Khảo sát 6 chỉ thị phân tử SSR tập trung ở các vùng giả định thuộc nhiễm sắc thể số 3 và số 4, xác định được 2 chỉ thị phân tử là RM3586 trên nhiễm sắc thể số 3 và RM6089 trên nhiễm sắc
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian thực hiện
Thời gian thực hiện đề tài từ 02/06/2013 đến 15/01/2014 tại phòng Công nghệ Sinh Học – Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, số 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, Quận 1, Tp.HCM.
Vật liệu nghiên cứu
Giống lúa được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và phát triển nông nghiệp Đồng Tháp Mười – trực thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam:
- Giống lúa chịu nóng: N22 từ ngân hàng giống lúa của viện lúa quốc tế IRRI Gene Bank
+ Là giống lúa indica có nguồn gốc từ Ấn Độ
+ Bộ rễ ăn sâu, chịu nhiệt, chịu hạn tốt (Jagadish và ctv, 2010)
+ Là giống lúa thể hiện tính chịu nhiệt độ cao tốt nhất thể hiện ở các tính trạng nông học so với các giống lúa nghiên cứu khác trong các công trình nghiên cứu của các tác giả Mackill và ctv, 1982; Satake và Yosida, 1978; Yosida và ctv, 1981; Prasad và ctv, 2006; IRRI, 1976
- Giống tái tục: AS996 Được chọn lọc từ tổ hợp lai IR 64/Oryza rufipugon Được công nhận giống chính thức theo Quyết định số 5310 QĐ/BNN- KHCN, ngày 29 tháng 11 năm 2002 của Bộ Nông Nghiệp & PTNT Đặc tính giống lúa AS996:
+ Thời gian sinh trưởng 90-95 ngày
+ Chiều cao cây: 95 - 100 cm Thân rạ cứng, đẻ nhánh khá, chịu phèn tốt
+ Kháng vừa với bệnh Đạo ôn Nhiễm nhẹ với bệnh Khô vằn và với Rầy nâu
+ Năng suất: vụ Đông Xuân 6-8 tấn/ha, vụ Hè Thu 4-5 tấn/ha
+ Hạt gạo dài, ít bạc bụng Cơm mềm và ngon
+ Chiều dài hạt trung bình: 7,37 mm
+ Là giống thích hợp cho cả vụ Đông xuân và Hè thu, thích hợp trên nhiều vùng đất phù sa đến phèn trung bình Lượng giống gieo thẳng 120 - 150 kg/ha, sạ hàng 100 - 120 kg/ha
- 11 dòng lúa lai ở thế hệ F2 được kí hiệu từ 3 đến 13 tạo từ giống chịu nhiệt N22 và giống tái tục AS996 tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển nông nghiệp Đồng Tháp Mười.
Phương pháp nghiên cứu
Bước 1: Chuẩn bị cây mẹ
Chọn cây: chọn cây tốt, tiêu biểu cho giống/ dòng, bứng cây vào chậu (đã chuẩn bị), cột thẻ ghi tên giống vào cây Chọn 2-3 bông/tổ hợp lai Chọn bông đã trổ khỏi bẹ 50–60% Cẩn thận tách bông được chọn ra khỏi các bông xung quanh
Có thể cắt bỏ các bông đã trổ
Dọn cây lai: loại bỏ những hoa trên (chóp bông) và hoa dưới (gần cổ bông); chỉ giữ lại các hoa có chiều cao bao phấn ở khoảng 1/2 - 1/3 vỏ trấu (nhìn xuyên qua vỏ trấu) Mỗi bông giữ lại 15-20 hoa tốt, đúng thời điểm để lai
Cắt vỏ trấu: cắt xiên vỏ trấu, bỏ từ 1/3 – 2/3 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn
Không cắt quá thấp sẽ làm tổn thương nướm nhụy cái Nếu cắt quá cao sẽ khó khử đực và phấn sẽ khó rơi xuống nướm nhụy cái
Dùng mũi nhọn của cây kẹp, vít nhẹ các túi phấn ra ngoài Cẩn thận để tránh thiệt hại đến nướm nhụy cái Phải chắc chắn cả 6 túi phấn đã được loại bỏ
