II. Mục đích và yêu cầu
2. Yêu cầu
1.3.3. Xác định con lai soma
Sản phẩm sau dung hợp là hỗn hợp gồm: Các dạng bố hoặc mẹ dùng để lai partners), các thể lai đồng hợp (do các tế bào của cùng 1 loài kết hợp lại với nhau - homozygous) và thể lai dị nhân (các tế bào khác loài kết hợp lại với nhau -hetezygous) do quá trình dung hợp xảy ra ngẫu nhiên và không
kiểm soát được. Chính vì vậy việc chọn lọc chính xác con lai soma trong hỗn hợp sản phẩm sau dung hợp là rất cần thiết. Có rất nhiều phương pháp để chọn lọc con lai soma khác nhau, có thể xếp vào hai nhóm là chọn lọc ở mức tế bào (hay calli) và chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh (planlet). Tùy từng loại cây trồng mà có thể áp dụng các phương pháp khác nhau, tuy nhiên thường thì chọn lọc con lai ở giai đoạn cây hoàn chỉnh cho hiệu quả cao hơn.
Chọn lọc ở mức tế bào
* Phương pháp tách trực tiếp:
Sau khi dung hợp, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi để chọn lọc trực tiếp sản phẩm dung hợp, bằng cách sử dụng micropipet hút trực tiếp tại vị trí dung hợp. Tuy nhiên phương pháp này rất khó khăn để tách được tế bào lai do mât độ tế bào khá dày, hơn nữa dễ gây tổn thương tế bào, ảnh hưởng đến sự tái sinh sau này. Phương pháp này ít được áp dụng trong chọn lọc con lai (Hein và Schieder 1984)
* Phương pháp nhuộm huỳnh quang:
Puite và Pijnacker (1986)[17] đã đề xuất phương pháp chọn lọc sản phẩm dung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang. Tiến hành nhuộm flouresencein diacetate (FDA) cho nguồn protoplast thu được từ mẫu lá xử lý trong dung dịch thuốc trừ cỏ, các protoplast này không hoặc có rất ít lục lạp, sau đó tiến hành dung hợp với nguồn protoplast bình thường có chứa lục lạp. Sau khi xử lý dung hợp, kết quả cho thấy các protoplast xuất hiện màu đỏ và màu xanh của FDA được xác nhận là con lai soma (heterokaryon). Tuy nhiên yêu cầu của phương pháp này là mật độ nuôi cấy protoplast phải thấp.
Theo Harkins và Galbrain, 1984, các ông tiến hành nhuộm flouresent khác nhau cho cả hai nguồn protoplast dung hợp. Sau dung hợp, hỗn hợp protoplast được chiếu tia laser khi đó các tế bào hấp thu năng lượng ánh sáng, cuối cùng tiến hành chọn lọc con lai dựa trên định lượng hàm lượng flouresent.
* Dựa trên các biểu hiện di truyền, sử dụng các gen chỉ thị và gen đánh dấu:
Chẳng hạn như các gen đột biến gây bạch tạng, các đột biến hóa sinh làm ức chế gen nào đó dẫn tới sự thiếu hụt enzyme hoạt động, các gen đánh dấu có được bằng phương pháp chuyển gen, các gen kháng sinh hoặc kháng thuốc trừ cỏ. Có thể nêu một số ví dụ sau:
Gây đột biến tính lặn mẫn cảm với ánh sáng SSvv và ssVV của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), khi đó dạng lai giữa hai kiểu đột biến trên có kiểu gen SSssVVvv không mẫn cảm với ánh sáng. Các dòng tế bào tồn tại hình thành diệp lục ở cường độ ánh sáng cao do không mẫn cảm với ánh sáng, đó chính là con lai soma (Athuja 1982).
Dạng lai giữa Solanum nigrum và Petunia hybrida có thể phát triển trên môi trường có chứa diethylpyrocarbamate (hợp chất gây mẫn cảm với
Solanum nigrum) và iodine acetate (gây mẫn cảm với Petunia hybrida). Protoplast bố mẹ dung hợp không phát triển trên môi trường có đồng thời hai chất trên do đó dễ dàng chọn lọc được con lai soma (Davey và Kumar 1983). Hai nguồn protoplast Nicotiana glauca và B.langsdorfii cần có auxin trong môi trường mới có thể phát triển được, ngược lại dạng lai giữa chúng có thể tự tổng hợp được auxin do vậy phát triển được trong môi trường thiếu auxin. Qua đó con lai soma dễ dàng xác định được trong điều kiện môi trường nuôi cấy (Pelletier và Chupeau 1984).
Dòng tế bào A của Shaerocarpos donelli chỉ phát triển được khi trong môi trường có acid nicotinic và dòng tế bào B (dạng bạch tạng) thì cần đường. Dạng lai giữa A và B phát triển bình thường trên môi trường không có cả acid nicotinic và đường. Dòng tế bào A và B được gọi là dòng tế bào đột biến dinh dưỡng thụ động (auxotrophic) theo Gonzales và Widholm 1985.
Chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh
Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc Isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố và mẹ dung hợp.
Theo N.Q.Thach và U. Frei và G. Wenzel (1993)[22] đã tạo thành công con lai soma giữa các nhóm khoai tây thuộc Solanum tuberosum L., việc xác định con lai dựa trên phân tích isozyme esterase, peroxidase (Deimling et al. 1988) và kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) đã xác định được các con lai đều có sự biểu hiện của 2 allele trội đơn gen Rx và Ry từ bố mẹ dung hợp (partners).
Theo Ramona Thieme và Elena Rakosy – Tican (2007)[18], Con lai giữa
Solanum tuberosum cv. Delikat và S. tarnii được xác nhận bằng chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat ) và AFLP (Amplified Fragment length polymorphism), đồng thời cũng dựa vào đặc điểm hình thái và phân tích Flow cytometry. Kết quả cho thấy SSR không cho kết quả với tổ hợp lai trên và các con lai BC1 còn AFLP cho kết quả tốt để khẳng định đúng con lai soma.
Ngoài ra, để xác định con lai soma một số tác giả đã nghiên cứu thành phần, hàm lượng alkaloid trong các cây lai. Theo nghiên cứu của Pehu và cộng sự (1990) về dung hợp protoplast giữa S. tuberosum và S. brevidens đã tạo con lai soma thành công. Để xác định con lai soma ông tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai. Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ bao gồm solanidine và
slanthrene của S. tuberosum, tomatidine của S. brevidens (Laurila et al 1996) đều có mặt trong cây lai. So sánh với bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S. tuberosum nhưng hàm lượng thấp vào khoảng 20 mg/ 100g trọng lượng tươi.
Hơn nữa người ta có thể xác định con lai dựa vào đặc điểm hình thái khi bố mẹ có đặc điểm khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên phương pháp này chỉ được áp
dụng đông thời với phương pháp xác định ở mức phân tử thì mới cho kết quả chính xác nhất.
PHẦN II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU