NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 TÁI TỔ HỢP TRÊN MỘT SỐ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 TÁI TỔ HỢP TRÊN MỘT SỐ HỆ THỐNG TẾ BÀO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9420101.21 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp sở chấm luận án tiến sĩ họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN vào hồi: .giờ .phút, ngày .tháng .năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thụ thể neurokinin - (viết tắt NK1R) nói riêng thụ thể kết cặp với G-protein (viết tắt GPCR) nói chung đích tác dụng quan trọng nhiều thuốc Khi NK1R tương tác với chất chủ vận nội sinh dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi thần kinh trung ương, gây trạng thái lo âu triệu chứng giống trầm cảm Trên sở nghiên cứu cấu trúc chức NK1R, nhiều loại thuốc giảm đau cho bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, chống nôn cho bệnh nhân ung thư… hãng dược phẩm đầu tư phát triển thương mại hóa Sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học hướng đích GPCR để phát triển thành thuốc nhu cầu mang tính thời nghiên cứu dược lý học phân tử Có số lượng lớn hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp tổng hợp (được gọi chung thuốc thử) cần xác định đích thụ thể tác dụng chế tác động lên thể Việc sử dụng GPCR tự nhiên nghiên cứu thường gặp khó khăn GPCR tự nhiên biểu mức độ thấp, có nhiều dạng biến thể khác Tuy nhiên, khó khăn khắc phục cách sử dụng tế bào biểu GPCR tái tổ hợp người GPCR tái tổ hợp biểu mức độ cao đầy đủ hoạt tính cung cấp nguồn nguyên liệu dồi cho thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử chức liên kết G-protein Chính vậy, xây dựng mơ hình biểu mạnh GPCR tái tổ hợp người hệ thống tế bào động vật nghiên cứu cấp thiết có giá trị thực tiễn giới Việt Nam -1- Mặc dù nhiều hệ thống biểu phát triển, đến biểu hiệu suất cao chủ động protein xuyên màng tế bào thách thức lớn Có thuận lợi GPCR dù đa dạng trình tự axit amin song có cấu trúc không gian tương đồng lớn (đều đơn chuỗi polipeptit với miền xuyên màng kị nước); vậy, mơ hình biểu thành cơng cho thụ thể có khả mở rộng áp dụng cho nhiều thụ thể khác, đặc biệt thụ thể họ GPCR Trong hệ thống biểu hiện, hệ thống biểu Semliki Forest virut (viết tắt SFV) ghi nhận hệ thống biểu protein màng tế bào động vật thời gian nhanh Theo tài liệu, hệ thống số hãng dược phẩm (như Hoffman La Roche) ứng dụng biểu cho 100 GPCR phục vụ cho nghiên cứu phát triển thuốc, dòng tế bào tái tổ hợp khơng thương mại hóa thị trường Trong bối cảnh đó, việc ứng dụng làm chủ hệ thống biểu SFV hứa hẹn cung cấp cơng cụ sinh học hữu ích nghiên cứu y sinh dược học Việt Nam Từ tiền đề sở thực tiễn nêu trên, tiến hành thực luận án: “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình biểu thụ thể neurokinin-1 tái tổ hợp số hệ thống tế bào định hướng ứng dụng nghiên cứu phát triển dược phẩm” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Biểu NK1R tái tổ hợp người hoạt động chức dòng tế bào tự nhiên vốn không biểu thụ thể nhằm ứng dụng bước đầu cho sàng lọc hoạt chất dịch chiết dược liệu hướng đích NK1R Qua đó, xây dựng mơ hình biểu thụ thể -2- tái tổ hợp cho GPCR dòng tế bào động vật khác phục vụ cho nghiên cứu phát triển dược phẩm Việt Nam 2.2 Mục tiêu cụ thể (1) Xây dựng quy trình kỹ thuật biểu NK1R tái tổ hợp người thông qua hệ thống biểu SFV dòng tế bào động vật (2) Đánh giá hoạt