «-~ ceeeerrrrerrrierr 4.5 SẢN XUẤT THỨ BỘ FPT VÀ XÁC ĐỊNH DIEU KIEN BAO QUAN
4.6 CHUYEN GIAO KY THUAT CHO CO so
4.6.1 Tập huấn cho cán bộ Chỉ cục trong vùng về phương pháp kiêm tra tôn dư kháng sinh trong thịt, trứng, sữa
4.6.2
4.7, XÂY DỰNG QUY TRINH KIEM TRA TON DU KHANG SINH
4.7.1 Đối tượng và phạm vỉ áp đdụng àì.ceerrrrrrrrrrrrrm
4.7.2 Quy trình định tính và bản định lượng kháng sinh tồn dự
Trang 6
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 3.1 Vĩ khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 trên môi trường GTS Hình 3.2 Vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 11778 trên môi trường TS
Hình 3.3 Vi khuẩn E.coli RIK 144 trên môi trường ỚTS
Hình 3.4 Vì khuẩn S.aureus ATCC 6538P trên môi trường GTS Hình 3.5 Chủng các vi khuẩn gốc trên môi trường thạch ban cé thé Hinh 3.6 Ching cac vi khuẩn gốc đông khô
Hình 3.7 Ly tâm vi khuẩn nhạy cảm
Hình 3.8 Thao tác trích nước thịt kiểm tra KSTD
Hình 3.9 Thao tác nhỏ nước thịt vào các giếng trên đĩa thạch Hình 3.10 Phản ứng trên môi trường 15787/pH7.2/Bs
Hình 3.11 Mẫu kháng sinh dương tính trên thịt
Trang 7
Bang 3.1 Bang 4.1 Bang 4.2 Bang 4.3 Bang 4.4 Bang 4.5 Bang 4.6 Bang 4.7 Bang 4.8 Bang 4.9 Bang 4.10 Bang 4.11 Bang 4.12 Bang 4.13 Bang 4.14
DANH MUC CAC BANG
Kháng sinh lựa chọn thí nghiệm trên các nhóm
Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các trại chăn
nuôi
Các loại kháng sinh đang được sử dụng ở các trại chăn nuôi gà Các loại kháng sinh dang dược sử dụng ở các trại chăn nuôi heo Các loại kháng sinh đang được sử dụng ở các trại bò
Cơ sở của việc lựa chọn kháng sinh trong điều trị
Kích thước vòng vành khăn của 3 loại kháng sinh nhóm beta lactam trên các môi trường ở 37C / 16 giờ (nỗng độ 10C)
Kích thước vòng vành khăn của streptomycin va gentamycin trén
các môi trường ở 37C / 16 gid (nồng độ 10C)
Kích thước vòng vành khăn của tetracyclin trên các môi trường ở
37°C / 16 gid (néng dd 10C)
Kích thước vòng vành khăn của sulfamethazin trên các môi
trường ở 37°C/ 16 giờ (nồng độ 10C)
Kích thước vòng vành khăn của erythromycin và tylosin trên các môi trường ở 37°C/ l6 giờ (nông độ 10C)
Kích thước vòng vành khăn của flumequin và enrofloxacin trên - các môi trường ở 37”C/ l6 giờ (nồng độ 10C)
KTVVK trên 2 mức nhiệt độ 37°C và 30°C
Kết quả bán định lượng trên mẫu thịt
Kết quả bán định lượng KSTĐ trên sữa gay
Trang 8
Bang 4.15 Bang 4.16 Bang 4.17 Bang 4.18 Bang 4.19 Bang 4.20 Bang 4.21 Bang 4.22 Bang 4.23
Két qua ban dinh lugng KSTD trén tring ga Két qua ban dinh lugng KSTD trên mẫu trứng
KTVVK của các kháng sinh trên 6 môi trường Ở nồng độ phát
hiện thấp nhất trên thịt
KTVVK của các kháng sinh ở nồng độ từ thấp đến cao khi phối
hợp trên 5 môi trường đã chọn
Định hướng kháng sinh phát hiện khi phối hợp 5 môi trường, So sánh kết quả bán định lượng KSTD bằng FPT và HPLC Tï lệ mẫu dương tính kiểm tra thực tế bằng FPT
Kết quả kiểm tra bằng HPLC sau khi định hướng kháng sinh tồn
dư
Kết quả theo dõi độ nhạy của bộ FPT
Trang 9
DANH MUC CAC BIEU DO
Biéu dé 4.1 Tinh str dung khang sinh trong trai ga Biểu đồ 4.2 Tình sử dụng kháng sinh trong trại heo
Biển đồ 4.3 Kích thước vòng vành khăn trên các môi trường Biểu đồ 4.4.KTVVK của Sulfamethazine trên các môi trường
Biểu đồ 4.5 KTVVK của Erythromycin và Tylosin trên các môi trường Biểu đồ 4.6 KTVVK của Flumequin và Enrofloxacin trên các môi trường
Biểu đỗ 4.7 KTVVK của peniciilin ở 2 mức nhiệt độ
Biểu đồ 4.8 T¡ lệ (%) mẫu dương tính theo thời gian
Biểu đồ 4.9 T¡ lệ mẫu dương tính kiểm tra thực tế bằng phương pháp FPT
Trang 10
CAC TU VIET TAT