Bao bông lúa: sau khi khử đực, bao bông lúa lại bằng bao giấy bóng mờ (trên bao giấy bóng mờ ngày khử đực, tên người khử đực) Xếp túm phần miệng bao, kẹp miệng bao vào gần cổ bông để giữ bông cho chặt
Chọn bông từ những cây đại diện, tốt, có nhiều hoa sẽ nở, vài hoa ở chóp bông đã tung phấn Cắt bông lúa có độ dài thích hợp, cắt bỏ lá cờ Cột các bông lúa cùng cây cha lại và gắn các thẻ ghi vào bó bông Mang các bông từ ruộng vào nơi thụ phấn Đặt các bông vào chậu nước, nơi ít gió, dễ di chuyển Sắp xếp các bông để rút bất cứ bông nào mà không ảnh hưởng đến bông khác
Quan sát kỹ các bông, khi nào túi phấn vươn ra khỏi vỏ trấu của cây cha phải thụ phấn ngay khi hoa nở, càng nhanh càng tốt, tận dụng thời gian thụ phấn nhiều nhất Lấy bao giấy ra khỏi bông cây mẹ, rút một bông (cha) đang nở rắc lên các bông cây mẹ đã khử đực Bao bông cây mẹ lại sau khi thụ phấn Xếp cạnh miệng bao, dùng kẹp giấy kẹp vào trục bông để giữ bông cho chặt
Lập nhật ký của những tổ hợp lai: Lập 1 phiếu cho một tổ hợp Liệt kê tất cả những cây cha được thụ phấn cho cây mẹ đó và ghi tên nguồn gốc, ngày thụ phấn
Bước 5: Bảo vệ chậu lúa
Tránh gió, mưa và ngừa chim, chuột và dịch hại khác Có thể bón thêm 1 ít phân urea để nuôi hạt lai
Khi hạt mất màu xanh, thường 25 ngày sau khi thụ phấn hạt sẽ chín Cắt bông, phơi khô và tuốt bằng tay Đếm hạt và giữ trong bao giấy, bên ngoài có ghi tên hoặc số tổ hợp lai, nhãn lai cũng được kẹp giữ bên ngoài bao
3.3.2 Chuẩn bị quần thể thí nghiệm
Hạt AS996, N22 và 11 dòng lai được làm nảy mầm trong các đĩa petri chứa đất tự nhiên (mỗi giống 6-8 hạt)
Hình 3.1 Gieo hạt trong các đĩa petri
Sau khi cây lúa nảy mầm được khoảng 10cm, chuyển ra trồng trong nhà lưới trong 26 chậu nhựa tròn đường kính 20cm, cao 21cm (đánh số lặp lại từ 1-13), mỗi giống cấy ra 2 xô, mỗi xô 3-4 cây, dưới nhiệt độ bình thường (tối đa 32 ± 1,7 o C, tối thiểu 23,8 ± 0,8 o C, trung bình 27,9 ± 1,2 o C), ánh sáng tự nhiên
30 ngày sau trồng, chọn những mẫu lá non khoảng 10 cm, không có vết bệnh cho vào bịch nylon zipper, để vào thùng lạnh Sau đó, vận chuyển về phòng thí nghiệm bảo quản ở -80 o C để tách chiết DNA
Hình 3.2 Lúa 30 ngày tuổi trồng tại nhà lưới
Khi cây lúa bước vào giai đoạn làm đòng (khoảng 40-45 ngày), mỗi xô của một giống lúa (đeo thẻ kí hiệu B) được chuyển vào tủ sinh trưởng cho đến lúc thu hoạch Xô còn lại được tiếp tục trồng ở nhà lưới (đeo thẻ kí hiệu A) để so sánh
Nhiệt độ tủ sinh trưởng được thiết lập theo bảng 3.1 dưới đây
Bảng 3.1: Thiết lập nhiệt độ cho tủ sinh trưởng
- 7- 8 giờ sáng: thiết lập 29 o C trong phytotron - 8-10 giờ sáng: 34 o C
- 10-12h giờ sáng: 37 o C - 12-14h giờ trưa: 39 o C - 14-15h giờ trưa: 37 o C - 15-16h giờ chiều: 34 o C - 16-18h giờ tối: 30 o C - 20-7 giờ hôm sau: 24 o C (không chiếu sáng) Độ ẩm duy trì 75%
Hình 3.3 Lúa được chuyển vào trồng trong tủ sinh trưởng
3.3.3 Đánh giá kiểu gen quần thể thí nghiệm 3.3.3.1 Ly trích DNA tổng số
DNA tổng số của bố mẹ và các dòng lai được ly trích theo phương pháp CTAB (cetyltrimethyllammonium bromide) của Murray và Thomson (1980), quy trình ly trích có cải tiến một số thành phần hóa chất nhằm phù hợp với điều kiện hiện có tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam Quy trình ly trích gồm các bước sau:
