II. Mục đích và yêu cầu
3.3.1.Tối ưu hóa các thông số của quy trình dung hợp bằng xung điện giữa giống khoa
2. Yêu cầu
3.3.1.Tối ưu hóa các thông số của quy trình dung hợp bằng xung điện giữa giống khoa
giống khoai tây Atlantic và dòng khoai tây dại
* Xác định mật độ protoplast thích hợp cho xung điện: Đối với phương pháp dung hợp bằng xung điện, để xác suất kết dính 2 tế bào cao thì việc xác định mật độ tế bào thích hợp của các dòng trước khi dung hợp là rất quan trọng. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành thử các mật độ tế bào khác nhau để xung điện (thông qua việc đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu): 15 x 105 pp/ml, 20 x 105 pp/ml, 25 x 105 pp/ml, 30 x 105 pp/ml. Kết quả cho thấy mật độ tế bào: 20 x 105 pp/ml là mật độ thích hợp nhất để dung hợp xung điện.
* Tối ưu hóa các thông số trong quy trình dung hợp xung điện:
Hỗn hợp protoplast của giống Atlantic và dòng khoai tây dại trn 3G được trộn theo tỷ lệ 1:1 (mật độ protoplast của mỗi dòng là 20 x 105 pp/ml), sau đó đem ly tâm nhẹ để đồng nhất. Sau đó tiến hành dung hợp xung điện bằng đĩa dung hợp và bước đầu thu được các thông số như sau:
1- Dung hợp bằng đĩa petri: xác định được mật độ protoplast của tổ hợp lai thích hợp cho dung hợp là 20x105 protoplast/ml; dùng máy AC với tần số
cho dung hợp là 800-1000Hz, thời gian xung là 2s, tiến hành 2 lần xung liên tiếp, khoảng cách giữa hai lần xung điện là 10-15µs, thời gian chờ sau khi dung hợp là 20s.
2- Thể tích huyền phù protoplast cho mỗi lần xung điện là 400µl hỗn hợp protoplast vào buồng dung hợp.
3- Dung dịch dùng trong quá trình dung hợp thích hợp nhất cho cả hai phương pháp là dung dịch chứa 0,4M manitol và 1,0mM CaCl2.
Sau khi xung điện, một quần thể các tổ hợp được tạo ra trong đó bao gồm: các tổ hợp đồng hợp nhân (homozygous), dị hợp nhân (hetezygous). Việc quan trong tiếp theo là phải tái sinh các tổ hợp lai này rồi chọn lọc chính xác các con lai dị hợp theo mong muốn. Tuy nhiên thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chỉ bước đầu tối ưu hóa được các thông số của quy trình xung điện.
Mật độ khác
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