CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN
4.1 Đánh giá kiểu gen
4.1.4 Sản phẩm PCR của quần thể các dòng lúa lai với các chỉ thị phân tử
Sản phẩm PCR với RM3586 (hình 4.3) cho đa hình các loại sản phẩm. Alen nhạy nhiệt có kích thước 118 bp. Alen kháng (chịu nhiệt) có kích thước khoảng 130-140 bp.
500bp
100bp
ladder
118 bp 140 bp 174 bp
137 bp
170 bp 190 bp
131 bp
179 bp
Kết quả điện di cho thấy có đa hình sản phẩm PCR giữa giống chịu nhiệt (N22) và giống nhạy AS996. Theo đó, dòng lai 3, 4, 6, 8, 12 cho alen kháng (chịu nhiệt) giống với N22. Còn lại dòng lai 5,7,9,10,11,13 cho alen nhiễm (nhạy nhiệt) giống với AS996.
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM3586
Ghi chú: gel agarose 3%, ladder 100 bp. 1: AS996, 2:N22, các dòng lai từ 3 đến 13, A: mẫu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu từ cây sẽ chuyển vào tủ sinh trưởng.
Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Bùi Chí Bửu và ctv. 2012.
Kết quả phân tích bước đầu trên quần thể phân ly BC2F2với số mẫu cá thể lớn (mẹ:
OM5930, AS996 và bố là Dular, N22) cho thấy có 4 tính trạng nông học quan trọng: năng suất, tỷ lệ hạt lép, chỉ số chống chịu, thời gian sinh trưởng liên quan đến tính chịu nóng ở giai đoạn lúa trổ. Nhiệt độ cực trọng ảnh hưởng đến năng suất lúa là 36oC. Tương quan giữa tỷ lệ hạt lép với điểm chịu nóng chặt chẽ và cùng chiều.
Có 45 SSR biểu thị đa hình được sử dụng để phân nhóm di truyền nguồn vật liệu nghiên cứu. Giống cho nguồn gen kháng là Dular và N22. Giống làm vật liệu tái tục (recurrent) là AS996, OM5930. Chỉ thị SSR biểu hiện liên kết chặt chẽ với QTL giả định trên nhiễm sắc thể số 3 là RM3586 được sử dụng để tìm con lai có gen kháng, phục vụ nội dung hồi giao với dòng tái tục nhằm tạo ra quần thể BC4 sau này.
500bp
100bp
ladder
118 bp 130 bp
4.1.4.2 Sản phẩm PCR với chỉ thị RM1278
Kết quả điện di (hình 4.4) cho thấy sản phẩm PCR với RM1278 chỉ cho một loại sản phẩm (không có dấu hiệu đa hình) với kích thước 131 bp. Như vậy, chỉ thị phân tử RM1278 không phân biệt được giữa giống chịu nhiệt và giống nhạy nhiệt.
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM1278
Ghi chú: gel agarose 3%, ladder 100 bp. 1: AS996, 2:N22, các dòng lai từ 3 đến 13, A: mẫu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu từ cây sẽ chuyển vào tủ sinh trưởng
4.1.4.3 Sản phẩm PCR với chỉ thị RM5320
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR với RM5320 chỉ cho một loại sản phẩm (không có dấu hiệu đa hình) với kích thước 137 bp. Như vậy, chỉ thị phân tử RM5320 không phân biệt được giữa giống chịu nhiệt và giống nhạy nhiệt.
500bp
100bp 131 bp
ladder
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM5320
Ghi chú: gel agarose 3%, ladder 100 bp. 1: AS996, 2:N22, các dòng lai từ 3 đến 13, A: mẫu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu từ cây sẽ chuyển vào tủ sinh trưởng
3.1.4.4 Sản phẩm PCR với chỉ thị RM6089
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM6089
Ghi chú: gel agarose 3%, ladder 100 bp. 1: AS996, 2:N22, các dòng lai
từ 3 đến 13, A: mẫu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu từ cây sẽ chuyển vào tủ
sinh trưởng
Sản phẩm PCR với RM6089 cho đa hình các loại sản phẩm. Alen nhạy nhiệt có kích thước 170 bp. Alen kháng (chịu nhiệt) có kích thước khoảng 190-200 bp.
500bp
100bp
500bp
100bp
ladder
137 bp
ladder
170 bp 190 bp
Kết quả điện di cho thấy có đa hình sản phẩm PCR giữa giống chịu nhiệt (N22) và giống nhạy AS996. Theo đó, dòng lai 3, 4, 7, 12 cho alen kháng (chịu nhiệt) giống với N22. Còn lại dòng lai 5, 6, 8, 9, 10, 11, 13 cho alen nhiễm (nhạy nhiệt) giống với AS996.
