Xác định độc lực và tính chất gây bệnh của virút viêm não nhật bản trên chuột bạch

TÓM LƯỢC Bệnh viêm não Nhật Bản bệnh truyền nhiễm nguy hiểm chung cho nhiều lồi động vật thơng qua vectơ truyền bệnh muỗi culex Heo đóng vai trò nguồn chứa mầm bệnh quan trọng Bệnh lưu hành nhiều nước Việt Nam nằm vùng dịch tễ bệnh viêm não Nhật Bản Để có hiểu biết bệnh, từ có biện pháp phòng trị kịp thời Tơi thực đề tài “Xác định độc lực tính chất gây bệnh gây bệnh virút viêm não chuột bạch” từ tháng 02 đến tháng 05 năm 2005 thu số kết sau:  Tỷ lệ chết virút viêm não Nhật Bản chủng CTM- P7 gây chuột bạch 61,18%, chủng Nakayama 50%  Phần lớn chuột trước chết có triệu chứng thần kinh co giật toàn Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu thân, cứng gáy, thể xanh tái, chạy hoảng loạn  Các bệnh tích ghi nhận nhiều não tích nước, gan sung huyết, thận sung huyết, tích nước xoang ngực xoang bụng, gan hoại tử,…  Khi tiến hành kiểm tra huyết học, có 100% chuột thí nghiệm có kháng thể kháng virút viêm não Nhật Bản ngày thứ 17 sau tiêm virút vào chuột viii CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm não Nhật Bản (VNNB) bệnh truyền nhiễm chung người nhiều loài động vật lây truyền nhân tố trung gian muỗi Mỗi năm khắp giới có 50.000 ca bệnh virút viêm não Nhật Bản gây Virút VNNB thuộc nhóm Arbovirus có tính với tế bào thần kinh, bệnh dẫn đến tình trạng tổn thương não vĩnh viễn, tỷ lệ tử vong 10- 40 %, 80% số bệnh nhân bị bệnh VNNB qua khỏi thường biểu dấu hiệu thần kinh suốt đời (Võ Công Khanh, 2005) Từ động vật nuôi đến hoang dại cảm thụ với bệnh viêm não Nhật Bản, bao gồm: heo, trâu bò, ngựa, dê, cừu, chó, thỏ, chuột, bồ câu, gà, vịt, chim hoang… Heo chim hoang xem động vật cảm nhiễm ổ chứa virút Viêm Não Nhật Bản Trung Bệnh viêm não Nhật Bản nguyên nhân gây thất bại sinh sản heo Heo nái bị nhiễm virút thời gian mang thai có biểu Học bất thường đẻ thaiThơ khô với heo chết tâm LiệukhiĐH Cần @nhiều Tài kích liệuthước họckhác tậpnhau, nghiên cứu sau sinh, heo sinh yếu ớt với triệu chứng thần kinh… (Chu Joo, 1996) Năm 2006, Hồ Thị Việt Thu cộng phân lập chủng virút viêm não Nhật Bản (CTM- P7) muỗi thành phố Cần Thơ Để có hiểu biết bệnh viêm não Nhật Bản, thực đề tài: “Xác Định Độc Lực Và Tính Chất Gây Bệnh Của virút Viêm Não Nhật Bản Trên Chuột Bạch” nhằm:  Theo dõi triệu chứng khảo sát bệnh tích đại thể chuột bạch  Khảo sát đáp ứng miễn dịch chuột bạch CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN Viêm não Nhật Bản (VNNB) bệnh nhiễm trùng cấp tính gây loại virút thuộc nhóm Arbovirus Bệnh nói đến năm 1871 Nhật Bản, đến năm 1934 người ta phân lập virút VNNB từ não bệnh nhân tử vong bệnh viêm não Tokyo, virút xem chủng virút mẫu có tên Nakayama Bệnh VNNB tìm thấy 25 quốc gia giới như: Australia, Bangladesh, Bhutan, Brunei, Cambodia, Trung Quốc, Hồng Kông, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Pakistan, Philippin, Nga, Singapore, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam, quần đảo thái bình dương (Konishi, 1998) Ở Việt Nam viêm não Nhật Bản thường gặp trẻ nhỏ 1- 15 tuổi, từ Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu đến tuổi Heo, ngựa, trâu, bò, dê, gà, ngan, ngỗng mắc viêm não Nhật Bản Các địa phương phía Nam bệnh thường phát sớm phía Bắc; trẻ nhỏ vùng nông thôn mắc bệnh nhiều trẻ nhỏ thành thị (Võ Công Khanh, 2005) 2.2 TÁC NHÂN GÂY BỆNH 2.2.1 Đặc điểm hình thái học virút VNNB Virút VNNB (Japanese encephalitis virus – JEV) Flavivirus, trước xếp vào họ Togaviridae, thuộc nhóm B Arbovirus Hiện có 60 lồi Flavivirus có lồi có ý nghĩa thú y: virút VNNB, virút gây bệnh Louping virút