Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xác định độc lực của rắn lục đuôi đỏ và tác động gây loét trên chuột

NHIEM VỤ VÀ NỘI DUNG: + Xác định thành phần gây độc và hoạt tính sinh học của nọc răn lục đuôi đỏ+ Tinh sạch Serine protease từ noc ran luc.. TÓM TAT LUẬN VĂNLở loét và hoại tử mô tại ch

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCMTRUONG ĐẠI HỌC BACH KHOA

NGUYEN TAN HIEP

XÁC ĐỊNH DOC LUC CUA RAN LUC ĐUÔI DOVA TAC DONG GAY LOET TREN CHUOT

Chuyén nganh: CONG NGHE SINH HOCMã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨHướng dẫn khoa học: PGS.TSKH NGUYEN LE TRANG

PGS TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG

TP HO CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014

Công trình được hoàn thành tại: Trường ĐH Bách Khoa- ĐHỌG-TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG

Cán bộ hướng dẫn khoa học 2: PGS.TSKH NGUYÊN LÊ TRANG

Thành phân Hội đồng đánh giá Luận văn thạc sĩ gồm:

(ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng khoa quản lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯƠNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: Nguyễn Tan Hiệp - 5-5-5: MSHV: 12310730

Ngày, tháng, năm sinh: 30/08/1978 - cccc c2 Nơi sinh: Khánh Hòa

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học - Mã số : 604280 I TÊN ĐÈ TÀI: Xác định độc lực của rắn lục đuôi đỏ và tác động gây loét trên chuột II NHIEM VỤ VÀ NỘI DUNG:

+ Xác định thành phần gây độc và hoạt tính sinh học của nọc răn lục đuôi đỏ+ Tinh sạch Serine protease từ noc ran luc

+ Thử nghiệm trung hòa noc va huyết thanh khang noc dé xác định kết quả ly giải

máu vùng dưới da chuột.

Ill NGÀY GIAO NHIỆM VU : (Ghi theo trong QD giao dé tài) 19/08/2013IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QD giao dé tai) 23/05/2014V CÁN BỘ HUONG DAN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):

1/ PGS.TSKH Nguyễn Lê Trang2/ PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Tp HCM, ngày 06 thang 8 năm 2014

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA (Họ tên và chữ ký)

LỜI CÁM ƠN

`Đề hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiễu sự giúp đỡ, động 5

viên của các Thay Cô, gia đình và bạn bè.Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thay Nguyễn LêTrang và cô Nguyễn Thúy Hương Thay và Cô đã hết lòng hướng dan, chỉbao, động viên và tao mọi điều kiện thuận lợi cho tôi suốt qua trình thực hiệndé tài Thay là người day cho tôi cách nhìn về cuộc sống, học tập và nghiêncứu Cô là người truyền đạt cho tôi kiến thức chuyên ngành, tận tụy hướngdân và dạy bảo tôi Tôi cảm thấy mình may mắn và hạnh phúc khi được thầyvà cô hướng dân, chỉ dạy

Tôi xin chân thành cam ơn các Thay Cô bộ môn công nghệ sinh học đãtruyện đạt kiến thức chuyên ngành, tiếp thêm hành trang dé tôi tiễn hànhnghiên cứu khoa học.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.DS Nguyễn Thị Nguyệt Thu và các Chiphòng Miễn Dịch học, Viện Pasteur thành phố Hồ Chi Minh Các chị đã tao

mọi điều kiện thuận lợi dé tôi thực hiện dé tài nay.Tôi xin chân thành cam ơn BS.CK1 Nguyễn Thị Hảo, TS.BS Phan BichLiên và toàn thê phòng Xét nghiệm, Bệnh Viện Đại Học Y Dược Cơ sở 1thành phố Hồ Chi Minh Các anh chị dong nghiệp đã động viên và tạo diéukiện về thời gian cho tôi học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi xin cảm ơn các bạn trong lớp cao học khóa 2012, các bạn đã độngviên giúp đồ khi tôi gặp khó khan.

Cuối cùng, con xin cảm on công sinh thành và nuôi dưỡng của Ba Me vàgia đình nhỏ của tôi là điểm twa vững chắc, tiếp thêm sức mạnh giúp tôi datkết quả tốt nhất trong học tập và trong cuộc sống

Nguyễn Tan Hiệp

TÓM TAT LUẬN VĂNLở loét và hoại tử mô tại chỗ còn là một vẫn đề mà kháng huyết thanh không đemlại hiệu lực tác dụng nào, đặc biệt với nhiễm độc nọc răn lục đuôi đỏ Hiện nay, chưacó một nghiên cứu nào ở Việt Nam báo cáo vé tác động gây loét khi bị rắn lục cắn.

Xác định thành phần gây độc chính trong noc ran lục đuôi đỏ (Trimeresurusalbolabris) và các yếu tô ảnh hưởng Độc lực, liều gây tôn thương được tiễn hànhkhảo sát trên chuột và hiệu lực trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc toàn phần củakháng huyết thanh kháng nọc

Tinh sạch serine protease từ noc ran luc bang hệ thống sắc ký tự độngAKTAexplorerTM 100 Air và sắc ký ái lực gắn Benzamidine-Sepharose Thí nghiệmtrên chuột thông qua đường tiêm i.v (intravenous), s.c (subcutaneous) và giải phẫuvùng da bị xuất huyết

Nọc rắn lục gây xuất huyết tại chỗ được chứng minh rõ ràng, độ tram trọng lệthuộc vào liều nọc Độc lực của nọc rắn lục được xác định qua đường tiêm fĩnh mạchđuôi chuột (20g +2, N=5): LDzo = 9,27 wg nọc/chuột (0,464 e/g) Liều noc tối thiểugây xuất huyết đường kính 10mm vùng dưới da chuột MHD (Minimum HemorrhagicDose) = 2 ue/ chuột Hiệu lực trung hòa 3 liều nọc MHD của kháng huyết thanh là1,175 ug (protein kháng huyết thanh) Enzyme serine protease trong noc ran lục đãđược tỉnh chế qua cột Benzamidine Sepharose 6B và chiếm tỉ lệ 8,72 % (gprotein/100g noc).

Sự hiện diện với tỷ lệ dang kể của serine proteinase trong noc là nguy co tiémnăng hoạt hóa nhiều hệ thống tiền enzyme trong co thé của nan nhân: hệ thống bổthể, hệ thống cầm máu, gây hoại tử và biến chứng Nghiên cứu cho thấy tác động gâyxuất huyết của serine protease và khả năng trung hòa hoạt tính enzyme băng khánghuyết thanh đặc hiệu

Huyết thanh trị liệu không mang lại hiệu quả đối với xuất huyết tại chỗ và biénchứng hoại tử Phương pháp mới kháng hoạt tính protease cần được triển khai, cụ thểlà bất hoạt tiền enzym có hoạt tính protease tại chỗ

Local tissue necrosis is a important problem when patients was bite byTrimeresurus albolabris because treating with antiserum is not effected There hasn’tbeen any study of necrotizing activity with 7 albolabris bite in Vietnam.

Identification of serine protease activities in Trimeresurus albolabris venomand its affecting Venom’ toxin strength, minimum haemorrhagic dose were test ofmice injected and neutralization of enzyme activities of Trimeresurus albolabrisvenom by antivenom.

Serine protease was purified from viper venom by AKTAexplorerTM 100 Airaffinity chromatography system and by affinity chromatography on Benzamidine -Sepharose, tested on mice via I.V (intravenous), s.C (subcutaneous) injection andhaemorrhagic spot in mice local tissue necrosis were identified.

The venom obviously causes local haemorrhage The LDzo of the venom wasdetermined by i.v injections of different doses into the caudal vein of mice (20+2,N=5): LDso = 9.27 wg (0,464 weg/g) MHD (Minimum Hemorrhagic Dose) is 2.0wg/20g Neutralization of 3MHD (6.0 7g) needed 1,175 wg antivenom protein The

yield of Serine protease occupied 8.72 % of venom protein.

The venom serine protease potentially activates hemostatic zymogen systemsand causes local necrosis Results showed haemorrhagic activities of serine proteaseand neutralization of enzyme activities by specific antivenom.

Antivenom treatment is not effective for local heamorrhage and necrosis Newmethods against protease activities need to be developed, specially against theactivation of local protease zymogen.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sô liệu, kêt quảnêu trong luận văn là trung thực Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của minh.

