Luận văn thạc sĩ Khoa học: Thử nghiệm mô hình ex vivo tế bào miễn dịch chuột trong sàng lọc dịch chiết thực vật có tiềm năng kháng viêm

Ứng dụng quy tắc 3Rs trong luận văn được thê hiện qua hai mô hình thí nghiệm sử dụng gồm: mô hình in vivo phôi cá ngựa văn và mô hình ex vivo tế bào lách chuộtđều là các mô hình đánh giá

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KIEU TRUNG KIÊN

THU NGHIỆM MÔ HÌNH EX VIVO TE BAO MIEN DỊCH CHUOT TRONG SANG LOC DICH CHIET THUC VAT CO TIEM NANG

KHANG VIEM

LUAN VAN THAC Si KHOA HOC

Hà Nội - Nam 2023

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KIEU TRUNG KIÊN

THU NGHIỆM MÔ HÌNH EX VIVO TE BAO MIEN DỊCH CHUOT TRONG SANG LOC DICH CHIET THUC VAT CO TIEM NANG

KHANG VIEM

Chuyén nganh: Cong nghé sinh hoc

Mã số: 60420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Lai Thành

TS Đặng Văn Đức

Hà Nội - Năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Thi nghiệm mô hình ex vivo tế bào miễn dịch chuộttrong sàng lọc dịch chiết thực vật có tiềm năng kháng viêm.” do PGS.TS Nguyễn

Lai Thành và TS Đặng Văn Đức hướng dẫn là công trình nghiên cứu của bản thân

tôi và một số kết quả nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu

Các kết quả công bé trong luận văn là trung thực, chính xác và tôi xin chịu

trách nhiệm hoàn toàn vê các sô liệu, nội dung đã trình bày trong luận văn.

Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2023.

Học viên

Kiêu Trung Kiên.

LỜI CẢM ƠN

Để luận văn thạc sĩ này có thể hoàn thành, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thànhtrước hết tới hai người hướng dẫn khoa học của tôi PGS.TS Nguyễn Lai Thành,

người thay luôn tạo điều kiện dé tôi có thé tự do thực hiện nghiên cứu và TS Đặng

Văn Đức, người đã hướng dẫn tôi từ những bước dau tiên khi tiếp cận với các nghiên

cứu miễn dịch, đông thời cũng là người luôn dam bảo phòng thí nghiệm của chúngtôi có đây đủ hóa chất đề thực hiện các thí nghiệm tốn kém trên máy phân tích tế bào

dong chảy.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới chương trình ARES vì đã hỗ trợ cho nghiên cứu và

đã cho tôi có cơ hội được cộng tác với rất nhiều thây, cô, nhà khoa học xuất sắc Xin cảm ơn các thây, cô trong Trung tâm khoa học sự sống và cán bộ Viện Kiểm địnhQuốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế đã tạo điều kiện để tôi có thể sử dụng thiết bị của

trung tâm cho nghiên cứu của mình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên, học viên và nghiên cứu sinh củaphòng Công nghệ Tế bào Động vật và toàn thể sinh viên, học viên và nghiên cứu sinh

của các phòng thí nghiệm khác trong khoa Sinh học đã hỗ trợ tôi để hoàn thành được

luận văn này.

Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn hỗ trợ tôi trong suốt hành

1.1 Mô hình trong đánh giá độc tính, dược tính của hóa Ce 31.1.1 Cac mô hình đánh giá an toàn hóa chat và nguyên tắc 3R - 31.1.2 Mô hình phôi cá ngựa vẫn ¿52 SE EEEE2E121121121212111 111 ce 41.1.3 Mô hình tế bảo lách chuột -:-+:225+t2£ExtrttExtrtrrkrrrrrtrrrrrrrrrrrrk 9

1.1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng trong hoạt động miễn dịch của lách chuột9

1.1.3.2 Mô hình tế bào lách chuột trong thử nghiệm đáp ứng miễn dịch 11

1.2 Độc tính miễn dich eeeeeeceeesseeeseesseeeseesseesseeesneesenessneeseesseeseneeseeseneesnes 12

1.3 Cytokine và các phương pháp xác định cytokine - 55+ s<<s++s 13

1.3.1 Giới thiệu vé cytOkine -. - ¿5+ sex EEE121121717111111111 2111 tEetre 131.3.2 Kỹ thuật cơ bản dé đánh giá khả năng tiết cytokine của tế bảo 141.3.3 Cytokine tiền viêm - Interferon và interferon gamma - 161.3.4 Cytokine tiền viêm - Yếu tố hoại tử khối u -2- s5 ++s+sezxerxez 19

1.4 Thuốc 66 truyên +22 Ss9E2EE2EE9EE92E211271571711211211211711211 111111 xe 22

1.4.1 Khái quát về thuốc cổ truyên -:- 2 2252+E2+E££E£EEEEEEEEEEEEEEEErrkrrkerree 221.4.2 Nghiên cứu thuốc cô truyền trên thế giới và Việt Nam - 231.4.2.1 Nghiên cứu thuốc cổ truyền trên thế giới - 2-2 2 +x+zxe£xe£zrszxe2 231.4.2.2 Nghiên cứu về thuốc cô truyền tại Việt Nam ¿-2- s+cxczxczzzsred 26CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUU -s° se27

2.1 Vt 0 5 27 2.2 Phương pháp nghiên CỨU 1 1E 9191191 ng ng HH ri rh 28

2.2.1 Chuẩn bi mẫu dịch chiết từ thảo dược -.-:-c-ccc+ccxcrrrxerrrrrrrree 282.2.1.1 Thông tin về các dịch chiết sử dụng trong nghiên cứu: - 28

111

2.2.1.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch chiẾt 2-2 2 2+ +2£++£EezxezEzz 29

2.2.2 Thử nghiệm độc tính trên mô hình in vivo phôi cá ngựa vằn 302.2.3 Thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro tế bào lách chuột 312.2.3.1 Thu tế bao lách từ chuột +¿22++tttEErtrrrie 312.2.3.2 Sử dụng kit Promega Celltitter-Glo 1 uminescent Cell Viability Assay dé

đánh giá độc tính trên tê bào Lah eee ee eeceeeceeeeeeceeeeeeseeeseeeeeenreeeeeneens 34

2.2.4 Sử dụng phương pháp đếm tế bao bằng dòng chảy dé định lượng ảnh hưởng

viêm của dich chiết lên tế bao lách chuột kích hoạt bằng anti-CD3/CD28 35

2.2.5 Phan tích thống k6 c.ceccecceccccccssssssesessessessessessessesssvcsessessessesnsssassssssesseees 38

CHƯƠNG 3: KET QUÁ NGHIÊN CỨU -.2- 5s s2 £seesecsevsezseze 40

3.1 Kết qua thử nghiệm độc tính trên phôi cá ngựa vẫn s¿: 40

3.1.1 Ảnh hưởng của dịch chiết lên sức sống của phôi cá ngựa văn 40

3.1.2 Ảnh hưởng của các dịch chiết lên hình thái của phôi cá ngựa vằn 43

3.2 Hình thái tế bao lách sau khi kích hoạt với anti CD3/CD28 463.3 Thử nghiệm độc tính in vitro trên tế bào lách chuột s- cx+cee: 473.4 Đánh giá độc tính miễn dich của các dịch chiết trên mô hình ex vivo tế bào

3.4.3 Phân tích ảnh hưởng của 4 loại dịch chiết lên tế bào lách chuột 53

3.4.3.1 Dich chiét KT17 tao ra dit liéu bat thường va chưa phân tích được 53

3.4.3.2 KT08§ va KT15 gây tăng tỷ lệ tế bào tiết cytokine tiền viêm IENy 553.4.3.3 Tế bào T CD4+ là nhóm tế bào chính biến đổi khi tiếp xúc với dịch chiết

KTO8 và KTTI5 ¿- + x+2E2E12E12212211211211271211211211211212121 tre 59

3.4.4 KTI15 làm tăng cường độ tín hiệu của tế bào CD8+ tiết cytokine IFNy 61

4100090002757 63HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO - <5 ©s£ssssssssezssessses 64

TÀI LIEU THAM KHẢO ° o2 2Ÿ s52 ©S<Ss£EseEssESsEEseEseEseesserserssrssse 65

IV

DANH MỤC HÌNH ANH

Hình 1.1: Cấu tạo và thành phan tế bào trong lách chuột 2-2-5252 s2 10Hình 1.2: Interferon — thụ thể, con đường tín hiệu cổ điển và một số con đường tín1ò ‹:-:1S 17Hình 1.3: Con đường truyền tín hiệu của TNFa qua TNFR1 và TNER2 20Hình 2.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm ¿2 2+ E+EE+EE+E++E£E£EerEerxerxrrsrree 28Hình 2.2: Quy trình thí nghiệm thử độc trên phôi cá ngựa vằn : 31Hình 2.3: Các bước thu tế bao đơn từ lách chuột ¿- - + 22+ £E+E+EvEtzxzzerees 32Hình 2.4: Quy trình thử nghiệm độc tính trên tế bào lách -2- 222 s2 35Hình 2.5: Quy trình thí nghiệm đánh giá các cytokine tiền viêm sử dụng phương pháp

đếm tế bào dòng chảyy - 2-52 s9E2E12E15E1921121121127171121121121111121111 111 cre 38

Hình 2.6: Chiến lược khoanh vùng cho thí nghiệm đếm tế bao dòng chảy 38

Hình 2.7: Sơ đồ phương pháp phân tích kết quả đếm tế bao dòng chảy 39Hình 3.1: Đồ thị tỷ lệ phôi sống sót và bat thường hình thái của ấu thé cá ngựa vansau 96 giờ phơi nhiễm 4 dịch chiẾt -2- 2¿+¿222+2+2+EE2Ext2EEEEESEEzrxerkrerkree 40Hình 3.2: Bat thường hình thái trên phôi cá ngựa van sau 96 giờ phơi nhiễm dịch chiết

¬— 43

Hình 3.3: Tế bào lách chuột đã kích hoạt bang kháng thé kháng CD3 và CD28 46Hình 3.4: Ảnh hưởng của 4 dịch chiết KT07, KT08, KT15, KT17 lên sức sống tế bao

4 2 47 Hình 3.5: Anh hưởng của các điêu kiện thí nghiệm lên tỷ lệ tê bào CD4+ và CD8+ 4+4 50

Hình 3.6: Ty lệ tế bào tiết cytokine ở các nhóm đối chứng .-. : :- 52

Hình 3.7: Dữ liệu KT17 khi phân tích CD4+/CD8+ và TNFo+/IFNy+ —— 54 Hình 3.8: Thay đôi tỷ lệ tế bào tiết cytokine trong các quan thê tế bào lách được bổ sung các dịch chiết thực vật vào môi trường nuôi cấy 2- 2 + +22 56

Hình 3.9: Biểu đồ tỷ lệ tế bào dương tính với từng cytokine trong mỗi lô thí nghiệm

Ắaaăẳõ5ắ 60

Hình 3.10: Trung vị cường độ huỳnh quang ở các nhóm tê bào dương tính với

A1040 61

DANH MỤC BANGBảng 2.1 Hóa chất, vật tư và thiết bị sử dụng trong luận văn ‹ -‹+- 27Bảng 2.2: Thiết kế ma trận các lô thí nghiệm nhuộm nội bào bằng kháng thé gan mauhuỳnh quang sử dung kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy -:- 36Bang 3.1: Giá tri LC50, EC50 va TI của 4 dịch chiết khi thử nghiệm trên phôi cá ngựa

Bảng 3.2: Giá trị IC1, IC10, IC20 và IC50 của 4 dịch chiết lên sức sống của tế bào

vi

DANH MỤC CHỮ VIET TAT

Từ viết tắt Từ đầy đủ Dịch nghĩa Tiếng Việt (nếu có)

AKT Protein kinase B

APC Allophycocyanin

BSA Bovine serum albumin Protein albumin tir huyét thanh

bo

CD Cluster of differentiation Cum biét hoa

CIAP Cellular Inhibitor of Protein ức chế qua trình chết theo

Apoptosis Protein chu trinh.