ELISA:Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay: Mién dich hap thu nối kết enzym
FAO : Food and Argriculture Organisation: Tổ chức nông lương thể giới FPT : Frontier Post Test
MRL :Maximum Residue Limit: gidi han tn dư tối đa HPLC: High Performance Liquid Chromatoghrapphy Ul: International Unit: đơn vi quéc té KTVVK: kích thước vòng vành khăn VSV: Vi sinh vat KSTD: khang sinh ton du KHCN: khoa học công nghệ BS: Bacillus subtilis BC: Bacillus cereus ML: Micrecoccus luteus EC: E.coli SA: Staphylococcus aureus VK: Vi khuan
ADI: Acceptable daily intake -lượng ăn vào hàng ngày ( pe/Ke trong lugng )
Trang 11
n: Số lượng mẫu
ND : Not detected
PPB: Parts per billion (10° )
PPM: Parts per million (10° )
NA: Nutrient agar
PCA : Plate count agar MHA :Mueller Hinton Agar
MT N° 11: Antibiotic N° 11 medium MT N° 5: Antibiotic N° 5 medium TSA :Tryptone Sojbean agar
AOAC : Association of official Analysis Chemical
Trang 12
CHUONG I: MO DAU
1.0) TINH CAP THIET CUA DE TAI
Vấn đề kháng sinh tồn dư trong thực phẩm đang là mỗi lo ngại cho cơ quan quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm (ANVSTP) và người tiêu dùng bởi vì nó không chí ảnh hưởng dến chất lượng sản phẩm, sức khỏe cộng dồng mà nó còn là rào cản khắc nghiệt dỗi với các doanh nghiệp xuất khâu sản phẩm dộng vật sang EU và Mỹ Năm 2002, Trung Quốc đã bị cấm xuất khẩu thủy sản sang EU sau cuộc thanh tra của tổ chức an toàn vệ sinh thực phẩm Châu Âu Lượng kháng sinh tồn dữ trong thịt gia súc gia cằm bị ảnh hưởng bởi điều kiện vệ sinh môi trường, lượng kháng sinh bỗ sung vào khẩu phần thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y phòng trị bệnh, quy trình kỹ thuật chăn nuôi và chế biến
Trong những năm vừa qua, một số nghiên cứu về kháng sinh tồn dư trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được công bố Đây là phương pháp hiện đại có độ chính xác cao, được cả thế giới công nhận Tuy nhiên ở Việt Nam, do đặc điểm người chăn nuôi sử dụng rất nhiều chủng loại kháng sinh trong thức ăn và điều trị gia súc, nguồn gia súc lại được thu gom từ nhiều nơi khác nhau đưa về lò giết mỗ, do đó việc lựa chọn kháng
sinh để xét nghiệm bằng HPLC khó khăn, đôi khi có sự nhầm lẫn chưa kể giá
xét nghiệm bằng phương pháp này khá cao, không thể thực hiện tại các vùng xa, thiếu trang thiết bị Song song với phương pháp HPLC, người ta còn dùng phương pháp FPT để xác định kháng sinh tồn dư trong thịt, gan và một số loại sản phẩm động vật khác Ưu điểm của phương pháp này là rẻ tiền, đơn giản, dễ áp dụng, có thể áp dụng rộng rãi cho các Chỉ cục thú y trong công tác kiểm
sốt an tồn vệ sinh thực phẩm
Trang 13Đề tài nhắm mục dich: 1.2 Tối ưu hóa quy trình định tính và bán định lượng kháng sinh tồn dư bằng phương pháp FT
"Dùng phương pháp FPT định hướng một số nhóm kháng sinh tồn dư trong thịt trước khi định lượng bằng phương pháp HPLC
Chuyển giao kỹ thuật FPT cho các địa phương sử dụng trong công tác kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm
Xây dựng quy trình kiểm tra kháng sinh tôn dư trong sản phẩm dộng vật Ý NGHĨA THỰC TẾ
Việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở nước ta khả phố biến dẫn dến việc kiêm tra, kiểm soát kháng sinh phức tạp
EPT test để định tính và bán định lượng kháng sinh tồn dư trong thịt gia
súc, gia cầm rất thích hợp với các phòng thí nghiệm của các Chỉ cục bởi
những ưu điểm nổi bật: đễ sử dụng, độ chính xác khá cao
FPT test còn có tác dụng như một lưới sàng để định hướng các nhóm kháng sinh cần kiểm tra băng HPLC trong trường hợp không biết chính xác loại kháng sinh nào được sử dung cho gia súc