gây bệnh Wesselsbron (Chu Joo, 1999) Hình thái: virút có dạng hình cầu, nhân chứa axít ribonucleic (RNA), kích thước 40nm, Chuỗi nucleotit hoàn hảo virút viêm não Nhật Bản chứa 10976 nucleotit tương ứng với 3432 gốc amino axít Virút qua lọc, gồm 32 capsom bao quanh, vỏ bọc chứa sợi ARN dương Capsit có cấu trúc hình khối, phần vỏ giàu lipít Virút có protein cấu trúc nhiều protein không cấu trúc Những protein cấu trúc bao gồm glycoprotein E vỏ, protein vỏ khơng có glycosylate M protein capxít C Vỏ lipít Chuỗi đơn ARN Hình 2.1: Cấu trúc virút Viêm Não Nhật Bản (Vietsciences2.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/i ) Trung Trong protein cấu trúc glycoprotein E quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, protein E có chứa epitop gây đáp ứng kháng thể trung hòa, có epitop, epitop vị trí định N protein biểu thị tính đặc hiệu virút (Kimura-Kuroda and Yasui, 1986) Glycoprotein E bề mặt hạt virút gây đáp ứng miễn dịch tế bào kháng nguyên ngưng kết hồng cầu 2.2.2 Sức đề kháng VirútLiệu tươngĐH đối bền với pH= đến pH 9, thích hợp tập ởvà pHnghiên = 8,5 Ở pH tâm Học Cần Thơ7 @ Tài= liệu học cứu = điều kiện cần thiết để giữ khả ngưng kết hồng cầu virút Virút bị hoạt lực 560C 30 phút, 600 C virút chết sau 10 phút, 700 C virút chết sau phút, virút bị bất hoạt nhanh tia cực tím Virút tồn nhiều tháng huyết -200C gây nhiễm tế bào ni cấy Các hóa chất cồn, ether, aceton làm hoạt lực sau ngày; lyson tiêu diệt sau phút; formol 0.5% tiêu diệt virút sau 48 2.2.3 Đặc tính ngưng kết hồng cầu Virút gây ngưng kết hồng cầu gà, ngỗng, bồ câu, chuột lang, thỏ tốt hồng cầu gà ngày tuổi Yếu tố ảnh hưởng đến ngưng kết hồng cầu Kháng nguyên chế từ não pH tối ưu 6,3 -6,5 Kháng nguyên chế từ nuôi cấy tế bào pH tối ưu 6,0-6,2 2.2.4 Đặc điểm ni cấy Virút nhân lên nhanh chóng nhiều loại tế bào lớp số dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật có vú, chim, muỗi (Rechacek, 1968) Khi ni cấy tế bào thận chuột, sau 60 phút có virút tiếp cận với màng tế bào, sau virút tiếp cận nguyên sinh chất số tế bào, hầu hết tế bào khác chưa có thay đổi, sau 3-4 ngày hầu hết tế bào thối hóa bong khỏi thành chai, lúc virút nhân lên mức độ cao tập trung thành đám lớn rải rác nguyên sinh chất tế bào (Đỗ Quang Hà Và Ctv, 1976) Có thể gây bệnh thực nghiệm chuột bạch khỉ cách tiêm vào xoang não, 3-8 ngày sau chuột bị liệt, co giật chết (Dương Đình Thiện, 2001) Trung 2.3 DỊCH TỄ HỌC 2.3.1 Phân bố bệnh theo mùa theo địa lí Bệnh có tính mùa thể rõ người, với phần lớn ca bệnh tập trung vào tháng mùa hè gió mùa Ở Đơng Nam Á, đặc biệt ca bệnh xảy vào tháng đến tháng tháng đến tháng 12 Bắc ấn Độ, Pakistan Bangladesh Nhiệt độ ảnh hưởng đến mật độ muỗi liên quan trực tiếp đến số lượng người nhiễm bệnh Ở nước ta, khoảng thời gian từ tháng đến tháng 8-9 âm lịch (cây phát triển, mưa nhiều, ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho muỗi sinh sản phát triển mạnh thiên nhiên) thời điểm phát triển bệnh VNNB trẻ em Đỉnh tâm Họcbệnh Liệu ĐH6Cần Thơ @tháng Tài10liệu học giảm nghiên cứu cao dịch tháng tháng Từ trở đi, mậttập độ muỗi bệnh VNNB giảm Vào mùa mưa mùa hè thời tiết nóng, nhiệt độ từ 270C-300C, virút thường phát triển tốt thể muỗi Nếu 200C phát triển virút dừng lại Đó lý mơ hình dịch tễ học lại khác hai miền Nam, Bắc Việt Nam Tại Miền Bắc bệnh giảm vào tháng lạnh, tăng vào tháng hè đỉnh cao vào tháng - – (Võ Công Khanh, 2005) Hình 2.2: Vùng dịch tễ chịu ảnh hưởng bệnh viêm não Nhật Bản (đỏ) (www.Jyi.org/articleimages/605/orignal/img1.jpg) Trung 2.3.2 Phân bố bệnh theo tuổi Người lứa tuổi chưa có miễn dịch mắc bệnh Ở vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh nên tỷ lệ mắc bệnh trẻ cao thường từ - 15 tuổi, phần lớn thể không triệu chứng lâm sàng, số tâm Học Cần @ tuổi Tàinên liệu cứu lượng trẻ cóLiệu khángĐH thể đặc hiệuThơ tăng theo tỷ lệhọc mắc tập bệnh giảmnghiên trẻ lớn người lớn 2.3.3 Trung gian truyền bệnh 2.3.3.1 Vai trò muỗi truyền bệnh Viêm Não Nhật Bản Muỗi nhân tố quan trọng nhiễm bệnh người yếu tố quan trọng chu trình truyền bệnh VNNB Muỗi Culex tritaeniorhynchus loài muỗi quan trọng cho nhân lên virút VNNB Do đó, lồi muỗi xem vectơ truyền bệnh hầu hết nước Châu Á Khi Culex tritaeniorhynchus bị nhiễm virút VNNB nồng độ thấp, virút nhân lên nhanh chóng thể lồi muỗi tiếp tục gây nhiễm cho nhiều loài động vật thích hợp heo, chim Trong thể heo chim virút khuếch đại gây nhiễm cho muỗi Kết lượng lớn virút VNNB trì tự nhiên, quần thể đơng đúc Culex tritaeniorhynchus bị nhiễm (Endy Nisalak, 2002) Ở Việt Nam muỗi Culex phân bố rộng, diện nhiều vùng đồng trung du (chiếm 40-50% tổng số muỗi bắt), hoạt động mạnh vào mùa nóng, mật độ cao vào tháng 3, đến tháng 7, thích hợp nhiệt độ 22-280C, ẩm độ 8090%, sinh sản ao hồ, vũng nước quanh nhà, chu kì sinh sản 15-16 ngày, thường hoạt động hút máu đêm từ 18 đến 20-22 giờ, giảm dần ngừng hoạt động vào lúc sáng Một số loài muỗi xem nhân tố trung gian truyền bệnh VNNB là: Culex tritaeniorhynchus, Culex fuscocephala, Culex pseudovishnui, Culex gelidus… Ở miền bắc nước ta, muỗi Culex tritaeniorhynchus trung gian truyền bệnh VNNB Ở Cần Thơ muỗi Culex Pseudovishnui trung gian truyền bệnh chủ yếu bệnh VNNB (Hồ Thị Việt Thu, 2005) Trung Hình 2.3 : Muỗi Culex tritaeniorhynchus đẻ trứng (www.jyi.org/articleimages/605/originals/img3.jpg) 2.3.3.2 Chu trình truyền virút VNNB tự nhiên tâm Học ĐH Cần Thơ @thiên Tàinhiên liệudohọc tập cứu VirútLiệu VNNB bảo tồn truyền sinhvà họcnghiên từ động vật có xương sống sang động vật có xương sống khác qua trung gian hút máu muỗi Muỗi nhiễm nhiễm Muỗi bệnh chích động bệnh cắn động vật và truyền truyền vật virút VNNB Muỗi cắn chim & mang virút VNNB Vật mang mang Vật mầm bệnh bệnh mầm Muỗi cắn chích chim Muỗi chim & chim chim mang mang & mầm bệnh bệnh mầm Muỗi chích động vật chứa mầm bệnh Muỗi nhiễm bệnh đốt người Hình 2.4: Chu trình truyền virút VNNB (www.rfa.org.TheJapaneseMeningitis) Heo vật chủ quan trọng làm lan tràn virút VNNB heo có nồng độ virút huyết cao, chu trình heo - muỗi tồn quanh năm Chim ký chủ sau heo chứa virút VNNB quan trọng, với nồng độ virút huyết cao Gà, vịt nuôi nguồn truyền virút cho muỗi, sau lại truyền sang cho người động vật khác Người sống gần chu trình sinh thái tự nhiên này, mắc bệnh bị muỗi đốt Người coi vật chủ cuối virút VNNB virút máu người tồn thời gian ngắn với nồng độ thấp, nên lây bệnh từ người sang người khác qua muỗi đốt (Huỳnh Phương Liên, 1988) Trung 2.4 CƠ CHẾ SINH BỆNH Virút từ nước bọt muỗi đốt, qua da, giai đoạn đầu virút nhân lên chỗ hạch lympho vùng, nguồn dẫn đến virút huyết Từ máu virút đến tổ chức nội tạng khác tổ chức lympho, mô liên kết, vân, tim, tuyến nội ngoại tiết Virút tiếp tục nhân lên tổ chức thần kinh đưa đến virút huyết lần kéo dài 3-5 ngày, thường với nồng độ thấp người Ở người chuột, virút VNNB xâm nhiễm có tính hướng thần kinh Những biến đổi bệnh lý trình phát triển virút hệ thần kinh trung ương tâm Liệu @ với Tàinồng liệu tậpgấp vàtriệu nghiên cứu virút nhân lênĐH trongCần tế bàoThơ thần kinh độ học não lần so với như:Học vị trí khác ngồi thần kinh Trong giai đoạn cấp tính, nói chung màng não bình thường thống mờ, não bị sung huyết, phù nề, xuất điểm xuất huyết chảy máu chất xám, hoại tử đồi thị, nhân