Nguyễn Tan Hiệp

MỤC LỤC

LOL CẢM ƠN on HH HeeTOM TAT LUẬN VĂN G111 121v 111191111 11110121 11111211 ng ng ri iiLOL CAM DOAN ch HH HH iv18/9080 VvDANH MỤC CAC CHU VIET TAT wueecccccccccscesecscecesessesscesesvecscececeseversceceseesevevees viiiDANH MỤC CÁC HINH eccecccssececesessesscscececcssevscscecscevavscecseseevavecevevavaceceaevavacees ixDANH MỤC CAC BANG wuucceccssssscscecescssscscscecscsevscacscecsecavacaceceesevsvacesevavacaceceeavavacees X90I0/9)I9110.i009.100075 |1.1 Tinh cấp thiết của dé tài - 5< Set 1E 121 1215111111111 11111111 re |I.2 Mục tiêu nghiÊn CỨU Ăn re 21.3 Nội dung nghiên CỨU G0 re 3CHUONG 2: TONG QUAN TAL LIỆU - <2 << 2 2S SESESE‡EEE£EeEeEeEeEerrrees 42.1 SINH HỌC VỀ LOÀI RAN LUC VÀ NOC ĐỘC -cccscxsecee 42.1.1 Sinh hoc vé ho ran luc 4772z:./.27 42.1.1.1 Đặc điểm loài cccccth the 42.1.1.2 Nanh noc và chức năng gây độc - c1 k, 42.1.1.3 Phân loại họ rắn ÌỤC -c <6 x11 ree 52.1.1.4 Ran lục đuôi đỏ (Trimeresurus qÌbolqbFi$) «« «<2 92.1.2 Nộc độc và độc LUC - CC 1131111010100 221111111111 111 nen 102.1.2.1 NOC đỘC cQQQ HH ngu 102.1.2.2 DOC lỰC LH ng nà 102.2 VAI TRÒ VÀ HOAT ĐỘNG CHỨC NĂNG PROTEASE 112.2.1 Đại cương VỀ ©ñZyI - + 6E 3E EEESE E915 5212111515111 ee, 1]2.2.1.1 Enzyme và tính đặc hiệu ou cccccccesssseseesesnnceeeeeeeeeeesseeeeeseaes 122.2.1.2 Protease thuộc loại enzyme thuỷ phan (Hydrolase) - 132.2.1.3 Protease thuỷ phân cầu nối Peptide -. 5-s-2 5s 132.2.2 Protease trong noc TAN LUC veeecececeseseseccecscecessecscsceceevecscececsesevacsceceeseees 172.2.3 Vai trò và hoạt động protease noc răn lục đối với cơ thể bị nhiễm độc

2.3 CƠ CHE GAY LOET TẠI CHỎ 6s + E2 EEsESESESESEsEseekseseree 232.3.1 Hệ thống huyết mạch - ¿+ 2E +E+E+E#EEEE£EEESEEEEErErErrrrerkred 232.3.2 Triệu chứng và biến chứng của các nhiễm độc rắn lục 3l2.3.2 Loạn năng máu do rắn LUC CĂP - - xxx E12 neo 32CHUONG 3: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - - 65s +62 £sEsEsesesecee 353.1 THỜI GIAN VA DIA DIEM TIEN HANH THÍ NGHIỆM 35

3.2 VAT LIEU weecccccccccccccscsccscescssesscscescscsecseescsecsecsesscsecsecsecseacsecsecaceasseeaeeaeees 35

3.2.1 Đối tượng nghiên COU cccecccseseeesescscsessesesesssessesesesssesseeeseeeees 353.2.2 THIGt Die ee eeceeceesecseesseeseceseesneesecessecneessccusesucessesneenecueeneeeneenneenseetees 353.2.3 Hóa chất the 363.3 PHƯƠNG PHÁP - cv thhrHhtrrgrrrrrrrrreed 373.3.1 Sơ đồ nội dung thực hiện dé tài - + 2 252 S<cxcesEsrrerereeree 373.3.2 Chuan bị dung dịch noc ran lỤc -. ¿- - 2 2 2 s+s+e+eeczereresree 373.3.3 Phương pháp định lượng prOf€1TI - 5 255555511 seesss 383.3.4 Phương pháp sắc ký ái lực dùng Bezamidine Sepharose 6B để tinh chếserine protease trong NOC rắn LUC ¿-¿- + + + 2 +E+E+E+ESEEEEEEEEEEEEErkrkrrrrees 393.3.6 _ Phương pháp SDS-PAGE 12% — cơ chat gelatine -. Al3.3.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 413.3.8 Phương pháp xác định độc lực qua liều gây tử vong 50% số chuột thí0140119080090 0n 433.3.9 Phương pháp xác định liều gây xuất huyết đường kính 10mm vùngðI1UN3:N9/10100106)/I81Đ)NGƯiddddiiiddddddẳồẳẢẨẢÕŸỶŸẢẲÕ 45CHUONG 4: KET QUÁ -BÀN LUẬN - -EsSSEE SE 111kg retu 464.1 Xác định thành phan gay độc va hoạt tính sinh hoc cua noc ran luc 464.1.1 Xác định độc lực của noc ran lục đuôi đỏ 55 5s se s£sesed 464.12 Xác định liều gây tốn thương đường kính 10 mm vùng dưới da chuột(MHD) 47

4.2 Tinh sạch serine protease từ noc ran luc đuôi đỏ Xác định liều tốn thươngđường kính 10 mm vùng dưới da chuột (MHD) . 55555 <x+2 484.2.1 Khảo sát pH các dung dịch đệm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym 46A22 Sắc ký ái lỰC L.LnTT TT HH2 ưyg 50

4.2.3 Sắc ký trao đổi ion -ccccS St E1 11 111112111111 11 1111211111 re 514.2.5 — Xác định độc lực thành phan khong bam va bam sau khi qua cot trao đôi

ion DEAE Sepharose® CL6B ¿6 121 1211211115111 11111111111 18111 1111 tre 57

4.3 Xác định hiệu lực trung hòa hoạt tinh enzyme trong noc toàn phần của khánghuyết thanh kháng nỌc - ¿5£ +E+EE+E£EEEEEE£E#EEEEEEEEEE 3 E115 21217115511, 58CHUONG 5: KET LUẬN —KIEN NGHỊ, - - 2 + 6 + sE+E+E+E+E£EsEsEseseseree 615.I Kết luận Q.11 1T ng ng HT ng 615.2 Kiến nghi ccecccccccccccccscscscscssescscscscscscscscscsssscscscscscsvssssescsvsssssscsesssssssecseess 61TÀI LIEU THAM KHHẢO G-G- + 66k 939198 E E31 E319 vn ng re 62PHU LUC | , G5562 522% 5 E2EE15E123E151111515 111511111511 11111 1111151101111 Le 68PHU LUC Í ¿5-5-5 SE 2EEE5EE2EEEEEEEE 1 11515 112111511111511 1111111151111 1 1111 69PHU LUC IIL ¿5-5-5 SE SEEEESEEEEEE SE E1 3E E1 151511111511 11511 1111111111111 L0 76CÔNG TRÌNH CÔNG BỒ - ST 1 1 1212111111112111101 010101111111 11 11g 1t 79PHAN LÍ LICH TRÍCH NGANG c3 53128 1E E811 6E EgEgvgEererkes 80

BSADdDIC

DTTHTHTKN

1.V.

KNKTLDsoMHDMNMW

PABPAGEPBS

RL

S.C.

SDSSNEWTLCKWHO

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

Bệnh nhânAlbumin huyết thanh bòDung dịch

Disseminated Intravascular CoagulationDithiothreitol

Huyét thanhHuyét thanh khang noc

Intravenous

Khang nguyénKhang théLethal Dose 50%Minimum Hemorrhagic DoseMién nhiém

Molecular Weightp-aminobenzamidinePolyacrylamide Gel ElectrophoresisPhosphate buffer saline

Ran lucSubcutaneousSodium Dodecyl SulfateSouthern Northern Eastern WesternN-tosyl -L-lysine chloromethyl ketoneWorld Health Organization

DANH MỤC CÁC HÌNHHình 2.1: VỊ trí cho thay trên đầu của Trimeresurus albolabris đặc điểm có hỗ mánăm giữa lỗ mii và MAt ¿ - 2525221 1 E5 1112111511511 111111111511 01 1111011111 re.4Hình 2.2: Hồ má giữa mũi và mắt của răn lục tre -+-5sc+ccs+s+s+ceẻ 4Hình 2.3: White-lipped green pit viper Nanh nọc rắn lục ở phía trước, hàm trên, cóthé di động, kéo ra khi miệng mở, gấp lại dé đóng miệng - 2 255 +: 5Hình 2.4: Taiwan Habu Viper (Trimeresurus mucrosquamatus) được lay noc ở vườnquốc gia Tam Dao, Việt Nam oo.cccccccccccscscsscscscscsscsescssscsssscsessscssssescsssssssssessessesseeees 5Hình 2.5: Sự phát sinh các chủng loài ran 2 2 255222 E2 £E+E£EzEzrrerereee 6Hình 2.6: Trimeresurus albOlaTIS - cọ vế 9Hình 2.7: Sự biến đổi năng lượng qua một phan ứng sinh hóa, chuyển hệ S thành Pvới sự tham Q1a CUA ENZYME - - << 5 99000100 re 12