Không chỉ ở Việt Nam, nhiều nước tiên tiến trên thế giới như Singapore,
Đức, Pháp cũng sứ dụng FPT để sàng lọc trước khi dùng HPLC Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐÈ TÀI
Đề tài không phải là một phát hiện mới về EPT bởi vì đã có nhiều tác giả
trong và ngoài nước sử dụng phương pháp này để phát hiện tồn dư kháng sinh trong thực phẩm (thịt, trứng, thủy sản)
Trang 14
1.4
Mỗi tác giả, tùy điều kiện thực tế của nước mình mà lựa chọn một số môi trường nhất định cho việc xác định những loại kháng sinh quốc gia đó sử
dụng Khác với Việt Nam, các nước phát triển sử dụng kháng sinh phải tuân theo những quy định rất nghiêm ngặt về liều lượng, chủng loại
kháng sinh được sử dụng
Từ trước tới nay chưa có tác giả nào nghiên cứu bán định lượng tồn dư kháng sinh bằng FPT, vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu hầu xác định lượng kháng sinh tồn dư thấp nhất mà phương pháp có thể phát hiện
dược
MỤC TIỂU CỦA ĐÈ TÀI
Xác định nghiệm thức: loại môi trường, vi khuẩn nhạy cảm, nhiệt độ,
thời gian thích hợp cho phương pháp FPT
Tạo ra bộ FPT dùng để định tính và bán định lượng ton du khang sinh
trong thịt, trứng, sữa, đồng thời định hướng loại kháng sinh cần định
lượng bằng phương pháp HPLC
Xây dựng được quy trình xác định kháng sinh tổn dư trong sản phẩm động vật cho các phòng thí nghiệm kiểm sốt an tồn vệ sinh thực phẩm
Trang 151.4
Mỗi tác giả, tùy điều kiện thực tế của nước mình mà lựa chọn một số môi
trường nhất định cho việc xác định những loại kháng sinh quốc gia đó sử dụng Khác với Việt Nam, các nước phát triển sử dụng kháng sinh phải tuân theo những quy định rất nghiêm ngặt về liều lượng, chủng loại
kháng sinh được sử dụng
Từ trước tới nay chưa có tác giả nào nghiên cứu bán định lượng tồn dư kháng sinh bằng FPT, vì vậy chúng tôi tiễn hành nghiên cửu hầu xác định lượng kháng sinh tồn dư thấp nhất mà phương pháp có thể phát hiện
được
MỤC TIỂU CỦA ĐỆ TÀI
Xác định nghiệm thức: loại môi trường, vi khuẩn nhạy cảm, nhiệt độ,
thời gian thích hợp cho phương pháp FPT
Tạo ra bộ FPT dùng để định tính và bán định lượng tồn dư kháng sinh
trong thịt, trứng, sữa, đồng thời định hướng loại kháng sinh cần định lượng bằng phương phap HPLC
Xây dụng được quy trình xác định kháng sinh tồn dư trong sản phẩm động vật cho các phòng thí nghiệm kiểm sốt an tồn vệ sinh thực phẩm
Trang 16CHƯƠNG II: TONG QUAN VE NGHIEN CUU TON DU KHANG SINH 2.1 KHANG SINH
Theo quan niệm mới ngày nay, thuốc kháng sinh là tất cả những chất tóa học, không kế nguồn gốc (chiết suất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, án tổng hợp hay tổng hợp) có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẫn
bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) bằng cách tac dong shuyén biét trén mot giai doan chuyén hóa cần thiết của vi sinh vật
Theo Puyt (1996), kháng sinh được phân loại thành các nhóm sau: ~ Nhom beta-lactamin: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin — Nhom aminoglycosid: streptomycin, gentamycin, kanamycin,
neomycin
— Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin
— Nhóm tetracycln: tetracyclin, oxytetracycln, chỈotetracyclin, doxycyclin
— Nhom phenicol: chloramphenicol, thiamphenicol — Nhom macrolid: erythromycin, spiramycin, tylosin
~_ Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolid: lincomycin, virginiamycin
—_ Nhóm sulfamid: sulfaguanidine, sulfacetamide, sulfamethazine
— Nhóm diaminopyrimidin: trimethoprim, diaveridin, pyrimethazine — Nhom quinolon: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin, enrofloxacin