xám sọ, não giữa, tiểu não, nhân xám thân não, chất xám vỏ não Sừng trước tủy sống bị tổn thương giống sốt bại liệt (Phạm Văn Ty, 2004) 2.5 MIỄN DỊCH HỌC Trong miễn dịch đặc hiệu, sau nhiễm virút ta có phát kháng thể IgG IgM Kháng thể IgM tạo sớm lại giảm nhanh, tồn khoảng tuần thường ứng dụng chẩn đoán Sau tiêm ngừa chủng virút vắc xin giảm độc lực cho heo, hiệu giá kháng thể HI đạt khoảng 40-640 phát sau tuần hiệu giá 160 trì tuần (Fuijisaki ctv, 1975) Khi viêm vắc xin VNNB vào chuột tuần tuổi kết 90 -100% chuột có kháng thể chống bệnh VNNB với hàm lượng tháng thể >= 1/1600 sau 24 tuần sau tiêm (Konoshi, 1998) Khi gây nhiễm cho heo mẫn cảm với virút VNNB, sau tuần kháng thể HI kháng thể trung hòa phát lúc, kháng thể đạt cao 2-4 tuần sau nhiễm giảm sau tuần nhiễm (Otsuka Ctv, 1966) 2.6 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH 2.6.1 Triệu chứng  Trên người Sau tuần nhiễm virút, bệnh khởi phát đột ngột với triệu chứng: Trung  Sốt cao liên tục  Các biểu giống cảm cúm đau nhức thể, chảy nước mũi  Những rối loạn thần kinh trẻ bị nhức đầu, nơn ói, quấy khóc nhiều, vã mồ hơi, ngủ gà, li bì  Các triệu chứng nặng tình trạng gồng cứng tồn thân, tay chân run, mê sảng, cổ cứng Bệnh diễn tiến nhanh 1-2 ngày trầm trọng đến mức gây tử vong.Học Các Liệu trường ĐH hợp khác hồi @ phụcTài khơng hồn tồn tâm Cần Thơ liệu học tập nghiên cứu Phần lớn người bị nhiễm virút VNNB thể ẩn, có triệu chứng lâm sàng, với thể đa dạng, thay đổi từ nhẹ cảm cúm đến nặng gây tử vong Dù thể thể tạo kháng thể đặc hiệu Thể ẩn: Chiếm đa số, khơng có triệu chứng lâm sàng, trường hợp điển hình có vào khoảng 200 đến 300 thể ẩn Theo Tổ chức Y tế Thế giới số dao động từ điển hình /20 - 1000 trường hợp thể ẩn Thể nhẹ: Sốt, nhức đầu, nơn Khơng có triệu chứng đặc hiệu Thể màng não: Ngồi hội chứng nhiễm trùng, xuất huyết màng não, đơi có rối loạn ý thức nhẹ, dịch não tủy thay đổi viêm màng não siêu vi khác Thể tủy sống: Khởi bệnh với sốt, sau liệt mềm cấp giống sốt bại liệt, liệt không đồng đều, ưu chân nhiều tay, dịch não tủy biến đổi thể điển hình Khoảng 30% thể có rối loạn tri giác xuất hội chứng viêm não sau Thể điển hình: Thời gian ủ bệnh trung bình tuần, tối thiểu ngày tối đa 15 ngày Giai đoạn tiền triệu: Trung bình từ - ngày, với hội chứng nhiễm trùng khơng điển hình: sốt, kèm rối loạn tiêu hóa, nơn, đau bụng, tiêu chảy, viêm long đường hơ hấp, ho, Trung Giai đoạn tồn phát: Có thể kéo dài từ đến tuần Thường xảy đột ngột không qua giai đoạn tiền triệu, với hội chứng nhiễm trùng xen kẽ với hội chứng thần kinh: sốt, buồn nôn, nhức đầu trẻ lớn Nhiệt độ tăng lên 390 – 400C , co giật tồn thân, đơi cục Rối loạn tri giác thay đổi từ nhẹ li bì, mê, kèm rối loạn thần kinh thực vật Các dấu hiệu thần kinh xuất co giật toàn thân, quay đầu, quay mắt, co cứng, co vặn cơ, run, ngón tay mân mê vấn thuốc, liệt chi, liệt thần kinh sọ não, múa vờn múa giật, mặt nhăn nhó (Võ Cơng Khanh, 2005)  Trên chuột Khi tiêm virút vào não chuột 6-7g thấy thời gian ủ bệnh kéo dài 3-4 ngày, triệu chứng lâm sàng xuất vào ngày thứ như: ăn, xù lơng, co ro, hoạt tâm ĐH @đóTài tậprồivà cứu động,Học xuất Liệu cơnCần động Thơ kinh, sau bại liệu liệt học chân sau chếtnghiên (Đỗ Quang Hà, 1965)  Trên heo Tất heo nái không mang thai heo trưởng thành khơng có triệu chứng đặc trưng Tuy nhiên bệnh lý heo nái mang thai thể bất thường lứa đẻ như: thai khô, thai chết, heo chết biểu phù thủng, heo yếu ớt, run, ứ nước da, não (Shimuzi ctv, 1954), có triệu chứng thần kinh chết sau vài ngày 2.6.2 Bệnh tích Bệnh tích đại thể Não thủy thũng, tích dịch, sung huyết não, phù nề, xuất điểm xuất