động chức NK1R tái tổ hợp biểu tế bào động vật (3) Áp dụng tế bào động vật biểu thụ thể NK1R để bước đầu sàng lọc số dược liệu tiềm Nội dung nghiên cứu (1) Phát triển hệ vectơ SFV biểu NK1R tái tổ hợp người (2) Ni cấy lựa chọn dịng tế bào nhân chuẩn phù hợp cho việc biểu NK1R tái tổ hợp (3) Xây dựng quy trình biểu NK1R tái tổ hợp người dòng tế bào động vật có vú (4) Đánh giá mức độ biểu hoạt tính chức NK1R tái tổ hợp (5) Tạo lượng lớn tế bào biểu NK1R tái tổ hợp người với đầy đủ chức năng, ứng dụng bước đầu nghiên cứu dược lý in vitro thụ thể NK1R tái tổ hợp với dịch chiết methanol tinh chất 10 lồi dược liệu Việt Nam Những đóng góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống biểu thụ thể màng người tái tổ hợp, từ xây dựng vectơ chuyển gen mã hóa NK1R người đến biểu thụ thể tái tổ hợp dòng tế bào động vật có vú Kết đánh giá hoạt tính sinh học hoạt chất hướng đích NK1R in vitro luận án có giá trị khoa học thực tiễn Dòng tế bào động vật biểu thụ thể -3- tái tổ hợp người mà dạng tự nhiên không biểu công cụ đại hiệu phục vụ cho nghiên cứu y sinh học Hệ thống biểu SFV thiết lập để tạo dòng tế bào biểu mạnh NK1R lần Việt Nam Đây sở biểu thụ thể có khả mở rộng áp dụng biểu cho nhiều GPCR khác Mô hình sàng lọc in vitro hoạt chất hướng đích NK1R xây dựng công cụ mới, đại phục vụ cho nghiên cứu dược lý, phù hợp với định hướng phát triển thuốc dược liệu Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Về mặt khoa học Gen mã hóa NK1R người biểu thành cơng dịng tế bào CHO, mở hướng nghiên cứu kỹ thuật biểu ổn định thụ thể tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu cấu trúc phân tử, dược lý in vitro, góp phần định hướng cho nghiên cứu phát triển thuốc giai đoạn sau (nghiên cứu dược lý in vivo, nghiên cứu lâm sàng, ) Cơ sở khoa học hiệu kỹ thuật chuyển gen, biểu protein tái tổ hợp với hệ thống biểu SFV khẳng định thông qua việc phát triển thành cơng vectơ SFV mang gen mã hóa NK1R người biểu hiệu tế bào động vật Về mặt thực tiễn Hệ thống tế bào biểu NK1R có hoạt tính sử dụng nghiên cứu dược lý in vitro ứng dụng để sàng lọc các hoạt chất hướng đích thu từ nguồn dược liệu khác Việt Nam Nghiên cứu mở triển vọng ứng dụng thực tiễn phát triển thuốc dược liệu, tiêu chuẩn hoá đại hố -4- sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, góp phần phát huy mạnh nguồn tài nguyên dược liệu phong phú Việt Nam Không biểu hiệu protein thụ thể, hệ thống SFV xây dựng nghiên cứu cịn cơng cụ hữu ích để chuyển gen biểu loại protein khác dòng tế bào động vật Nhiều nghiên cứu khác giới cho thấy cơng cụ có tiềm ứng dụng liệu pháp gen trị liệu ung thư hay công nghệ sản xuất vắc-xin CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án có 153 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành chương, phần: Mở đầu (05 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang), Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (19 trang), Chương 3: Kết nghiên cứu (28 trang), Chương 4: Bàn luận kết nghiên cứu cứu (28 trang), Kết luận kiến nghị (02 trang), Các cơng trình công bố liên quan đến luận án (01 trang), Tài liệu tham khảo (23 trang), Phụ lục (12 trang) Luận án có bảng, 39 hình tham khảo 173 tài liệu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) thụ thể kết cặp G - protein (GPCR); (2) Tachikinin thụ thể neurokinin; (3) Sự biểu NK1R dòng tế bào; (4) Các hệ thống biểu thụ thể tái tổ hợp, (5) Sơ lược thuốc