Hình 2.8: Trypsin, chymotrypsin va elastase (thuộc loại Serine Protease) 14

Hình 2.9: Các thành phần của nọc ran v.c.cececcccscscscscecssssssesesescsssssscsesssssssscsesssssseseseens 18Hình 2.10: Động hoc Michaelis-Menten - + + 1 H1 11 xk2 20Hình 2.11: Hoạt động của bradykinin - - - << S11 ng reg 24Hình 2.12: Cơ chế tan khối huyét - + ¿2E £2E2£E+E£E+E£EEEE£E£EeEeEsErkrsrerree 29Hình 2.13: Cau trúc bật một (trình tự) của plasminogen người -. - -: 29

Hình 2.14: Tổ chức phân tử PLG gồm 7 vùng +-2- +5 2 2+£+s+£+£z£zzszxreee 30Hình 3.1: Sơ đỗ máy điện di “*SNIEW”” -.Sc tt 1 1 12 111111121111 111111 211 re40Hình 3.2: Tiêm độc tô vào tĩnh mạch đuôi chuột 5c cccccscxcerrerrreee 44Hình 4.1: Liều gây tốn thương đường kính 10 mm vùng dưới da chuột 48

Hình 4.2: pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzy1m ¿ 22-5 +2 2 2££+£+£+£z£z£szxzs+ẻ 50Hình 4.3: Tình sạch Serine protease qua cột Sepharose 6B Benzamidine 51

Hình 4.4: Xác định thành phần không bám qua cột DEAE Sepharose® CL-6B 52

Hình 4.5: Các phân đoạn bám trên cột DEAE Sepharose® CL-6B (lần 1) 53

Hình 4.6: Các phân đoạn bám trên cột DEAE Sepharose® CL-6B (lần 2) 56

Hình 4.7: Kiểm tra các thành phan sau tinh chế băng SDS-PAGE 12% 56

Hình 4.8: Kiểm tra hoạt tính enzym sau tinh chế bằng SDS-PAGE 12%-gelatine 0,1%óiŸÝÝßÃẼŸẼŸẼŸẼŸẼỶÝỶÝ _RäÄẦA 57

DANH MỤC CAC BANG

Bang 2.1: Các nhóm ran lục điển hình (Viperinae) chủ yếu va ảnh hưởng 6

Bảng 2.2: Các nhóm ran lục có rãnh mũi má chủ yếu (Crotalinae) 7

Bảng 2.3: Họ ran lục ở Việt Nam 5-5252 SE 2 1 1 1511111112111 ecxrk 8Bang 2.4: Tính đặc hiệu va chức nang Profease - 5-2 16Bảng 2.5: Một số chức năng sinh học cần đến vai trò của Protease 17

Bảng 2.6: Tính đặc hiệu với co chất của œ -Chymotrypsin va trypsin 21

Bang 2.7: Phân loại các nhóm độc tố có trong noc ran lục gây bệnh lý đông máu(6110010010022 a 32

Bang 3.1: Các dung dịch đệm với pH khác nhau 5-5555 <++<<<<<s+242Bảng 3.2: Khảo sát ảnh hưởng pH cho hoạt động của enzyme trong nọc rắn lục đốivới 3 loại đệm Tris HCl, Phosphate và CÏyC1n€ - 5c S111 s2 42Bảng 4.1: Thử nghiệm LDso với các hàm lượng noc ran lục khác nhau 46

Bảng 4.2: Thử nghiệm MHD với các hàm lượng nọc ran lục khác nhau 47

Bảng 4.3: Khảo sát pH các dung dịch đệm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym 49

Bang 4.4: Thanh phan bám sau khi qua cột Sepharose 6B Benzamidine 50

Bang 4.5: Phân đoạn không bám sau khi qua cột DEAE Sepharose® CL-6B 51

Bang 4.6: Phân đoạn bám sau sắc ký trao đối ion qua cột DEAE Sepharose® CL6BóiŸÝÝßÃẼŸẼŸẼŸẼŸẼỶÝỶÝ _RäÄẦA 52

Bang 4.7: Phân đoạn thu được sau sắc ký trao đối ion qua cột DEAE Sepharose® OB (lần 2) 55c 1 1 12 E111 1115151111 1101151111 110111110111 11 011111111110 11 0101011110711 11 re 54Bảng 4.8: Xác định độc lực thành phần không bám và bám sau khi qua cột trao đổiion DEAE Sepharose® CL6B - (5c 22 1211111111111 111111111111111110111 111 011 57Bảng 4.9: Thử nghiệm trung hoa 3MHD noc của huyết thanh khang noc 59

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦUTính cấp thiết của dé tài

Theo thống kê của tổ chức y tế thé giới (WHO), trên thé giới có khoảngnửa triệu người bị rắn căn thì khoảng 30000-40000 người chết/năm do ran độccăn và chủ yếu các nước ở vùng nhiệt đới Hàng năm ở Châu Á, có khoảng25000 -35000 người chết (chiếm tỉ lệ 87%) [24] Việt Nam thuộc vùng có địahình và khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho sự sinh sống, phát triển của các loài rắnnói chung và răn độc nói riêng

Trên cơ sở của triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm nọc rắn độc ởViệt Nam có thé chia làm hai loại: các loài ran thuộc họ nhỡn kính (Elapidae),noc gây độc than kinh (neurotoxic) và các loài ran thuộc ho ran lục (Viperidae),nọc gây độc hệ huyết mạch (hemotoxic) [41] Ở nước ta, huyết thanh khángnoc ran lục (Trimeresurus albolabris) và kháng một số noc rắn nhỡn kính khácđã được sản xuất và thử nghiệm thành công trên người [1, 44]

Huyết thanh kháng nọc rắn đã chứng tỏ có hiệu quả để điều trị nhiễmđộc noc ran [34] Tuy thé, bénh nhan thuong duoc điều trị sau một thời giantrì hoãn (dé đến trung tâm y tế) Tai nạn ran căn thường lại xảy ra ở nông thôn,xa các trung tâm y tế có kháng huyết thanh Hơn nữa, rắn căn ở Việt Nam làmột vấn đề chưa được y tế lưu tâm đúng mức Thời gian trì hoãn là một nguyênnhân làm tăng nguy cơ gây tử vong và cũng làm tăng nguy cơ tạo các biếnchứng sinh lý bệnh gây tàn phế, đặc biệt làm tăng độ trầm trọng về gây hoạitử tại chỗ [29]

Ngoài thời gian trì hoãn, lở loét và hoại tử mô tại chỗ còn là một van đềmà kháng huyết thanh không đem lại hiệu lực tác dụng nào, đặc biệt với nhiễmđộc noc ran lục [43] Ngược lại với quan niệm thông thường, một nghiên cứuhồi lưu đã cho thay tỷ lệ trường hợp bị lở loét, mụn nước và hoại thư da tạichỗ còn cao hơn trong số các bệnh nhân có điều trị với kháng huyết thanh sovới số bệnh nhân điều trị không sử dụng huyết thanh kháng noc [29] Đề ngănchặn sự lan rộng của hoại thư mô, có trường hợp cần cat cụt loại bỏ phan biton thuong [28]

Nguyên nhân gây lở loét được quy cho các protein có kích thước lớnlưu lại tại chỗ căn, không được máu di chuyển Các độc tố chính trong noc cácrắn nhỡn kính là những peptide (< 8kDa) gây độc thần kinh, được máu phânphối nhanh khắp co thé Các protein gây độc trong noc các ran lục có trọnglượng phân tử lớn hơn, khó đi vào các mao mach hơn [17] Các protein đó nếucó hoạt tính thủy phân protein (proteolytic enzyme) sẽ phân hủy các thànhphan của mô; sự tốn thương nay gây nên những phản ứng bệnh lý của cơ thé,tăng tuần hoàn máu tập trung vảo vết thương và là nguyên nhân gây sưng phùtại chỗ.

Đặc biệt protease trong noc ran luc lam tang bradykinin mau, làm giãnvanh mach Hoat tinh cua cac protease cua noc khong nhitng phan huy m6 coma còn gây ton thương cho vành mach, lam xuất huyết tại chỗ Trong cácprotein lưu lại tại chỗ con có các collagenase, phân hủy mô liên kết Tuy lượngcác protease của noc nhiễm ở vết thương là ít nhưng do cơ chế xúc tác củachúng gây hậu quả trầm trọng

Tóm lại, nghiên cứu tập trung vào nọc của một răn lục thường xuyêngây tai nạn ở Việt nam, đó là răn lục xanh đuôi đỏ Do các protease của nọc cóthể tác động, gây rối loạn vào các hệ thống enzyme bảo đảm sự nội hăng địnhsinh lý (homeostasis), hoạt hóa các enzyme nội sinh cách bất thường, gây hậuquả bệnh lý tram trọng và gây ra các bién chứng khi nhiễm độc noc ran lục Vìvậy, đề tài nghiên cứu tập trung vào “Xác định độc lực của răn lục đuôi đỏ vàtác động gây loét trên chuột”.