huyết, hoại tử đồi thị (trường hợp cấp tính), tích nước xoang ngực, phù da, hoại tử gan, lách, sung huyết hạch lâm ba Bệnh tích vi thể Viêm não khơng mủ, xuất huyết quanh mạch, với xâm nhiễm nhiều lympo bào, đại thực bào, tăng sinh tế bào thần kinh đệm khác Hiệu giá kháng thể đạt cao vào ngày thứ 17, sau hiệu giá kháng thể giảm dần ngày thứ 31 thấp ngày thứ 38 Bảng 4.9 Đáp ứng kháng thể cá thể chuột chủng CTM – P7 đường tiêm bắp thịt Kí hiệu Hiệu giá kháng thể theo thời gian 17 ngày 31 ngày 38 ngày 40 640 40 640 80 160 20 * Chuột số Chuột số Chuột số Chuột số Ghi chú: (-) kí hiệu âm tính, (*) Chuột chết lần lấy mẫu trước 700 600 640 Hiệ u giá KT Trung tâm Học Liệu 500 ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Chuộ t số 400 Chuộ t số Chuộ t số 300 Chuộ t số 200 160 100 40 17 ngày 80 40 20 31 ngày 38 ngày Thời gian Biểu đồ 4.2 Đáp ứng kháng thể cá thể chuột chủng CTM- P7 đường tiêm bắp thịt Qua bảng 4.9 biểu đồ 4.2 cho thấy đường tiêm bắp thịt hiệu giá kháng thể cao so với đường tiêm xoang não Đường tiêm xoang não chủng CTMP7 cao đạt 80 hiệu giá kháng thể cao đường tiêm bắp thịt 640 31 Hiệu giá kháng thể đường tiêm bắp thịt cao vào ngày thứ 17 sau giảm dần vào thứ 31 không phát kháng thể vào ngày 38 4.4.1.2 Kết đáp ứng kháng thể cá thể chủng Nakayama Bảng 4.10 Đáp ứng kháng thể cá thể chuột chủng Nakayama đường tiêm xoang não Kí hiệu Hiệu giá kháng thể theo thời gian 17 ngày 31 ngày 38 ngày 40 20 320 20 10 80 20 20 Chuột số Chuột số Chuột số (-) kí hiệu âm tính 350 Trung tâm Học Liệu ĐH Cần 320 Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hiệu giá KT 300 250 Chuộ t số 200 Chuộ t số 150 100 50 Chuộ t số 80 40 17 ngày 20 31 ngày 20 10 38 ngày Thời gian Biểu đồ 4.3 Đáp ứng kháng thể cá thể chuột chủng Nakayama đường tiêm xoang não Qua kết ta thấy hiệu giá kháng thể cao ngày thứ 17 (hiệu giá 320), ngày thứ 31 hiệu giá kháng thể chuột hiệu giá 20, cho thấy khả đáp ứng kháng thể chuột gần tương đương 32 Bảng 4.11 Đáp ứng kháng thể cá thể chủng Nakayama đường tiêm bắp thịt Kí hiệu số chuột Hiệu giá kháng thể theo thời gian 17 ngày 31 ngày 38 ngày 160 40 10 40 40 10 20 80 10 40 10 10 40 10 10 80 10 - Chuột số Chuột số Chuột số Chuột số Chuột số Chuột số (-) kí hiệu âm tính 180 160 160 Hiệu giá KT Trung tâm Học Liệu 140 ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Chuộ t số 120 Chuộ t số 100 80 Chuộ t số 80 Chuộ t số 80 Chuộ t số 60 40 40 20 20 17 ngày Chuộ t số 40 10 31 ngày 10 38 ngày Thời gian Biểu đồ 4.4 Đáp ứng kháng thể cá thể chuột chủng Nakayama đường tiêm bắp thịt Qua kết ta thấy điểm chung chủng CTM- P7 Nakayama hiệu giá kháng thể đạt cao vào ngày thứ 17 giảm dần ngày thứ 31 thấp vào thứ 38 Hiệu giá cao vào ngày thứ 17 sau tiêm giảm dần từ 31 33 trở sau, kết gần giống với nghiên cứu Otsuka ctv (1966) nghiên cứu khả đáp ứng kháng thể heo 4.4.2 Kết đáp ứng kháng thể theo đường tiêm chủng CTM- P7 Nakayama Bảng 4.12 Hiệu giá kháng thể trung bình theo đường tiêm chủng CTM- P7 Nakayama Chủng CTM- P7 Trung Số mẫu Log Hiệu giá HT Đường tiêm Log 10 10(hg)*n Kháng thể dương tính 10 1,00 2,00 Tiêm x.não 20 1,30 2,60 40 1,60 1,60 80 1,90 3,80 20 1,30 1,30 tâm Học Liệu ĐH 2Cần Thơ40@ Tài liệu học tập 1,60 3,20 Tiêm bắp thịt 80 1,90 1,90 160 2,20 2,20 640 2,80 5,61 Chủng Nakayama 10 1,00 1,00 20 1,30 5,20 Tiêm x.não 40 1,60 1,60 80 1,90 1,90 320 2,50 2,50 10 1,00 8,00 20 1,30 1,30 Tiêm bắp thịt 40 1,60 8,01 80 1,90 3,80 160 2,20 2,20 x.não : xoang não,GMT: hiệu giá kháng thể trung bình, HT: huyết 34 GMT 26,92 nghiên cứu 107,67 33,64 23,91 120.00 107,67 100.00 GMT 80.00 CTM- P7 60.00 40.00 26,92 Nakayama 