thử nghiệm nghiên cứu Có bốn siêu họ thụ thể chính, đó, GPCR siêu họ thụ thể lớn đa dạng người (Lundstrom K., 2009) Theo thống kê năm 2017, 108 GPCR đích tác dụng 475 (chiếm khoảng 34%) thuốc Cơ quan Quản lý Thực phẩm Thuốc Hoa Kỳ -5- phê duyệt Tổng doanh thu thuốc giới lên đến 180 tỷ đô la Mỹ tương ứng 27% thị phần năm (Hauser A.S., 2017) Do liên quan đáng kể đến sinh lý bệnh thể giá trị khám phá dược lý, GPCR đích nghiên cứu thuốc có giá trị quan tâm nhiều Tuy vậy, nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc sử dụng GPCR tự nhiên gặp nhiều trở ngại Cụ thể, GPCR tự nhiên thường biểu mức độ thấp, đồng thời có nhiều dạng phụ khác dạng biến thể khác dẫn đến nhận định khơng xác khả tương tác với thuốc thử (Lankiewicz S., 1998; Hassaine G., 2006, Lundstrom K., 2006) Thêm nữa, dòng tế bào tự nhiên thường biểu tín hiệu yếu với nhiều loại thụ thể GPCR nên phép đo xác định thơng số dược lực học phân tử có kết sai số lớn Dễ dàng nhận thấy khó khăn khắc phục cách sản xuất tế bào biểu protein GPCR tái tổ hợp người dùng chúng làm đích phân tử cho thí nghiệm nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc Bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, đích phân tử protein có giá trị dược lý quan trọng (kể dạng phụ hay biến thể loại) phân lập, nhân dòng chủ động sản xuất lượng đủ lớn phục vụ cho nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc (Hassaine G., 2006) Hiện nay, GPCR tái tổ hợp nghiên cứu biểu hệ thống dịch mã phi tế bào, hệ thống biểu tế bào nhân sơ nhân chuẩn Trong đó, hệ thống biểu Semiliki Forest virut (viết tắt SFV) đánh giá hệ thống có hiệu sản xuất GPCR tái tổ hợp người dòng tế bào động vật Hệ thống tạo lượng lớn thụ thể biểu -6- chức không khác biệt so với dạng tự nhiên Các vectơ SFV đến ứng dụng biểu cho 100 GPCR mức độ biểu phần lớn trường hợp cao đo phối tử đánh dấu lai Western (Lundstrom K., 2006) Hình 1.11 Các hệ thống vectơ biểu GPCR xây dựng SFV (A) Hệ thống gồm vectơ biểu vectơ hỗ trợ (B) DNA vectơ có độ dài đầy đủ hệ gen SFV (C) Các vectơ DNA biểu biến nạp trực tiếp vào tế bào động vật có vú để biểu GPCR Thụ thể neurokinin-1 (viết tắt NK1R) thuộc phân họ thụ thể tachykinin, thuộc họ thụ thể A (họ thụ thể lớn siêu họ GPCR) Ở hệ thần kinh trung ương, NK1R đóng vai trị định sống tế bào thần kinh, tham gia điều hịa phản xạ nơn, chức tim mạch, hô hấp điều chỉnh hành vi phản xạ (Ebner K cs, 2006; Marieke V.D.H., 2009) Hiện nay, nhiều chất -7- đối vận với NK1R phát triển thành thuốc dùng cho giảm đau điều trị đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho bệnh nhân ung thư, … Một số nghiên cứu chất đối kháng thụ thể NK1, sau liên kết với thụ thể NK1 có tác dụng chống ung thư ức chế tăng sinh, xâm lấn, di cư tế bào ung thư cảm ứng tế bào ung thư chết theo chu trình (Berger M cs, 2014; Munoz M cs, 2015) Mười thuốc lựa chọn cho thử nghiệm đánh giá tương tác với thụ thể NK1R dựa kinh nghiệm dân gian tài liệu y học cổ truyền Ngoài canhkina loài ngoại nhập, chín lồi cịn lại thuốc Việt Nam sử dụng nhiều thuốc y học cổ truyền Ngoại trừ Râu mèo chọn ngẫu nhiên, thuốc lại chọn dựa tác dụng chúng liên quan đến tác dụng sinh lý biết NK1R an thần, giảm đau, kháng viêm, chữa thấp khớp, hen suyễn, tăng cường miễn dịch, chống nôn, tăng co giãn trơn, thúc đẩy phân bào Trong nghiên cứu này, giả thiết ban đầu tác dụng thuốc liên quan đến NK1R CHƯƠNG VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vectơ pEGFP-NK1 pJET1.2-NK1 mang cDNA mã NK1R PGS TS Võ Thị Thương Lan (Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp Vectơ pSFV2 pSFVHelper2 quà tặng TS Ghérici Hassain (Trường Đại học Công nghệ Liên Bang Laussane, Thụy Sĩ) Chủng vi khuẩn E.coli DH5α mua từ Invitrogen (Mỹ) Các dòng tế bào động vật có vú: BHK-21 (Tế bào thận chuột Hamster -8- 2.2.6 Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol tinh chất số dược liệu Việt Nam thụ thể NK1 tái tổ hợp Trong phép thử Fura 2AM đánh giá tương tác thụ thể phối tử, thuốc thử thử với với ba lần lặp lại vùng nồng độ 10-1 - 103 g/mL với dịch chiết methanol 10-3 - 103 M với tinh chất Các giá trị thu từ nồng độ thuốc thử dùng để dựng đường cong liều lượng - đáp ứng phần mềm Graph Prism 6.01 theo mơ hình sigmoid Thơng số động học thuốc thử (EC50/Kd chất chủ vận IC50/Ki chất đối kháng) xác định qua đường cong liều lượng - đáp ứng CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phát triển vectơ SFV biểu NK1R Hình 3.1 Vị trí mồi dùng nhân dịng đoạn chèn mã cho NK1R vectơ pSFV2-EGFP-NK1 pSFV-KLEPT1.2-NK1 NK1: gen mã cho neurokinin-1, EGFP: gen mã cho protein huỳnh quang lục mạnh, OM6: đoạn trình tự mã hóa cho Flag, polyHistidin vị trí Thrombin Các cặp mồi phục vụ cho sàng lọc vectơ SFV mang gen mã NK1R thiết kế với vị trí mơ tả Hình 3.1 Khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 chiều vectơ tạo sản phẩm colonyPCR có kích thước khoảng 900 bp - 11 - Hình 3.4 Kết sàng lọc khuẩn lạc mang vectơ tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 Kết ni cấy đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin khuẩn lạc E.coli biến nạp: (A) hỗn hợp nối pSFV-KLEPT1.2-NK1; (B) hỗn hợp nối chứa pSFV-KLEPT1.2 mở vòng (C) Kết điện di sản phẩm colony - PCR với cặp mồi SFV-F2/NK1R-R2: (-): đối chứng âm (PCR E.coli không biến nạp); (+): đối chứng dương; 1-5: sản phẩm colony - PCR với mồi SFV-F1 NK1R2; M1: thang chuẩn DNA 1kb Hình 3.6 Kết sàng lọc khuẩn lạc mang vectơ tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1 Kết ni cấy đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin khuẩn lạc E.coli biến nạp: (A) hỗn hợp nối pSFV- EGFP -NK1; (B) hỗn hợp nối chứa pSFV2 mở vòng (C): Kết điện di sản phẩm colony - PCR với cặp mồi SFVF1/NK1R-R2: (-): đối chứng âm (PCR E.coli không biến nạp); (+): đối chứng dương; 1-4: sản phẩm colony - PCR với mồi SFV-F1 NK1R2; M1: thang chuẩn DNA 1kb Kết giải trình tự đoạn chèn vectơ cho thấy đoạn chèn mã cho NK1R, có độ tương đồng 100% với trình tự cDNA mã NK1R vectơ nhân dịng pJET1.2-NK1 Như chúng tơi tạo - 12 - thành công vectơ biểu pSFV chèn cDNA mã hóa NK1R có chiều dài đầy đủ 3.2 Phiên mã in vitro từ vectơ biểu vectơ hỗ trợ Hình 3.7 Kiểm tra chất lượng DNA plasmit mở vòng sản phẩm RNA phiên mã in vitro gel agraose 1% M1: thang chuẩn DNA 1kb; pS: DNA plasmit pSFV- KLEPT1.2-NK1R mở vòng enzym NruI (kích thước khoảng 11,9 kb); pH: DNA plasmit pSFV-Helper2 mở vịng enzym SpeI (kích thước khoảng 8,2 kb); mS: RNA pSFV- KLEPT1.2-NK1R phiên mã in vitro; mH: RNA pSFV-Helper2 phiên mã in vitro Kết điện di Hình 3.7, pS (DNA plasmit pSFVKLEPT1.2-NK1R mở vòng enzym NruI) pH (DNA plasmit pSFV-Helper2 mở vòng enzym SpeI) thu băng DNA tương đồng với kích thước lý thuyết Kết điện di sản phẩm RNA tạo từ vectơ pSFVKLEPT1.2-NK1R pSFV-Helper2 có độ đặc hiệu cao, sản phẩm phiên mã hoàn tồn với độ dài đầy