1.2 Mục tiêu nghiên c u

Xác định thành phần gây độc chính trong nọc răn lục đuôi đỏ(Trimeresurus albolabris) và các yêu tỗ ảnh hưởng Độc lực, liễu gây tốnthương được tiến hành khảo sát trên chuột và hiệu lực trung hòa hoạt tínhenzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh kháng nọc Dựa trên khảnăng trung hòa thành phần gây độc giải thích cơ chế về sự gây loét tại chỗ khibị răn lục căn ở người ở mô liên kêt, mô nên Nghiên cứu này nhăm góp phân

tham gia tìm kiém những giải pháp b6 sung cho phương pháp huyết thanh trịliệu trong việc cứu chữa nạn nhân nhiễm độc nọc răn, đặc biệt ở giai đoạn sơCứu.

1.3 Nội dung nghiên c u+ Xác định thành phân gây độc và hoạt tính sinh học của nọc răn lục đuôi đỏ

Xác định độc lực của noc ran lục đuôi đỏ.‹ồ Xác định liều gây tốn thương đường kính 10mm vùng dưới da chuột

(MHD).+ Tinh sạch Serine protease từ noc ran luc

- Khao sát pH các dung dịch đệm ảnh hưởng đến hoạt tinh enzyme.- Tinh sạch thành phan gây độc của noc ran lục qua sắc ký

« Xác định độc lực thành phan bám sau khi qua cột trao đôi ion DEAESepharose CL6B.

¢« Điện di SDS PAGE 12% đánh giá độ tinh sạch các phan đoạn qua 2 cộtsắc ký trao đôi ion va ái lực

+ Thử nghiệm trung hòa noc và huyết thanh kháng noc để xác định kết quả lygiải máu vùng dưới da chuột.

1.4 Y nghĩa khoa hoc và thực tiễn của đề tài

Đề tài bước đầu xác định độc lực của nọc rắn lục đuôi đỏ và tác độnggây xuất huyết tại chỗ trên chuột Sự hiện diện với tý lệ đáng kể của serineprotease trong nọc là nguy cơ tiềm năng hoạt hóa nhiều hệ thống tiền enzymetrong cơ thể của nạn nhân: hệ thống bồ thể, hệ thống cầm máu, gây hoại tử vabiến chứng Nghiên cứu bước đầu cho thấy tác động gây xuất huyết của serineprotease và khả năng trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc của kháng huyếtthanh.

TONG QUAN

CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIEU2.1 SINH HOC VE LOAI RAN LUC VA NOC DOC

2.1.1 Sinh học về ho ran lục (Viperidae)2.1.1.1 Đặc điểm loài

Ran là động vật thuộc loài bò sát (reptile), không chân Toàn bộ số ran đã đượcghi nhận trên thế giới đạt con số khoảng 2700 đến 3000 loài khác nhau, trong đókhoảng 600 là gây độc [9, 19] Chỉ khoảng 1/5 — 1/6 của số ran đó đã được nghiêncứu và sắp xếp với nhau thành dòng họ Các răn được lưu tâm đặc biệt và nghiêncứu nhiều là rắn có nọc gây độc cho người và cho gia súc Con số các răn gây tửvong cho người đã được biết không đạt con số 200 [3]

Theo Võ Văn Chi và Nguyễn Đức Minh (1993), ở Việt Nam có 140 loài rắnvà Bourret (1934-1936) đã xây dựng một danh sách gồm 32 loài ran độc có mặtở Việt Nam (chiếm 22,8 %) [3] Riêng họ ran lục là ho ran lớn thứ hai trên thégiới gôm 33 giống được chia thành họ ran lục điển hình (Viperinae) và ran lục córãnh mũi má (Crotalinae).

Hình 2.1: Vi trí cho thay trên đầu của Hình 2.2: HỖ má giữa mũi và mat của rắn lụcTrimeresurus albolabris đặc điểm có hỗ má đuôi do [46]

năm giữa lỗ mũi va mắt [25].

2.1.1.2 Nanh nọc vàch c nang gay độcTât cả răn lục đêu có răng độc có thê cử động được ở phía trước của miệng, mọcở hàm trên, cho phép răng độc có thể gấp thu lại vào sàn miệng Cử động này giúp

ho ran họ ran lục (Viperidae) có thê với răng độc ra xa hơn so với ho ran nhonkính (Elapidae).

Hình 2.4: Răng độc năm lọt vàotrong ở họ nhỡn kính (Elapidae) [54].

Hình 2.3: White-lipped green pit viper | Hinh 2.4: Taiwan Habu Viper

Nanh noc rắn lục ở phía trước, ham trên, (Trimeresurus mucrosquamatus) đượccó thé di động, kéo ra khi miệng mở, gap | lấy noc ở vườn quốc gia Tam Đảo, Việt

lại dé đóng miệng [47] Nam [55]

2.1.1.3 Phan loại ho ran lụcNọc rắn gồm nhiều thành phan peptide hoặc protein Một số gen phát hiện cácphân tử này ở các răn được phân tích đê đánh giá sự gần nhau qua các bước tiênhóa Sự phân tích di truyền này đã cho phép sự luận ra sự liên quan giữa các loàiđể lập cây phả hệ [32] Răn cùng dòng xuất phát từ một nguồn gốc chung

Dong Viperidae xuât hiện vào thời điêm tương đôi trước hon nhiêu so vớiElapidae Họ răn lục (Viperidae) trên thế giới chia thành 2 họ nhỏ hơn: Ran lục điển

3FTx

ElapidaeAtractaspididae

Natricinae =

XenodontinaeColubrinae „38pJ1qn|OS,

Homalopsinae _/Viperidae

Hình 2.5: Sự phát sinh các chủng loài rắn

hình (Viperinae) va ran lục có rãnh mỗi má (Crotalinae)Bảng 2.1: Các nhóm ran lục điển hình (Viperinae) chủ yếu và ảnh hưởng [36]

Tên khoa học | Tên thường gọi Phân bố Ảnh hưởng

Atheris spp African bush vipers Chau Phi Khong dang kéBitis spp African puff adders, | Châu Phi Tùy loài, một vai gây tổn thương tai

Gaboom vipers ect chỗ nặng né, rôi loạn đông mau,

xuât huyết, sôc, độc tô tim.

Causus spp African night adders | Châu Phi Tác dụng tai chỗ, liệtCerastes spp | African horned Chau Phi Tác dụng tại chỗ, rối loạn đông

adders máu, xuât huyét, sôc

Daboia russelii | Russell's viper Châu Phi, | Tác dụng tai chỗ, rối loạn đông

Châu Mỹ máu, thận hư, liệt, tiêu cơ (chỉ ở Sr1

Lanka)

Echis spp African & West Chau Phi Tác dung tại chỗ, rối loạn đông

Asian saw scaled Tay A máu, xuât huyét, sôc.vipers

Macrovipera Eurasian vipers Chau A Tác dụng tại chỗ, rối loạn đông

SDD Châu Âu mau, xuât huyệt, sôc.Pseudocerastes | Middle East horned | Trung Gay liệt.

spp vipers Dong

Vipera spp European vipers Chau Au Tác dung tại chỗ, hoại tử, sốc.

Bảng 2.2: Các nhóm rắn lục có rãnh mũi má chủ yếu (Crotalinae) [36]

Tên khoa học Tên thông thường | Phân bô Anh hưởngAgkistrodon spp | Nth American Bac My Tác dụng tại chỗ, hoại tử, rôi loạn

copperhead, đông máu, xuất huyết, sốc.

cottonmouth, cantil

Atropoides spp — | Central American Trung My | Tác dung tại chỗ, hoại tử

jumping pit vipers

Bothriechis spp | Central American Trung My | Tac dụng tại chỗ, hoại tử, sốc.

palm pit vipersBothrops spp Sth & Central Trung My | Tùy loài, một vai tac dụng tại

American pit vipers | Nam Mỹ | chỗ, hoại tử, rối loạn đông máu,

xuất huyết, ton thuong than, tiéuCƠ, SỐC

Calloselasma Malayan pit viper Dong Tác dụng tại chỗ, hoại tử, rỗi loanrhodostoma Nam A đông mau, chảy máu, ton thương

thận, sốc

Crotalus spp Rattlesnakes Bac My | Tùy loài, ở Bac Mỹ, tác dụng tại

Nam Mỹ | chỗ, hoại tử, rỗi loạn đông máu,

sốc; ở Nam Mỹ: tác dụng tại chỗ,

liệt, rối loạn đông máu, tiêu cơ,

ton thương thận.Deinagkistrodon | Chinese hundred Đông Tác dụng tại chỗ, hoại tử, rôi loạnacutus pace viper Nam A đông mau, xuất huyết, sốc

Gloydius spp Asian terrestrial pit Chau A Tác dụng tại chỗ, hoại tử, rôi loạn

vipers dong máu, xuất huyết, sốcHypnale spp Sri Lankan hump Srilanka Tác dụng tai chỗ

nosed vipers

Lachesis spp Central & Trung Mỹ | Tác dung tại chỗ, hoại tử, rỗi loan

thAmerican Nam Mỹ | đông máu, sốc

bushmasters

Ophryacus spp Central American Trung My | Tác dung tại chỗ, hoại tử, sốc

horned pit vipers

Ovophis spp Asian pit vipers Chau A Tại chỗ, rồi loạn đông máu

Porthidium spp Central American Trung My | Tác dung tại chỗ, hoại tử, sốc

montane pit vipers

Sistrurus spp North American Bac Mỹ Tac dung tại chỗ, hoại tử, hiém

pygmy rattlesnakes khi xuat huyét.

