NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TÁCH VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST GIỮA CÁC DÒNG KHOAI TÂY DẠI VỚI GIỐNG KHOAI TÂY TRỒNG ATLANTIC PHỤC VỤ CHƯƠNG TRÌNH CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS VÀ BỆNH MỐC SƯƠNG

Các dòng khoai tây dại có khả năng kháng cao với hầu hết các chủng gây bệnh virus và mốc sương. Do đó, các loài khoai tây dại này như một nguồn cung cấp gen giàu có cho quá trình cải tiến giống khoai tây của các nhà chọn tạo giống và các nhà di truyền học. Tuy nhiên rất khó để lai tạo hữu tính giữa các loài dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sự không tương hợp về genom, sự bất thụ trong lai xa… Chính vì thế lai soma bằng dung hợp protoplast là một giải pháp rất hữu hiệu để khắc phục những nhược điểm trên Đối với Việt Nam, công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh vẫn còn nhiều hạn chế, chủ yếu vẫn áp dụng các phương pháp truyền thống, chưa áp dụng các phương pháp CNSH hiện đại, chưa có bộ vật liệu phong phú mang các tính trạng quý như mang gen kháng virus, mốc sương, chống chịu với các stressmôi trường. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tách và dung hợp protoplast giữa các dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng Atlantic phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và bệnh mốc sương”

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------    ------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TÁCH VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST GIỮA CÁC DÒNG KHOAI TÂY DẠI VỚI GIỐNG KHOAI TÂY TRỒNG ATLANTIC PHỤC VỤ CHƯƠNG TRÌNH CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS VÀ BỆNH MỐC SƯƠNG Giáo viên hướng dẫn : GS.TS. Nguyễn Quang Thạch KS. Hoàng Thị Giang Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Ngân Lớp : KSCNSH0702 – K14 P h ạ m T h ị N g â n - L ớ p : C N S H 0 7 - 0 2 HÀ NỘI - 2011 2 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực tập cuối khoá tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học khoai tây - Viện sinh học nông nghiệp - Trường đại học nông nghiệp Hà Nội, tôi đã nhận đước giúp đỡ nhiệt tình, chu đáo của thầy giáo, GS.TS Nguyễn Quang Thạch. Thầy đã giúp tôi nâng cao kiến thức, hiểu biết sâu và rộng hơn về công nghệ sinh học trong nông nghiệp nói riêng và lính vực khác của công nghệ sinh học nói chung. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới thầy. Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành tới các cán bộ công tác tại Viện sinh học nông nghiệp, đặc biệt là KS. Hoàng Thị Giang đã chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại đây. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo Viện đại học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô khoa Công nghệ sinh học đã truyền đạt những kiến thức vô cùng quý báu cho tôi có nền tảng cơ sở để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè tôi, những người luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành bào cáo tốt nghiệp. Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2011 Sinh viên Phạm Thị Ngân i MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 I. Đặt vấn đề 1 II. Mục đích và yêu cầu 2 1. Mục đích .2 2. Yêu cầu .2 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1. Giới thiệu chung về khoai tây .3 1.1.1. Nguồn gốc .3 1.1.2. Phân loại .3 1.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây khoai tây 4 1.1.4. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 6 1.2. Tình hình nhiễm bệnh virus ở khoai tây .9 1.2.1. Tình hình nhiễm bệnh vius .9 1.2.2. Tác hại của bệnh virus 11 1.2.3. Tình hình nhiễm bệnh mốc sương ở khoai tây 13 1.3. Các hướng nghiên cứu tạo giống khoai tây 14 1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen .14 1.3.2 Nghiên cứu dung hợp tế bào trần 15 1.3. Tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần .21 1.3.1. Khái niệm tế bào trần (protoplast) và con lai soma (somatic hybrid) 23 1.3.2. Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast 23 1.3.3. Xác định con lai soma .25 PHẦN II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Vật liệu .29 2.1.1. Giống khoai tây Atlantic (Solanum .tuberosum cv.Atlantic) 29 2.1.2. Các dòng khoai tây dại .29 2.2. Nội dung, địa điểm và thời gian nghiên cứu .29 2.2.1. Nội dung nghiên cứu 30 2.2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu .31 2.3.2. Phương pháp đếm protoplast và pha loãng mật độ 32 2.3.3. Phương pháp chuẩn bị hóa chất tách protoplast 33 2.3.5. Phương pháp dung hợp protoplast bằng xung điện .34 2.3.6. Phương pháp chuẩn bị dung dịch dung hợp 34 2.3.7. Phương pháp nuôi cấy và tái sinh protoplast sau khi dung hợp 35 2.3.8. Các chỉ tiêu theo dõi .35 2.3.9. Phuơng pháp xử lý số liệu: .35 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1. Các kết quả tách protoplast 36 3.1.1. Thí nghiệm 1: So sánh khả năng tách protoplast của các kiểu gen khác nhau .36 3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất và chất lượng tách protoplast của các dòng khoai tây dại và giống Atlantic .39 ii 3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch