II. Mục đích và yêu cầu
3.2.2.So sánh ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của
2. Yêu cầu
3.2.2.So sánh ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của
tái sinh của protoplast
Các protoplast sau khi tách sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng cho tới khi microcallus xuất hiện. Trong giai đoạn này, do các protoplast do chưa có thành tế bào nên rất yếu, vì vậy môi trường nuôi cấy cần phải đảm bảo áp suất thẩm thấu để không làm vỡ tế bào, ngoài các yếu tố dinh dưỡng cần thiết còn cần cung cấp đủ ion Ca2+ cho quá trình phân chia hình thành thành vách tế bào mới. Ở đây chúng tôi sử dụng 4 loại môi trường lỏng khác nhau: VKM II; VKM II + BSA (chất làm tăng khả năng kết tụ của tế bào); 24a; 24b (phụ lục). Tiến hành theo dõi sự phân chia của protoplast sau các khoảng thời gian nhất định, đồng thời theo dõi sự kết tụ và hình thành microcalli và calli trên các môi trường đó. Kết quả được thể hiện như sau:
Bảng 7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast và hình thành microcalli
Chỉ tiêu
KG
Loại môi trường nuôi cấy
Sự phân chia của
protoplast Số lượng microcalli sau 4
tuần(x 100000) Sau 3 ngày Sau 7 ngày
Atlantic VKM II + + + 102 VKM II + BSA + + 78 24 a - + 12 24 b - + 7 trn 3G VKM II + + + 95 VKM II + BSA - + 49 24 a - + 7 24 b - + 3 pnt 2G VKM II + + + 74 VKM II + BSA - + 11 24 a - + 3 24 b - + 1
Chú thích: Mật độ protoplast nuôi cấy là 20 x 105 pp/ml ; (+) có biểu hiện phân chia; (+ +) hầu hết đều phân chia; (-) không phân chia;
Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và hình thành microcalli của protoplast
Môi trường VKM II
Môi trường 24a
Môi trường 24b
Hình 5: Hình ảnh callus của giống Atlantic phân chia trên các nền môi trường
Sau 3 ngày
Sau 3 tuần
Sau 4 tuần
Hình 6: Hình ảnh protoplast của giống Atlantic phân chia trên môi trường VKM II
Nhận xét:
Môi trường lỏng VKM II cho hiệu quả phân chia tê bào tốt nhất, hầu như các tế bào đều phân chia sau 7 ngày nuôi cấy. Đồng thời tiếp tục theo dõi trên môi trường này sau 4 tuần thì thấy số lượng microcalli hình thành cao nhất. Việc bổ sung BSA vào môi trường VKM II nhằm mục đích tăng khả năng kết tụ của tế bào, kích thích sự hình thành microcalli, tuy nhiên lại làm giảm khả năng phân chia của tế bào. Môi trường 24a, 24b với hàm lượng Ca2+ cao nhằm kích thích sự tái tạo thành tế bào, tăng khả năng phân chia. Tuy nhiên 2 loại môi trường này tỏ ra không hiệu quả đối với sự phân chia và hình thành microcalli. Tóm lại, môi trường VKM II cải tiến là loại môi trường có hiệu quả nhất đối với sự phân chia và hình thành calli của protoplast.