Bước 1: Nghiền 0,5 g lá trong Nitơ lỏng, sau đó chuyển vào tuýp 1,5 ml
Bước 2: Thêm 500 l dung dịch CTAB, lắc cho đến khi hỗn hợp đồng nhất
Bước 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C
Bước 5: Chuyển dịch nổi sang tuýp mới Thờm 250 àl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24 : 1), lắc mạnh trong 1 phút, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
Bước 6: Ly tâm 12.000 vòng/phút, trong 1 phút ở 4 o C, sau đó lấy dịch nổi (lớp trên) sang tuýp mới
Bước 7: Lặp lại bước 5 và 6
Bước 8: Cho vào 500 l isopropanol, đảo nhẹ tuýp, ủ mẫu ở -20 o C trong 1 giờ
Bước 9: Thu tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C
Bước 10: Đổ bỏ dịch nổi, rửa tủa với 500 l ethanol 70%, sau đó ly tâm
Bước 11: Tiếp tục đổ bỏ dịch nổi, rửa tủa với 500 l ethanol 70%, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 4 o C
Bước 12: Phơi khô tủa ở 50 o C trong khoảng 15 phút
Bước 13: Hòa tan mẫu trong 50 l dung dịch TE 1X và trữ mẫu ở - 20 o C
Sau đó, tiến hành định tính và định lượng DNA bằng phương pháp điện di và phương pháp đo OD Định tính DNA bằng phương pháp điện di
DNA sau khi ly trích sẽ được định tính bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% Vì DNA mang điện tích âm (do tính chất của nhóm phosphate), dưới tác dụng của điện trường DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA DNA có phân tử càng lớn, lực cản càng mạnh nên di chuyển càng chậm DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh Nhờ vậy ta có thể phân loại được các đoạn DNA trên gel agarose
Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA được phân tách tùy theo trọng lượng phân tử Chúng có thể được quan sát bằng mắt thường nhờ kỹ thuật nhuộm màu với ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV
- Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1 g agarose cho vào 125 ml dung dịch TAE 0,5 X Đun sôi bằng lò Viba ở công suất 650 W cho đến khi agarose tan hoàn toàn thể tích còn lại 100ml Để nguội đến khoảng 60 o C
- Đổ gel, chờ agarose đông
- Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 4 l DNA mẫu
- Chạy điện di ở điều kiện 90 V, 250 mA, thời gian 1 giờ 30 phút
KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN
Đánh giá kiểu gen
DNA là nguồn vật liệu di truyền quan trọng cho các thao tác sinh học phân tử sau này Mục đích của việc tách chiết DNA là thu được DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt
Mẫu mô lá lúa được thu nhận và tiến hành nghiền mẫu bằng cối và chày trong nitơ lỏng Do thành tế bào cây lúa rất cứng và khó phá vỡ, nitơ lỏng làm cho các mô trở nên lạnh và dẻo, như vậy mô có thể được nghiền mịn nhanh chóng
Nguồn gốc mô cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng DNA Mô cây khỏe, trẻ cho kết quả phân lập tốt nhất, trong khi đó, nếu sử dụng mô già thì sản phẩm thu được dễ bị tạp do polysaccharide dẫn đến chất lượng sản phẩm thấp, do đó cần lựa chọn những mô lá non, không có vết bệnh để cho kết quả tách chiết DNA tốt