ECHA European chemical agency | Cục hóa chất Châu Âu

ECx (vd: EC50) Efficacy concentration x Nong độ gây anh hưởng x %

ELISA The enzyme-linked Xét nghiệm miễn dịch hấp thụ

1mmunosorbent assay liên kêt với Enzyme

EMA European medicines Cục quản lý được Châu Âu

agency

EU European Union Lién minh Chau Au

EURL ECVAM | EU Reference Laboratory | Tham khảo của liên minh Châu

for alternatives to animal | Au về thử nghiệm thay thé cho thí

testing nghiệm trên động vật.

FADD Fas associated protein with | Protein ving gay chét lién hé voi

Death domain protein Fas

FDA Food and drug | Tổ chức quản lý thực pham va

administrator dược pham Hoa Ky

FITC Fluorescein isothiocyanate

GAF Gamma activated factor Yếu tố kích hoạt bởi interferon

gamma.

GAS Gamma activated site Vung kich hoat boi interferon

gamma

vil

GHS Globally Harmonized | Hệ thống hài hòa toàn cầu về

System of Classification | phân loại và ghi nhãn hóa chất

and Labelling of Chemicals hpf Hour after fertilization Gio sau thu tinh

ICD International Classification | Phan loại thống kê quốc tế về các

of Diseases bệnh tật va vấn dé sức khỏe liên

quan

ICH International Conference on | Hội nghị quéc tế về hài hòa hóa

Harmonization các thủ tục đăng ky được phẩm sử

dụng cho con người

ICx (vd: IC50) Inhibition concentration x Nông độ gây ức chế x %

IEN Interferon Interferon

IFNy Interferon gamma Interferon gamma

IL Interleukin Interleukin

ISG Interferon stimulated gen Cac gen duoc kich thich boi

interferon

ISRE Interferon stimulated | Yếu tố phan ứng với kích thích từ

response element interferon

JAK Janus kinase Janus kinase

LCx (vd: LC50) Lethal concentration x Nong độ gây tử vong x%

LPS Liposaccharide Liposaccharide

LUBAC Linear ubiquitin chain Phức lắp ráp chuỗi ubiquitin

assembly complex thăng.

MAPK Mitogen-activated protein | Protein kinase kích hoạt bởi yếu

kinases tô phân bảo.

MLMK Mixed lineage protein Protein kinase đa nguồn gốc

kinase

Vili

NF-kB Nuclear factor

kappa-light-chain-enhancer of activated

B cells

Yếu tố hạt nhân tăng cường chuỗi

nhẹ kappa của các tê bào B hoạt

động

NK Nature killer (cell) Té bao giét tu nhién

OECD Organisation for Economic | Tổ chức Hop tác va Phát triển

Co-operation and | Kinh té

STAT Signal transducer and Protein chuyên đổi va kích hoạt

activator of transcription phién ma protein.

TACE Tumour necrosis factor | Enzym chuyên đổi yếu tố họai tử

alpha converting enzyme khối u

TDAR T cell dependent antibody | Đáp ứng kháng thé phụ thuộc vào

response té bao T

TI Teratogenic index Trị số phát trién bat thường

TNF Tumor necrosis factor Yếu tổ hoại tử khối u

TNFa Tumor necrosis factor alpha | Yếu tố hoại tử khối u alpha

TNFR Tumor necrosis factor Thu thé yeu tô hoại tử khối u

TRADD Tumor necrosis factor | Thu thể yếu tố hoại tử khối u loại

receptor type l-associated | I liên hệ với protein vùng gây

DEATH domain protein chét

TRAF Tumor necrosis factor Yếu tố liên hệ với thụ thể yếu tố

receptor—associated factor | hoại tử khôi u.

TYK Tyrosine kinase Protein kinase tyrosine

1X

MỞ ĐẦU

Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng sinh học của hóa chất là bước đầu tiên trongnghiên cứu sàng lọc thuốc Quy trình nghiên cứu thường tuân theo hướng dẫn của các

tổ chức quốc tế như OECD và các tô chức quản lý hóa chất và được phẩm ở từng

quốc gia (như FDA ở Hoa Kỳ, ECHA va EMA ở Liên minh Châu Âu) dé đảm bảo

chất lượng Hiện nay, nguyên tắc 3Rs đang là xu hướng phát triển chung của các

nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của hóa chất lên mô hình sinh học, 3Rs bao gồmReduction: giảm thiểu; Replace: thay thé; Refinement: cải tiến; mục tiêu chung là hạnchế sử dụng các mô hình động vật thí nghiệm, đảm bảo nhân đạo khi sử dụng sinhvật mô hình Các phương pháp thay thế (alternative method) được đề xuất và khuyến

khích sử dụng thường có yêu cầu cao hơn về khoa học kỹ thuật, hướng tới cung cấpthêm thông tin về các đặc điểm độc học khác của hóa chất như độc tính gen hay độc

tính miễn dịch bên cạnh đữ liệu cơ bản về độc tính lên sức sống của sinh vật

Thuốc cô truyền đã trở thành xu hướng nghiên cứu trên thé giới, nhiều bàibáo khoa học đã chứng minh dược tính và khả năng ứng dụng của nhiều thực vật từ

thuốc cô truyền Một số ví dụ như Ma Hoàng có khả năng kháng viêm, Combretum

caffrum là thực vật cỗ truyền của Nam Phi có hoạt chất kháng ung thư

Combretastatins và đã được thử nghiệm lâm sàng nhưng do các ảnh hưởng tiêu cực lên hệ tim mạch nên chưa được ứng dụng rộng rãi [20, 33, 34], Palitaxel (Taxol) là

thuốc chữa ung thư phổ biến có nguồn gốc từ vỏ cây Thủy Tùng (Taxus brevifolia)

đã được phát hiện và nghiên cứu từ những năm 1960 [17] Việt Nam là đất nước giàutai nguyên thiên nhiên và có lịch sử lâu đời sử dụng thực vật từ tự nhiên dé chữa bệnh

và cải thiện sức khỏe Một số loài dược liệu bản địa đã được chứng minh khoa học

có tính hiệu quả, như cây Lim Xanh [74], Bọ Mây [55] Mặc dù vậy, phần lớn cácthực vật quý này vẫn chưa có bằng chứng khoa học chứng minh tính hiệu quả và tính

thực vật có tiềm năng kháng viêm” đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm cá ngựavăn và phòng thí nghiệm Công nghệ tế bảo động vật, khoa Sinh học, Đại học Khoahọc tự nhiên Mục tiêu của nghiên cứu bao gồm:

1 Xác định được ngưỡng nồng độ ảnh hưởng của một số loại dịch chiết tự

nhiên lên hình thái va sức sống của mô hình phôi cá ngựa van (Danio

rerio).

2 Xác định được độc tinh in vitro của các dịch chiết tiềm năng lên mô hình

tế bào lách chuột

3 Đánh giá được khả năng điều hòa miễn dịch của các dịch chiết tự nhiên

lên mô hình tế bào thông qua khả năng tiết 2 cytokine tiền viêm IFNy vàTNFa của tế bào lách chuột được kích hoạt bằng kháng thé kháng

CD3/CD28.

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Mô hình trong đánh giá độc tinh, dược tinh của hóa chat

1.1.1 Các mô hình đánh giá an toàn hóa chất và nguyên tắc 3R

Đề đánh giá ảnh hưởng sinh học của một hóa chất, các nhà khoa học thườngbắt đầu từ khảo sát tính an toàn thông qua các thí nghiệm độc học (toxicology test)

Mô hình thí nghiệm phổ biến nhất cho các thí nghiệm độc học thời kỳ đầu là các môhình in vivo trên động vật sống, đặc biệt là trên chuột nhắt trắng (Mus musculus) Vi

dụ như OECD 401 là hướng dẫn thử nghiệm độc tính đường miệng được OECD xây

dựng từ 1980 với đối tượng thử nghiệm là chuột Nó đã được thay thế bởi hướng dẫnOECD số 423 từ 1996, sửa đổi năm 2001 nham giảm thiểu số lượng cá thé cần thiết

dé xác định giá tri LD50 của hóa chất [57] OECD cũng cung cấp một số thiết kế thử

nghiệm khác dé xác định độc tính hóa chất cũng trên đối tượng chuột như OECD 425,

dé phù hop với da dạng các nhóm chat thí nghiệm Các thử nghiệm độc tính có xuhướng phát triển rời xa khỏi các thí nghiệm trên động vật và hướng tới sử dụng cácphương pháp thay thế (alternative methods), động lực của sự phát triển này là nguyêntắc 3R 3R (hay 3Rs) là ký hiệu viết tắt cho: Replace: thay thế, Reduce: giảm bớt,Refine: cải tiến được William Russell va Rex Burch khởi xướng từ 1959 với mục tiêuđảm bảo tính nhân đạo cho động vật thí nghiệm đồng thời vẫn duy trì tiến bộ trongkhoa học [68] Những ảnh hường mà nguyên tắc 3Rs đã tạo ra sau hơn 70 năm tồntại và phát triển có thé quan sát thay trong các tài liệu hướng dẫn thử nghiệm của các

tổ chức quản ly hóa chất: Hướng dẫn thử nghiệm độc tính của OECD và EU 2023giới thiệu 29 thí nghiệm khác nhau đề đánh giá ảnh hưởng lên sức khỏe và môi trường[2] Trong đó, không có thử nghiệm nào tiến hành trực tiếp trên động vật có xương

sông và đều ưu tiên sử dụng các phương pháp thay thế, ví dụ: thử nghiệm trên võngmạc bò (mô hình ex vivo) OECD 437 dé kiêm tra anh hưởng lên mắt; thử nghiệm trên

biểu bì người nhân tạo (in vitro) — OECD 439 dé kiểm tra khả năng gây kích ứng da;

mô hình in vitro Micronucleus tế bào động vật có vú — OECD 487 dé đánh giá khả

năng gây độc lên hệ gen (genotoxic) và mô hình đánh giá độc tính trên phôi cá ngựa

văn — OECD 236 dé khảo sát độc học môi trường Xu hướng chung là thay thế mô

hình động vật truyện thong băng các mô hình in vitro, ex vivo hoặc in vivo trên động

3

vật bậc thấp hơn; giảm thiểu các thử nghiệm không cần thiết trên động vật và giảm

tối đa số lượng động vật cần thí nghiệm trong các thử nghiệm trên động vật; cải tiền

các phương pháp đang sử dung dé giúp giảm căng thang cho động vật trong toàn bộquá trình trước, trong và sau khi thực hiện thử nghiệm Chuẩn hóa kết quả các thửnghiệm dé hình thành các cơ sở dữ liệu về độc tinh chat, từ đó có thé giảm thực hiệncác thí nghiệm trùng lặp và là cơ sở sử dụng thêm các phương pháp tin sinh học dé

dự đoán ảnh hưởng của các hóa chất mới có đặc điểm cấu trúc tương tự

Ứng dụng quy tắc 3Rs trong luận văn được thê hiện qua hai mô hình thí nghiệm

sử dụng gồm: mô hình in vivo phôi cá ngựa văn và mô hình ex vivo tế bào lách chuộtđều là các mô hình đánh giá thay thế, trong đó kết quả khảo sát trên phôi cá đượcdùng làm nền tang dé tìm hiểu sâu hơn về khả năng anh hưởng của dịch chiết tự nhiênlên quá trình viêm Một số thông tin giới thiệu về 2 mô hình này được trình bày trongphần tiếp theo

1.1.2 Mô hình phôi cá ngựa văn

Thử nghiệm độc tính của hóa chất lên mô hình phôi và ấu thể cá ngựa văn đã

được thực hiện trên 30 năm và đã đạt được rất nhiều kết quả đáng kê, khẳng định tính

khoa học và hiệu quả của mô hình.

