Xác định độc lực của rắn lục đuôi đỏ và tác động gây loét trên chuột

TR I H C QU C GIA TP HCM NG I H C BÁCH KHOA NGUY N T N HI P XÁC NH VÀ TÁC C L C C A R N L C UÔI NG GÂY LOÉT TRÊN CHU T Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH H C Mã s : 60 42 80 LU N V N TH C S H ng d n khoa h c: PGS.TSKH NGUY N LÊ TRANG PGS TS NGUY N THÚY H TP H CHÍ MINH, tháng 08 n m 2014 NG Cơng trình c hồn thành t i: Tr ng H Bách Khoa- HQG-TP.HCM Cán b h ng d n khoa h c 1: PGS.TS NGUY N THÚY H NG Cán b h ng d n khoa h c 2: PGS.TSKH NGUY N LÊ TRANG Cán b ch m nh n xét 1: (Ghi rõ h , tên, h c hàm, h c v ch ký) Cán b ch m nh n xét 2: (Ghi rõ h , tên, h c hàm, h c v ch ký) Lu n v n th c s c b o v t i Tr ng i H c Bách Khoa, HQG Tp.HCM ngày tháng n m 2014 Thành ph n H i ng ánh giá Lu n v n th c s g m: (ghi rõ h , tên, h c hàm, h c v c a H i ng ch m b o v lu n v n th c s ) Xác nh n c a Ch t ch H i ng ánh giá LV Tr ng khoa qu n lý chuyên ngành sau lu n v n ã c s a ch a (n u có) CH T CH H I TR NG NG KHOA I H C QU C GIA TP.HCM NG I H C BÁCH KHOA TR C NG HÒA XÃ H I CH NGH A VI T NAM c l p - T - H nh phúc NHI M V LU N V N TH C S H tên h c viên: Nguy n T n Hi p MSHV: 12310730 Ngày, tháng, n m sinh: 30/08/1978 N i sinh: Khánh Hòa Chuyên ngành: Công Ngh Sinh H c Mã s : 604280 TÀI: Xác I TÊN nh c l c c a r n l c uôi tác ng gây loét chu t II NHI M V VÀ N I DUNG: + Xác nh thành ph n gây c ho t tính sinh h c c a n c r n l c uôi + Tinh s ch Serine protease t n c r n l c + Th nghi m trung hòa n c huy t kháng n c máu vùng d xác i da chu t III NGÀY GIAO NHI M V : (Ghi theo Q giao tài) 19/08/2013 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : (Ghi theo Q giao V CÁN B H nh k t qu ly gi i tài) 23/05/2014 NG D N (Ghi rõ h c hàm, h c v , h , tên): 1/ PGS.TSKH Nguy n Lê Trang 2/ PGS.TS Nguy n Thúy H ng Tp HCM, ngày 06 tháng n m 2014 CÁN B H NG D N (H tên ch ký) TR CH NHI M B MÔN ÀO T O (H tên ch ký) NG KHOA….……… (H tên ch ký) Ghi chú: H c viên ph i óng t nhi m v vào trang u tiên c a t p thuy t minh LV C Liên ,t i Trimeresurus albolabris) serine protease ÄKTAexplorerTM 100 Air v -Sepharose (intravenous), s.c (subcutaneous) 50 (Minimum Hemorrhagic Dose) % (g ) kháng H ii ABSTRACT Local tissue necrosis is a important problem when patients was bite by Trimeresurus albolabris been any study of necrotizing activity with T albolabris bite in Vietnam Identification of serine protease activities in Trimeresurus albolabris venom and its affecting Venom mice injected and neutralization of enzyme activities of Trimeresurus albolabris venom by antivenom Serine protease was purified from viper venom by ÄKTAexplorerTM 100 Air affinity chromatography system and by affinity chromatography on Benzamidine Sepharose, tested on mice via i.v (intravenous), s.c (subcutaneous) injection and haemorrhagic spot in mice local tissue necrosis were identified The venom obviously causes local haemorrhage The LD50 of the venom was determined by i.v injections of different doses into the caudal vein of mice (20±2, N=5): LD50 = 9.27 µg (0,464 µg/g) MHD (Minimum Hemorrhagic Dose) is 2.0 µg/20g Neutralization of 3MHD (6.0 µg) needed 1,175 µg antivenom protein The yield of Serine protease occupied 8.72 % of venom protein The venom serine protease