đủ; khơng có vệt băng kéo dài phản ứng phiên mã khơng hồn tồn 3.3 Tạo hạt SFV mang gen NK1R người Ở bước tạo hạt virut, hai đoạn RNA tạo từ pSFVNK1R pSFV-Helper2 đồng biến nạp vào tế bào BHK-21 - 13 - phương pháp xung điện với điều kiện sau tối ưu hiệu điện kiểu bắn xung trình bày Bảng 3.2 Sau lần lặp lại thí nghiệm tối ưu kết quan sát lô tạo hạt virut sau đó, chúng tơi nhận thấy tượng tan bào BHK-21 ổn định sau 42 Chính vậy, 42 sau chuyển gen xung điện thường lựa chọn thời điểm thu hạt virut từ mơi trường ni cấy sử dụng màng lọc 0.22 µm Bảng 3.2 Chế độ xung điện đồng biến nạp RNA hệ SFV vào tế bào BHK-21 thiết bị Gene pulser Xcell II Bình ni T75 (chứa BHK-21) Bình tạo virut (bổ sung RNA) Đối chứng vật lý (không RNA) Đối chứng sinh học (không RNA) Kiểu bắn xung Phân rã theo hàm mũ Phân rã theo hàm mũ - Trở Số lần Hiệu điệu kháng bắn (V) (µF) xung 75 360 75 360 - - Thời gian (ms) 0.9 Mật độ virut tạo từ pSFV-KLEPT1.2-NK1 sau đặc thu trung bình 34,9 ng/mL tương ứng khoảng 50  1010 (hạt virut/mL) với OD260/280 1,04 ± 0,2 Mật độ virut tạo từ pSFVEGFP-NK1 sau đặc trung bình 32,6 ng/mL tương ứng khoảng 46,9  1010 (hạt virut/mL) với OD260/280 1,24 ± 0,3 3.4 Ni cấy chọn dịng tế bào biểu NK1R tái tổ hợp Kết lai Western thể Hình 3.9 cho thấy dòng tế bào U937, HeLa, HEK-293 xuất băng có kích thước phù hợp với thụ thể NK1R (khoảng 46 kDa) Trong dịng tế bào ni cấy, có dịng tế bào CHO khơng biểu NK1R dạng tự nhiên lựa chọn để biểu NK1R tái tổ hợp người - 14 - Hình 3.9 Biểu NK1R số dòng tế bào A: Kết lai Western số dòng tế bào với kháng thể kháng neurokinin kháng thể kháng beta actin, kí hiệu tên dịng tế bào phân tích B: Mức độ biểu NK1 dòng tế bào (trung bình ± độ lệch chuẩn) 3.5 Đánh giá biểu NK1R tái tổ hợp tế bào CHO 3.5.1 Đánh giá động học biểu protein Kết quan sát tế bào CHO cho thấy tế bào biểu eGFP mạnh sau 24 đến 48 lây nhiễm virut SFV mang gen eGFP tái tổ hợp Như vậy, tế bào CHO sử dụng nghiên cứu liên quan đến biểu protein tái tổ hợp khoảng thời gian từ 24 đến 48 sau lây nhiễm virut SFV Hình 3.10 Ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào CHO lây nhiễm virut SFV mang gen eGFP tái tổ hợp Ảnh chụp tế bào sau lây nhiễm hạt SFV-eGFP 24 (A) 48 (B) - 15 - 3.5.2 Kiểm tra biểu NK1R tế bào CHO qua lai Western Kết băng lai Western Hình 3.12 cho thấy có dịng tế bào CHO-NK1R xuất băng tương ứng với kích thước thụ thể NK1R 46 KDa Như vậy, biểu thành công thụ thể NK1 người dòng tế bào CHO mà dạng tự nhiên không biểu thụ thể thơng qua hệ thống biểu SFV Hình 3.12 Ảnh lai Western với kháng thể kháng beta-III-tubulin kháng thể kháng neurokinin tế bào CHO tự nhiên tế bào CHO nhiễm hạt SFVNK1R CHO: mẫu tế bào CHO tự nhiên; CHO -NK1R: mẫu tế bào CHO phân tích 24 sau lây nhiễm hạt SFVNK1R; M: thang chuẩn PageRuler Prestained Protein 3.5.3 Phép thử chức thụ thể Fura-2AM Với phép thử chức thụ thể phương pháp Fura-2, Lượng Ca2+ giải phóng tính từ tỉ số F340/F390 tăng SP kích thích cho thấy tế bào CHO-NK1R biểu thụ thể có chức truyền tín hiệu (đường số , Hình 3.13), tế bào CHO khơng lây nhiễm virut SFV khơng có đáp ứng tế bào suốt thời gian đo dù bổ sung SP (đường số , Hình 3.13) Từ kết lai Western Fura-2, CHO lây nhiễm hạt virut SFV khẳng định biểu thành công thụ thể NK1R hoạt động chức năng, sẵn sàng sử dụng cho nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc - 16 - Hình 3.13 Sự thay đổi Ca2+ nội bào tế bào CHO CHO-NK1R theo