Các thử nghiệm đầu tiên trên mô hình ấu thể cá ngựa văn được thực hiện bởi

Geogre Streisinger và các cộng sự của ông từ những năm 1980 tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử tai đại hoc Oregon, Hoa Kỳ Streisinger đã nhân bản thành công cá

ngựa vằn lưỡng bội và giới thiệu mô hình này đến rất nhiều cơ sở nghiên cứu kháctrên thế giới [45] Hiện nay, cá ngựa van và mô hình thử nghiệm phôi cá đã đượccộng đồng khoa học sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và ngày càng phô biếntrong các xuất bản trên các tạp chí khoa học Tìm kiếm từ khóa “zebrafish” trên thưviện điện tử Pubmed cho thay có hơn 50.000 kết quả, trong đó số xuất bản mỗi năm

từ 2020 đến 2022 đạt trên 4.000 bài mỗi năm Nếu giới hạn từ khóa cho ấu thể và

phôi cá ngựa văn “zebrafish embryo” và “larvae” thu được trên 2.700 kết quả, trong

đó hơn 2.300 kết quả là các xuất bản mới từ 2010 và khoảng 300 bài được xuất bản

mỗi năm từ 2020 đến nay

Phôi cá ngựa văn đã được ứng dụng trong nghiên cứu độc tính của rât nhiêu

hóa chất khác nhau do rất nhiều ưu điểm Trong bài nghiên cứu tông hợp về ứng dụng

mô hình cá ngựa van trong đánh giá an toàn khi sàng lọc thuốc Izuru Miyawaki đã

đưa ra 13 ưu thế của mô hình này [52]:

Dễ dàng thực hiện các kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen.

Vòng đời ngắn, dé tạo các mô hình bệnh

Phôi và ấu thé có kích thước nhỏ, vừa trong đĩa 384 giếng chứa 50 pL nước

Dé chăm sóc và giao phối, yêu cầu cơ sở vật chat đơn giản với chi phí chămsóc thấp

Cá trưởng thành đẻ mắn (khoảng 200 trứng/tuần) cho phép chuẩn bị số lượng

mẫu thí nghiệm lớn.

Cá có thé hap thụ chat thử qua miệng, mang và da, do vậy chỉ cần hòa tanchất thử nghiệm trong nước nuôi cá

Trường hợp chất thử nghiệm không tan trong nước, là hợp chất phân tử lớn

hoặc protein, có thể tiêm trực tiếp vào noãn hoàng, xoang tĩnh mạch hoặc

mạch máu Với cá trưởng thành còn có thể đưa thuốc theo đường miệng hoặc

tiêm bụng.

Phôi thu tinh ngoài, dễ thao tác.

Tốc độ phát triển phôi rất nhanh, cho phép thực hiện các nghiên cứu độc họcphát triển trong một thời gian ngăn (các cơ quan được hình thành gần như

hoàn chỉnh sau 24 giờ sau thụ tinh, ấu thể thoát khỏi vỏ phôi sau 3 — 4 ngày).Phôi và au thé gần như trong suốt, cho phép theo dõi quá trình phát triển hình

thái mà không cân mô.

Hướng dẫn số 236 của OECD cho thử nghiệm độc tính trên phôi cá có thể

được ứng dụng với phôi cá ngựa văn, đây là một trong những hướng dẫn thử nghiệm

độc tính môi trường nước được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu, được EURL

ECVAM khuyên khích sử dụng từ tháng 7/2014 cho các hóa chất công nghiệp, chat

bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm [14].

Mô hình phôi cá ngựa văn là một mô hình độc học phát triển, trong khoảng

120 giờ, cá phát triển từ 1 phôi bào đến cơ thé toàn diện (Whole body) Điều này tạo

điều kiện cho các nghiên cứu sâu hơn về độc học phát triển, các cơ quan nhận được

nhiều quan tâm bao gồm: Tim, hệ mạch, gan và thần kinh

Tim: quá trình phát triển tim của cá ngựa van và con người có nhiều điểmtương đồng, cả 2 đều bắt đầu từ tế bảo tiền thân tim phát triển thành 1 ống tim Ởkhoảng 30 giờ sau khi thụ tinh, ống tim bắt đầu hình thành các ngăn tim Từ 72 — 96giờ sau thụ tinh, tim cá tiếp tục hoàn thiện và đỉnh tâm thất được hình thành trongkhoảng thời gian này, hệ gen của cá và người có chung nghiều gen thiết yếu [40].Một số mô hình bệnh tim đã được phát triển trên mô hình phôi cá như chứng QT kéodai ở dòng đột biến allele kcnh2 [7] Trong một nghiên cứu năm 2022, chất điều hòa

sinh trưởng thực vật 6 — BA được đánh giá tính an toàn sử dụng mô hình phôi cá ngựa

văn Kết quả cho thay 6 - BA gây ảnh hưởng đến quá trình hình thành tim ở cá, gâytăng tế bào chết theo chu trình ở tim cá với cơ chế thông qua thay đổi biểu hiện cácgen cần thiết cho quá trình phát triển tim như my/7, vmhc, myh6, và quá trình hình

thành xoang nhĩ thất như bmp4, tbx2b, và notch1b [79] Trong một nghiên cứu khác,

thuốc diệt cỏ pendimethalin được đánh giá ảnh hưởng lên phôi cá ngựa van Các cáthé tiếp xúc với thuốc có xuất hiện các dị dang hình thái như phù mang tim, phù mangnoãn hoàng, cong cột sống và bat thường trong hình thành khoang tim Nhóm nghiêncứu cũng tìm thấy thay đổi trong các chỉ dấu liên quan đến phát triển tim và tế bàochết theo chu trình vbhc, nppa, tbx5a, nkx2.5, gata4, thx2b and FoxOI, bax, bcl-2,

p53, casp-9, casp-3, đặc biệt, kích hoạt con đường Wnt bằng BML-284 (10 nm) có

khả năng làm giảm mức độ phù màng tim của ấu thé cá tiếp xúc với thuốc diệt cỏ

[51].

Gan: Trong nghiên cứu của Jian-hui He và cộng sự, phôi cá được phơi nhiễmvới 6 loại thuốc gây độc trên gan đã biết ở người: acetaminophen, aspirin, tetracycline,

sodium valporate, cyclophosphamide và erythromycin dé đánh giá hiệu quả của môhình Au thé cá 3 ngày tudi được cho tiếp xúc với thuốc trong 2 ngày ở các nồng độkhông có khả năng gây tử vong hoặc gây chết rất thấp (<.LC10) Kết quả cho thấy âuthé xuất hiện các kiểu hình gan khác biệt rõ rệt so với đối chứng, gan không còn trongsuốt mà trở nên tối màu [24] Một nghiên cứu mới hơn công bố năm 2020 đã đánhgiá khả năng gây độc gan của 19 đơn chat tinh khiết được chiết từ Polygoni MultifloriThunb lên phôi cá Hiện tượng gan chuyền tối màu được khang định là bang chứngtốt dé nhận diện các thuốc gây ton thương gan do có tương đồng cao với kết qua phân

tích hoạt tính enzyme gan ALT và AST Nhóm nghiên cứu đã xác định được 6/19

đơn chất có độc tính trên gan rất rõ rệt và đưa đến kết luận thành phần emodin,

emodin-8-O-B-D-glucopyranoside, chryophanol và đianthrone là tác nhân dẫn đến

độc tính trên gan của Polygoni Multilori [46].

Trong các nghiên cứu về cá ngựa van, các giá trị LC50, EC50 va TI thường

được sử dụng làm các tiêu chuẩn để đánh giá ảnh hưởng và xếp loại các hóa chất.Trong đó, giá trị LC50 là nồng độ ước tính từ đường cong đáp ứng liều sao cho 50%lượng cá thé tử vong, EC50 là nồng độ với 50% cá thé xuất hiện bat thường hình thái.Riêng giá trị chỉ số dị dạng (TI— teratogenic index), có 2 phương pháp tính khác nhau

thường được sử dụng Phương pháp thứ nhất xuất phát từ thử nghiệm tính hiệu quả

của thí nghiệm độc tính trên phôi cá ngựa van trong sàng lọc thuốc được thực hiệnbởi tập hợp một số công ty dược gồm Astrazeneca, Pfizer, Lampire và BMS Kết quả

2 giai đoạn được báo cáo trong 2 bài báo của Gustafson (2012) và Ball (2014) [8, 22].

Giai đoạn | được báo cáo bởi Gustafson và cộng sự vào năm 2012, đây là một trong

những nghiên cứu đi đầu đánh giá sự tương đồng kết quả thử nghiệm độc tính trênphôi cá ngựa van giữa các phòng thí nghiệm khác nhau Họ chọn 10 chất gây dị dạng

và 10 chất không gây di dạng trên động vật dé thử nghiệm trên phôi cá ở 4 phòng thi

nghiệm khác nhau Kết quả cho thấy tương đồng giữa các lab đạt khoảng 60 — 70 %

Trong giai đoạn 2, thử nghiệm được thực hiện trên 2 phòng thí nghiệm với 2 loại cá

ngựa van với nguồn gốc khác nhau và so sánh 38 chất (19 gây di tật và 19 không gây

dị tật được chọn làm thử nghiệm Ở trong cả 2 thử nghiệm, chỉ số di dạng Teratogenic index (TI) được nhóm đề xuất là tỷ lệ giữa nồng độ gây tử vong 25%phôi thí nghiệm với nồng độ không gây ảnh hưởng quan sát được (LC25/NOEAL)

-và TI> 10 được coi là chuẩn dé xác định một chất là chất gây di tật (Teratogen) Một

thử nghiệm quy mô lớn trên phôi cá cũng sử dụng phương pháp tính toán

TI = LC25/NOEAL được thực hiện bởi nhóm của Yi-Sheng Song nhăm kiểm tra hiệuquả của mô hình và tối ưu hóa các ngưỡng đánh giá kết quả Với quy trình tuân theo

tiêu chuẩn hướng dẫn của ICH S5(R3), trong 31 chất chuân dương tính có khả năng

gây di dạng theo tiêu chuẩn của ICH, phôi cá đạt độ nhạy 74,2% (23/31), với 14 chấtchuẩn âm tính không có khả năng gây dị dạng phôi cá dự đoán chính xác 12 chất đạt

tỷ lệ 85.7% Nhóm nghiên cứu dé xuất b6 sung thêm giá trị TI tại thời điểm 48h làmtiêu chuẩn đánh giá, đồng thời hạ ngưỡng giá trị gây dị dang của TI > 10 xuống