— Nhóm nitrofuran: nitrofurazol, furazolidon, furaltadon
— Cac nhom khac: glycopeptide (vancomycin), pleuromutilin (tiamulin), poly-ether ionophore (monensin, salinomycin
Trang 17
chuyển hoá và thải trư
e Dugc động học của các chất kháng sinh UZ Hap thu ¬ As TM | Thuốc > Mau Mô ase protein Dự trữ Protein — <> + Thuốc (T) cư <_ ⁄ M Chất chuyển hoá(M) T+ * ona Chuyển hoá Thải trừ : : «Sự hấp thu kháng của kháng sinh
Sơ dễ 2.1 Sự phân bố và chuyển hoá kháng sinh trong cơ thể động vật (Đào Văn Phan, 2003)
sinh
dễ hấp thu hơn dạng dầu, dịch keo hoặc dạng cứng
Dược động học nghiên cứu các quá trình chuyển vận của kháng sinh
từ lúc hấp thu vào cơ thể cho đến khi bị thải trừ hoàn toàn Theo Đào Văn
Phan thì quá trình dược động học gồm các quá trình: hấp thu, phân bố,
Tác
dụng
Hấp thu là sự vận chuyển kháng sinh từ nơi dùng kháng sinh vào máu để rồi đi khắp cơ thể tới nơi tác dụng Như vậy sự hấp thu phụ thuộc vào:
— D6 hoa tan của kháng sinh: kháng sinh dùng dưới dạng dung dịch nước
Trang 18
— Néng d6 cha khang sinh: nông độ càng cao hấp thu càng nhanh
—_ Tuần hoàn tại vùng hấp thu: càng nhiều mạch máu thì sự hấp thu càng
nhanh
—_ Diện tích vùng hấp thu: phổi, niêm mạc ruột có diện tích lớn, hấp thu nhanh
e Sự phân bố kháng sinh
Sau khi hấp thu vào máu, một phần chất kháng sinh sẽ gắn vào protein (albumin) của huyết tương, phần kháng sinh tự do không gắn vào protein sẽ qua được thành mạch để chuyển vào các mô, vào nơi tác dụng, vào mô dự trữ hoặc bị chuyển hoá rồi thải trừ Giữa nồng độ thuốc tự do và
phức hợp protein - kháng sinh luôn có sự cân bằng động
Quá trình phân phối kháng sinh phụ thuộc vào tuần hoàn khu vực, tùy
theo sự tưới máu
Hai loại yếu tố có ảnh hưởng đến sự phân bố kháng sinh trong cơ thể:
—_ Về phía cơ thể: tính chất màng tế bio, mang mao mạch, số lượng vị trí gắn thuốc và pH của môi trường
—_ Về phía kháng sinh: trọng lượng phân tử, tỉ lệ tan trong nước và trong lipid, tinh acid hay base, độ ion hóa, ái lực của kháng sinh với thụ thể
(receptor)
e Sự chuyển hoá kháng sinh trong co thể động vậi
Mục đích của sự chuyển hoá kháng sinh là để thải trừ chất lạ (kháng
sinh) ra khỏi cơ thể Kháng sinh là những phân tử tan dược trong chất béo
Trang 19
(lipid), không bị ion hoá, dễ thấm qua màng tế bào, gắn vào protein huyết tương và được giữ lại trong cơ thể Muốn thải trừ, cơ thể phải chuyển hoá những kháng sinh này sao cho chúng trở thành những phân tử có cực, dễ bị ion hoá do đó íL tan trong mỡ, khó gắn vào protein, khó thấm vào tế bào, và vì thế tan nhiều hơn ở trong nước, dễ bị thải trừ
Nơi chuyển hoá và các cnzyme chính xúc tác cho chuyển hoá — Niêm mac rudl protease, lipase, decarboxylase
— Huyét thanh: esterase
—_ Phổi: oxydase
—_ Vị khuẩn ruột: reductase, decarboxylase
—_ Hệ thần kinh trung udng: monoamine oxydase, decarboxylase
— Gan là nơi chuyển hoá chính, chứa hầu hết các enzyme tham gia
chuyển hoá chất kháng sinh
e Sự thải trừ kháng sinh
Kháng sinh được thải trừ dưới dạng nguyên chất hoặc đã bị chuyển hoá
— Thải trừ qua thận: là đường thải trừ quan trọng nhất của các thuốc tan
trong, nước
— Thai trv qua mat: sau khi chuyển hoá ở gan, các chất chuyển hoá sẽ thải trừ qua mật để để vào ruột rồi theo phân ra ngoài Phần lớn sau
khi bị chuyển hoá thêm ở ruột sẽ được tái hấp thu vào máu để rồi được
thải trừ qua thận
— Thải trừ qua sữa: thường là các chất tan mạnh trong lipid, vì sữa có tính acid yếu hơn huyết tương Các thuốc có tính kiểm yếu có thể có nồng
Trang 20
độ trong sữa hơi cao hơn trong huyết tương và các thuốc có tính toan yếu thì sẽ có nồng độ trong sữa thấp hơn trong huyết tương