thời gian sau bổ sung chất P SP bổ sung trước đo Đường số ) kết đo với tế bào CHONK1R Đường số  kết đo với tế bào CHO tự nhiên đối chứng 3.6 Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol tinh chất số dược liệu Việt Nam thụ thể NK1 tái tổ hợp 3.6.1 Xác định thông số dược lực học chất chủ vận chất đối kháng đặc hiệu NK1R Kết Hình 3.14 cho thấy tế bào CHO không lây nhiễm virut (CHO đối chứng) khơng có đáp ứng tế bào xảy xử lý với SP nồng độ Trong đường số , nồng độ SP tăng từ 10-12 đến 10-5M tế bào CHO lây nhiễm SFVNK1R xuất đáp ứng nội bào, thể qua lượng Ca2+ giải phóng tăng theo hàm sigmoit trở nên bắt đầu bão hòa nồng độ cao SP (10-7 đến 10-6 M) Từ hàm hồi quy thu được, xác định Kd SP 7,32 ± 1,24 nM, thuộc vùng nanomol, giống phần lớn phối tử đặc hiệu tương tác với thụ thể GPCR nói chung (Kroeze W.K.,2003; Marinissen M.J.,2001) thụ thể tachykinin (NK-1R, NK-2R NK3-R) nói riêng (Almeida Ta,2004; Pannefather Jn, 2004) Từ kết xác định EC80 (nồng độ kích thích thụ thể đạt 80% hoạt độ tối đa) SP  10-7M Trong điều kiện có mặt 10-7M SP, chúng tơi bổ sung nồng độ tăng dần từ 10-12 đến 10-5M chất đối kháng đặc - 17 - hiệu AP Ở kết thể đường số  Hình 3.14, hoạt độ thụ thể giảm rõ rệt nồng độ AP tăng dần Qua đó, chúng tơi xác định giá trị Ki AP thơng qua Phương trình Cheng-Prusoff mơ hình tế bào CHO-NK1R nghiên cứu 41,1 ± 9,90 nM, thuộc vùng nanomol Hình 3.14 Đường cong đáp ứng theo liều thể hoạt tính biểu chức thụ thể NK1R tái tổ hợp người Trong thí nghiệm sơ cấp, dịch chiết methanol tinh chất 10 loài thuốc chọn cho nghiên cứu thử nghiệm với tế bào CHO lây nhiễm SFV-NK1R không gây đáp ứng tăng sinh Ca2+ nội bào nồng độ thử nghiệm dải từ đến 1000 g/mL (được chuẩn bị theo dãy Log10) Điều chứng tỏ khơng có dịch chiết lồi thuốc có xu hướng biểu hoạt tính chủ vận, hay hoạt hóa thụ thể Từ kết sơ đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm thứ cấp với giả thiết dịch chiết/ tinh chất có hoạt tính đối kháng thụ thể NK1R Phân tích kết chúng tơi nhận thấy số 10 lồi dược liệu sàng lọc, tính trung bình hoạt độ mạnh - 18 - quan sát thấy loài Bình vơi với giá trị IC50 xác định khoảng từ 4,7  0,21 đến 53,1  1,93 g/mL; giá trị IC50 trung bình (IC50TB) lồi  20,1 g/mL Tiếp theo Hồ tiêu với giá trị IC50 dao động từ 5,7 ± 0,41 đến 60,5 ± 2,77 g/mL (IC50TB  29.9 g/mL) Hòe với giá trị IC50 từ 15,4  0,27 đến 63,5  1,42 g/mL (IC50TB  58.5 g/mL) Nhình chung, dịch chiết methanol lồi khác có hoạt độ yếu (IC50TB > 60 g/mL) với hoạt lực xác định theo trật tự: Cỏ mần trầu (IC50TB  76,1 g/mL) > Râu mèo (IC50TB  93,1 g/mL) > loài Panax (IC50TB  99,2 g/mL) > Đảng sâm (IC50TB  100,1 g/mL) > Canh ki na (IC 50 TB  433,7 g/mL) Riêng dịch chiết Ba Kích, số IC50 khơng xác định tín hiệu huỳnh quang có xu hướng không đổi nồng độ dịch chiết tăng tới 100 g/mL, nồng độ 1000 g/mL tín hiệu tăng đột ngột Vì nồng độ cao dịch chiết nên tượng biểu kiểu tương tác khơng đặc hiệu đó.Tiếp tục phân tích sâu hơn, chúng tơi tìm thấy hoạt độ ức chế mạnh rotundin từ Bình vơi với IC50 xác định 0,88 M Hoạt tính ức chế thấp quan sát thấy capsaicin piperine từ Hồ tiêu với IC50 hai chất vào khoảng 2,0 M Trong đó, rutin không ức chế thụ thể NK1R nông độ tăng cao đến 100 M CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Phát triển vectơ SFV biểu NK1R người tế bào CHO Để biểu thụ thể màng thông qua lây nhiễm hạt SFV, tể bào CHO lựa chọn sử dụng nhiều nghiên