CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN
4.1 Đánh giá kiểu gen
4.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA là nguồn vật liệu di truyền quan trọng cho các thao tác sinh học phân tử sau này. Mục đích của việc tách chiết DNA là thu được DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt.
Mẫu mô lá lúa được thu nhận và tiến hành nghiền mẫu bằng cối và chày trong nitơ lỏng. Do thành tế bào cây lúa rất cứng và khó phá vỡ, nitơ lỏng làm cho các mô trở nên lạnh và dẻo, như vậy mô có thể được nghiền mịn nhanh chóng.
Nguồn gốc mô cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng DNA. Mô cây khỏe, trẻ
cho kết quả phân lập tốt nhất, trong khi đó, nếu sử dụng mô già thì sản phẩm thu được dễ bị tạp do polysaccharide dẫn đến chất lượng sản phẩm thấp, do đó cần lựa chọn những mô lá non, không có vết bệnh để cho kết quả tách chiết DNA tốt.
Việc ly trích DNA tổng số được tiến hành theo phương pháp CTAB, đây là phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô thực vật mang lại hiệu quả cao, đồng thời đã được cải tiến để phù hợp với điều kiện thí nghiệm tại viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp miền Nam.
CTAB là chất có hoạt tính bề mặt, nó sẽ tạo phức với DNA là ion âm trong dung dịch. Khi nồng độ muối lớn hơn 0,7 M, phức hợp DNA-CTAB sẽ hòa tan trong dung dịch. Khi nồng độ muối nhỏ hơn 0,7M thì phức hợp DNA-CTAB sẽ được tủa. NaCl thêm vào để điều khiển nồng độ muối trong dung dịch.
Protein và chất cặn của tế bào được tách rời ra khỏi DNA bằng cholorofrom- isoamylalcohol. Trong quá trình ly trích sử dụng chloroform-isoamylalcohol lặp lại hai lần liên tiếp kết hợp với ly tâm đã loại bỏ hết lượng protein và polysaccharide có trong mẫu. Chloroform có tác dụng làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau, isoamylalcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích. Protein bị biến
tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ kết tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ.
Pha nước có chứa acid nucleic sẽ được thu nhận lại. Sau đó, tiến hành thu tủa acid nucleic bằng isopropanol. Mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung môi theo nồng độ mong muốn. Bên cạnh đó, các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa nên có thể loại bỏ chúng bằng kết tủa trong isopropanol. Sau đó, cặn kết tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các dấu vết của isopropanol còn dính lại.
EDTA và Tris là hai dung môi hết sức quan trọng trong quá trình tách chiết.
Tris được sử dụng với khả năng đệm rất hiệu quả. Ở pH 8, DNA rất ổn định. Để ngăn ngừa DNA bị thủy phân bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA. Bởi vì tất cả các enzyme thủy phân được biết đến hiện nay đều cần Mg2+ làm cofactor.
EDTA có thể kiềm giữ Mg2+ và làm bất hoạt nó trong dung môi. Không có Mg2+, enzyme không thể hoạt động.
Kết quả định lượng DNA bằng máy quang phổ kế cho thấy các mẫu DNA
nguồn vật liệu bố mẹ và 11 dòng lai đều cho thấy DNA thu nhận được đạt chất lượng tốt, DNA thu được với tỉ lệ OD260/280 đạt từ 1,5-2,2 đảm bảo độ tinh sạch tương đối cao cho các thao tác sau này.
Bảng 4.1: Kết quả định lượng DNA bằng máy quang phổ kế
Mẫu Nồng độ DNA (ng/àl) Tỉ lệ OD 260/OD 280
1A 182,62 1,82
1B 94,16 1,88
2A 185,74 1,84
2B 186,36 1,83
3A 178,65 1,80
3B 179,37 1,81
4A 177,78 1,79
4B 174,69 1,78
5A 108,49 1,80
5B 176,55 1,79
6A 174,57 1,78
6B 179,02 1,80
7A 180,72 1,81
7B 180,30 1,81
8A 177,86 1,80
8B 176,05 1,79
9A 175,42 1,78
9B 189,03 1,85
10A 175,15 1,78
10B 181,76 1,82
11A 179,24 1,80
11B 176,30 1,79
12A 174,18 1,77
12B 176,93 1,79
13A 103,66 1,77
13B 107,55 1,79
Ghi chú: A: trồng ở điều kiện nhà lưới, B: trồng ở điều kiện nóng nhân tạo
Các mẫu DNA lúa của giống AS996, N22 và 11 dòng lúa lai sẽ được tiến hành kiểm tra chất lượng bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch TBE 0,5X.
Hình ảnh kết quả điện di (hình 4.1) cho thấy qui trình tách chiết đạt hiệu quả tốt do sản phẩm thu được không có hiện tượng đứt gãy nhiều, tạp chất được loại bỏ gần như hoàn toàn, các vạch sản phẩm sáng, đều.
Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số
Ghi chú: gel agarose 1%, TBE 0,5 X. 1: AS996, 2:N22, các dòng lai từ 3 đến 13, A:
mẫu lá thu từ cây trồng điều kiện nhà lưới, B: mẫu lá thu từ cây sẽ chuyển vào tủ
sinh trưởng.
Kết quả đánh giá sản phẩm DNA tổng số bằng 2 phương pháp đo OD và điện di có sự tương đồng với nhau, đều cho thấy sản phẩm DNA tổng số được tách chiết đạt hiệu quả tốt, tạp chất được loại bỏ, DNA thu được có độ tinh sạch cao, nồng độ đủ để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Trong quá trình ly trích DNA cần lưu ý những vấn đề sau để hiệu quả ly trích đạt được tốt nhất:
- Cần ủ trước dung dịch ly trích đến 65oC (có thể ủ trong khoảng 15 phút) để tránh hiện tượng kết tủa (do dịch ly trích chứa CTAB) làm ảnh hưởng đến kết quả ly trích.
- Khi nghiền mẫu trong nitơ lỏng, cần bổ sung nitơ lỏng thường xuyên để giữ lạnh mẫu, tránh để mẫu tan chảy sẽ làm hư hỏng DNA, nghiền mẫu nhanh tay. Khi mẫu đã được nghiền thành bột mịn, chuyển ngay mẫu vào tuýp 1,5 ml giữ lạnh để bảo quản.
- Khi phơi khô cặn tủa DNA, tránh để quá lâu sẽ làm hư hỏng DNA.