— Thai trừ qua các đường khác: thuốc có thể được thải trừ qua mô hôi, qua nước mắt, qua tế bào sừng (lông, tóc, móng), tuyến nước bọt Tuy nhiên số lượng không đáng kể nên ít có ý nghĩa về mặt điều trị
© Sw dung khang sinh
Su dụng kháng sinh hợp lý cần tuân thủ các nguyên tắc của sử dụng kháng sinh trong danh mục cho phép, sử dụng kháng sinh trong trường hợp nhiễm khuẩn hoặc đề phòng nhiễm khuẩn lựa chọn kháng sinh thích hợp với
loại tế bào mầm bệnh Để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu
dùng, người chăn nuôi phải tuân thủ nghiêm ngặt thời gian ngưng thuốc 2.2 GIỚI HẠN TỎN DƯ KHÁNG SINH TRONG THỊT
Giới hạn tồn dư tối đa (MRL) hay mức độ cho phép (tolerance) là nồng
độ mà các chất hóa học hay thuốc trong mô (hoặc trứng, sữa) phải giảm đến
mức này để mô của vật nuôi, trứng hoặc sữa được đánh giả là an toàn cho người tiêu dùng (Riviere, 991) MRL được tính bằng hàm lượng chất tồn dư so với khôi lượng mô (mg/kg hoặc ng/kg hoặc ppm)
2.2.1 Các yếu tô ảnh hướng đến tồn dư kháng sinh
— Liều kháng sinh cung cấp cho thú: liều dùng càng cao thì thời gian bài thái trong mô của kháng sinh cảng chậm
—_ Loại mô: thông thường mức độ tồn đọng ở thận cao nhất, rồi đến gan, cơ, mỡ, da
Trang 21
— Khoang thoi gian ngung thuốc trước khi thú được hạ thịt hoặc trước khi bò cho sữa hay gà đẻ càng ngắn thì mức độ ton đọng càng cao và ngược
lại
—_ Tùy theo loại kháng sinh, đường, cấp, giống loài tuổi gia súc, gia cầm và tình trạng sức khỏe của con vật
2.2.2 Ảnh hưởng của dư lượng kháng sinh đối với sức khúc cộng đẳng
— _ Sự lạm dụng thuốc kháng sinh tất yếu dẫn đến sự tồn du trong thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe con người Việc sử dyng Nitrofuran,
quinoxalinedinoxides có khả năng gây ung thư và đột biến gen Sulfamides gây kích ứng tuyến giáp, penicilin thường gây dị ứng
— Ngoài ra kháng sinh nhóm aminoglycoside còn gây ngộ độc mãn tính trên thính gíac và thận Kháng sinh nhóm tetracyline có phản ứng tạo phức hợp với các kim loại hóa trị hai như: Ca`'', Mg””, Zn””, Co” có
trong thành phần các enzyme, vì vậy mà nó cản trở chuyên hóa vật chất
và tăng trưởng của động vật (Nguyễn Đức Trang, 1998)
— Đối với công nghiệp chế biến sữa, sự có mặt của kháng sinh sẽ dẫn đến những thất bại trong quá trình lên men sữa chua và phó mát (Mayra
Makinen, 1995)
2.3 PHUONG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯƠNG KHÁNG SINH TRONG THỰC
PHAM
2.3.1 Sie ky (Chromatography)
— Thuat ngit : “sắc ký” có nghĩa là ghi màu bắt nguồn từ thí nghiệm phân
tích màu thực vật trên cột chứa một chất hấp thu của nhà hóa học Nga,
Tsvet, nam 1903
Trang 222.3.3
Nguyên tắc cơ bản của sự chia tách trong sắc ký là một pha động di chuyển qua một pha tĩnh và kéo các chất tan trong hỗn hợp phân tích di chuyển theo với những tốc độ khác nhau Quá trình di chuyển của các chất giữa hai pha là quá trình hấp phụ và phản hấp phụ xảy ra hoặc phân bố và rửa giải ra liên tục Kết quả là các chất tan trong hỗn hợp được tách ra Nếu gọi là trạng thái pha động, có sắc ký lỏng và sắc ký khí Nếu gọi tên theo hình dạng của pha tĩnh ta có sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy
Đây là phương pháp phê biến và hiện đại nhất được áp dụng kiểm tra tồn dư kháng sinh trong thực phẩm Giới hạn mà phương pháp này có thể
xác định được 10°- 1019
Tuy nhiên, chỉ phí xét nghiệm bằng phương pháp HPLC rất cao
Phuong phap mién dich enzyme (ELISA)
Phương pháp này áp dụng cho việc kiểm tra sulfonamide, độ chính xác
của phương pháp thấp hơn phương pháp HPLC