Việc ly trích DNA tổng số được tiến hành theo phương pháp CTAB, đây là phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô thực vật mang lại hiệu quả cao, đồng thời đã được cải tiến để phù hợp với điều kiện thí nghiệm tại viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp miền Nam
CTAB là chất có hoạt tính bề mặt, nó sẽ tạo phức với DNA là ion âm trong dung dịch Khi nồng độ muối lớn hơn 0,7 M, phức hợp DNA-CTAB sẽ hòa tan trong dung dịch Khi nồng độ muối nhỏ hơn 0,7M thì phức hợp DNA-CTAB sẽ được tủa NaCl thêm vào để điều khiển nồng độ muối trong dung dịch
Protein và chất cặn của tế bào được tách rời ra khỏi DNA bằng cholorofrom- isoamylalcohol Trong quá trình ly trích sử dụng chloroform-isoamylalcohol lặp lại hai lần liên tiếp kết hợp với ly tâm đã loại bỏ hết lượng protein và polysaccharide có trong mẫu Chloroform có tác dụng làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau, isoamylalcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ kết tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ
Pha nước có chứa acid nucleic sẽ được thu nhận lại Sau đó, tiến hành thu tủa acid nucleic bằng isopropanol Mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung môi theo nồng độ mong muốn Bên cạnh đó, các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa nên có thể loại bỏ chúng bằng kết tủa trong isopropanol Sau đó, cặn kết tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các dấu vết của isopropanol còn dính lại
EDTA và Tris là hai dung môi hết sức quan trọng trong quá trình tách chiết
Tris được sử dụng với khả năng đệm rất hiệu quả Ở pH 8, DNA rất ổn định Để ngăn ngừa DNA bị thủy phân bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA Bởi vì tất cả các enzyme thủy phân được biết đến hiện nay đều cần Mg 2+ làm cofactor
EDTA có thể kiềm giữ Mg 2+ và làm bất hoạt nó trong dung môi Không có Mg 2+ , enzyme không thể hoạt động
Kết quả định lượng DNA bằng máy quang phổ kế cho thấy các mẫu DNA nguồn vật liệu bố mẹ và 11 dòng lai đều cho thấy DNA thu nhận được đạt chất lượng tốt, DNA thu được với tỉ lệ OD260/280 đạt từ 1,5-2,2 đảm bảo độ tinh sạch tương đối cao cho các thao tác sau này
Bảng 4.1: Kết quả định lượng DNA bằng máy quang phổ kế
Mẫu Nồng độ DNA (ng/àl) Tỉ lệ OD 260/OD 280
Ghi chú: A: trồng ở điều kiện nhà lưới, B: trồng ở điều kiện nóng nhân tạo
Các mẫu DNA lúa của giống AS996, N22 và 11 dòng lúa lai sẽ được tiến hành kiểm tra chất lượng bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch TBE 0,5X
Hình ảnh kết quả điện di (hình 4.1) cho thấy qui trình tách chiết đạt hiệu quả tốt do sản phẩm thu được không có hiện tượng đứt gãy nhiều, tạp chất được loại bỏ gần như hoàn toàn, các vạch sản phẩm sáng, đều
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số
Ghi chú: gel agarose 1%, TBE 0,5 X 1: AS996, 2:N22, các dòng lai từ 3 đến 13, A: mẫu lá thu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu lá thu từ cây sẽ chuyển vào tủ sinh trưởng
