II. Mục đích và yêu cầu
1.3.2.Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast
2. Yêu cầu
1.3.2.Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast
Sự ra đời của kỹ thuật dung hợp tế bào trần ở thực vật cho phép tạo ra những cơ thể lai mới, mang các đặc tính tốt mà phương pháp lai truyền thống rất khó hoặc không thể tạo ra được con lai. Hơn nữa, cây khoai tây là một loại
cây rất dễ nuôi cấy mô, do vậy các nhà nghiên cứu dễ dàng áp dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo thể lai soma để cải tiến một số tính trạng mong muốn, đặc biệt là tính kháng. Đặc tính kháng bệnh trong con lai soma có được là do một trong hai đối tượng tế bào dung hợp có mang tính chất đó. Đồng thời tế bào lai soma là sự dung hợp của gen nhân và các bào quan (ty thể lai, lạp thể lai), nên cũng góp phần tăng cường các đặc tính nông sinh học khác ở con lai soma.
Vào những năm 60 của thế kỷ XX, E. C. Cooking đã sử dụng một enzyme để phân giải thành tế bào và kết quả là tạo ra các protoplast tế bào chóp rễ của cây cà chua.
Sau đó I.Takebe và cộng sự (Viện nghiên cứu virus thực vật, Aobacho, Chiba/Japan)[21] đã cải tiến kỹ thuật trên và đã tạo được một lượng lớn tế bào trần của các tế bào thịt lá cây thuốc lá. Quy trình này cũng được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng thực vật khác, rất dễ sử dụng và đạt hiệu quả cao. Quy trình này được tiến hành qua hai bước: đầu tiên là phân giải lớp màng mỏng bằng enzym pectinase; sau đó, phân giải thành tế bào bị phân giải bằng enzym cellulase.
Đây là những người đặt nền móng đầu tiên cho các nghiên cứu về tế bào trần. Những kết quả nghiên cứu trên góp phần vào sự thành công tạo nguồn tế bào trần phục vụ dung hợp.
1.3.2.1. Tách protoplast
Để tách được protoplast người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ học và tách bằng enzyme. Tách cơ học là làm cho protoplast ở trạng thái co nguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần. Tuy nhiên phương pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tượng thực vật; mật độ protoplast thu được không cao; khả năng tái sinh yếu. Phương pháp tách protoplast bằng enzyme đã khắc phục được những nhược
điểm trên. Hiện nay, phương pháp enzyme được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.
1.3.2.2. Dung hợp
Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện- electrofusion). Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên. Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế bào (Banner, 1990). Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này.
1.3.2.3 Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần sau dung hợp
Sản phẩm sau khi dung hợp sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng cho tới khi microcallus xuất hiện. Trong giai đoạn ban đầu protoplast “rất yếu ớt” do chưa có thành tế bào, do vậy môi trường nuôi cấy cần phải đảm bảo áp suất thẩm thấu để không làm vỡ tế bào, ngoài các yếu tố dinh dưỡng cần thiết còn cần cung cấp đủ ion Ca2+ cho quá trình phân chia hình thành thành vách tế bào mới. Tiếp đó, các microcalli này sẽ được chuyển sang môi trường rắn để tạo thành macrocallus, tùy thuộc vào từng loại cây trồng mà sử dụng loại môi trường khác nhau. Cho tới khi kích thước calli đạt tiêu chuẩn thì cấy chuyển sang môi trường tái sinh để tạo chồi và cuối cùng tạo cây hoàn chỉnh.