cứu hệ thống nội màng phát triển, đồng thời phù hợp cho phép thử tương tác thụ thể tế bào khỏe thời gian sống kể từ lây - 19 - nhiễm virut thường dài so với tế bào HEK-293 BHK-21 (Simmen U., 1999; Sjoeberg M., 2005) Lundstrom K người thiết lập hệ vectơ SFV sử dụng hệ vectơ để biểu NK1R người dòng tế bào CHO từ năm 1994 Phép thử Fura-2 xây dựng nghiên cứu khắc phục hai nhược điểm phép đo nghiên cứu Thứ nhất, nghiên cứu thực phép đo Fura-2 tế bào bám đáy Điều giảm thiểu vỡ tế bào qua lần ly tâm thu tế bào, qua giảm lượng tế bào phải sử dụng nuôi cấy cho phép thử Thứ hai, thực phép thử chức thụ thể Fura-2 thực đĩa 96 giếng cho phép đồng thời thực nhiều phân tích thời điểm, tăng cường hiệu suất sàng lọc thuốc thử Với số lượng thuốc thử có nguồn gốc từ dược liệu tự nhiên tổng hợp lớn nay, phát triển phương pháp sàng lọc thuốc hiệu cao nhu cầu cấp thiết ngành dược phẩm Chỉ số Kd SP Ki AP thu nghiên cứu tế bào CHO-NK1R tương ứng vào khoảng - nM 30 - 50 nM, cao so với số nghiên cứu trước số tìm thấy xấp xỉ nM với SP (Eistetter H., 1992; Steiner D., 1992) hay 150 mg/kg thể trọng), vừa xác nhận tác dụng giảm đau, an thần, gây ngủ động vật thí nghiệm Trong y học đại, rotudin xác định L.tetrahydropalmatin, dùng làm thuốc an thần, gây ngủ, giảm đau, điều trị số trường hợp rối loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh, ngủ dai dẳng nguyên nhân tâm thần Đây tác dụng dược lý biết chất đối kháng thụ thể NK1R apepritant dẫn xuất (Huang S., 2010) Khơng giống rotundin lần xác định có hoạt tính đối kháng NK1R, capsaicin piperine nhiều dẫn xuất thuộc nhóm alkaloit chúng trước tìm thấy có tính đối kháng với thụ thể NK1R Nhiều hãng dược phẩm đăng ký quyền cho chế phẩm từ Hồ tiêu này, kể đến piperidin Janssen, piperazin 4-aminopiperidin Boehringer Ingelheim, DNK333 Novartis, ezlopitant maropitant Pfizer, dapitant Rhone-Poulenc, dẫn xuất phenylpiperidin Hisamitsu Việc dịch chiết Hịe có hoạt độ ức chế NK1R tương đối ổn định, song Rutin khơng có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động thụ thể cho thấy dịch chiết Hịe có thành phần khác tác động lên thụ thể NK1 Hiện không Việt Nam mà giới, xu hướng phát triển thuốc dược liệu có thành phần từ tự nhiên ngày phát triển Khác với thuốc tân dược thường chứa dược chất có chế dược lý biết rõ, dược liệu địa thường có dạng đa chất, gồm hoạt chất chưa rõ chế lẫn với chất - 22 - hoạt tính, chí độc chất Chính vậy, việc tiêu chuẩn hố phát triển sản phẩm thuốc có nguồn gốc tự nhiên địi hỏi cấp bách q trình đại hố, cơng nghiệp hố y học cổ truyền Muốn vậy, nghiên cứu nhằm xác định chế tác dụng thuốc, phát mục tiêu tác dụng thuốc, xác định hợp chất có hoạt tính sinh học cần phải triển khai cách tồn diện có hệ thống Đối với dược liệu tự nhiên, phép thử sinh học tương tác với protein thụ thể đồng thời giúp dự đoán xác định chế tác dụng dược lý dược liệu đích dược lý phân tử thành phần dược liệu Theo đó, mơ hình sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học nghiên cứu dược lý sở mơ hình đánh giá tương tác với GPCR tái tổ hợp người có nhiều tiềm cần quan tâm thúc đẩy KẾT LUẬN Đã thiết lập hệ thống quy trình kỹ thuật biểu thụ thể neurokinin-1 (NK1R) tái tổ hợp người thông qua hệ vectơ biểu Semliki Forest Virut (SFV) cải biến Quy trình tạo hạt SFV mang gen mã hóa NK1R thông qua đồng biến nạp xung điện RNA phiên mã in vitro từ vectơ SFV biểu vectơ hỗ trợ vào tế bào BHK-21 cho