potentially activates hemostatic zymogen systems and causes local necrosis Results showed haemorrhagic activities of serine protease and neutralization of enzyme activities by specific antivenom Antivenom treatment is not effective for local heamorrhage and necrosis New methods against protease activities need to be developed, specially against the activation of local protease zymogen iii Tôi iv i ii iv v viii ix x 1.1 .1 1.2 1.3 .4 2.1 2.1.1 Viperidae) 2.1.1.1 2.1.1.2 2.1.1.3 2.1.1.4 Trimeresurus albolabris) .9 2.1.2 10 2.1.2.1 10 2.1.2.2 10 2.2 11 2.2.1 11 2.2.1.1 12 2.2.1.2 Protease thu c lo i enzyme thu phân (Hydrolase) .13 2.2.1.3 Protease thu phân c u n i Peptide .13 2.2.2 .17 2.2.3 .22 v 2.3 .23 2.3.1 .23 2.3.2 31 2.3.2 32 35 3.1 35 3.2 35 3.2.1 35 3.2.2 .35 3.2.3 36 3.3 PHÁP 37 3.3.1 .37 3.3.2 .37 3.3.3 .38 3.3.4 seri 39 3.3.6 -PAGE 12% 3.3.7 41 41 3.3.8 50) 43 3.3.9 45 - 46 4.1 .46 4.1.1 46 4.1.2 (MHD) 47 4.2 48 4.2.1 .48 4.2.2 50 vi 4.2.3 51 4.2.5 ion DEAE Sepharose® CL6B 57 4.3 58 61 5.1 61 5.2 61 62 .68 69 .76 .79 80 vii [52] http://www.bioscience.org/2001/v6/d/ploplis/fulltext.php?bframe=figures.htm [53] http://www.photomazza.com/?Trimeresurus-albolabris [54] http://www.toxinology.com/fusebox.cfm?staticaction=snakes/ns-viperid1.htm [55] www.nationalgeographicstock.com 66 -Trypsin âm (O- ) (Oxyanion hole) [11] 68 Máu 2, glucose, axit2 - erythros CO2 - 69 cá máu 70 [6] [12] Plasmin làm tan Fibrin 71 (thrombogenic protease ) Hình 2.13 minh ình minh lành, bình t ng superoxide (O2 ) oxidase, (reactive oxygen species, ROS) O2 có b mơ TF [39] hình 2.13 72 Trên hình 2.14, (positive feedback reaction) [45] 73 hình 2.15 m - h) V Va, VIII VIIIa, XI (protein C + protein S + TM) XIIIa, Hình 2.15 74 protein 3 x103 (thrombogenic/ hemostatic factors) 75 -PAGE 12 % - Dd 40% T Acylamide Methylene : 38,93g bisacrylamide N - : 1,07 g : 100 mL Dd 9,5% T Acrylamide Methylene : 6,3 g bisacrylamide : 3,2 g : 100 mL - Dd Tris base : 18,15g : 100 mL - Dd Tris base : 3,0 g : 100 mL - Dd Tris base : 12,0 g Glycine : 57,6 g : 1000 mL - Dd Coomassive Brilliant Blue : 0,625 g Methanol : 112,5 mL Glacial Acid acetic : 25 mL 76 : 250 mL - Dd Acid acetic (99%) : 75 mL Methanol (99%) : 50 mL : 1000 mL - Dd Tris base 0,5M : mL SDS 10% : 2,5 mL Glycerol : mL Xanh Bromophenol : 0,004 % : 10 mL pH : 6,8 DDT (Dithiothreitol) : 10% 77 H2 O 1,440 µL 1,500 µL Dd 40% Acrylamide 1,800 µL SDS 10% 60 µL Dd Glycerol 1200 µL TEMED µL APS 10% 20 µL H2 O 480 µL ,8 500 µL Dd 9,5% T Acrylamide 1000 µL SDS 10% 20 µL TEMED µL APS 10% 30 µL 78 Trang (2004 -131 Trang (2014) -49 79 -08-1978 Khánh Hịa - - Hóa Sinh Lâm Sàng Khóa 2012- 80 ... ngành: Công Ngh Sinh H c Mã s : 604280 TÀI: Xác I TÊN nh c l c c a r n l c uôi tác ng gây loét chu t II NHI M V VÀ N I DUNG: + Xác nh thành ph n gây c ho t tính sinh h c c a n c r n l c uôi... [43] [29] [28] Nguyên nhân gây l [17] Các protein hân protein (proteolytic enzyme các protease , Do protease gây vào 1.2 (Trimeresurus albolabris) Vì 1.3 + nh li u gây t i da chu t (MHD) + DEAE... 561 - -Val562 2603 -COOH Trên Asp646 Ser741 [27] 30 , uPA) 2.3.2 Tri u ch ng bi n ch ng c a nhi cr nl c T V 73,17%) [16] 115 BN (98, ,d hóa, âm tiêu ) [26] - 3- hi tác nên fibrinogen (fibrinogenolysi