TI > 3 sẽ giúp tăng độ nhạy của thí nghiệm phôi cá ngựa van lên tới 90,3% [92]

Ở phương pháp thứ 2, giá trị TI được tính toán bằng tỷ lệ giữa LC50 và EC50

Nghiên cứu sớm nhất trên phôi cá ngựa vằn có sử dụng giá trị TI này là của Ingrid

W.T Selderslaghs và cộng sự vào 2009, 4 chất gây dị tật đã biết retinoic acid, valproic

acid, caffeine, lithium chloride và 2 chat không gây di tat (glucose, saccharin) đã đượcthử nghiệm Tác giả đã tinh TI = LC50/EC50 và lay TI > 1 là ngưỡng xác định chấtgây di tật Trong nghiên cứu tiếp theo của cùng nhóm tác giả vào năm 2011, một bộgồm 27 chất thử nghiệm bao gồm cả các 6 chất trước đó được đánh giá trên phôi cá

ngựa van Ngưỡng của TI được điều chỉnh lên 2 dé giảm hiện tượng dương tinh giả

Một nghiên cứu tương tự được thực hiện bởi nhóm cua Sergio Jarque (2020) và cộng

sự, thử nghiệm trên 31 chất Nhóm đưa ra ngưỡng đánh giá là TI > 3 và EC50 < 1000

uM [30] Nghiên cứu của SH Lee và cộng sự đã so sánh 7 loại thuốc trị động kinh

lên mô hình phôi cá và thu được kết quả la TI của các loại thuốc dao động từ

0,76 — 2,68, trong đó các thuốc xếp hạng D theo tiêu chuẩn độc tính trên người của

FDA có TI đều lớn hơn 2, còn các thuốc xếp hang C (ít độc hơn) có TI dao động từ0,73 đến 2,3 Có thé thay các chất có TI > 0,7 đã có thé là chất gây di dạng phôi thai,đồng thời với TI > 2 chắc chắn là chat gây di dang [41]

Có thể nhận thay phôi và ấu thé cá ngựa van là một mô hình độc học rất

mạnh mẽ, đặc biệt nhờ khả năng sàng lọc các ấu thé bat thường dựa trên hình thái

quan sát ngay khi phơi nhiễm, các thông tin hình thái là cơ sở để mở rộng các sảng

lọc sâu hơn về chức năng của chất Tuy nhiên, những khác biệt lớn trong cấu tạo cơ

thé giữa cá và người làm cá ngựa van không phải mô hình lý tưởng cho các nghiên

cứu chuyên sâu, thay vào đó, các mô hình trên chuột vẫn là đối tượng thí nghiệm chủ

chốt Trong nghiên cứu nay, phôi cá ngựa van được dùng dé sang lọc các dịch chiết

sau đó, mô hình ex vivo lách chuột sẽ được ứng dụng đề tìm hiểu sâu hơn về khả năng

điều hòa miễn dịch của các dịch chiết

1.1.3 Mô hình tế bào lách chuột

1.1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng trong hoạt động miễn dịch của

lách chuột

Lach là co quan miễn dịch thứ cấp lớn nhất trong cơ thé chuột và thực hiện

rất nhiều chức năng miễn dịch Cấu trúc lách được mô tả trong hình 1.1A, bao gồmtủy đỏ (red pulp), tủy trắng (white pulp) và vùng biên (marginal zone) Tủy trắngchiếm khoảng một phần tư cấu trúc mô của mô lách và đóng vai trò cơ bản trong đápứng miễn dich Tuy trang gồm nhiều cấu trúc tương tự với hạch bạch huyết, trong tủytrang có các tế bào T nhớ và T non trẻ (naive) được kích hoạt khi tiếp xúc với cáckháng nguyên và phản ứng đáp ứng miễn dịch phụ thuộc tế bào T ở vùng tâm phôi(germinal center) của tế bào B Bên trong tủy trăng có các khu vực riêng cho tế bào

T và B Vùng tế bào T được hình thành quanh mạch máu trung tâm đi qua tủy trắng,các tế bào T CD4+ sẽ tập trung ở bên ngoài dé tiếp cận được với các tế bao B nang.Ngược lại, tế bào T CD8+ nằm phía bên trong, gần với mạch máu dé có thể tiếp xúcvới tế bào trình điện kháng nguyên Sau khi được tiếp xúc với kháng nguyên, các tếbào T gây độc đã được kích hoạt sẽ rời tủy trang dé sang vùng biên và tủy đỏ, giúptiêu diét các tác nhân lây nhiễm trong lách Sau đó, một số tế bao T ghi nhớ CD8+ sẽtrở lại tủy trắng, tế bào T nhớ CD63L-CXCR3 thì sẽ ở lại tủy đỏ Vùng tế bào B làcác nang (follicle), chứa hỗn hợp các tế bào quan trọng cho kích hoạt và sống sót của

tế bào B Khi tế bào B nang được kích hoạt, nó sẽ đi chuyên qua lại giữa vùng sáng

và tôi của vùng tâm phôi (germinal center), CXCR5 khiến tế bào B di chuyên sang

9

vùng sáng đề tiếp xúc với tế bào T hỗ trợ, CXCR4 đưa tế bào B sang vùng tối, nơichúng có thé tăng sinh, chuyển đổi nhóm (class switch) và đột biến (somatic

hypermutation) Sau quá trình này, một số tế bào B sẽ di chuyên sang tủy đỏ và trở

thành tế bào tiết kháng thé và một số trở thành tế bao plasma tuổi thọ cao sống trong

tủy đỏ Ngoài các tế bao lympho, lách còn chứa nhiều loại tế bào khác bao gồm: tếbào tua (dendritic cell), tế bào NK, tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào [43]

OC wm #CD4 #T-reg # CD8 8# B-cell # NK # iMC # mDC # Macs © pDC # Neutro

Hình 1.1: Cấu tạo và thành phần tế bào trong lách chuột

(A) Cau tạo của lách chuột và lách người [43]; (B) Thanh phan tế bào trong lách của 3

dòng chuột thí nghiệm phô biên C57BL/6, Balb/c, 129/SvHsd [25].

Theo nghiên cứu của Jonathan A Hensel và cộng sự năm 2019, tỷ lệ tế bào

trong lách của 3 dòng chuột thường sử dụng trong thí nghiệm miễn dich C57BL/6NCT,

129/SvHsd, và BALB/cAnNCr đã được đánh giá bằng phương pháp đếm tế bào băngdòng chảy (Hình 1.1B) Tế bao lympho, bao gồm cả tế bào B và tế bao T, là nhómchiếm tỷ trọng lớn nhất trong quan thể tế bào lách ở cả 3 dòng chuột, tỷ lệ tế bào

lympho sẽ dao động trong khoảng 60 — 80% tổng số tế bào lách Tỷ lệ tế bào B ở

chuột C57BL/6 chỉ đạt khoảng 20%, khoảng 44% và 48% ở chuột Balb/c và chuột

129/SvHsd Với tế bào T CD4+, CD57BL/6 ở mức khoảng 20%, Balb/c ở mức

khoảng 28%, đặc biệt, dòng 129/SvHsd có tỷ lệ T CD4+ chênh lệch khá lớn giữa 2

giới tính, chuột đực có nhiều tế bào T CD4+ hơn ở mức 31,67% trong khi chuột cai

chỉ có 24% Tỷ lệ tế bao T CD8+ của dòng C57BL/6 xấp xi 18%, dòng 129/SvHsd ở

10

khoảng 12%, chuột cái dòng Balb/c có ty lệ cao hơn ở mức 21,39% trong khi chuột

đực ở mức 17,7% Các nhóm còn lại có tỷ lệ thấp, dao động từ 0,3% đến 4% [25]

1.1.3.2 Mô hình tế bào lách chuột trong thử nghiệm đáp ứng miễn dịch

Mô hình tế bào lách của chuột đã được ứng dụng trong các nghiên cứu liênquan tới miễn dịch trong một thời gian dài Có những nghiên cứu từ 1975 đã sử dụng

sự thay đôi tỷ lệ các nhóm tế bào miễn dịch trong lách chuột sau khi tiêm các kháng

nguyên khác nhau như tế bào hồng cầu từ cừu (đây là kháng nguyên kích thích hệ

miễn dịch phụ thuộc tế bào T, LPS từ £ coli (Kháng nguyên không phụ thuộc tế baoT) và virus gây ung thư bạch cầu (Friend leukemia virus) để đánh giá đặc điểm đáp

ứng của tế bào miễn dịch với các loại kháng nguyên [16] Concanavalin A (ConA) làmột tác nhân gây phân bào ở thực vật đã được chứng minh có ảnh hưởng lên tế bào

miễn dịch dựa trên các nghiên cứu trên tế bào lách Thử nghiệm đầu tiên của Dutton(1972) cho thấy phụ thuộc vào nồng độ ConA khác nhau mà phản ứng của tế bào Tvới hồng cầu cừu thay đổi, đồng thời quan trọng hơn, khi thử nghiệm với tế bào lách

đã được tiếp xúc trước với ConA sau 24 giờ và 48 giờ trước khi tiếp xúc với khángnguyên (hồng cầu cừu), phản ứng của tế bào lách lại đối lập nhau: ở thời điểm 24 giờ,

tế bào bị ức chế và giảm số lượng nhưng ở thời điểm 48 giờ tế bào lại tăng sinh, đây

là một trong những bằng chứng sớm nhất cho sự tổn tại của 2 loại tế bào T khác nhautrong lách chuột, một loại gây độc có tuổi thọ ngắn và một loại hỗ trợ tăng sinh tồntại lâu hơn, cả 2 loại đều bị kích hoạt bởi lectin ConA Hiện nay, tuy co chế kích hoạt

tế bào T của ConA vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn, ConA vẫn được sử dụng chungvới ionomycin và phorbol 12-myristate 13-acetate trong các thí nghiệm tăng sinh tế

bao T Ngoài phối hợp với ConA, tế bao lách cũng thường được sử dụng trong các

nghiên cứu làm giàu tế bào T, từ những nghiên cứu cô điển, sử dụng kháng thể khángCD3+ cùng với IL-2 [1], đến các thí nghiệm đồng kích hoạt tế bao T trong lách băng

anti CD3/CD28 [38] Bên cạnh đó, tế bào lách chuột là mô hình nghiên cứu tìm kiếm

giải pháp cho các căn bệnh thời đại như: Ung thư biểu mô [66], ung thư máu [88, 90],

bệnh đa xơ cứng [94].