Enzyme đến năng suất và chất lượng của protoplast .41 3.2. Các kết quả nuôi cấy protoplast 44 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của protoplast 44 3.2.2. So sánh ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của protoplast 48 3.3. Các kết quả dung hợp protoplast .54 3.3.1. Tối ưu hóa các thông số của quy trình dung hợp bằng xung điện giữa giống khoai tây Atlantic và dòng khoai tây dại 54 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 4.1. Kết luận 57 4.2. Đề nghị .58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 PHỤ LỤC 62 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế giới năm 2007 .6 Bảng 2: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây ở Việt Nam 9 Bảng 3: Khả năng tách protoplast của các vật liệu nghiên cứu .36 Bảng 4: Ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất và chất lượng protoplast .39 Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến năng suất và chất lượng protoplast 42 Bảng 6: Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast và hình thành microcalli 45 Bảng 7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast và hình thành microcalli 49 iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Hình 1: Hình ảnh lớp nổi protoplast sau khi li tâm lần 1 37 Hình 2: protoplast của các dòng sau khi tách .38 Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất protoplast 41 Hình 3: Mật protoplast của giống Atlantic tách bằng các dung dịch enzym khác nhau 43 46 Biểu đồ 2: : Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast 46 Hình 4: Hình ảnh microcallus trên các nền môi trường khác nhau của giống Atlantic .47 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và hình thành microcalli của protoplast 49 Hình 5: Hình ảnh callus của giống Atlantic phân chia trên các nền môi trường 51 Hình 6: Hình ảnh protoplast của giống Atlantic phân chia trên môi trường VKM II .53 Hình 7: Protoplast sau khi xung điện .56 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Hình ảnh lớp nổi protoplast sau khi li tâm lần 1 37 Hình 2: protoplast của các dòng sau khi tách .38 Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất protoplast 41 Hình 3: Mật protoplast của giống Atlantic tách bằng các dung dịch enzym khác nhau 43 46 Biểu đồ 2: : Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast 46 Hình 4: Hình ảnh microcallus trên các nền môi trường khác nhau của giống Atlantic .47 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và hình thành microcalli của protoplast 49 Hình 5: Hình ảnh callus của giống Atlantic phân chia trên các nền môi trường 51 Hình 6: Hình ảnh protoplast của giống Atlantic phân chia trên môi trường VKM II .53 Hình 7: Protoplast sau khi xung điện .56 vi CÁC KÍ TỰ VIẾT TẮT • AFLP-Amplified Fragment length polymorphism • BC (Back cross) • NST. Nhiễm sắc thể • PLRV. Potato leafroll luteovirus PLRV • PVA .Potato A potyvirus • PVM. Potato M carlavirus • PVM. Potato M carlavirus • PVS. Potato S carlavirus • PVV. Potato V potyvirus • PVX .Potato X potexvirus • PVY.Potato Y potyvirus vii MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Khoai tây là một loại cây trồng quan trọng của Việt Nam, đặc biệt là đối với vùng Đồng bằng Sông Hồng. Gần đây, do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu đã làm thay đổi sản xuất cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Sự biến đổi của khí hậu kéo theo sự xuất hiện của hàng loạt các loại bệnh và dịch hại làm thiệt hại đến năng suất và sản lượng cây trồng nghiêm trọng. Để đối phó với những tác động của sự biến đổi khí hậu toàn cầu trong tương lai, nhiệm vụ cấp thiết đặt ra cho các nhà chọn tạo giống khoai tây là phải tạo ra các giống mới không chỉ có năng suất cao, chất lượng tốt mà đồng thời phải chống chịu được với các stress môi trường. Hiện nay, sản xuất khoai tây trên thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng đang phải đối mặt với 2 loại bệnh virus, trong đó PVY là bệnh nguy hiểm hơn cả và bệnh mốc sương (do nấm Phytophthora infestans). Chiến lược sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật để phòng trừ bệnh virus PVY đã không thành công (Jones và cộng sự, 1982; De Bokx và Van der Want, 1987; Valkolen và cộng sự, 1996). Việc trồng các củ giống vị nhiễm virus PVY (potato Y potyvirus) hoặc PLRV (potato leafroll luteovirus) đã làm giảm năng suất tới 80% (Banttari và cộng sự, 1993). Bên cạnh đó, bệnh mốc sương cũng được cho là một bệnh hại khoai tây nghiêm trọng nhất hiện nay trên toàn thế giới (Hammann, 2009; Thieme, 2010). Để phòng trừ bệnh này đã phải mất lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật mỗi năm (mất khoảng 14 lần phun/mỗi vụ). Mỗi năm nước Đức đã phải chi tới 470 EURO/ha để phòng trừ bệnh này bằng thuốc bảo vệ thực vật (Darsow, 2008). Các dòng khoai tây dại có khả năng kháng cao với hầu hết các chủng gây bệnh virus và mốc sương. Do đó, các loài khoai tây dại này như một nguồn cung cấp gen giàu có cho quá trình cải tiến giống khoai tây của các nhà chọn tạo giống và các nhà di truyền học. Tuy nhiên rất khó để lai tạo hữu tính 1