& massasauga

Trimeresurus spp | Asian green pit Chau A Tác dụng tại chỗ, rối loan đông

vipers máu, xuất huyết.Tropidolaemus Asian tree vipers Chau A Tác dụng tại chỗ, hiểm khi hoạiSDD tử, rỗi loan đông máu, xuất huyết

O Việt Nam, phân bô nhóm ran lục xanh và ran khô mộc phô biên ở miên Bac

gây sưng né và chảy máu trong cơ, dưới da, ít gây hoại tử; rắn cham quạp lại phô biếnở miên Nam gây hoại tử nhiêu, bong nước, xuât huyệt dưới da, trong cơ và có thê gâyhội chứng khoang Các loài răn lục ở Việt Nam được tóm tắt trong bảng 2.3

Bảng 2.3: Họ rắn lục ở Việt Nam [36]Tên khoa học Tên thường gọi Phân bố

Azemiops feae Miễn Bac: Cao Bang, Vinh Phúc,

Ran luc dau bac

Lang son

Calloselasma Malayan pit viper Mién Nam: Ninh Thuan, Binh

rhodostoma (RL cham quap) Duong, An GiangAncistrodon acutusSharp-nosed viperMién Bac: Lao Cai, Lang Son,

Vinh PhúcTrimeresurus AlbolabrisWhile-lipper greenTrên toàn quôc

Pit viper (RL mép)Trimererusus jedonii RL hoa cai Lao Cai

Trimererusus monticola | RL núi Mién Trung, Mién Nam

Trimererusus

mucosquamatus

Chinese Habu (RL khô mộc)Mién Bac

Trimererusus popeiorumPopes green pit viperMién Trung, Mién Nam: Gia Lai,

Lam Déng

Trimererusus stejnegeri | RL Xanh Mién Bac, Mién Trung

Trimererusus Quang Binh Pitviper Quang Binhtruongsonensis

Triceratolepidophis Three Horned-scaled pitviper | Quảng Binh

sleversorum

Nghiên cứu tập trung vào noc của mot ran lục thường gây tai nan ở Việt Nam: ran lụcxanh đuôi đỏ (Trimeresurus albolabris), có ở mọi miễn dat nước Day là loài ran gâynạn cho người với tỷ lệ cao nhât.

2.1.1.4 Ran lục đuôi đó (Trimeresurus albolabris)

Danh pháp: Trimeresurus albolabris Gray, 1842Tén Viét Nam: RAN LUC MEP

Tén Latin: Trimeresurus albolabrisHo: Ran luc Viperidae

Bo: Co vay SquamataLớp (nhóm): Bò sat

Hình 2.6: Trimeresurus albolabris [53]

Mô taThân của loài bò sát xinh đẹp nay khá day va khỏe, các vay gồ lên Dau va thânmau xanh lá cây, cam, cổ họng và bụng màu xanh lục nhạt hay trắng vàng nhạt Ranđực có sọc trang trên hang vảy thân dau tiên mà ở ran cái sọc nay rất mờ nhạt hoặckhông có Đuôi màu nâu đỏ nhạt, chiều dài thân khoảng 100cm

Sinh họcThức ăn của chúng là chuột, chim, thăn lăn và ếch vào ban đêm trên mặt đất vànghỉ ngơi trên cây vào ban ngày Mỗi lứa đẻ gồm từ 7 đến 16 rắn con có đặc điểmgiống hệt rắn trưởng thành, dài 12 - 18cm Có noc độc và nguy hiểm Loài ran nàygây ra nhiều vết thương nguy hiểm do vết cắn của chúng

Nơi sống và sinh tháiLoài này thường thích sống ở vùng đồi núi có độ cao dưới 400m, đôi khi nó cũngcư tru ở các khu vực thành thị, thích sống trên cây do đó có những tên gọi “white-

32 66

lipped tree viper”, “white-lipped bamboo viper” ( ran lục mép trang leo cây)

Phân bốViệt Nam: Đây là loài có mặt hầu như trên khắp lãnh thé Việt Nam từ Cao Bangcho đến Kiên Giang Minh Hải.

Thế giới: Chúng có mặt trên bình diện rộng của châu Á nhiệt đới và phân bồ trênkhắp Thái Lan ngoài ra chúng còn có ở Trung Quốc, An Độ, Lào, Campuchia,Malaysia, Indonesia [2, 15].

Tình trang: Số lượng còn khá pho biến ngoài tự nhiên.2.1.2 Nộc độc và độc lực

2.1.2.1 Noe độcNộc độc khác với những chất độc (như chất curare, nguồn gốc từ thực vật, đãđược dùng tâm vào đầu mũi tên; hoặc muscarine có ở nam Amanita muscafia) Nọcđộc được bơm tiêm vào cơ thé nạn nhân từ hạch noc qua nanh nọc Chất độc thườngđược đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa hoặc đường hô hấp nếu chất độc ở dạng hơi,khí (những người làm việc với nọc ran ở dạng bột khô, nên đeo khâu trang ngừakhông để bụi nọc bay vào mũi, tạo khả năng gây biến chứng dải hạn) Nọc độc hìnhthành ở ran qua những cơ chế sinh tổng hợp phức tạp của những tế bao hạch rồi dựtrữ trong hạch trước khi được sử dụng để thực hiện chức năng Trong nọc độc ngoàinhững độc tô dé bất hoạt con mỗi còn có một số yếu tố khác, đặc biệt là các enzymetham gia vào sự tiêu hóa con mỗi

2.1.2.2 Độc lựcĐể tránh sự biến động theo vi trí cắn, phương pháp thực nghiệm để xác định độclực của noc là tiêm ở một vị trí nhất định, như 6 bụng, hoặc để hiệu lực biểu hiệnnhanh hơn, tiêm vào tĩnh mạch, đối với chuột là tĩnh mạch ở đuôi Độc lực được xácđịnh tương đối với thể trọng, để loại trừ biến động theo trọng lượng của thể nhận Vàđiều thiết yếu là loài vật thử nghiệm cần có sự nhạy cảm tốt; đối với răn lục, chuột làcon vật thử nghiệm thích hợp.

Độc lực thực nghiệm thông thường được diễn đạt bằng liều gây tử vong 50% sốvật thử nghiệm: LDso (lethal dose 50%) Nếu số vật thử nghiệm đủ lớn, trung vi(median) của các ket quả của từng ca thê sẽ xác định giá trị LDso chính xác hơn giá

trị trung bình phù hợp hơn với tính biến động sinh học của các kết quả thử nghiệm.Nguyên nhân gây độc của noc ran lục chủ yếu đến từ các thành phan protease Thaycho nọc toàn phần, enzyme tinh chế từ nọc cũng được đánh giá trong những điều kiệnthử nghiệm đúng như với nọc.