Một vấn đề thường gặp khó khăn của phương pháp là làm sao tạo ra các tác nhân mién dich (immunogen) má không làm hư hỏng cấu trúc của phân tử thuốc
Miễn dịch phong xa (Radio Immuno Assay)
Trong kỹ thuật RIA, sự hình thành phức hợp kháng nguyên, kháng thể có thể được do lường bằng cách sử dụng kháng nguyên không đánh dấu phóng xạ (chất cần tìm) cho tiếp xúc với một số lượng an định của kháng
thể
Sẽ có sự cạnh tranh gắn kết với vị trí hoạt động của kháng thể giữa hai
kháng nguyên này Sau một thời gian, một số kháng nguyên gắn kết với
Trang 23
khang thể, một số còn tự do Ti sé gan két tuong đối của các kháng
nguyên đánh dấu và kháng nguyên không đánh dấu
Hoạt tính phóng xạ của phức hợp kháng nguyên - kháng thê càng thấp, néng độ kháng nguyên không đánh dẫu càng cao Hoạt tỉnh này được xác định bằng máy đếm phóng xạ trong chất lỏng sau khi đã tách phức hợp kháng nguyên - kháng thể ra khỏi phần tự do So sánh với đường cong chuẩn, người ta sẽ tính dược số lượng kháng nguyên cần tìm
(FAO.1990)
2.3.4 Phương pháp sử dung vi sinh vat: FPT (Frontier Post test)
Qui trình này liên quan đến việc nuôi cấy một số chủng vi khuẩn nhạy
cảm trên đĩa thạch có sự hiện diện của mẫu thịt nghỉ ngờ có tồn dư kháng
sinh Nếu mẫu thịt có kháng sinh thì chung quanh nó sẽ có vòng vô
khuẩn do sự khuếch tán của kháng sinh từ mẫu thịt ra môi trường thạch ức chế sự phát triển của vi khuẩn (Heitzman, 1994)
Phương pháp này có ưu điểm là thao tác đơn giản, dễ thực hiện, chỉ phí
thấp, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp
Nhiều tác giả đưa ra các quy trình với môi trường, chủng vi khuẩn nhạy
cảm khác nhau đề xác định kháng sinh tồn dư trong thịt, sữa
Hiện nay có 5 loại vỉ khuẩn nhay cam: B subtilis, B cereus, E coli,
M.luteus, S aureus voi 12 loại môi trường nhưng chỉ ở 3 mức pH và 2
mức nhiệt độ
Trang 242.4 2.4.1
-_ CÁC NGHIÊN CỨU VE DU LUQNG KHANG SINH TRONG THIT GIA
SUC, GIA CAM
Nghiên cứu trong nước
Khao sat tinh trạng nhiễm vi sinh vật và kháng sinh tồn sư trong thịt gia
suc, pia cầm tươi khu vực TP.HCM, Đồng Nai, Bình Dương và để xuất biện pháp khắc phục - Báo cáo khoa học năm 2001, Nguyễn Thị Hoa Lý
- Lê Văn Hùng
Thí nghiệm dịnh tinh khang sinh tôn dư trong thịt gia súc, gia cầm bằng phương pháp FPT — Thông báo khoa học năm 2003 Nguyễn Thị Hoa Lý và Cs
Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại
các cơ sở chăn nuối gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh - Luận
án thạc sĩ nông nghiệp ĐHNL tháng 8/2001, Võ Thị Trà An
Bước đầu khão sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt gà thương phẩm trên địa bàn tỉnh Bình
Dương Định Thiện Thuận, Nguyễn Ngọc Tuân, Võ Thị Trà An, Lê Thanh Hiền, Võ Bá Lâm, Khương Thị Ninh Tạp chí KHKT Thú y, tập
X, số 1/2003, trang 50
Khảo sát kháng sinh tồn dư trên thịt gia súc tại lò mê vùng TPHCM
Nguyễn Thị Hoa Lý — Lê Thị Giang Năm 2002
Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của TP HCM Nguyễn Ngọc Hoài Thi LVTN Khoa Chăn Nuôi Thú y, Trường ĐHNL TP HCM
Sự quen thuốc kháng sinh và cách đối phó Julia Kleenliside — Bacon Bits - Nguyễn Quang Sức dịch Tạp chi KHKT Thú y, tập X, số
1/2003.trang 89
Trang 25
2.4.2
Thử nghiệm phương pháp vi sinh vật để kiểm tra tồn dư kháng sinh trong sữa bò Nguyễn Hoàng Phương LVTN Khoa Chăn Nuôi Thú y, Trường
ĐHNL TP HCM
Tén dư kháng sinh và sức khỏe cộng déng Robert C Wilson, 2002 Tap
chí KHKT Thú Y, tập IX số 2-2002 Nghiên cứu ở nước ngoài
A.LL Van Eenennaam, £8 Cullor, Evaluation of milk antibiotic Ressiddue Screening test in Cattle with naturally occurring clinical matitics University of California 1997