Kết quả đánh giá sản phẩm DNA tổng số bằng 2 phương pháp đo OD và điện di có sự tương đồng với nhau, đều cho thấy sản phẩm DNA tổng số được tách chiết đạt hiệu quả tốt, tạp chất được loại bỏ, DNA thu được có độ tinh sạch cao, nồng độ đủ để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo
Trong quá trình ly trích DNA cần lưu ý những vấn đề sau để hiệu quả ly trích đạt được tốt nhất:
- Cần ủ trước dung dịch ly trích đến 65 o C (có thể ủ trong khoảng 15 phút) để tránh hiện tượng kết tủa (do dịch ly trích chứa CTAB) làm ảnh hưởng đến kết quả ly trích
- Khi nghiền mẫu trong nitơ lỏng, cần bổ sung nitơ lỏng thường xuyên để giữ lạnh mẫu, tránh để mẫu tan chảy sẽ làm hư hỏng DNA, nghiền mẫu nhanh tay Khi mẫu đã được nghiền thành bột mịn, chuyển ngay mẫu vào tuýp 1,5 ml giữ lạnh để bảo quản
- Khi phơi khô cặn tủa DNA, tránh để quá lâu sẽ làm hư hỏng DNA
4.1.2 Tuyển chọn các SSR primer cho phản ứng PCR
So sánh kiểu gen và kiểu hình quần thể thí nghiệm
Kết quả so sánh kiểu gen của quần thể thí nghiệm khi chạy PCR với chỉ thị RM3586 và chỉ thị RM6089 và kết quả đánh giá kiểu hình thông qua đánh giá tỉ lệ hạt phấn bất dục và tỉ lệ hạt hữu thụ được trình bày tóm tắt ở bảng 4.6
Bảng 4.6: So sánh kiểu gen và kiểu hình quần thể thí nghiệm
Giống/dòng lúa RM3586 RM6089 Kiểu hình
+: chịu nhiệt độ cao -: nhạy nhiệt độ cao
Kết quả so sánh cho thấy mức độ chính xác giữa kiểu gen và kiểu hình khi sử dụng chỉ thị phân tử RM3586 là 92%, mức độ chính xác giữa kiểu gen và kiểu hình khi sử dụng chỉ thị phân tử RM6089 là 84% Khi so sánh mức độ chính xác giữa kiểu gen bằng chỉ thị phân tử và kiểu hình: giá trị tiên đoán mức độ chính xác này càng lớn (>70%) thì thể hiện mức ý nghĩa liên kết giữa vùng QTL mục tiêu và chỉ thị phân tử càng cao
Hầu hết những tính trạng nông nghiệp quan trọng như năng suất, hình thái, tính kháng sâu bệnh, tính trạng chống, chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường thì phức tạp và do nhiều gen quy định Tương tác giữa các gen và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường có thể tạo ra những kiểu hình khác biệt của cùng một kiểu gen Điều này giải thích cho kết quả mức độ chính xác giữa kiểu gen và kiểu hình
Kết quả này cho thấy, bước đầu có thể sử dụng primer RM3586 và RM6089 bổ sung cho tập hợp các SSR marker sử dụng trong công tác chọn, tạo giống lúa chịu nóng ở Việt Nam
Các SSR marker được xác định sẽ giúp sàng lọc các dòng lai mang gen chịu nóng, các dòng này sẽ được tiếp tục dùng như là vật liệu để lai hồi giao (BC) với giống tái tục, tiến trình này kéo dài đến BC 6 Các dòng BC bắt đầu thuần với kiểu hình, xét nghiệm microsatellite giúp khẳng định việc hồi giao đã thành công, chuyển được gen mục tiêu từ giống cho vào giống nhận một cách ổn định Các dòng chịu nóng được tuyển chọn để đánh giá và chọn lọc tiếp tục, đưa các dòng này sang đánh giá sơ khởi, so sánh hậu kì và khảo nghiệm quốc gia Kết quả là một số dòng đạt yêu cầu về tính chịu nóng và năng suất sẽ được đưa vào sản xuất trong tương lai.