Như vậy, dựa trên đặc điểm sinh học của họ răn lục, danh tánh của rắn lụcđược nêu lên cùng với vùng, môi trường sinh sống, hình thái bên ngoài về đặc điểmmắt, lỗ mũi, hỗ má và bên trong với cau trúc bộ xương, đặc biệt xương đầu và hàm,bộ răng Dựa trên sự có mặt của nanh nọc ở hàm răng trên, cho thay chức năng gâyđộc của dòng ran ruc (Viperidae) là nanh noc to, có độ di động tốt, và có ống dẫn nọc

Chất xúc tác chỉ tác động làm tăng tốc độ phản ứng và đóng vai trò một chấttrung gian tham gia trong cơ chế phản ứng

Trong thế giới sinh vật, đa số vật liệu sinh học bình thường không thé phan ứngbiến hoá Nhưng kết hợp với enzyme, phan ứng biến hoá mới có thé thực hiện.Chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hoá cần cho thực hiện phản ứng, như vậy làmtăng phần các chất phản ứng đủ năng lượng tạo nên phản ứng

Đề phản ứng hoá học được thực hiện nhanh, các chất tham gia phải tiếp xuctrực tiếp với chat xúc tác S đi vào trang thái trung gian trong đó các liên kết trunggian định hướng phản ứng Nhờ sự gắn của S vào chất trung gian E làm biến S quatrạng thái hoạt hóa dé tạo phan ứng xảy ra

Vì vậy enzyme làm tăng tốc độ phản ứng và hoạt động với hiệu quả rất cao,đóng vai trò một chất quan trọng trong cơ chế phản ứng

Đề làm rõ các bước trên, sơ đỗ biến đối năng lượng qua một phản ứng sinhhóa thể hiện sau đây :

AGo +^

Trạng thái chuyền tiếp trong

một phản ứng hóa họcPhản ứng được

2.2.1.1 Enzyme và tính đặc hiệuEnzyme là chất xúc tác sinh học có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu cơ chất rấtcao qua tổ chức cau trúc cao của các đại phân tử sinh học Bình thường, các phản ứngnày không thé thực hiện được, hoặc thực hiện với tốc độ không đáng kẻ

Enzyme dùng năng lượng hoạt hóa thấp hơn so với năng lượng cân thiết trongmột phản ứng không xúc tác cần làm tăng nhiệt độ lên rất cao Enzyme làm tăng tốcđô phản ứng và hoạt động với hiệu quả rất cao ở nhiệt độ bình thường Một phân tửenzyme có thể làm cho hàng nghìn thậm chí hàng trăm nghìn phân tử cơ chất kết hợpthành sản phẩm trong mỗi giây

Qua các enzyme, các phản ứng sinh hóa thực hiện trong tế bào sống với một tổchức rất cao Một điểm thiết yếu của các phản ứng sinh học do enzyme xúc tác là sựkết hợp giữa hai phan ứng dé chuyển năng lượng hoá học trong một mục đích: đồnghoá hoặc di hoá [4, 35].

Ví dụ : Trong tế bào sống, nhiễu phan ứng kết hợp hình thành sản phẩm như

Sau:

A-B > A+B+NL(AG)

C+D+NL2> C-D (AG‘)

A-B+C+D > C-D+ A+B

2.2.1.2 Protease thuộc loại enzyme thuỷ phan (Hydrolase)

Protease xúc tac phan ứng thủy giải (chuyển các nhóm chức cho phan tử nước)

A-B+HạO — 5 A-H+B-OHỌ Ọ

|

R-C-NHR'+HO Ser ENZYME —>R-C -O-Ser _ ENZYME+R'NH,

O O| |

R_C O-Ser ENZYME +HO_>R_C€ OH+ HO-Ser— ENZYMEChất trung gian ester acyl-enzyme phải bị thủy phân băng một phản ứng bậc hai,trong đó nước trở thành nucleophile.

2.2.1.3 Protease thuỷ phân cau nối PeptideTrypsin, Chymotrypsin và Elastase là endopeptidase, có nghĩa chúng cắt chuỗiprotein tại các nối peptide bên trong mạch nhưng mỗi enzyme sẽ thủy phân ưa thíchcác nối kể cận với kiểu gốc axit amin đặc trưng Trypsin cắt nối peptide ngay tại cácnhóm carbonyl của gốc axit amin kiềm (lysine hay arginine) Chymotrypsin cắt ngaycạnh gốc axit amin thơm (phenylamine, tyrosine hay tryptophan) Elastase ít phânbiệt hơn nhưng ưa thích các gốc axit amin nhỏ ky nước như alanine

R, Rast

—Ñ-Ev-E-NÑ-Œœ-E-N—|

H H © H H OH

Trypsin: Rn =Lysine (K), Arginine (R)Chymotrysin: Ra = Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W)

l oOOS NOH

HO N-HSer ` —o ElastaseHN

5 Leu

N-H/

Hinh 2.8: Trypsin, chymotrypsin va elastase (thudc loai Serine Protease)Ba enzyme này xúc tác thuỷ phân protein tai các nỗi peptide bên trong với các kiểuaxit amin khác nhau Trypsin ưa thích các gốc lysine hay arginine; chymotrypsin ưathích các axit amin chuỗi bên vòng thơm và elastase ưa thích các gốc axit amin nhỏkhông cực.

2.3 Các loại Protease

2.3.1 Endopeptidase và Exopeptidase

Enzyme được phần cắt bởi cơ chất protein tại liên kết amide được phân loại làprotease hoặc peptidase Hầu hết các peptidase được biết đến thuộc một trong hainhóm sau, phụ thuộc vào vi trí đặc hiệu tại liên kết peptide của cơ chất

e Endopeptidase:Nếu liên kết peptide bị đứt tại vi trí liên kết bên trong mạch của mộtpolypeptide thi enzyme này gọi là endopeptidase Trong nhóm này có chymotrypsinvà trypsin Các tiền chất của các enzyme gọi là các zymogen, nghĩa là chất sản sinhra enzyme Các zymogen có trọng lượng phân tử hơi cao hơn enzyme vì có mangthêm một đoạn peptide Cat peptide nay gọi là hoạt hóa zymogen dé sinh ra enzyme

để làm xuất hiện hoạt tính Trong cơ thể, trong tế bào, các enzyme hiện diện ở dạngzymogen và chỉ được hoạt hóa dé hoạt động lúc cần thiết.

Trypsin cắt nối peptide ngay tại các nhóm carbonyl của gốc axit amin base(lysine hay arginine) Chymotrypsin cắt ngay cạnh gốc axit amin thơm(phenylalanine, tyrosine hay tryptophan).

O O

H j H H O9 H HỊ HH Ri C —.c— N-—c ¢ N—c—€——N——c—€00

NH, R2 R3 = ĐầuC

Ậ

Dau N

Vi trí hoat động của aminopeptidase Vị trí hoat động Carboxypeptidase

Vi trí hoạt động của exopeptidase

2.2.2 Enzym hoạt động đặc hiệu:Cơ chế phản ứng do các Protease xúc tác được chia thành năm loại [22]

+ Serine Protease+ Cysteine Protease+ Aminopeptidase (metallo-exopeptidase)+ Carboxypeptidase (metallo-exopeptidase)+ Acid Protease

Bang 2.4: Tính đặc hiệu va chức nang Protease [35 |

Xác định hoạt tính ể ù ăLoại Enzym ] 3 Enzyme cụ thể thường gặp

Ch cnăng Chất c chế Protease Ch cnăngSerine protease lo Fluorophosphates | Trypsin Tiêu hóa (Digestion)

Thrombin Đông máu

( Blood coagulalation )Plasmin Tiêu cục máu đông

(Lysis of blood clots)

Conoonase Co hoc (Mechanical)

Subtilisin Tiêu hóa

Acrosin Xam nhập của tinh trùng

(Sperm penetration)

Metallo- Zn** EDTA, EGTA Carboxypeptidase | Tiêu hóa

exopeptidase

Sulfhydryl CySH o-Phenanthroline | Papain Tiêu hóa

Idoacetate Streptococcal Tiêu hóa

Protease Nội bào (Intracellular)Cathepsin B Tiêu hóa

Acid Protease | Acidic pH | o-Phenanthroline | Thermolysin Tiêu hóa

optimum

Pepsin Tiêu hóa

Các serine protease hoạt động qua nhóm —OH của Serine Dé biết một proteaselà serine protease, có thể dùng phương pháp bất hoạt đặc hiệu: serine protease bị hoàntoàn bat hoạt nhanh bởi diisopropyl fluorophosphates (DFP) do chất này gan đồng trivào trung tâm hoạt động serine qua liên kết phosphate ester [23].

Don vi dai phan tu (Macromolecular Tao Fibrin Fibrinassembly) Tao Collagen>Collagen

Zymogen > Hoạt hóa proteaseTiêu hóa (Digestion) Prococoonase> Cocoonase

Phát triển (Development) Tổng hợp Prochitn > Tổng hợp

Chitin

Một số chức năng vat lý như: cơ chế bảo vệ cơ thé khi bị ton thương thì biểuhiện bằng cớ chế đông tụ máu, làm lành vết thương Ngoài ra chúng còn có chức năngtiêu hóa làm biến đối các tiền chất zymogen hoạt hóa thành các protease hoạt động.Các chức năng trên được điêu tiệt qua hoạt động của các protease.