II

1.2 Độc tính miễn dịch

Độc tính miễn dịch được định nghĩa là các thay đôi có hại hoặc không thíchhợp lên cau trúc và chức năng của hệ miễn dịch, hoặc gây hại đến các hệ thong khac

do hoạt động bat thường của hệ miễn dịch Một anh hưởng được coi là gây ra độc

tính miễn dịch nếu nó làm cản trở hoạt động của hệ miễn dịch thể dịch và hệ miễndịch tế bào cần thiết cho chủ thể chống lại các tác nhân lây nhiễm (ức chế miễn dịch

— immunosuppressant) hoặc gây ra những tổn thương mô không cần thiết (bệnh tự

miễn, quá man hoặc viêm mạn tính) Một thay đôi trong chức năng miễn dịch có thé

là một ảnh hưởng có hại hoặc do kết quả của quá trình kích hoạt miễn dịch(immunostimulation) và một đáp ứng tăng cường phản ứng miễn dich lại có thé gây

ức chế đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân khác

Trong các nghiên cứu sang lọc thuốc, tiêu chuẩn được sử dụng phô biến dé

đánh giá độc tính miễn dich là hướng dẫn S8 của ICH Hướng dẫn thử nghiệm độc

tính này được xuất bản vào năm 2005 [84], trong đó tập trung vào độc tính ức chế

miễn dịch Nhóm thử nghiệm sẽ thực hiện và theo dõi một bộ thí nghiệm độc tínhtiêu chuẩn trên chuột (standard toxicology studies) với 5 đặc điểm, nhằm tim kiếmdấu hiệu của độc tính miễn dịch:

© Chỉ số máu: đếm số tế bào bạch cầu tổng số

e Hoa lâm sàng: mức độ globulin và tỷ lệ A/G

e Bệnh học giải phẫu: các mô cơ quan lympho

e Can nặng cơ quan: tuyén ức (thymus), lách, có thể bao gồm một số hạch bạch

huyết

e Mô bệnh học: tuyến ức, lách, hạch bạch huyết, tủy xương,

Từ kết quả bộ thí nghiệm kết hợp với các thông tin về dược lý của thuốc, đặcđiểm của nhóm bệnh nhân sẽ sử dụng thuốc, sự tương đồng cấu trúc của thuốc so với

các chất ức chế miễn dịch đã biết, đặc điểm khi sử dụng của thuốc và thông tin lâm

sảng của bệnh nhân, nhà nghiên cứu có thể cần thực hiện thêm các thử nghiệm độctính miễn dịch bé sung

Bên cạnh các phương pháp thử nghiệm trên động vật, các phương pháp thay

thế cũng đang dần được phát triển, tháng 6 năm 2023, OECD xuất bản hướng dẫn số

12

444A về thử nghiệm độc tính miễn dich in vitro, thí nghiệm sẽ ứng dụng phương

pháp IL-2 Luc assay Một dòng tế bào lympho nguyên bào T chuyên gen cho phép

định lượng biểu hiện gen của cytokine IL-2, IFNy va GAPDH dựa trên tín hiệu phát

quang từ phản ứng cua luciferase [58].

Có thể nhận thấy, tuy nghiên cứu về độc tính miễn dịch đã xuất hiện từ lâunhưng chưa nhận được nhiều quan tâm của các nhà quản lý, do đó, các hướng dẫnthử nghiệm còn rất hạn chế Mặc dù vậy, xu hướng chung là tiễn đến sử dụng các mô

hình hạn chế sử dụng động vật ở các hướng dẫn thử nghiệm được giới thiệu trong

mục này, các hướng dẫn càng mới thì càng ưu tiên dùng các biện pháp thay thế Bêncạnh các hướng dẫn thử nghiệm độc tính từ các tô chức quốc tế, có thể tham khảo các

mô hình đánh giá độc tính miễn dịch đã và đang được sử dụng trong nghiên cứu Ởmục tiếp theo, các phương pháp đánh giá cytokine tiết của tế bào miễn dịch sẽ được

giới thiệu, đây là nhóm phương pháp thường sử dụng trong nghiên cứu, hướng dẫn

444A của OECD cũng năm trong nhóm này

1.3 Cytokine và các phương pháp xác định cytokine

1.3.1 Giới thiệu về cytokine

Cytokine là các protein tan được tiết ra từ các tế bào miễn dịch bao gồm tếbao lympho, tế bào NK, dưỡng bào, tế bào nền (stromal cell) Chúng là các phân

tử trung gian truyền tín hiệu có chức năng điều hòa hệ miễn dịch Một loại cytokine

có thê được tiết ra từ nhiều tế bào khác nhau, đồng thời cũng có thể có nhiều hơn mộtdich tác động (pleiotrophic) Lượng cytokine trong thé dich (bao gồm huyết tương,

máu, mồ hôi, phân, nước bọt) có thể cung cấp nhiều thông tin có giá trị về tính hìnhsức khỏe, giúp chuẩn đoán và tiên lượng nhiều loại bệnh Ví dụ tiêu biểu là tiên lượngcủa bệnh nhân nhiễm COVID-19 có thể được đánh giá dựa trên lượng cytokine IL-6

trong huyết tương [19]

Cytokine được phân loại thành các nhóm: Yếu tố hoại tử khối u (tumornecrosis factor), interleukin (ILs), interferon (IFNs), lymphokine, monokine, yếu tốhình thành quan lac (colony stimulating factors — CSFs) Cac nhóm cytokine này bandau được đặt tên dựa trên chức năng giúp tim ra cytokine tương ứng, ví du nhưinterferon được tiết ra khi tiếp xúc với virus, các yếu tổ hoại tử khối u gây chết không

13

theo chu trình ở tế bao ung thư, các lymphokine được tiết ra từ tế bào lympho, cácinterleukin chịu trách nhiệm liên lạc giữa các loại bach cầu khác nhau Tuy vậy, sauquá trình nghiên cứu, nhiều cytokine mang nhiều chức năng hơn so với chức năng

trong tên của chúng, do vậy cách phân chia này hiện tại chỉ mang tính chất tham khảo

một phần cho chức năng của 1 cytokine Các cytokine cũng có thể được phân loạitheo nguồn gốc tế bảo tiết ra nó, vi dụ như cytokine nhóm 1 (type 1) được tiết ra từ

tế bào T hỗ trợ loại 1 (T helper 1 cells) gồm có IL-2, IL-12, IFN-y và TNF-B; cytokine

nhóm 2 được tiết ra từ tế bao T hỗ trợ loại 2 (T helper 2 cells) gồm có 4, 5,

IL-6, IL-10 và IL-13 Cũng có thé phân loại cytokine dựa trên ảnh hưởng của nó lên quátrình viêm thành 2 nhóm lớn là cytokine tiền viêm (pro-inflammatory) và cytokine

kháng viêm (anti-inflammatory) [48].

1.3.2 Kỹ thuật cơ bản để đánh giá khả năng tiết cytokine của tế bào

Dé đánh giá định lượng cytokine, có nhiều phương pháp đã được sử dụngnhưng về cơ bản có thể chia thành 2 nhóm chính là nhóm các phương pháp ELISA

và nhuộm nội bào và đánh giá bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy (Flowcytometry) Trong đó, các phương pháp ứng dụng ELISA thường sẽ thu dich nuôi tế

bào hoặc dịch ly giải tế bào, các cytokine sẽ bị bắt giữ bởi kháng thé sơ cấp và định

lượng thông qua tín hiệu từ kháng thé thử cấp liên kết với kháng thé sơ cấp Vớiphương pháp nhuộm nội bao và phân tích bang máy đếm tế bào dòng chảy, các tế bao

sẽ được có định (thông thường sử dụng paraformaldehyde 10%) và làm tăng tính

thấm của màng bằng dung dịch chứa các chất có tính xà phòng hóa như triton-x100hoặc saponin Sau đó, các kháng thé gắn màu sẽ có thé tiếp xúc và liên kết với cácphân tử cytokine bên trong tế bao, tín hiệu từ các khang thé tương ứng với lượngcytokine bên trong tế bào [37, 80]

Phương pháp ELISA cho phép định lượng tông số cytokine đã tiết ra sau 1quá trình thời gian thử nghiệm xác định, trong khi đó đêm tế bao dòng chảy cung cấpthông tin về tín hiệu cytokine bên trong tế bào ở 1 lát cắt thời gian xác định Thôngqua nhuộm nội bào nhiều loại kháng thé gắn màu, có thé xác định được nhóm tế baotiết đồng thời nhiều cytokine khác nhau và có thé phối hợp định danh tế bao bằng cácnhuộm ngoại bao với các kháng thé định danh trước khi tiến hành nhuộm nội bào dé

14

xác định cytokine, từ đó cung cấp thêm thông tin về nhóm tế bao và ảnh hưởng khác

nhau của điều kiện thí nghiệm lên các nhóm tế bào khác nhau Với ELISA, có thểthực hiện thêm phương pháp ELIspot dé xác định hoạt động tiết cytokine của các tế

bào miễn dịch, trong đó, các tế bào miễn dịch sau khi kích hoạt được bồ sung vào đĩa

có phủ sẵn kháng thể kháng cytokine quan tâm Khi các tế bào miễn dịch tiết cytokine,protein này sẽ bị giữ lại bởi các kháng thê ở đáy đĩa, một kháng thể khác có gắn biotin

sẽ được bổ sung dé liên kêt với cytokine đó và một phân tử streptavidin gắn màu sẽđược bồ sung sau dé dé cung cấp tín hiệu về các phân tử cytokine quan tâm đã bị bắt

giữ [36] Phương pháp này cho phép xác định được nhóm tế bào tiết cytokine quantâm với độ nhạy cao, và có thé thu được các tế bao này còn sống sau khi thực hiện

assay.

Nhược điểm của phương pháp nhuộm nội bào là phải thực hiện bước có định,khiến tế bào chết và thay đổi cấu trúc màng tế bào, dẫn đến khó thực hiện các đánhgiá tiếp theo; còn với ELISA, thí nghiệm bị giới hạn bởi số lượng kháng thể sử dụng

được trong thí nghiệm, kháng thé sơ cấp gắn đĩa chỉ có thé bắt được 1 loại cytokine

nhất định

Cả 2 phương pháp đều đang được sử dụng rộng rãi, một số nghiên cứu sosánh kết quả khi thực hiện trên 2 phương pháp đều nhận thay sự tương đồng trong kếtquả [12, 42] Có một số nô lực dé phối hợp 2 phương pháp này nhằm tận dụng ưuđiểm của cả 2, có thé phân tích khả năng tiết cytokine của từng nhóm tế bao quan tâmtrong các điều kiện thí nghiệm khác nhau dù quan thé tế bào tiết là quan thé hiếm va

tế bào vẫn còn sống sau khi phân tích Trong một nghiên cứu năm 2020, 2 phươngpháp phân tích tế bào dòng chảy và xét nghiệm tiết cytokine đã được phối hợp dé xácđịnh và phân lập (isolation) các tế bào B tiết cytokine TNF (quan thể lớn), IL10 và

GM-CSF (quan thê hiếm) [65]

Trong nghiên cứu này, tế bào lách chuột chứa tế bào lympho T sẽ được kích

hoạt bằng kháng thể kháng CD3 và CD28 Khi đó, chúng sẽ tiết các cytokine tiền

viêm như IL-1, TNFa và IFNy Sau 24 giờ tiếp xúc với thuốc thử nghiệm, cáccytokine này sẽ bị giữ lại trong tế bào bang cách ức chế hệ thống vận chuyên bêntrong tế bào thông qua monesin (GolgiStop) Tế bào sâu đó sẽ được nhuộm nội bào

15

với kháng thé có gắn mau và phân tích với máy đếm tế bào dòng chảy dé có thé định

lượng các cytokine tiền viêm này Phương pháp nhuộm nội bào được chọn thay vi

ELISA nhờ ưu điểm có thê phân tích được khả năng tiết cytokine trên 2 nhóm tế bào

cụ thé: tế bào T CD4+ và tế bào T CD8+ trong lách chuột Balb/c Đây là 2 nhóm tế

bào lympho có tỷ lệ cao trong lách (Hình 1.1B) và được kích hoạt khi các thụ théCD3 và CD28 có sự liên kết Trong nghiên cứu này, hai kháng thé anti-CD3/CD28

được sử dụng dé hoạt hóa hai thụ thé và kích hoạt sự hoạt động của tế bào T Haicytokine tiền viêm IFNy va TNFa sẽ được sử dụng làm chỉ dấu nhằm đánh giá hoạt

động của các tế bào T trong nghiên cứu này

1.3.3 Cytokine tiền viêm - Interferon và interferon gamma

Phân tử interferon được tim ra sau thí nghiệm của Isacc và Lindenmann

(1957) về đề kháng chống lại virus trên tế bào miễn dịch Nhờ các tiến bộ về côngnghệ sinh học, đặc biệt là sinh học phân tử và các kiến thức mới về miễn dịch, nhiềuthông tin mới về interferon đã được tìm ra, cho thấy vai trò của cytokine này rất đa

dạng và đa mục tiêu (pleiotropic) chứ không chỉ giới hạn trọng đáp ứng nhiễm virus.