4.1.4.5 Sản phẩm PCR với chỉ thị RM6148
Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM6148
Ghi chú: gel agarose 3%, ladder 100 bp. 1: AS996, 2:N22, các dòng lai từ 3 đến 13, A: mẫu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu từ cây sẽ chuyển vào tủ sinh trưởng
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR với RM6148 chỉ cho một loại sản phẩm (không có dấu hiệu đa hình) với kích thước 179 bp. Như vậy, chỉ thị phân tử RM6148 không phân biệt được giữa giống chịu nhiệt và giống nhạy nhiệt.
4.1.4.6 Sản phẩm PCR với chỉ thị RM6507
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR với RM6507 chỉ cho một loại sản phẩm (không có dấu hiệu đa hình) với kích thước 174 bp. Như vậy, chỉ thị phân tử RM6507 không phân biệt được giữa giống chịu nhiệt và giống nhạy nhiệt.
500bp
100bp
ladder 179 bp
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM6507
Ghi chú: gel agarose 3%, ladder 100 bp. 1: AS996, 2:N22, các dòng lai từ 3 đến 13, A: mẫu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu từ cây sẽ chuyển vào tủ sinh trưởng
Kết quả so sánh sản phẩm PCR với chỉ thị RM3586 và RM6089 cho thấy: tỉ lệ tương đồng giữa hai chỉ thị này là 76,9% (10/13), tỉ lệ không tương đồng là 23,1%. Theo Collad và Mackill (2008), khi tiến hành chọn lọc bằng chỉ thị phân tử, nếu chỉ thị phân tử liên kết chặt với vị trí mục tiêu thì mức độ chọn lọc sẽ đạt hiệu quả cao. Bên cạnh đó, sử dụng nhiều chỉ thị phân tử nằm gần với gen mục tiêu sẽ làm gia tăng mức độ tin cậy trong việc dự đoán kiểu hình. Như vậy, sử dụng kết
hợp 2 chỉ thị phân tử RM3586 và RM6089 trong đánh giá kiểu gen sẽ mang lại mức độ tin cậy cao hơn trong việc chọn dòng lai chứa gen chịu nóng.
4.2 Kết quả đánh giá kiểu hình tính chịu nóng của các giống/dòng lúa nghiên cứu
Sự biểu hiện kiểu hình là do sự tương tác của nhiều gen trong cơ thể và kiểu gen là một hệ thống phức tạp, giữa các gen có mối quan hệ chặt chẽ với nhau. Có
mối quan hệ nhất định giữa kiểu gen và môi trường. Sự biểu hiện của kiểu hình luôn thay đổi thông qua các môi trường khác nhau, và mức độ thay đổi này tùy thuộc vào tính ổn định của gen và tính thích nghi với môi trường của gen (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2011).
500bp
100bp
ladder 174 bp
4.2.1 Kết quả đánh giá hạt phấn
Nhiệt độ cao gây bất dục đực ở lúa với sự thay đổi quá trình phiên mã trong suốt quá trình phát triển ở hạt phấn. Trong các bao phấn, hạt phấn đang phát triển nằm trong các chất lỏng chứa dinh dưỡng như đường và lipid sinh ra từ mô tầng nuôi thể bào tử. Các giai đoạn sớm của sự phát triển hạt phấn đặc trưng bởi sự thay đổi biến dưỡng mức độ cao vì một lượng lớn các đường sẽ chuyển từ cơ quan nguồn đến mô bao phấn. Ở các giai đoạn sau, sự trưởng thành của hạt phấn đòi hỏi sự tích lũy tinh bột, là nguồn cung cấp năng lượng cho sự nảy mầm sau đó và sự hình thành ống phấn. Do đó, nhiệt độ cao ảnh hưởng đến quá trình phát triển của hạt phấn, ảnh hưởng đến quá trình tích lũy tinh bột của hạt phấn (Endo Makoto và ctv, 2009). Những hạt phấn hữu dục, do đó bắt màu xanh đen do phản ứng của thành phần tinh bột trong hạt phấn với iodine. Hạt phấn bất dục không tích lũy được tinh bột sẽ có màu vàng nâu nhạt do không có phản ứng giữa tinh bột với iodine.
Bảng 4.3: Kết quả đánh giá hạt phấn của các giống/dòng lúa thí nghiệm
Giống/dòng
Tỉ lệ hạt phấn bất dục (%) Nhà lưới Tủ sinh trưởng AS996 13,9 ± 1,0 66,1 ± 2,8
N22 15,9 ± 0,9 21,1 ± 2,1
3 11,1 ± 0,8 21,8 ± 1,5
4 14,7 ± 1,3 22,1 ± 1,6
5 17,1 ± 1,0 56,6 ± 2,4
6 18,4 ± 0,9 30,9 ± 1,6
7 13,7 ± 1,3 63,6 ± 1,4
8 12.6 ± 1,2 67,8 ± 2,4
9 16,5 ± 0,8 62,1 ± 2,1
10 14,5 ± 1,1 66,7 ± 2,6
11 16,2 ± 1,0 77,9 ± 3,0
12 14,4 ± 1,3 18,0 ± 1,1
13 14,3 ± 1,1 83,5 ± 2,3
Cao và ctv (2009) cho rằng tỉ lệ hạt phấn hữu dục là một chỉ số quan trọng trong chọn giống chịu nhiệt độ cao ở lúa.