Với các đặc tinh và chức năng sinh học nêu trên, ta cũng thay rang serineprotease có trong noc ran lục cũng chính là các tiên chat zymogen được hoạt hoathành các protein hoạt động khi nó vào trong cơ thé bị nhiễm noc rắn lục

2.2.2 Protease trong nọc rắn lụcNọc ran là một phức hợp gồm nhiều enzyme, protein, những polypetide có độctinh, va các thành phần vô cơ Các enzyme đã xác định là phospholipase Ax, L-aminoacid oxidases, metalloprotease và serine protease [38] Thanh phan protein và peptidechiém 90-95% trọng lượng noc khô [17]

Nọc răn©

df ĐO OFrdale

aside

Proteins va Peptides(90-95%)

NGF va VEGFEnzymes Lectin dang C

Độc tố ba ngón tay

Proteins và PeptidesMyotoxins Peptides

Cystain Enzymes Độc tố CRISP

PLA2s LAAOsHyaluroni dases HEP Arinaselike enzymes

Acetylcholinesterases Metallo- va Serine proteases

EnzymesNAD Nucleosidases Phosphomonoesterases

Endonucleases Phosphodiesterases

Arylamidases Paraoxonases

Hinh 2.9: Cac thanh phan cua noc ranThanh phân cua noc ran phụ thuộc vào nhiêu yêu tô như di truyền, tuôi, giới tinh,thức ăn, cư trú của từng loài dân đên ảnh hưởng đên hôn hợp tự nhiên có thê gây bâtđộng, gây chết và tiêu hóa con mồi [14]

Nọc rắn độc chứa nhiều protein có tác động vào hệ cầm máu, một số tương tácvới các yếu tô hoặc tác động trên tiểu cầu va các thành phần khác của hệ thống cầmmáu Một số protein là các enzyme như nucleotidase, phospholipase A2,metalloprotease và serine protease, trong khi lectin dang C và disintegrins, cho thaykhông có hoạt động enzyme.

Trong dé tài này, khảo sát serine protease và 3 enzyme đặc trưng pho biến là:trypsin, chymotrypsin và elastase.

Da số enzyme tham gia trong việc đông máu cũng là các serine protease, cácenzyme này tuần hoàn trong máu ở dạng tiền enzyme (zymogen) chưa hoạt động vàchỉ được hoạt hóa khi mạch mau bị tổn thương, hoạt hoá lam zymogen mắt một đoạnpeptide, tức cũng do một protein cắt: trypsin hoạt hóa trypsinogen nên hoạt hoá làmột cơ chế nhanh [7] Nồng độ cơ chất ảnh hưởng lớn đến vận tốc phản ứng doenzyme xúc tác.

Trong cơ thể nhiều Enzyme cùng hoạt động và phối hợp điều tiết Đối với một

enzyme:

+ Tốc độ phản ứng xúc tác lệ thuộc vào nồng độ của enzyme [E] và của cơ chất[S] Có enzyme tốc độ lệ thuộc vào hai cơ chất (các oxydo - reductases) Tốcđộ còn lệ thuộc vào một số yếu tố khác

Ở một nông độ [E] = Cte và [S] =Cte thì:

tốc độxk BAN DAU

a.

> t (giay)

+ AI lực E với SToc độ xoay vân xúc tác (turnover rate)+ Khi có cân bằng giữa sự hình thành và phân ly ES thì [ES] không thay đổi (Cte)

+ Ở giai đoạn trung gian nồng độ của phức hợp [ES] là giới hạn của tốc độ phảnứng

VẬ

V max

Y V max

Kn > SHình 2.10: Động hoc Michaelis-Menten: tốc độ phản ứng ban dau giảm bớttheo [S] tang.

V (Velocity): tốc độ, S (Substrate concentration): nông độ cơ chấtQua đồ thị ta thấy rằng trong giai đoạn đầu nồng độ [S] còn thấp và đang tănglên có nghĩa là [ES] tăng khi v đạt Vụ, V không tăng nữa do toàn bộ E ở dạng phứchợp ES (ES]FIET])

Phương trình biéu diễn sự phụ thuộc hăng số vận tốc phản ứng thuận tạo phứcES vào nồng độ co chất S.

_ Vmax [S|

~ KM +[S]Vv

Ku (hang số Michaelis-Menten) càng nhỏ ái luc giữa E va S cảng lớn, nghĩalà v phản ứng càng lớn

œ-Chymofrypsin N-benzoyl-L-arginine ethyl ester 14 I.5x107 | 93x10!

Trypsin N-acetylglycine ethyl ester 0.028° 0.79 3.5x107œ-Chymotrypsin N-acetylglycine ethyl ester 0.066° 0.41 1.6x10!œ-Chymotrypsin N-benzoylglycine ethyl ester 0.10° 23x103 | 43x10!

+ Kea trong phản ứng ES> E+P

aP dt(giá tri cua kcat là đơn vi thời gian, tính bang sec! )

(Tốc độ thời gian v tính bang sec’)Bảng này nói lên tính đặc hiệu với cơ chất S của hai enzyme trypsin và ơ-chymotrypsin: trypsin có ái lực cao với nhóm arginine nhưng rất thấp với một axitamin thom (tyrosine) Trai lai, a- chymotrypsin có ai lực rat cao với các axit aminthơm (benzoylglycine, tyrosine ) và đồng thời chúng ta cũng thấy tính đặc hiệu củatrypsin đối với arginine là rất cao và có tính giới hạn hon a- chymotrypsin Trypsinlà một enzyme đặc trưng của các serine protease và có vai tro quan trong trong đôngcâm máu.

2.2.3 Vai trò và hoạt động protease noc ran lục đối với cơ thể bị nhiễm

độc

Thành phan chính của noc ran luc bao gồm:

1 Emzyme ly giải protein: xúc tác phá hủy protein cau trúc mô và dẫn đếnđau, sưng tại vi trí can

2 Những độc tô polypeptid, phá hỏng dẫn truyền thần kinh và có thé dẫn đếntrụy tim và hô hấp

3 Protease: phá vỡ các liên kết các protein peptide trong mô, hậu quả gâytôn hại đến thành mạch máu, xuất huyết, phá hủy cau trúc sợi cơ

4 Phospholipase: xúc tác phản ứng ảnh hưởng đến than kinh và cơ.5 Collagenase: phá hủy collagen mô liên kết

6 Các enzyme giống thrombin: xáo trộn cơ chế cam máu.Triệu chứng ngay vết răn lục căn phụ thuộc vào lượng độc khi bị ran căn.Trong trường hợp lượng độc nhẹ, theo dõi triệu chứng ngay tại vị trí căn biểu hiệnsưng đỏ va vết mau bam, không biểu hiện toàn thân

Trường hợp lượng độc trung bình, triệu chứng biểu hiện ngay tại vị trí cắnsưng rộp chiếm phan lớn vùng bị ảnh hưởng Triệu chứng nhiễm độc toàn thân xuấthiện, nhưng không ảnh hưởng đến tính mạng (huyết áp giảm nhẹ, tim đập nhanh vàthở gấp)

Trong trường hợp nhiễm độc nặng, triệu chứng biêu hiện hoàn toàn, lan nhanh:phù né, xuât huyệt và hoại tử mô Triệu chứng nhiêm độc toàn thân biêu hiện, dau

bụng, nôn mửa, huyết áp giảm hoàn toàn, thở gấp, khó thở, nhịp tim đập nhanh vàtriệu chứng thần kinh Ngoài ra còn có biéu hiện chảy máu từ vết căn hoặc bề mặtniêm mạc.

Các protease nọc răn đưa vào cơ thể ngoài phá hủy các mô tại chỗ còn có thểhoạt hóa các tiền protease (zymogen) của mô hoặc nếu vào máu tuần hoan chúng hoạthóa các tiền protease của hệ cầm máu Tiền protease then chốt lưu hành làprothrombin (yếu tố II) và dạng hoạt hóa thrombin có hoạt tính của một serineprotease và có chức năng hoạt hóa nhiều yếu tố (XI, VHIL, V, protein C) và đặc biệt:

+ Hoạt hóa fibrinogen thành đơn vi fibrin Don vi fibrin có đặc tính tự liên kếtvới nhau qua những liên kết nhẹ dé kết hợp thành sợi trùng hop fibrin, còn tantrong dịch.

+ Thrombin cũng hoạt hóa yếu tố XIII thành XIIa Yếu tố XIIa có hoạt tínhtransglutaminase và tạo những liên kết đồng hóa trị nối các nhóm Q(glutamine) với các nhóm K (lysine) gitra các sợi trùng hợp fibrin, thành mang

lưới fibrin, hết tan được trong dịch, gom các tế máu thành huyết khối(thrombus, blood clot), có thé làm nghẽn tuần hoan máu

2.3 CƠ CHE GAY LOÉT TẠI CHO23.1 Hệ thống huyết mạchHệ thống huyết mạch gém hai thành phan gắn liên: máu/huyết (phụ lục ID và lướiống mạch Hệ thống huyết mạch phủ toàn bộ cơ thể và xen kẽ sâu vào các mô

Đông máu và khối huyếtSự đông máu là một hệ thống đã được hình thành không dé mat máu cách bam sinh,phức tạp hơn cơ chế cầm máu nội tại, vì có phối hợp với sự khởi động một số cơ chếchống nhiễm khuẩn Trong trường hợp bị chan thương mở, không tự nhiên, máu rangoài huyết mạch, rồi đông lại ngay trên da Sự đông máu ngoài cơ thể này được khởiđộng với một số yếu tố đã được biết là do một bề mặt kết hợp với ba thành phần củamáu: yếu tố XII, prekallikrein và kininogen có trọng lượng phân tử cao (HMWkininogen, HMWK) Bản chất của bề mặt đã được biết là do những điểm có tĩnh điệnâm, vì trong cơ thé (in vivo) khi tiểu cầu tiết ra polyphosphate, chat này hoạt hóa yếu

tố XII thành XIIa Các phosphatases trong cơ thể ngược lại làm mat hiệu ứng đôngmáu của polyphosphate Điều cũng đã biết được là ở những người thiếu hụt sự biểuhiện cua ba protein nêu trên, sự cầm máu nội tại (khởi động với yếu tố TF và VIla)vẫn diễn biến bình thường, tức yếu tố XIIa là không can thiết cho sự cầm máu nội tại.Hai yếu tổ Vila và XIIa khởi động đông máu cách độc lập.