Hiện nay, interferon được chia thành 3 nhóm dựa trên cấu trúc phân tử, nhóm 1 cóIFNa và IFNB, nhóm 2 chỉ có 1 protein là IFNy, nhóm 3 gồm 4 cytokine là IFNAI,

IFNA2, IFNA3 và IENA4 (Hình 1.2A) [10].

Interferon được sinh tông hợp từ các tế bào miễn dịch, chúng được tông hợpnhanh chóng và thường cần có sự kích thích từ virus, sản phẩm vi sinh hoặc chất kíchhoạt hóa học Con đường tổng hop interferon đã được làm rõ rất nhiều thông quanhững nghiên cứu về phản ứng của tế bào với phân tử DNA sợi kép ngoại lai [10, 87]

Thụ thê của interferon nhóm 2 có cấu trúc đối xứng, với phần nội bào có gắnprotein họ JAK là JAK1 và JAK2, phần ngoại bào có | cặp thu thé interferon gammaloại 1 liên kết với thụ thể interferon gamma loai 2 Hầu hết thụ thê interferon gamma

loại 1 được biểu hiện cơ định ở mức trung bình trong khi thụ thể loại 2 bị kiểm soátchặt hơn và thường biểu hiện ở mức thấp, nhưng thay đổi biéu hiện trong các trạng

thái biệt hóa hoặc kích hoạt khác nhau của tế bảo [10]

16

A Type I: IFN-œs (13 types) Type Il: IFN-¥ Type Ill: IFN-As (3 types}

IFNLRI

Nature Reviews | Drug Discovery

Canonical Jak-Stat signaling Non-canonical Jak-Stat signaling

IFNAR2 IFNARL

Contribution to IFNy-induced — antiviral state, Delayed defense against A

transcription and modulation resistance to DNA damage pathogens

of activated STAT1 activity

Stat1-dependent signaling ~Statl-independent signaling SSS dependent signaling

Hình 1.2: Interferon — thụ thé, con đường tín hiệu cỗ điển và một số con

đường tín hiệu thay thế

(A) 3 nhóm interferon và thụ thể tương ứng cùng với cơ chế cổ điển của chúng dựa trên

con đường JAK-STAT (B) Giới thiệu một số con đường tin hiệu thay thé của IFNy

17

Interferon gamma là phân tử gồm 2 tiều phần polypeptide 17 kDa liên kếtkhông công hóa trị đối xứng song song (antiparallel) dé hình thành phân tử hoàn thiện

50 kDa Tính đối xứng cho phép IFNy bám đồng thời với 2 thụ thé, giúp tăng cườngtín hiệu Tế bào lympho đã kích hoạt là nhóm chính sản xuất ra IFNy, tiêu biểu làCD4 T hỗ trợ và tế bào T gây độc CD8, tế bào T yö, NK và tế bào B Các tác nhângây biểu hiện IFNy có thé là các cytokine khác như IL-12, IL-15, IL-18 và các IFNnhóm 1 IFNy là một cytokine đa mục tiêu (pleiotropic), được điều hòa bởi hang trămgen liên quan đến interferon và có chức năng trong phan ứng viêm, gây chết tế baotheo chu trình, điều hòa chu trình tế bào và điều hòa biểu hiện gen Trong điều kiệnsinh lý bình thường, biểu hiện của các interferon được kiểm soát chặt chẽ, chi tậptrung quanh mô sản xuất (localized) và không gây ảnh hưởng đến toàn bộ cơ thể.Nhưng khi tiếp xúc với nguồn bệnh và hệ thống miễn dịch đáp ứng đã được khởi

động, interferon gamma được các tế bào lympho tiết ra sẽ tham gia các quá trình miễn

dịch Các tác động sinh học của IENy được thực hiện thông qua mạng lưới tín hiệu

phân tử, chủ yếu nhờ con đường JAK/STAT (Hình 1.2) Cụ thé hon, sau khi interferongamma bám vảo thụ thể IFNTRI và IFNTR2, JAK1 và JAK2 sẽ được kích hoạt Cáckinase này sẽ phospho hóa thụ thể xuyên màng IFNTR và tạo ra chỗ bám cho STATI

JAK sau đó sẽ phospho hóa phân tử STAT1 dé 2 phân tử này liên kết với nhau thành

1 phức homodimer, được gọi là yếu tố được kích hoạt bởi gamma (gamma activated

factor — GAF) GAF sẽ di vào trong nhân va bám vào vung kích hoạt gamma (gamma

activated site - GAS), vùng này năm trên vùng promoter của các gen kích hoạt bởiinterferon (interferon stimulated gens — ISGs) iz/7 là 1 gen trong số đó và nó có vaitrò khỏi động ISRE (Yếu tố phản ứng với kích thích từ interferon — interferon

stimulated response element) ISRE là một yếu tố phiên mã chịu trách nhiệm khởi

động một lượng lớn các ISGs thứ cấp [87]

IFNy đã được chứng minh có liên hệ với nhiều bệnh tự miễn bao gồm tiểuđường type 1, bệnh đa xơ cứng và bệnh viêm khớp dạng thấp IFNy cũng tham gianhiều vai trò miễn dịch quan trọng như tăng biểu hiện thụ thé Toll-like của các tế bàomiễn dịch bam sinh, kích thích quá trình chuyển nhóm (class switch) kháng thé sang

18

IgG, tăng cường biéu hiện các gene MHC nhóm | và MHC nhóm 2 trên tế bào trình

diện kháng nguyên, tăng tiết các chemokine, kích hoạt đại thực bào và day mạnh quátrình thực bào Bên cạnh đó, cũng có một số bằng chứng cho thấy IFNy có tham gia

vào quá trình kháng viêm thông qua điều hòa viêm, khi loại bỏ gene sản xuất IFNy

khỏi chuột mô hình bệnh đa xơ cứng (Chuột mang bệnh EAE), chuột đã phát triểntriệu chứng bệnh nghiêm trọng hơn hăn so với chuột đối chứng có IFNy được sảnxuất bình thường IFNy cũng có thé ức chế tăng sinh tế bao T thông qua quá trình

chết theo chu trình, ức chế sự biệt hóa của tế bào T non trẻ thành một số phân nhóm

tế bào T khác như Th17 [64]

1.3.4 Cytokine tiền viêm - Yếu tố hoại tử khối u

Yếu tổ hoại tử khối u (Tumor necrosis factor - TNF) là một họ protein đóng

vai trò trung tâm trong phản ứng viêm Họ protein này đóng nhiều vai trò khác nhautrong cơ thể, tham gia vào các hoạt động miễn dịch, gây chết tế bào theo chu trình,biệt hóa, xâm lắn, tạo mạch và di căn của tế bào ung thư [6, 50]

TNFa là một homotrimer protein chứa 157 axit amin, được san xuất chủ yếu

từ đại thực bào, tế bào lympho T va tế bao NK TNFa tồn tại đưới 2 dang, dang hoa

tan (soluble TNFa - sTNFa) va dang xuyên mang (transmembrane TNFa — tmTNFa),

trong đó, tmTNFa là dạng tiền chất được tông hop trước, sau đó cần được enzymechuyên hóa TNFa (TACE) xử ly dé giải phóng dưới dạng hòa tan là sTNFa Sau đó,sTNFa sẽ tham gia vào rất nhiều hoạt động sinh học thông qua tương tác với thụ théTNF loại 1 (TNFR1, còn được biết đến với tên gọi là TNFRSF1IA, CD120a va p55)

và thụ thé TNF loại 2 (TNFR2, còn gọi là TNFRSF1B, CD120b va p75) Thụ thể loại

1 được biểu hiện ở hầu hết mọi tế bao trong cơ thé trong khi đó thụ thé loại 2 chỉ biéu

hiện ở một số tế bào miễn dịch, tế bao nội mô và một số tế bào thần kinh Vùngprotein gây chết (Death domain — DD) chỉ được tìm thay ở TNFR1 và nó tương tác

chức năng với adaptor protein TRADD (Tumor necrosis factor receptor type

1-associated DEATH domain protein - domain gay chét lién hé voi TNFR1) [6, 29]

19

NE-kB and MAPKs MI.KI MAPKs || NExB

Irlatrưnation Apoptosis * Necroptusis

’ lissue regeneration Tissue degeneration * Inflammation _

Cell proliferation Cell survival

Host defence Inflammation

Host defence

Cell proliferation Cell survival

Hình 1.3: Con đường truyền tín hiệu của TNFa qua TNERI và TNFR2

Con đường TNERI được kích hoạt bởi sTNFa, sau đó liên kết với TRADD ở domain

gây chết và hinh thành các phức [, Ha, IIb, IIc phụ thuộc các diéu kién khac nhau,Phức I gây kích hoạt NF-kB, MAPK, AKT; phức La và IIb gây chết theo chu trình

dựa trên Caspase và phức IIc gây chết không theo chu trình và gây viêm qua con

đường MLMK Con đường TNFR2 được kích hoạt chủ yếu nhờ tmTNFa và liên kếtvới TRAF dựa vào domain TRAF dé hình thành phức I gây kích hoạt con đường tin

hiệu NF-kB, MAPK và AKT [29].