33,64 23,91 20.00 0.00 Xoang não Bắp thịt Chủng virút Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể trung bình theo đường tiêm chủng CTM- P7 & Nakayama Trung Từ kết bảng 4.12 biểu đồ 4.5 cho thấy đường tiêm xoang não hiệu giá kháng trung bình chủng P7 liệu (26,92) Nakayama (33,64) gần tâm Học thể Liệu ĐH Cần Thơ CTM@ Tài học tập nghiên cứu tương đương Tuy nhiên đường tiêm bắp thịt hiệu giá kháng thể trung bình chủng CTM- P7 (167,67) lớn 4,5 lần so với chủng Nakayama (23,91) Hình 4.11 Kết thực phản ứng HI 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Trung 5.1 KẾT LUẬN Đường tiêm phúc mạc đường tiêm gây nhiễm chết chuột cao (100%) chủng CTM – P7 Nakayama Tỷ lệ chết chủng CTM –P7 Nakayama gây chuột bạch khác khơng có ý nghĩa thống kê (P = 0,502) Cả chủng CTM –P7 Nakayama gây cho chuột bạch (14 ngày tuổi) triệu chứng gần giống Các triệu chứng thần kinh xem thường thấy: co giật toàn thân, cứng gáy, chạy hoảng loạn, bại liệt chân sau, run tay chân, thể xanh tái, chảy nước dãi … Về bệnh tích: có nhiều bệnh tích biểu sau mổ khảo sát như: não tích nước, gan sung huyết, hoại tử, thận sung huyết, ứ nước, phổi nhạt màu, tích nước xoang bụng, xoang ngực,… Tuy nhiên bệnh tích thường thấy não tích nước, gan sung huyết, thận sung huyết, tích nước xoang ngực xoang bụng Tất chuột thí nghiệm (100%) ngày thứ 17 có đáp ứng kháng thể đạt hiệu giá cao nhất, hiệu giá kháng thể giảm dần ngày thứ 31 giảm thấp tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu vào ngày thứ 38 sau tiêm 5.2 ĐỀ NGHỊ Phân lập định tính kháng nguyên viêm não Nhật Bản chuột thí nghiệm bị gây nhiễm với virút viêm não Nhật Bản Tiếp tục xác định độc tính tính chất gây bệnh chuột giai đoạn lớn 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trung Nguyễn Thị Chính, Ngô Tiến Hiển, 2001 Virút học NXB quốc gia Hà Nội, trang 200- 203 Nguyễn Chương, 1996 Bệnh viêm não Nhật Bản Việt Nam NXB Y Học trang 23-31 Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn, 2002 Bệnh học truyền nhiễm Nhà xuất Y Học Hà Nội, trang 349-355 Đỗ Quang Hà, Đoàn Xuân Mượu, 1965, phân lập định loại virút viêm não Nhật Bản B Việt Nam Tập san vệ sinh phòng dịch số 1/1-1965, trang 1215 Võ Cơng Khanh, 2005 Bệnh viêm não Nhật Bản Trung tâm nhiệt đới TP.HCM, trang Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện, 2004 Một số bệnh virút gia súc, gia cầm nhập nội biện pháp phòng trị Nhà xuất Nông nghiệp, trang 8699 Phan Thị Ngà, Lê Kim Phương, Vũ Sinh Nam, Nguyễn Thu Yến, Trần Văn Tiến, Huỳnh Phương Liên, 1996 Transmission of Japanese Encephalitis tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu (JE) virus in Gia Luong District, Ha Bac Province, Vietnam, After Je vaccination, 1993-1994 Tropical Medicine, 37(4), pp.129-134 Nguyễn Đa Phúc, 2001 Điều tra tình hình nhiễm virút viêm não Nhật Bản đàn heo sinh sản thị xã Vĩnh Long phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu Luận án thạc sĩ nông nghiệp, Đại Học Cần Thơ, 97 trang Huỳnh Thị Xuân Thẳm, 2007 Xác định độc tính virút viêm não Nhật Bản (chủng CTM-P7) chuột bạch 1-3 ngày tuổi Luận văn bác sỹ Thú Y khoa Nông Ngiệp & SHƯD trường Đại Học Cần Thơ, 29 trang 10 Hồ Thị Việt Thu, Huỳnh Phương Loan, Huỳnh Thị Phương Thảo, Huỳnh Ngọc Trang, Nguyễn Văn An, Trần Đình Từ, 2006 Phân Lập virút từ muỗi thu thập thành phố Cần Thơ Tạp chí khoa học kĩ thuật thú y, tập XIII, số 5, trang 19-23 11 Hồ Thị Việt Thu, 2007 Sự lưu hành virút viêm não Nhật Bản heo vai trò hội chứng rối loạn sinh sản số tỉnh ĐBSCL Luận án tiến sĩ nông nghiệp Đại Học Nông Lâm TP.HCM, trang 25 12 Lê Thị Thu, 2005 Chẩn đoán huyết học khảo sát ảnh hưởng