II. Mục đích và yêu cầu
2. Yêu cầu
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách protoplast (Theo quy trình của viện JKI – viện
nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nông nghiệp – CHLB Đức)
1. Nhân 10 – 20 cây in vitro (mỗi kiểu gen bố mẹ trong bình thủy tinh từ 3- 4 tuần tuổi, trong điều kiện 16h chiếu sáng và 220C; để các nguyên liệu này trong tối trước khi tiến hành các thí nghiệm dung hợp)
2. Ngắt và thái nhỏ lá cây in vitro bằng một lưỡi dao sắc nhọn trong một đĩa petri chứa 10ml dung dịch rửa II (Washing solution II hay còn gọi là dung dịch gây co nguyên sinh), ủ trong dung dịch gây co nguyên sinh 10 -15 phút, sau đó loại bỏ dung dịch này và bổ sung dung dịch enzym (Enzym solution), quấn parafilm.
Cách tính lượng enzym:
- Bổ sung 10ml dịch co nguyên sinh vào đĩa petri, quấn parafilm rồi mang đi cân ta được khối lượng là m1, sau đó ngắt lá cây in vitro vào đĩa vừa cân xong rồi quấn parafilm và đem đi cân ta được khối lượng là m2. Khối lượng lá cây
3. Ủ đĩa petri trong tối và qua đêm tại nhiệt độ phòng (20-220C) trong thời gian 14-16 giờ; kết thúc giai đoạn này, quan sát các tế bào dưới kính hiển vi, ghi lại chất lượng protoplast (trong một vài trường hợp tùy thuộc vào từng kiểu gen, có thể chuyển đĩa petri vào lắc trong thời gian 5-15 phút).
4. Lọc dịch huyền phù tế bào qua rây lọc 2 lớp (100/50µm) vào 1 lọ vô trùng; dùng pipette hút 5-10ml dung dịch nổi (Rinsing Solution); sau đó bổ sung dịch huyền phù protoplast vào các ống ly tâm (từ bước này phải làm việc trên đá để tránh gây tổn thương protoplast).
5. Ly tâm lần 1 trong 15 phút với tốc độ 50g = 600rpm
6. Dùng một pipette Pasteur vô trùng hút cẩn thận lớp dịch nổi phía trên cùng vào một ống ly tâm khác, bổ sung 10ml dung dịch rửa I (Washing Solution I) và đem ly tâm lần 2 trong 8 phút với tốc độ 80g = 700rpm.
7. Protoplast kết tủa xuống phía đáy, loại bỏ lớp bên trên, bổ sung 10ml dung dịch rửa II (Washing Solution II) rồi đem ly tâm lần 3 trong 8 phút với tốc độ 80g = 700rpm.
8. Hút bỏ dịch phía trên, bổ sung dung dịch dung hợp (Fusion Solution) hoặc môi trường nuôi (tùy mục đích thí nghiệm) và tính mật độ protoplast.