Cơ chế hoạt động cơ bản của TNFơ như sau: TNFơ tương tác với thụ thé

TNFR1 hoặc TNFR2 sẽ khởi động các phức hệ tín hiệu tế bào dược gọi là phức nhóm

I, nhóm IIa, Ib và Ic (Hình 1.3) Phức nhóm 1 được khởi động từ tín hiệu của cả thu

thé loại 1 và loại 2, với TNFR1, sau khi được kích hoạt bởi sTNFơ sẽ bám vào

20

TRADD và tương tác với rất nhiều yếu tổ khác bao gồm cả RIPK1, TRAF2/5,CIAP1/2, LUBAC dé hình thành phức I (Complex I), TNFR2 có thé được kích hoạtbởi tmTNFa, nhưng do không có domain gây chết nên dù đã kích hoạt, nó không thé

tương tác với TRADD, thay vào đó, TNFR2 tương tác trực tiếp được với TRAF2,

cùng với TRAFI, cIAP1, cIAP2 dé hình thành phức nhóm 1, phức này sẽ tham giakích hoạt con đường NF-kB, MAPK và AKT, gián tiếp tham gia điều hòa cân băngsinh lý bên trong tế bào thông qua các chức năng phục hồi mô, tăng sinh tế bào và

gây ra phản ứng viêm chống lại tác nhân gây bệnh [72]

Khác với phức I được lắp ráp trên màng sinh chất, phức Ila, IIb va IIc đượchình thành ở bên trong tế bào chat và chỉ từ phản ứng của TNFRI Phức Ia cấu trúc

từ TRADD, RIPK1, TRAF2, cIAP1/2, pro-Caspase-8, va protein liên hệ với Fas có

mang vùng gây chết (FADD), phức IIb có thành phan tương tự với [la nhưng được

bổ sung RIPK3 và phức IIc (còn được gọi là necrosome) gồm có thành phan là RIPK1

và RIPK3 Phức IIa va IIb sẽ tham gia gây chết tế bào theo chu trình thông quaCaspase-8 còn phức IIc sẽ kích hoạt MLMK và gây chết tế bào không theo chu trình

(necroptosis) từ đó gây ra phản ứng viêm [29, 72].

Bên cạnh chức năng chính trong điều hòa quá trình chết của tế bào, TNFơcũng tham gia điều hòa hoạt động của tế bào T Co một số bằng chứng cho thay TNFalàm thay đổi khả năng sống sót khi phơi nhiễm với vi khuẩn Listeria monocytogens,hoặc thành phan từ vi khuân LPS và S aureus enterotoxin B của chuột chuyển genTNF-/— hoặc TNFRI—/— Đồng thời trong dap ứng nhiễm khuẩn, tmTNF và sTNFđóng vai trò khác nhau Nhiều loại thuốc ức chế TNF có hiệu quả trong điều trị các

bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp, bệnh Crohn, viêm khớp vảy nén , điều này

cho thay TNF cũng có thé gây bệnh Tuy nhiên, có một số nghiên cứu cho thay TNF

cũng có thể có chức năng bảo vệ trong một số bệnh viêm khác Một ví dụ về khả năng

bảo vệ cua TNF trong bệnh viêm thần kinh (neuroinflammation), chuột thí nghiệm

mô hình bệnh viêm não (experimental autoimmune encephalomyelitis model) được

chuyên gen chỉ biểu hiện được tmTNF được bảo vệ trước các triệu chứng của bệnh

đa xơ cứng, kết quả này đã cho thấy vai trò quan trọng của dạng xuyên màng củaTNFR2 Một ví dụ khác trong bệnh ghép chống chủ, chuột được nhận tế bào T chỉ

21

biểu hiện dạng tmTNF sẽ biểu hiện tình trạng bệnh nhẹ hơn so với nhóm được nhận

tế bào T chỉ biểu hiện dạng sTNF [50]

TNFa và IFNy là đối tượng phù hợp với mục tiêu nghiên cứu là đánh giá khả

năng điều hòa miễn dịch của các dịch chiết nhờ một số nguyên nhân Thứ nhất, từ

những thông tin trong 2 phan trên, cả hai protein đều là các phân tử tín hiệu có chứcnăng quan trọng trong điều hòa miễn dịch, TNFa và IFNy đều tham nhiều quá trìnhmiễn dịch và đóng vai trò trong nhiều bệnh tự miễn Thứ hai, các tế bảo T đã kíchhoạt thuộc cả 2 nhóm tế bào T hỗ trợ (CD4+) và tế bào T gây độc (CD8+) đều có khảnăng sản xuất ra các cytokine kích thích quá trình gây viêm dé hỗ trợ hệ miễn dichthực hiện chức năng, trong số đó có TNFa và IENy Trong các tế bào CD4+, nồi bật

là phân nhóm ThI có khả năng tiết mạnh IFNy và đã được chứng minh đóng vai tròtrong nhiều bệnh tự miễn [64] Tế bào T CD8+ ngoài khả năng tiêu diệt các tế bao đã

bị xâm nhiễm virus bằng các protein gây độc như perforin — granzyme thông qua con

đường Fas/FasL tế bào chịu trách nhiệm chính cho hoạt động chống sự xâm nhập củavirus Bên cạnh tiêu diệt các tế bào đã bị xâm nhiễm bằng các protein gây độc như

perforine granzyme, tế bao T CD8+ còn tiết các cytokine TNFa và IFNa nhằm ức chếquá trình xâm nhiễm của virus [69] Như vậy, khi kích hoạt các tế bào T trong láchchuột sẽ có thể kích hoạt chúng tổng hợp TNFa va IFNy, đồng thời, sự thay đổi tỷ lệ

tế bào sản xuất 2 cytokine này là bằng chứng cho ảnh hưởng của dịch chiết lên miễn

dịch tế bào T Sử dụng các kỹ thuật xác định được sự thay đổi khả năng tiết hai loạicytokine này có thé đánh giá được mức độ đáp ứng của tế bao T khi có các tác động

tới hệ miễn dịch.

1.4 Thuốc cỗ truyền

1.4.1 Khái quát về thuốc cỗ truyền

Thuốc cô truyền được WHO định nghĩa là tập hợp kiến thức, kỹ năng và kinh

nghiệm thực hành dựa trên quan điểm, lý thuyết, niềm tin của dân tộc bản địa từ các

nền văn hóa khác nhau, được sử dụng dé gìn giữ sức khỏe, phòng chống, chân đoán,

giúp cải thiện va chữa trị các bệnh lý va tâm lý Hiện nay, thuốc cô truyền đã trở thànhmột trong những liệu pháp chữa trị thay thế (alternative medicine) phát triển nhanh

và nhận được nhiều quan tâm Từ 2013, WHO đã xuất bản bộ chiến lược phát triển

22

thuốc cô truyền giai đoạn 2014 — 2023 với mục tiêu tài liệu hướng dẫn các quốc gia

tận dụng được nguồn tài nguyên y học truyền thống dé phục vụ y tế cộng đồng thông

qua việc ban hành luật dựa trên các nghiên cứu về tính an toàn và hiệu quả của chúng[77] Một cột mốc quan trọng với giới nghiên cứu y học cô truyền là Giải Nobel yhọc và sinh lý học 2015 được trao cho giáo sư Tu You You nhờ phát hiện ra thuốcđiều trị sốt rét Arteminisin chiết từ Artemisia annua L Đến 2019, WHO xuất bảnphiên ban thứ 11 của ICD, trong đó có dành 1 chương cho thuốc cô truyền, đây làmột bước tiến lớn, cho thấy sự thừa nhận của các quy phạm y tế quốc tế đối với sửdụng thuốc cổ truyền và là nền tảng đề ngành thuốc cổ truyền có thể nhận được chất

lượng cao hơn trong dịch vụ, giáo dục, nghiên cứu và quản lý, hướng tới tích hợp với

các cơ sở y học phương Tây [39] Số lượng các nghiên cứu về y học cô truyền cũngtăng trưởng rất nhanh đặc biệt trong những năm gần đây, theo co sở dit liệu pubmedhiện có hơn 38.800 nghiên cứu mang từ khóa thuốc cô truyền với hon 17.000 xuất

bản từ 2020 đến nay, trong đó thuốc cô truyền trung Quốc chiếm đa số với khoảng15.000 nghiên cứu với 8.700 nghiên cứu từ 2020 đến nay Cũng trong năm 2019,

WHO công bố báo cáo về tình hình sử dụng y học cổ truyền trên thế giới, theo đó:tới 2018 có đến 80% (170) quốc gia thành viên của WHO đang sử dụng các phươngpháp y học truyền thống và đã có 124 nước ban hành luật quản lý được phẩm cónguồn gốc từ thực vật Mặt khác, báo cáo cũng chỉ rõ khó khăn lớn nhất mà các quốcgia đang gặp phải là “Thiếu dữ liệu nghiên cứu” [78]

1.4.2 Nghiên cứu thuốc cỗ truyền trên thế giới và Việt Nam

1.4.2.1 Nghiên cứu thuốc cỗ truyền trên thế giới

Các thử nghiệm độc tính trên chuột van được coi là tiêu chuẩn vàng dé đánh

giá ảnh hưởng tiêu cực của thuốc lên cơ thé sinh vật Trong nghiên cứu các dược liệu

y học cô truyền cũng không ngoại lệ, các thử nghiệm độc tính in vivo chiếm vị trí rất

quan trọng Tiêu chuân phổ biến cho các thí nghiệm nay là hướng dẫn số 425 của

OECD, theo đó, chuột sẽ được cho ăn hoặc tiêm với liều cố định và theo đõi hàng

ngày [2] Nong độ gây tử vong 50% cá thé (LC50) được tính toán từ dit liệu độc học

và sử dụng để đánh giá mức độ độc tính cấp của chất, ở các thử nghiệm độc tínhtrường diễn hoặc bán trường diễn, các thông số sinh lý khác của chuột cũng được

23

quan tâm, tiêu biểu như: cân nặng, đường huyết, thay đôi hành vi , ngoài ra, sự hình

thành khối u và các thay đổi cấu trúc các mô nội quan (gan, thận) cũng có thê được

đánh giá.

Một số ví dụ về nghiên cứu độc học của thực vật cô truyền trên chuột: Nhóm

của Chinenye Jane Ugwah-Oguejiofo đã đánh giá độc tinh cấp và bán trường diễn(28 ngày) của Caralluma dalzielii N E Brown trên chuột với kết quả LC50 cấp tínhcao hơn 2.000 mg/kg và đã quan sát thay ảnh hưởng lên cân nặng, lượng thức ăn tiêu

thụ và cấu trúc mô học của gan chuột khi thử nghiệm liều 600 mg/kg sau 28 ngày

[71] Zhao va cộng sự đã nghiên cứu độc tính của alkaloid từ lá cây Hoa sữa (Alstonia

scholaris (L.) R Br.), thử nghiệm độc tính cấp trên chuột ICR và độc tính kéo dàitrong 13 tuần trên chuột cống Sprague-Dawley (SD) đã được thực hiện với kết quacho thay alkaloid tổng số có liều gây tử vong 50% ở chuột ICR là 5.48 g/kg và ở liều

300 mg/kg không gây tử vong cho chuột SD Nhóm đã kết luận liều 100 mg/kg làliều lượng không quan sát được ảnh hưởng tiêu cực trên cả chuột nhắt và chuột cống,

đồng thời khang định alkaloid tông số từ lá Hoa sữa an toàn dé thử nghiệm lâm sang

[82] Dé nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng sinh học, các nhóm nghiên cứu đã sử dụngcác dòng chuột thí nghiệm mô phỏng bệnh ở người như tiêu đường, viêm da cơ địa,viêm dưới da Takeshi Hori và cộng sự đã đánh giá hiệu quả khi cho bé sung vàothức ăn chuột bài thuốc Bofutsushosan hoặc Daisaikoto trên dòng chuột tiểu đường

béo phì Tsumura Suzuki Dòng chuột này mắc tiêu đường type 2 và suy giảm thínhgiác theo độ tuôi do sự thu hẹp mạch máu ở bên trong ốc tai Kết quả thử nghiệm kéo

dai 11 tháng cho thay nhóm chuột có bé sung thuốc vào thức ăn có đường huyết thấphơn đối chứng, đồng thời lưu lượng máu trong ốc tai cũng có cải thiện [27] Nhómcủa Nguyen Thi Huong Ly đã thử nghiệm hiệu quả giảm stress của bài thuốcgyogamdan (một bài thuốc dân gian Hàn Quốc với thành phan chính bao gồm Củ gấu