Antibiotic residues in Food and Their SignificanceStanley E Katz and Marietta Sue Brady Antimicrobial in food Eds PM Davidson & A.L
Branen, 2" edittion, Marcel Dekker, Inc, 1993
CNEVA Detection Des Residus a Activite antibiotione dans le Muscle
1995 ‘
‘BU Ban on Chinese Shirmp to Continue; China Decries Report By
WorldCatch News Network, Apr.12,2002
Simple Continuos and Stimulataneous Determination of tetracycline
Residues.C-E TSA!, F.KONDO, Department of Veterinary Public
health, Faculty of Agriculture, Miyazaki University, Kibanadai-Nishi, Gakuen, Miyazaki-shi 889-21, Japan Reasearch in Veterinary Science,
1994
The food and Drug Administration (FDA) — USDA, “ Guidance for Industry: Dugs, Biologis, and Medical Deviced from Bioengineered
Plants for Use in Humans and Animals”, draft dated September 12, 2002,
web sites: hitp://www-.aphis.ussda.gov/vs/evb
Trang 26
Có thể nói nghiên cứu về kháng sinh tồn dư trong sản phẩm động vật không phải là điều mới mẻ, đặc biệt là các nước kinh tế phát triển như
Mỹ, Nhật, Đức, Pháp, Anh, Australia Van đề sử dụng kháng sinh trong
chăn nuôi và tồn dư kháng sinh trong thực phẩm rất được chú ý
Trong các phương pháp xác định kháng sinh tồn dư, phương pháp vì sinh vật được sử dụng lâu đời nhất Hiện nay có một số phương pháp kiểm tra ° KSTD bằng phương pháp vi sinh vật: phương pháp của tác giả F Dondo người Nhật xác dịnh Tetracyclin, phương pháp của CNEVA (Đức) xác
định ba loại penicilline, tetracycline, streptomycine
Đây là phương pháp được sử dụng ở nhiều nước và mỗi nơi có một qui trình riêng với loại môi trường và vi khuẩn nhạy cảm đặc trưng phụ
thuộc vào việc cần xác định một số loại kháng sinh nhất định Đây là vấn
để đơn giản ở các nước chăn nuôi phát triển, nhưng ở Việt Nam thực tế cho thấy thuốc thú y được sử dụng rất đa dạng, phong phú Do đó qui trình của các tác giả nước ngoài gặp khiếm khuyết dẫn đến kết quả kém
chính xác
Trang 27
3.1 3.2 CHUONG II: NOL DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU DIA DIEM Tối ưu hóa quy trình, điều chế môi trường tại Trung tâm Kiểm Tra Vệ Sinh Thú Y TWII Phân tích các mẫu tham chiếu tại Phòng thí nghiệm Trung tâm phân tích thí nghiệm Tp.HCM - Sở KHCN Tp.HCM
Mẫu thịt, trứng, sữa được thu mua tại các cơ sở giết mổ, chợ, siêu thị
Tp.HCM, Bình Dương, Vũng Tàu, Long An
Kiểm tra, đánh giá, độ chính xác của bộ FPT tại 10 Chỉ cục thú y: Vũng
Tàu, Đồng Nai, Tp.HCM
'THỜI GIAN THÍ NGHIỆM
Điều tra tình hình sứ dụng kháng sinh trong trại chăn nuôi từ 12/2003 — 02/2004
Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình và bán định lượng kháng sinh tồn dư
được thực hiện từ 12/2003 — 06/2004
Tập huấn cho Cán bộ Chỉ cục về phương pháp kiểm tra kháng sinh tồn
dư trong thịt, trứng, sữa 07/2004
Triển khai tại Chỉ cục để lấy kết quả 08/2004
Trang 28
3.3 NOLDUNG VA BO TRi THI NGHIEM
Noi dung I Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia súc gia
cầm
Qui mô và địa điểm khảo sát:
`5IHrại và hộ chăn nuôi gia đình thuộc tỉnh Đồng Nai, Long An, Bình
Dương, TP Hồ Chí Minh
- 7 trai heo qui m61000 - 5000 con - 3 trại heo qui mô T00 - 900 con
- 7 trai heo.qui mé < 100 con
- 5 trại gà thịt qui mô 5000 - 10000 con - 4 trại gà thịt qui mô 1000 - 4000 con - 40 trại gả thịt qui mô < 1000 con
Nội dung 2 Tối ưu hoá qui trình định tính kháng sinh tồi dư bằng phương
pháp FPT
Qui mé: Thí nghiệm thực hiện trên
- 11 loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn nhạy cảm
Trang 29
Chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm 2 Xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho phương phá)?