virút viêm não Nhật Bản suất sinh sản heo số trại chăn 37 nuôi thành phố Cần Thơ Luận án thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp & SHƯD trường Đại Học Cần Thơ, 91 trang 13 Dương Đình Thiện, 2001 Dịch tễ học bệnh truyền nhiễm NXB Y Học Hà Nội, trang 194-197 14 Nguyễn Hồ Thiện Trung, 2000 Khảo sát tỷ lệ nhiễm virút viêm não Nhật Bản bước đầu tìm hiểu mối liên quan với hôi chứng rối loạn sinh sản heo Đồng Tháp Luận án thạc sĩ khoa nông nghiệp, Đại Học Nông Lâm TP.HCM, 94 trang 15 Phạm Văn Ty, 2004 Virút học NXB giáo dục, trang 169- 174 16 Chu R M., Joo H.S., 1996 Japanese encephalitis B (Diseases of swine), 7th Eds: Towa state university press, Ames, Tiowa, U S A., pp 286-292 17 Joo H.S, 1986 Japanese Encephalitis Diseases of swine 6thed Iowa state University Press, Ames, Iowa, USA, pp.407- 410 Trung 18 Johnson R.T (1987), “The pathogenesis of acute viral encephalitis and postinfectious encephalomyelitis”, Dis, học 155(3), pp.359-364) tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @J.infect Tài liệu tập nghiên cứu 19 Kimura-Kurota J., Yasui K., 1986 Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses during monoclonal antibodies J Gen Virol 67, pp 2663-2672 20 Mathur Asha, Arora K.L, chaturvedi U.C, 1981 Congential infectious of mice with Japanese Encephalitis virus Department of pathology and Bacteriology, K.G medical college, Lucknow-3, India, 34(1), pp 26-29 21 Otsuka S., Manako K., Kunihiro H., Motomura I, (1966), Studies on the sensitive of swine anti-serum againist Japanese encephalitis virus to 2mercaptoethanol, Nippon Saikingaku Zasshi, 21(12),pp 175-184 22 Poland J D, Cropp C B, Craven R B, Monath T P Evaluation of the potency and safety of inactivated Japanese encephalitis vaccine in US inhabitants J infect Dis 1990; 161;878-882 23 Endy T.P., Nisalak A (2002), Japanese encephelitis virus: ecology and epidemiology, current topic in microbiology and immunology, 267, pp.1148 38 Tài liệu internet Từ khóa “Japanese encephalitis virus” Cấu trúc virút Viêm Não Nhật Bản www Vietsciences2.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/i Hình Vắc xin viêm não Nhật Bản www vabiotechvn.com/upload/images/thumb_produ Sơ đồ phác họa chu trình truyền virút VNNB www rfa.org.TheJapaneseMeningitis Muỗi Culex tritaeniorhynchus Culex pseudovishnui www Jyi.org/articleimages/605/originals/img3.jpg Vùng dịch tễ chịu ảnh hưởng bệnh Viêm Não Nhật Bản (đỏ) www Jyi.org/articleimages/605/orignal/img1.jpg Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 39 PHỤ CHƯƠNG + Phương pháp xác định liều LD50 chuột ổ Nguyên tắc: pha loãng huyễn dịch virút với dung dịch PBS thành nồng độ lệch 10 lần từ nồng độ pha loãng tiến hành tiêm cho thể cảm thụ Sau thời gian định ( 2-3 ngày), ý xem nồng độ có vật ni bị chết Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm tính liều LD50 chuột ổ Độ pha lỗng virút (lg) Số lượng chuột tiêm /chủng virút (con) Liều tiêm (ml/con) Đường tiêm CTM – P7 Nakayama -1 4 0,02 Xoang não -2 4 0,02 Xoang não -3 4 0,02 Xoang não -4 4 0,02 Xoang não -5 4 0,02 Xoang não -6 4 0,02 Xoang não -7 4 0,02 Xoang não -8 4 0,02 Xoang não -9 4 0,02 Xoang não Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Kết tính LD50 chuột ổ chủng CTM- P7 Độ pha loãng virút (lg) Số thật Số tổng hợp Tỷ lệ Sống (con) Chết (con) Sống (con) Chết (con) Nhiễm (con) % nhiễm -1 21 21/21 100 -2 17 17/17 100 -3 13 13/13 100 40 -4 9/9 100 -5 2 5/7 71,43 -6 2 3/7 42,86 -7 1/8 12,5 -8 11 0/11 -9 15 0/15 - Khoảng cách tỷ lệ PD độ pha loãng 10-5 10-6 PD = 71,43  50  0,75 71,43  42,86 - Độ pha loãng lũy thừa gây chết 