Kết quả đánh giá hạt phấn thông qua phần trăm hạt phấn bất dục thể hiện ở bảng 4.3 cho thấy dưới điều kiện xử lý nhiệt độ cao trong tủ sinh trưởng đã làm tăng tỉ lệ hạt phấn bất dục ở tất cả các giống/dòng lúa.
Kết quả trắc nghiệm T-Test sử dụng phần mềm MINITAB 16 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa tỉ lệ hạt phấn bất dục giữa các giống/dòng lúa trồng ngoài nhà lưới (điều kiện tự nhiên) và trong tủ sinh trưởng (điều kiện nóng nhân tạo) (p- value < 0,05), với giá trị trung bình tỉ lệ hạt phấn bất dục của các giống trồng ngoài nhà lưới là 14,8% và trong tủ sinh trưởng là 50,6%, cho thấy sự tương tác rõ ràng của yếu tố môi trường là nhiệt độ cao lên tỉ lệ hạt phấn bất dục ở các giống thí nghiệm.
Có một sự khác biệt đáng kể giữa tỉ lệ hạt phấn bất dục của giống bố mẹ ở điều kiện được xử lý nhiệt độ cao (66,1% và 21,1%), nhưng sự khác biệt ở điều kiện trồng bình thường ở nhà lưới là rất nhỏ (13,9% và 15,9%). Sự khác biệt tỉ lệ hạt phấn bất dục giữa điều kiện trồng nhà lưới và điều kiện trồng ở nhiệt độ cao trong tủ sinh trưởng của N22 là 5,2%, và của AS996 là 52,2%. Kết quả này cho thấy tác động của nhiệt độ cao làm tăng mạnh tỉ lệ hạt phấn bất dục ở các giống nhạy nhiệt, trong khi đó chỉ làm tăng nhẹ tỉ lệ hạt phấn bất dục ở các giống chịu được nhiệt độ cao.
Tỉ lệ hạt phấn bất dục tăng mạnh ở các dòng lai 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13. Chất lượng hạt phấn giảm (tăng tỉ lệ hạt phấn bất dục) sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng thụ phấn, thụ tinh, và do đó sẽ tác động đến tỉ lệ hạt hữu thụ ở các giống/dòng lúa này.
4.2.2 Đánh giá tỉ lệ hạt hữu thụ (tỉ lệ hạt chắc)
Nguyên nhân chính gây ra hạt bất thụ do nhiệt độ cao ở giai đoạn trổ bông là do hiện tượng không mở ra của bao phấn. Bao phấn của các giống chịu nhiệt sẽ mở ra dễ hơn so với các giống nhạy nhiệt dưới điều kiện nhiệt độ cao. Đó là bởi vì sự đóng chặt của các lỗ khuyết do các lớp tế bào, làm cho lỗ khuyết không mở ra được và do đó làm giảm tỉ lệ hạt hữu thụ dưới nhiệt độ cao (Matsui và Omasa, 2002). Do đó, các tác giả đề nghị tỉ lệ hạt hữu thụ ở nhiệt độ cao được dùng như một công cụ tầm soát tính chịu nóng ở giai đoạn trổ bông (Prasad và ctv, 2006).
Kết quả nghiên cứu của Bùi Chí Bửu và ctv năm 2013 về hệ số tương quan giữa tính trạng chịu nóng và các tính trạng nông học quan trọng cho thấy tỉ lệ phần trăm hạt hữu thụ (hạt chắc) có mối tương quan chặt chẽ với tính trạng chịu nóng (hệ số tương quan là 0,9290).
Từ kết quả đánh giá kiểu hình thông qua đánh giá tỉ lệ bất dục hạt phấn bằng
kính hiển vi sau nhuộm bởi iodine-kali iodide (I2-KI 1%), đề tài cũng tiến hành đánh giá tỉ lệ hạt chắc/lép để khẳng định lại kết quả đánh giá kiểu hình, trong 2 điều kiện tự nhiên (nhà lưới) và điều kiện gây nóng nhân tạo (trong tủ sinh trưởng).
Kết quả đánh giá tỉ lệ hạt chắc lép của 2 giống lúa bố mẹ và 11 dòng lai trồng ngoài nhà lưới và trong tủ sinh trưởng cho kết quả như bảng 4.4.