Chỉ tiêu theo dõi
Nội dung 3 Đán định lượng kháng sinh tồn dư bằng phương pháp FPT MO tả thi nghiệm
Kích thước vòng vành khăn
Tần suất (+) của các môi trường với pH tương ứng trên II loại kháng sinh thử
Phổ phát hiện của nhóm môi trường lựa chọn
Thí nghiệm dược bố trí ở 2 mức nhiệt dộ 37C và 30ˆC Thời gian theo dõi sau khi đặt mẫu từ 16-24h
Thí nghiệm được lặp lại trên 11 loại kháng sinh
Tần suất (+)
Kích thước vòng vành khăn
Thí nghiệm thực hiện trên II loại kháng sinh đã lựa chọn
Kháng sinh được sử dụng ở 6 nồng độ: !c, 2c,5c, lÚc, 20c, 50c, (c là
hàm lượng giới hạn kháng sinh tồn dư cho phép trong thịt
Thí nghiệm được thực hiện trên các mẫu có hàm lượng kháng sinh từ
thấp tới cao Các mẫu có hàm lượng kháng sinh tồn dư thấp dã (+) thì
không cần thử trên các mẫu cao
Các mẫu cho phản ứng (+) được định lượng kháng sinh tồn dư bằng
phương pháp HPLC tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Sở KHCN
TP.HCM
Trang 30
Chỉ tiêu theo dõi
—_ Kích thước vòng vành khăn và tần suất (+) của từng loại kháng sinh ở các nồng độ khác nhau ~ Theo déi ham lugng khang sinh tồn dư trong các mẫu (+) đã được định lượng bằng HPLC —_ Xác định được giới hạn tối thiểu và kháng sinh tồn dư mà phương pháp FPT cho phản ứng (+) Nội dung 4 Sản xuất thử FPT test và xác định điều kiện bảo quản thích hợp Mô ta thí nghiệm
— Chuẩn bị vi khuẩn nhạy cảm, rửa, ÏÏ tâm, tạo dịch vi khuẩn
—_ Chuẩn bị môi trường nuôi cây
—_ Chế thử FPT test hút chân không
— Bảo quản ở 2 mức nhiệt độ: nhiệt độ phòng và 4-10°C/ thoi gian 3 - 4 thang
— Moéot tuần lay 1 b6 ra để kiểm tra độ nhạy của test
Chỉ tiêu theo dõi
— Mat do vi khuẩn trong dịch cây
— Trạng thái tiềm sinh của vi khuẩn nhạy cảm trên đĩa — Trang thai của môi trường trong quá trình bảo quản
— _ Tần suất (+) của FPT test sau các thời gian nhất định
~_ Rút ra kết luận về điều kiện và thời gian bảo quản thích hợp
Trang 31
Nội dung 5 Định tính và định hướng kháng sinh tổn dư bằng phương pháp
FPT
—_ Dựa trên khả năng nhạy cảm của Ì số chủng vi khuẩn với những kháng sinh hoặc nhóm kháng sinh tương ứng Điều này giúp cho việc chỉ định
khi phân tích bằng HPLC chính xác hơn
Dia diém lay mau
Mo ta thi nghiém
- Các mẫu (+) và đã được định hướng sẽ định lượng kháng sinh tồn dư
Chỉ tiêu theo doi
Mẫu thịt gà, heo, bò dược lấy tại lò mé TP.ICM, Long An, Đồng Nai Mẫu trứng được thu nhận tại chợ, siêu thị
Mẫu sữa được thu nhận tại các hộ gia đình chăn nuôi bò sữa thuộc huyện
Thú Đức, Củ Chỉ Tp.Hồ Chí Minh
Mẫu được đặt trên môi trường có vi khuẩn nhạy cảm
Ở giữa các đĩa dat | disk khang sinh chuẩn đối chứng
Ủ nhiệt độ thích hợp và thời gian thích hợp
Trang 32
— Hàm lượng kháng sinh tổn dư trong các mẫu được phân tích định lượng bằng HPLC So sánh tý lệ (+) của FPT và HPLC
Nội dung 6 Xây dựng qui trình kiểm tra và triển khai tại cơ sở
Địa điểm thực hiện
PTN Chỉ Cục Thú Y TP Hồ Chí Minh,PTN Chỉ Cục Thú Y Vũng Tàu, PTN Chi Cục Thú Y Long An
PTN Chỉ Cục Thú Y Đồng Nai
Mỏ ta các buốc triên khai Hoàn thiện qui trình
Chế bộ FPT test
Mỗi Chỉ Cục được cấp 5 bộ FPT ( tương ứng với 30 mẫu)
Tập huấn cho các Chỉ Cục phương pháp kiểm tra, cán bộ kỹ thuật Chỉ Cục trực tiếp lấy mẫu kiểm tra theo qui trình Các mẫu (+) được gửi về phòng thí nghiệm trung tâm dễ định lượng kháng sinh tồn dư
Chỉ tiêu theo dõi:
Cán bộ chỉ cục trực tiếp thực hiện và ghi nhận các chỉ tiêu sau: Tỉ lệ mẫu (+)/ số mẫu kiểm tra ngẫu nhiên
Tình trạng của môi trường và vi sinh vật nhạy cảm trong quá trình bảo quản
Trang 33
3.4 _PHUONG PHAP
3.4.1 Nguyên lý của phương pháp EPT
— Vị sinh vật nhạy cảm được nuôi cấy trên môi trường đặc trưng
— _ Đặt sản phẩm (thịt, trứng, sữa) lên bề mặt môi trường
—_ Giữ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
— Các chất tồn dự kháng sinh có trong sản phẩm động vật sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật tạo ra vòng vành khăn xung quanh vị trí đặt mẫu
—_ Độ nhạy của phương pháp sẽ được tính bằng tần suất (+) và kích thước
vòng vành khăn
3.4.2 Vậtliệu
— Giống vi khuẩn nhạy cảm: gồm 6 giống
Trang 34
Hình 3.2 Vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 11778 trên môi trường ỐTS
22
Trang 36{II
Hinh 3.5 Chung vi khuẩn gốc trên môi trường b
Hình 3.6 Ching vi khuẩn gốc đông khô
24 NS
Trang 38lr—~ -Kháng sinh lựa chọn thí nghiệm trên các nhóm