phép tạo khoảng 50  1010 hạt virut/mL sau 42 chuyển gen Sau 24 - 48 lây nhiễm hạt SFV, lượng lớn tế bào CHO biểu NK1R tái tổ hợp tạo sẵn sàng cho nghiên cứu dược lý Trong bốn dịng tế bào ni cấy CHO, U937, HeLa HEK293, dòng CHO dạng tự nhiên không biểu NK1R phù hợp để biểu NK1R tái tổ hợp người Nồng độ Ca2+ nội bào NK1R tái tổ hợp biểu tế bào CHO tương - 23 - tác với chất chủ vận (chất P) giảm thụ thể tương tác với chất đối kháng (aprepitant) cho thấy thụ thể có hoạt tính chức đầy đủ Mơ hình đánh giá tương tác dược lý phân tử đích NK1R với dịch chiết methanol số tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam thử nghiệm Mối tương quan dược lực in vitro dịch chiết Bình vơi thụ thể NK1R hàm lượng Rotundin bước đầu tìm thấy Hoạt lực ức chế NK1R Rotundin tương đối mạnh (IC50 = 0,88 M) cho thấy NK1R nhiều khả đích dược lý phân tử quan trọng chất Hoạt độ đối kháng NK1R tương đối ổn định với dịch chiết Hồ tiêu (IC50 khoảng 5,7 60,5 g/mL) Hòe (IC50 khoảng 15,4 140,6 g/mL) NK1R khơng phải đích tác động phân tử theo chế đối kháng thụ thể dịch chiết methanol Canhkina, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Râu mèo, Ba kích Đảng sâm KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Mở rộng áp dụng thụ thể NK1R tái tổ hợp tạo từ đề tài nghiên cứu dược lý loài dược liệu khác Việt Nam Áp dụng mở rộng nhân dòng biểu thụ thể GPCR khác có vai trị dược lý quan trọng phục vụ cho nghiên cứu dược lý phân tử phát triển thuốc Việt Nam Phân lập biểu dạng biến dị phổ biến, đặc trưng gen mã thụ thể GPCR người Việt Nam nhằm làm sáng tỏ mối quan hệ phần lớn chưa biết đầy đủ cấu trúc gen hoạt động chức thụ thể - 24 - DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Long Doan Dinh, Nhung Hong Thi Pham, Nhung My Thi Hoang, Cuong Trinh Tat, Van Hong Thi Nguyen, Lan Thuong Thi Vo, Huyen Thanh Pham, Kenneth Lundstrom (2015), “Expression of Human Neurokinin-1 Receptor in CHO Cells to Evaluate Involvement with Vietnamese Medicinal Plant Extracts”, 12th Protein Expression in Animal Cells, pp.175 Long Doan Dinh, Nhung Hong Thi Pham, Nhung My Thi Hoang, Cuong Trinh Tat, Van Hong Thi Nguyen, Lan Thuong Thi Vo, Huyen Thanh Pham, Kenneth Lundstrom (2015), “Interaction of Vietnamese Medicinal Plant Extracts with Recombinantly Expressed Human Neurokinin-1 Receptor”, Journal of Planta Medica Letters 2(1), pp e42 - e47 Tác giả phụ Bằng độc quyền sáng chế: “Quy trình sản xuất dịng tế bào biểu thụ thể Neurokinin-1 người (hNK1R)” Cấp theo Quyết định số 49722/QĐ-SHTT, ngày 25/07/2017 Cục Sở hữu Trí tuệ (Bộ Khoa học Công nghệ, Việt Nam) Phạm Thị Hồng Nhung, Đinh Đoàn Long (2018), “Xây dựng mơ hình sàng lọc invitro hoạt chất hướng đích dựa thụ thể hệ thần kinh trung ương tái tổ hợp”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 34(1), tr.105-110 ... góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống biểu thụ thể màng người tái tổ hợp, từ xây dựng vectơ chuyển gen mã hóa NK1R người đến biểu thụ thể tái tổ hợp dòng tế bào động vật... nhân chuẩn phù hợp cho việc biểu NK1R tái tổ hợp (3) Xây dựng quy trình biểu NK1R tái tổ hợp người dòng tế bào động vật có vú (4) Đánh giá mức độ biểu hoạt tính chức NK1R tái tổ hợp (5) Tạo lượng... NK1R tái tổ hợp biểu tế bào động vật (3) Áp dụng tế bào động vật biểu thụ thể NK1R để bước đầu sàng lọc số dược liệu tiềm Nội dung nghiên cứu (1) Phát triển hệ vectơ SFV biểu NK1R tái tổ hợp người