Bảng 4.4: Kết quả đánh giá tỉ lệ hạt chắc lép của 2 giống lúa bố mẹ và 11 dòng lai
trồng ngoài nhà lưới và trong tủ sinh trưởng
Giống/dòng
Phần trăm hạt hữu thụ (hạt chắc) (%) Nhà lưới Tủ sinh trưởng
AS996 91,3 15,3
N22 90,2 62,4
3 89,8 63,2
4 92,5 42,5
5 87,5 12,7
6 93,5 41,4
7 83,4 8,3
8 92,9 12,2
9 85,4 18,9
10 86,0 13,5
11 66,3 6,3
12 83,5 44,3
13 88,0 Chết
Trung bình (%) 26,2
Độ lệch chuẩn (SD) 21,6
Kết quả trắc nghiệm T-Test sử dụng phần mềm MINITAB 16 cho thấy có sự
khác biệt có ý nghĩa giữa tỉ lệ hạt hữu thụ giữa các giống/dòng lúa trồng ngoài nhà lưới và trong tủ sinh trưởng (p-value < 0,05), với giá trị trung bình tỉ lệ hạt hữu thụ của các giống trồng ngoài nhà lưới là 86,9% và trong tủ sinh trưởng là 26,2%, cho
thấy sự tương tác rõ ràng của yếu tố môi trường là nhiệt độ cao lên tỉ lệ hạt hữu thụ ở các giống thí nghiệm.
Có một sự khác biệt đáng kể giữa tỉ lệ hạt hữu thụ của giống bố mẹ ở điều kiện được xử lý nhiệt độ cao (62,4% và 15,3%), nhưng gần như không có sự khác biệt ở điều kiện trồng bình thường ở nhà lưới (90,2% và 91,3%). Sự khác biệt tỉ lệ
hạt chắc giữa điều kiện trồng nhà lưới và điều kiện trồng ở nhiệt độ cao trong tủ sinh trưởng của N22 là 27,8%, và của AS996 là 76%, một sự khác biệt đáng kể.
Jagadish và ctv (2007) đã xây dựng phương pháp đánh giá kiểu hình giống
lúa chống, chịu nóng. Sử dụng giống N22 làm giống chuẩn kháng (chống, chịu được nhiệt độ cao), để phân loại các giống/dòng lúa thí nghiệm theo chỉ tiêu độ hữu thụ của hạt sau khi xử lý dưới nhiệt độ cao. Theo đó, các kiểu gen được phân loại theo:
- Rất chịu nhiệt độ cao (tỉ lệ hạt hữu thụ ≥ tỉ lệ hạt hữu thụ của N22 - SD).
- Chịu nhiệt độ cao (tỉ lệ hạt hữu thụ của N22 – 2xSD <tỉ lệ hạt hữu thụ < tỉ lệ hạt hữu thụ của N22 – SD).
- Nhạy với nhiệt độ cao (tỉ lệ hạt hữu thụ của N22 – 3xSD <tỉ lệ hạt hữu thụ < tỉ lệ hạt hữu thụ của N22 – 2xSD).
- Rất nhạy với nhiệt độ cao (tỉ lệ hạt hữu thụ <tỉ lệ hạt hữu thụ của N22 – 3xSD).
Với SD là độ lệch chuẩn giữa các giá trị tỉ lệ hạt hữu thụ của các giống/dòng lúa lai ở điều kiện nóng nhân tạo.
Như vậy, theo kết quả thu nhận được khi xử lý các giống/dòng lúa ở nhiệt độ cao trong tủ sinh trưởng, với SD = 21,6% các giống/dòng lúa được phân loại như sau:
- Rất chịu nhiệt độ cao: với các giống/dòng lúa có % hạt hữu thụ >= 40,8%.
- Chịu nhiệt độ cao: với các giống/dòng lúa có % hạt hữu thụ < 40,8% và >=19,2%.
- Nhạy với nhiệt độ cao: với các giống/dòng lúa có % hạt hữu thụ < 19,2% và 0%.
Thuộc phạm vi đề tài, chỉ thực hiện phân loại các giống/dòng lúa theo 2 cấp độ là chịu được nhiệt độ cao (bao gồm cả những giống rất chịu nhiệt độ cao) và nhạy với nhiệt độ cao.
Riêng đối với dòng lai 13, cây lúa chết khi đang trong giai đoạn trổ bông, ở ngày thứ 13 sau khi chuyển vào tủ sinh trưởng (đã loại trừ các yếu tố ngoại cảnh khác gây chết cây), cũng được kết luận là giống nhạy với nhiệt độ cao, vì khả năng chịu nóng ở cây lúa thể hiện ở khả năng sống sót và sinh sản ra sản phẩm có giá trị kinh tế (hạt hữu thụ) dưới tác động của điều kiện nhiệt độ cao (Wahid và ctv, 2007).