50%: Lg LD50 = 0,75 x [(-6)- (-5)] + -(-5) = -5,75 LD50= 10-5,75 với liều tiêm 0,02 ml Trung tâm Học Thơ @ Tài họcdịch tập vàCTMnghiên Vậy ởLiệu độ phaĐH loãngCần 1: 105,75 tiêm 0,02 liệu ml huyễn virút P7 cứu gây chết 50% số chuột thí nghiệm Kết LD50 chuột bạch chủng Nakayama Độ pha loãng virút (lg) Số thật Số tổng hợp Tỷ lệ Sống (con) Chết (con) Sống (con) Chết (con) Nhiễm (con) % nhiễm -1 15 15/15 100 -2 11 11/11 100 -3 7/7 100 -4 2 3/5 60 -5 1/6 16,67 -6 0/9 41 -7 13 0/13 -8 17 0/17 -9 21 0/21 - Khoảng cách tỷ lệ PD độ pha loãng 10-4 10-5 PD = 60  50  0,23 60  16,67 - Độ pha loãng lũy thừa gây chết 50% là: Lg LD50 = 0,23 x [(-5)-(-4)] + (-4) = -4,23 Vậy độ pha loãng 1:104,23, tiêm 0,02 ml huyễn dịch virút chủng Nakayama gây chết 50% chuột bạch thí nghiệm + Xử lý thống kê Chi-Square Test: chết, sống Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Expected counts are printed below observed counts CTM-P7 Nakayama Total Chết 11 10.00 sống 8.00 10.00 8.00 20 16 Total 18 18 36 Chi-Sq = 0.100 + 0.125 + 0.100 + 0.125 = 0.450 DF = 1, P-Value = 0.502 42 Chi-Square Test: có kháng thể (dương tính), khơng kháng thể (âm tính) Expected counts are printed below observed counts Đáp ứng kháng thể o chủng CTM- P7 Nakayama duong ti am tinh Total CTM- P7 19 14 33 17.86 15.14 Nakayama 27 28.14 25 23.86 52 46 39 85 Total Chi-Sq = 0.073 + 0.086 + 0.046 + 0.055 = 0.260 DF = 1, P-Value = 0.610 + Các dung dịch hóa chất dung thí nghiệm - Dung dịch Alsever (dung dịch chống đông) Dextrose (C6H12O6) 20,50g Citric (H3C6H5O7.H2O) 0,55g Sodium citrate (Na3C6H5O7.2H2O) 8,00g Nước cất vừa đủ 1000ml Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập4,20g nghiên cứu NaCl Sấy ướt 1100C 10 phút - Dung dịch DGV (Destrose – Gélatine – Versonal) Versonal 0,58g Gélatine 0,60g Sodium versonal 0,38g CaCl2 0,02g MgSO4.7H2O 0,12g NaCl 8,50g Glucose 10,00g Nước cất vừa đủ 1000ml 43 Sấy ướt 1100C 10 phút * Các dung dịch mẹ (bảo quản 4oC) - Dung dịch NaCl 1,5M NaCl 43,85g Nước cất vừa đủ 50g - Dung dịch acid boric 0,5M BO3H3 7,73g Nước cất vừa đủ 250g (Hòa tan nước nóng, sau thêm vào nước cất vừa đủ) - Dung dịch NaOH 1N NaOH 40,00g Nước cất vừa đủ 1000g Na2HPO - Dung dịchLiệu 0,5M Trung tâm Học ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Na2HPO4.12H2O 179,08g Nước cất vừa đủ 1000ml - Dung dịch NaH2PO4 1M NaH2PO4.2H2O 156,01g Nước cất vừa đủ 1000ml * Các dung dịch làm việc - Dung dịch VAD Dung dịch NaCl 100ml Dung dịch Na2HPO4 0,5M 62ml Dung dịch NaH2PO4 1M 160ml Nước cất vừa đủ 1000ml - Dung dịch Borat pH = Dung dịch NaCl 1,5M 80ml 44 Dung dịch BO3H3 0,5M 100ml Dung dịch NaOH 1N 24ml Nước cất vừa đủ 1000ml - Dung dịch 4% Bovalbumine (Fraction V) Bovalbumine 2g Borat pH = vừa đủ 50ml Chỉnh lại pH = dung dịch NaOh 1N - Dung dịch BABS 0,4% (BABS – Bovalbumine Buffered Saline) Bovalbumine 0,4% pH = 10ml Borat pH = 90ml - Dung dịch Kaolin 25% Kaolin 25g Dung dịch Borat pH = 100ml Trữ lạnh ĐH C Trung tâm Học Liệu Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 45 ... chủng virút viêm não Nhật Bản (CTM- P7) muỗi thành phố Cần Thơ Để có hiểu biết bệnh viêm não Nhật Bản, thực đề tài: Xác Định Độc Lực Và Tính Chất Gây Bệnh Của virút Viêm Não Nhật Bản Trên Chuột Bạch ... sát bệnh tích đại thể chuột bạch  Khảo sát đáp ứng miễn dịch chuột bạch CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN Viêm não Nhật Bản (VNNB) bệnh nhiễm trùng cấp tính gây loại... Liệu ĐH liệu học tập nghiên cứu Năm 1934, virút viêm não Nhật Bản phân lập từ não bệnh nhân chết viêm não, virút xem chủng virút mẫu virút viêm não Nhật Bản đặt tên Nakayama Năm 1942, Sabin đồng