Yếu tố XII là một protein 80kD, gồm một chuỗi nặng (353aa) và một chuỗinhẹ (243aa) liên kết với nhau qua một cầu disulfide Yếu t6 XII hoạt hóa (XIIa) cóhoạt tính của một serine endopeptidase, trung tâm xúc tác nam trên chuối nhẹ củaphân tử XII tự hoạt koa thành XIHa, tức XIIa hoạt hóa XII khi gặp một số vật liệunhư thủy tinh, thạch cao, dextran sulfate, nguyên collagen, hoặc polyphosphate Déchế tạo và phát triển các vật liệu sử dụng cho bệnh nhân tim mạch, sự hoạt hóa yếutố XII đang được nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hóa lý của sự hoạt hóa Yếu t6 XHacòn tham gia điều tiết một số hoạt động sinh lý, hoạt hóa đến năm tiền profease củahuyết tương: prekallikrein, yếu t6 XI, yếu t6 VIL, plasminogen và bồ thé Cl, mộtthành phan trong hệ thống chống nhiễm bam sinh

Nhiễm khuẩn gây viêm[XHa + )

~>> kallikrein

Prekallikrein

HMW kininogen

GPCRs: G-proteincoupled receptors

Hình 2.11: Hoạt động cua bradykinin [49]Như đã nói trên, prekallikrein và HMWK là hai đồng yếu tố của XIIa trong sự khởiđộng đông máu khi có chan thương mở Hai đồng yếu tô này thuộc hệ thống kinin,hệ thông gồm một số protein có mặt trong máu và trên màng tế bao nội mô (kinin-kallikrein system, KKS) [37] Ngay sau khởi động đông máu, hai đồng yếu tố này đivào hoạt động trong các cơ chế gây viêm, điều hành huyết áp, đông máu và gây đau,là những triệu chứng kèm theo sau thương tích (như bị bỏng, viêm do nhiễm khuẩn,

sốc, di ứng) Trong các tôn thương này có mô và tế bao bị hư hỏng, xuất huyết, lànhững cơ hội gây nhiễm khuẩn Hình 2.11 cho thay XIIa xúc tác sản xuất kallikrein(hoạt hóa prekallikrein) và tiếp theo là sự khuếch đại sản xuất bradykinin (BD) từMWK Kininogen trọng lượng phân tử thấp (LMWK) cho thành phẩm kallidin (KD,không nêu trên hình 2.11) Prekallikrein và HMWK do gan tiết ra, đưa vào máu.LMWK và kallikrein được sản xuất tại chỗ Kallikrein có hoạt tính của một serineprotease, giải phóng ra BD và KD từ các tiền protein (K) BD là một nanopeptide cóarginine ở hai đầu (RiPPGFSPFRs) và KD là BD với một don vị lysine trước arginineđầu N cuối (KRPPGFSPFR) Các aminopeptidase chuyển hóa KD thành BD Cácendopeptidase phân hủy BD gọi là các kininase: (1) Angiotensin-converting enzyme(ACE) thủy phân BD ở liên kết peptide 7-8; ACE còn được gọi là kininase II (2)Aminopeptidase P (APP) cắt liên kết 1-2 (3) Carboxypeptidase N (CPN) cat liên kết8-9 (N là dạng enzyme lưu hành trong máu; carboxypeptidase M là dạng liên kết trênmảng tế bào, hoạt động tại chỗ) Do hoạt động phân hủy của chúng, các endopeptidasenày hạ nông độ BD, giảm tác động của BD vào các thụ thể B2 và BI của nó (Hình2.11).

BD có hoạt tinh làm giãn huyết mach va làm tăng tinh thấm của vành mạch; do đólam hạ huyết áp (hypotensive), gây phù và một số hoạt tính khác đã được khai thácnhiều trong dược học Sự khám phá ra BD có liên quan đến nọc rắn độc (Bothropsjararaca, Brazil, Mauricio Rocha e Silva, 1948) và các dược pham nội sinh(autopharmacological substances/endogenous autacoids) Tu những năm 1939 Rochae Silva đã nghiên cứu về sự gây sốc tuần hoàn (circulatory shock) khi bi nhiễm độcnoc ran thuộc dòng ‘ran luc’ (viperidae) (Trong dòng ran này có nhiều loài có màunâu đặc biệt những loài có hé má, pit viper Từ ‘viper’ không có nội dung “màu luc’ma là từ rút gọn của hai từ la-tinh vivo (tôi sống) và pario (tôi sản sinh) Nạn nhân bịrắn độc dòng nhỡn kính (elapidae) không bao giờ bị sốc tuần hoàn Nhưng khi bị mộtrăn thuộc dòng viperidae căn, bệnh nhân hay bị sốc tuần hoàn và phù tại chỗ Vàonăm 1948, một thử nghiệm cho noc Bothrops jararaca vào huyết thanh làm nồng độbradykinin tăng lên Từ bradykinin là từ ghép của hai từ Hy lạp brady có nghĩa làchậm và kini nghĩa là di động vì nhận thay ruột non bệnh nhân nhiêm doc ran co, di

động chậm Tiếp đó bradykinin được xác định làm giãn huyết mạch, giải thích cơ chếcủa các triệu chứng nhận thấy Một số protease và peptidase cũng đã được tìm thấytrong các noc ran độc thuộc dòng viperidae ‘Ran luc’ căn còn có thé dẫn đến suythận do các enzyme thủy phân protein của noc gây hoại tử tế bào và mô của tô chứccác ông lọc trong thận (glomeruli), trong lúc kali huyết tăng (hậu quả của tăngbradykinin), hemoglobin và myoglobin niệu cũng tăng [20].

G-protein và sự truyền tín hiệu qua màng tế baoBradykinin tác động vào hai thụ thể B2 và BI có mặt trên hầu hết các loại tế bàotrong cơ thé Khi liên kết vào hai thụ thé đó BD kích động nhiều hoạt động sinh lýcủa các tế bao chức năng: tăng độ thấm vành mach, giãn cơ trơn tiểu tinh mach, hahuyết áp, co co trơn ruột, co co trơn đường hô hap (tao tính bên), kích thích tế bàothần kinh giác quan (tăng khả năng cảm nhận đau đón), gây rối sự tiết các ion của cáctế bào biểu mô, kích thích bạch cầu tiết cytokine, NO, kích thích tổng hợpprostaglandin Đó là những đáp ứng sinh học (sinh lý/miễn nhiễm bam sinh) làmtăng sự chuyền vận của huyết tương và sự di chuyển của các tế bào máu

Hai thụ thé B2 và B1 của bradykinin là những protein toản tan trong màng, xuyênmảng tế bào qua lại bảy lần, đầu N cuối của phân tử nam ngoài tế bao dé cảm nhậnnông độ phối tử BD trong máu va phần C cuối của protein năm trong tế bào, liên kếtvới phức hop G-protein; phan trong tế bảo có mặt của serine, threonine và tyrosineđể có thé tạo liên kết ester với nhóm phosphoryl Các G-protein có vai trò trung giantruyền tín hiệu qua màng tế bảo (signal transduction) Sự liên kết với phối tử bênngoài tế bao là một tín hiệu được truyền xuyên màng tế bào vào đến đơn vị ơ thànhphan của G-protein, tiếp theo Gạ bat GTP và hoạt hóa khởi động các đáp ứng của tếbào Don vi a của G-protein có hoạt tính của một GTPase (liên kết với GTP,guanosine triphosphate); hoạt động của G-protein điều hòa các yếu tô sinh lý và lệthuộc vào nông độ của GTP trong té bào G-protein hoạt động như một nút tắt bật,bật khi GTP gan vào và tắt khi có GDP gan liền

Thu thé B2 được biểu hiện pho biến trên nhiều loại tế bao chứa năng trong cơ thể vàlà thành phân cấu thành của màng tế bào bình thường và khởi động nhiều hoạt động:kích thích phospholipase C để làm tăng nồng độ Ca** nội bao va ức chế adenylate