(Cyperus rotundu) và Phục Linh (Poria cocos (Schw.) Wolf), thường được sử dụng

dé chữa tức ngực và giảm căng thăng, mệt mỏi) lên chuột BALB/c đã gây kích ứng

da với 2,4-Dinitrochlorobenzene Kết quả cho thấy chuột được uống gyogamdan ởliều 100 và 500 mg/kg có giảm ảnh hưởng kích ứng trên da nhưng sự khác biệt không

có ý nghĩa thống kê [54]

24

Các nghiên cứu trên chuột mang những ưu điểm không thể phủ nhận, tuynhiên, với mục tiêu bảo vệ động vật theo nguyên tắc 3Rs (Thay thế, Giảm thiểu vàCải tiễn — Replacement, Reduction and Refinement) [28], một số mô hình thử nghiệm

độc tính khác đã được áp dụng đề đánh giá các dịch chiết từ thực vật và các bai thuốc

y học cô truyền, tiêu biểu là các thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào và trên các

mô hình động vật khác ít ảnh hưởng đến sức sống của sinh vật hơn như mô hình phôi

cá ngựa văn

Mô hình in vitro thường sử dụng các dòng tế bao động vật, phd biến là các

dong tế bào ung thư như: HeLa [9, 4], HaCaT [54], MCF-7 [63], HepG2 [91], U87[86] , tế bào sinh dưỡng người như: tế bào nguyên bao sợi phôi MRC-5 [49], và tế

bào từ chuột như: nguyên bào sợi chuột V79 [73] hoặc 3T3 [3, 5] Nhóm nghiên cứu

của Park, E đã tìm hiểu độc tính của dịch chiết cây Melandrii Herba trên cả 2 đôitượng là chuột Sprague Dawley và 3 dòng tế bao tuyến tiền liệt: tế bao trung mô

WPMY-I, tế bào biéu mô WPME-I và tế bào biểu mô tăng sản (hyperplasia) BPH-1[62] Việc lựa chọn 3 dòng tế bào này dựa trên một sé nghiên cứu trước đó đã chứng

minh dịch chiết từ Melandrii Herba có khả năng bảo vệ chuột khỏi phì đại tuyến tiềnliệt lành tính [89] Nghiên cứu của Godwin Upoki Anywar và cộng sự đã tìm hiểuđộc tính của một số thực vật hỗ trợ bệnh nhân HIV/AIDS ở Uganda 11 dịch chiétthực vật đã được đánh giá độc tinh bằng phương pháp AlamarBlue® Cell ViabilityAssay trên dòng tế bào U87.CD4.CXCR4, đây là dòng tế bào ung thư não U87 đã

được chuyên gen dé biểu hiện marker bề mặt CD4 và CXCR4, đây đều là các marker

mà virus HIV nhận diện và do đó thuận lợi cho các nghiên cứu kế tiếp muốn tìm kiếmcác chất ức chế thụ the CXCR4 [86]

Mô hình phôi cá ngựa van đã được sử dụng rất thành công dé sàng lọc tìmkiếm thuốc mới [11] và cũng đã được ứng dụng để sảng lọc các dược liệu tự nhiên

(31, 53] Nhóm của Amir Modarresi Chahardehihe đã khảo sát hiệu quả của mô hình

phôi cá ngựa văn, theo đó, mô hình đã đánh giá độc tính của 69 loài thực vật, baogồm 88 dịch chiết thô và 8 sản phẩm phối hợp dịch chiết và 2 sản phẩm phối hợp chất

tinh sạch [53].

25

1.4.2.2 Nghiên cứu về thuốc cổ truyền tại Việt Nam

Các nghiên cứu về độc tính tại Việt Nam cũng đã được thực hiện theo cácchuẩn tương tự trên thế giới Trong đó, các nghiên cứu về độc tính cấp thường tập

trung thực hiện trên chuột theo hướng dẫn của bộ Y tế hoặc của OECD, ví dụ như

nghiên cứu của Phạm Thị Ninh và Trần Thị Phương Thảo đã sử dụng chuột BALB/c

dé đánh giá độc tính và hoạt tính ngăn tiêu đường của cao chiết ethanol-nước từ vỏ

và cành loài Boi lời nhớt (Litsea glutinosa) với kết qua cho thay cao chiết thực vật

này không gây độc trên chuột dù ở liều rất cao 20 g/kg trọng lượng cơ thé, đồng thờicao chiết cũng thé hiện hiệu quả giảm ảnh hưởng của tiểu đường ở liều 250 mg/kg và

500 mg/kg thé trọng [56]

Bên cạnh đó, một số thử nghiệm khác đã sử dung mô hình in vitro dé đánhgiá độc tính và tìm hiểu về cơ chế gây độc của các thành phần dịch chiết Trongnghiên cứu của Võ Thị Phương Hiền và cộng sự, nhóm đã thử độc các chất tinh sạch

từ dịch chiết trong Ethanol 70% từ lá cây Lim xanh (Erythrophleum fordii) trên tếbào ung thư bạch cầu HL-60 và dòng tế bào ung thư KG Nhóm đã sử dụng phươngpháp CCK-8 assay và phát hiện Erythrofordin B là chất có hoạt tính mạnh nhất với

IC50 trên HL-60 và KG lần lượt là 15,2 + 1,5 uM và 18,6 + 2,3 uM Thông qua sự

phối hợp với một số phương pháp nghiên cứu phân tử: Western Blot, Protein docking,nhóm đã tìm được bằng chứng có sự tương tác giữa erythrofordin B với Caspase 3 vàquá trình phân cắt PARP-1 Đây là 2 protein quan trọng trong quá trình tự chết theochương trình của tế bào, kết quả góp phần lý giải cơ chế gây độc của dịch chiết từ lá

Lim xanh [74].

Như vay, ở Việt Nam đã có các nghiên cứu dé đánh giá độc tính của hóa chất,

gồm cả độc tính gây chết và độc tính chức năng, cũng như các nghiên cứu về hoạt

tính như hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nam Mặc du vay, cac

phương pháp đánh giá độc tính vẫn tập trung thực hiện trên đối tượng động vật và

độc tính miễn dịch chưa nhận được nhiều quan tâm.

26

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Hóa chất, dụng cụ tiêu hao và thiết bị dùng trong luận văn được tập hợp trongBảng 2.1, bảng bao gồm dụng cụ và hóa chất cho cả 3 mô hình thí nghiệm: thử độc

trên mô hình in vivo, thử độc trên mô hình in vitro tế bao lách chuột, đánh giá ảnh

hưởng của dịch chiết lên khả năng sinh cytokine tiền viêm IFNy và TNFa của tế bào

lách chuột đã kích hoạt bằng kháng thê anti CD3/CD28

Bang 2.1 Hóa chất, vật tư và thiết bị sử dụng trong luận văn

Tên hóa chất Hãng sản xuất | Cat number

DMSO Bio Basic D0231

Fcy block clone 2.4G BD 553141

Dung dich ly giai héng cau PAN P10-90100

Khang thé CD3, CD8, CD8 — PE, TNFa— | eBiosciences và

FITC, IFNy-APC, CD4-Biotin, CD8-Cy7 BD

BD Cytofix/CytopermTM

Fixation/Permeabilization Kit BD 954715

Dia petri SPL Life Sciencs 10090

Vật tư Đĩa nuôi cấy 6 giếng SPL Life Sciencs 30006

tiéu : :

hao Đĩa nuôi cây 24 giêng SPL Life Science 30024

Cell Lifter SPL Life Science 90040

27

Tên thiết bị Hãng sản xuất ModelKính hiển vi soi nồi Leica MZ7.5

Thiết Máy lac đĩa Blosan OS - 20

bị Máy đo đĩa đa năng Berthold Tristar LB942

Máy ly tâm lạnh Thermo Fisher 75002421

May dén té bao dong chay Cytoflex Beckman Coulter C0978

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế tổng thế kế hoạch nghiên cứu đã thực hiện trong luận văn được trình bảy

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên 2 mô hình chính là mô hình phôi cá ngựa văn và mô hình

ex vivo tê bào lách chuột Kết quả của các đánh gid sàng lọc trên phôi cá ngựa van là cơ

Sở cho các thí nghiệm trên tê bào lách chuội.

2.2.1 Chuẩn bị mẫu dịch chiết từ thảo dược

2.2.1.1 Thông tin về các dịch chiết sử dụng trong nghiên cứu:

Các cây thuốc được chọn trong nghiên cứu là thành phần trong các bài thuốc

cô truyền của các ông lang ba mé ở miền núi Tây Bắc Việt Nam, Quá trình thu mẫu

28

được thực hiện vào mùa khô 2017, 2018 và 2019 Mẫu thu thập được sẽ được định

danh, đánh mã hiệu và lưu trữ tại Bảo tảng sinh học, Khoa Sinh học, Đại học khoa

học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội [93] Bốn dịch chiết sử dụng trong luận vănđược ký hiệu KT07, KT08, KT15, KT17, thông tin về các dịch chiết này được trình

bay trong

Bảng 2.2.

Bang 2.2: Thông tin về các dịch chiết sử dụng trong luận văn

Ký Tên khoa học Mã | Vị trí thu thập mẫu theo GPS, | Bộ phận

hiệu | (Tên Tiếng Việt) | hiệu thời điểm thu mẫu thu thập

Clerodendrum HNU |22”26°06.7"N 104°57°55.1"E | Lá khô

KT07 | cyrtophyllum 024106 | (Bac Quang, Ha Giang); mua

Turcz (Bo May) thu 2017

Pericampylus HNU | 22°26718.7"N — 103°55’25.9"E | Lá khô glaucus (Lam.) | 024778 | (Bát Xát, Lao Cai); mùa thu

KT08 | Merr 2017

(Tiết dé lá day)

Aganope balansae | HNU | 22°26’06.7"N — 104”57°55.1"E | Thân khô

KT15 | (Gagnep.) P.K.Loc | 024785 | (Bắc Quang, Hà Giang); mùa

(Mạn Mân) thu 2018

Stixis scandens | HNU_ | 22°26’06.7"N 104”57°55.1"E | Lá khô

KT17 | Lour 024787 | (Bắc Quang, Hà Giang); mùa

(Trứng Cuốc) thu 2019

2.2.1.2 Phuong pháp chuẩn bị mẫu dịch chiết

Các bộ phận làm thuốc của cây sẽ được nghiền thành bột và hòa trong dung

môi ethanol, mỗi mẫu được hòa ethanol với tỷ lệ 1:10 (khối luong/thé tich) va dat

trong máy ủ siêu âm (S100H; Elma GmbH, Singen, Đức) trong 30 phút 45°C Hỗnhợp thu được sau đó được lắc ở 200 vòng mỗi phút trong 60 phút ở nhiệt độ phòng

trên máy lắc (GyromaxTM 747 Incubator Shaker; Amerex Instruments, Concord, Hoa

29